Procédures légères
Evaluation préclinique de nouvelles molécules à visée anti-leucémique dans des modèles murins
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 186 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques prélevées sur des enfants, subissent huit à vingt prises de sang hebdomadaires et, pour certaines, des traitements par voie orale ou intrapéritonéale pendant deux mois, avant la mise à mort pour récupérer les cellules cancéreuses multipliées. L'objectif est d'amplifier ces cellules pour constituer un stock et de tester des molécules contre les rechutes des leucémies aiguës T de l'enfant. Le porteur affirme que ces cellules ne survivent pas plus de trois jours en laboratoire et présente la souris comme un moyen d'en produire assez pour réduire ensuite les expériences in vitro.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d'amplifier dans des souris des cellules cancéreuses de patients pédiatriques atteints de leucémies aigues T en réalisant des greffes de la tumeur du patient. Les cellules leucémiques humaines ne peuvent pas être maintenues plus de 3 jours en laboratoire et grâce à la greffe dans les souris nous pourrons créer une réserve de cellules leucémiques pédiatriques. Enfin dans une partie plus préclinique nous testerons également de nouvelles molécules dans le but de trouver de nouvelles options thérapeutiques pour les patients en rechute.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d'établir une collection de cellules leucémiques à partir d'échantillons pédiatriques de leucémies aigues T au diagnostic et à la rechute . Les cellules leucémiques amplifiées chez la souris permettront d'effectuer des expériences in vitro dans des sytèmes complexes de coculture afin d'étudier les mécanismes de rechute. Elles seront également utilisées in vivo pour confirmer le potentiel thérapeutique de nouveaux médicaments pour pallier au mauvais pronostic des rechutes. En effet bien que la leucémie de l'enfant connaisse un fort taux de rémission, pour les 15 % de patients qui rechutent le pronostic est très défavorable avec 70% de décés. Il est donc primoridal de trouver des nouveaux traitements.
Procédures
Toutes les semaines les souris subiront une prise de sang afin d'effectuer un suivi précis du développement de la maladie soit sur la durée du protocole entre 8 et 20 prises de sang selon les souris. Le prélévement dure environ une dizaine de secondes. Certaines souris recevront une injection unique de cellules cancéreuses par voie intraveineuse. Enfin certaines souris recevront 3 fois par semaine par voie orale ou intraperitonéale des molécules anti-leucémiques pendant au maximum deux mois soit 24 administrations.
Impact sur les animaux
Les animaux recevront sous contention par voie intraveineuse des cellules leucémiques humaines et vont donc développer une leucémie qui pourra altérer à terme leur formule sanguine (anémie) et donc entrainer une fatigue et une altération de l'état général. Certains animaux seront soumis à des contentions (stress physique) pour effectuer des injections répétées (3 fois par semaine) en intra-péritonéale ou par voie orale. Les injections en intra-péritonéale peuvent entraîner des rougeurs (lésions) au site d'injection. Il se peut que certains traitements présentent des effets secondaires inattendus comme modification des fécés.
Devenir
A la fin de chaque procédure tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer et de congeler les cellules cancéreuses humains qui se sont multipliées dans les souris.
Remplacement
Les cellules leucémiques humaines ne peuvent pas être gardées in vitro au delà de 3 jours, ce qui limite le nombre d'expériences au laboratoire. Un des buts de notre projet est l’amplification de cellules cancéreuses humaines chez la souris afin de mettre en place des stocks de cellules. Ainsi la greffe d'un échantillon de patient dans une souris permettra de produire une vingtaine de tubes à congéler qui seront ensuite utiliser dans des expérience in vitro. Donc paradoxalement bien que nous ne pouvons pas nous passer de l’utilisation des souris, celles-ci permettront par la suite d'avoir suffisamment de matériel pour l'utiliser dans des systèmes in vitro et ainsi réduire l'utilisation à posteriori de souris.
Réduction
Nous utiliserons à la fois les mâles et les femelles, ce qui permet d’utiliser la totalité des animaux générés. Pour la procédure d'évaluation préclinique, la taille des groupes expérimentaux a été définie en utilisant un logiciel de calculs statistiques.
Raffinement
Nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement. Les animaux sont hébergés dans un milieu enrichi en portoirs ventilés avec un suivi journalier. Des points limites précis sont définis dans chaque procédure expérimentale. Un dosage par prise de sang permet de suivre le développement de la leucémie et de quantifier avec précision l'envahissement par les cellules leucémiques. Ainsi nous avons défini un seuil limite d'envahissement à ne pas dépasser et qui permet de stopper l'expérimentation au plus tôt pour limiter la souffrance animale tout en préservant l'obtention de données scientifiques exploitables. Lors des traoitemenst par injections intrapéritonéales, nous effectuerons une rotation des sites d’injection et surveillerons quotidiennement leur aspect. Nous effectuerons un suivi hebdomadaire du poids, un bon indicateur de l'état général. L'administration d’eau gélifiée et de nourriture directement dans la cage est prévue en cas de signe d'inconfort.
Choix des espèces
Dans ce projet nous utilisons des souris immunodéficientes qui sont des souris dont le système immunitaire est très peu actif afin de permettre la greffe de cellules humaines sans rejet. Elles sont très utilisées pour la recherche en onco-immunologie Les souris seront utilisées à l'âge de 6-12 semaines, âge optimal pour la prise de greffes.
Rôle des phagocytes spléniques dans la physiopathologie et la réponse aux traitements de la leucémie aiguë myéloïde induite par transplantation de cellules tumorales dans un modèle murin (2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 418 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent par voie intraveineuse des cellules leucémiques qui envahissent moelle, sang, rate, foie et poumons en provoquant perte de poids et douleurs, subissent des gavages quotidiens pendant cinq à quinze jours et des injections répétées, avant la mise à mort pour prélever leurs organes. L'objectif est d'identifier les cellules immunitaires de la rate impliquées dans une leucémie aiguë myéloïde, dans un travail mené sur deux établissements. Le porteur affirme que ces interactions ne peuvent pas être étudiées in vitro, y compris avec des organoïdes.
Objectifs
La leucémie aiguë myéloïde touche différents organes dont la rate et est le type le plus fréquent de leucémie chez l'adulte, avec un pronostic effroyable. L'identité des cellules immunitaires de la rate impliquées dans l'élimination des cellules leucémiques est inconnue. Tous comme celle des cellules responsables de l'efficacité des traitements pour induire la rémission, courament utilisés ou actuellement en cours d'essai thérapeutique chez l'homme. Nous proposons d’identifier et caractériser ces cellules par l'étude d'un modèle de leucémie aiguë myéloïde murine induite par la transplantation de cellules leucémiques dans des souris transgéniques. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
L’identification des cellules immunitaires de la rate impliquées dans la progression ou la rémission d'un modèle murin de leucémie aiguë myéloïde, ou dans l’efficacité des traitements de référence ou en cours d'essai chez l'homme permettra de mieux comprendre la physiopathologie de la maladie humaine, ou de proposer de nouvelles stratégies de traitement ciblant plus spécifiquement les cellules immunitaires impliquées.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions selon les procédures : une biopsie d'oreille/queue pour génotypage (durée du geste 10 secondes/souris), une injection intraveineuse de cellules leucémiques (durée du geste 10 secondes/souris) sous anesthésie gazeuse par isoflurane ; gavage oral quotidien à l'aide d'une sonde en silicone (durée du geste 1 min/souris) en condition vigile pendant 5 à 15 jours consécutifs ; inclusion d'un traitement dans l'alimentation des souris ; injections intrapéritonéales de molécules ou véhicules sur des animaux vigiles en contention manuelle (durée du geste 30 secondes/souris) sous la forme de 5 injections avec une injection tous les deux jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables des procédures sur les animaux sont : 1) légers. Les biopsies d'oreille/queue réalisées par des zootechniciens expérimentés génèrent des douleurs négligeables. Les injections de molécules ou de cellules leucémiques sont associées à des douleurs minimes prévenues par une anesthésie gazeuse par isoflurane de durée la plus courte possible pour les intraveineuses. Le recours aux gavages oraux sera remplacé si possible par l'administration du traitement dans l'alimentation des souris, laquelle s'associe à une perte de poids transitoire, réversible et modérée qui sera surveillée et corrigée le cas échéant. 2) modérés. La leucémie induite par l'injection intraveineuse de cellules cancéreuses infiltre différents tissus (moelle osseuse, sang) et organes (rate, foie, poumons…) causant une perte de poids, d’une altération du comportement et éventuellement des douleurs. Ces évènements significatifs seront limités par la définition de points limites cotés à l’aide d’un scoring spécifique et la mise en place d’un plan d’action graduel (utilisation d’antalgiques, correction de la perte pondérale et hydrique, mise à mort).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de prélever différents organes pour étudier le système immunitaire et/ou le développement de la leucémie
Remplacement
Tous les modèles de leucémie impliquent un envahissement progressif de la moelle osseuse, du sang, du foie, de la rate et des poumons. Par ailleurs, il existe des interactions dynamiques entre les cellules leucémiques et les cellules du système immunitaire au sein de ces différents organes. Ces phénomènes ne peuvent pas être étudiés in vitro y compris en utilisant des organoïdes. Il n'y a donc pas d'alternative à ce jour au recours à des modèles animaux vivants.
Réduction
Dans le cadre des procédures exploratoires nous avons inclus le nombre minimal d'animaux permettant d'effectuer un test statistique pertinent. Pour les études de survie nous avons utilisé des outils statistiques pour déterminer une taille d'échantillon nécessaire. Nous conserverons tout échantillon non utilisé. Nous avons mis en place une stratégie "stop and go" pour identifier si l'administration d'un traitement mélangé à l'alimentation peut remplacer le gavage oral. Cette stratégie permet également de ne pas entreprendre de tests de durées de traitements supplémentaires si l'objectif fixé est atteint pour des durées plus courtes.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans un environnement adapté et enrichit de l’environnement (nids en coton, cylindre en plastique, copeaux de bois). Un protocole de surveillance du bien-être est défini a priori et appliqué pour chaque procédure, avec définition de points-limites basé sur un score composite d’items (apparence physique externe, changement de comportement des animaux, perte pondérale) d’observations cliniques. L’atteinte de points-limites de gravité variable conduit à une décision immédiate ou différée (utilisation d’antalgiques, correction de la déshydratation par de l’eau gélifiée, mise à mort) et à un renforcement de la surveillance des animaux.
Choix des espèces
Les modèles animaux représentent un organisme de choix dans l’étude des réponses immunitaires en contextes physiologiques et pathologiques, notamment dans les réponses anti-tumorales. Ils permettent une étude dynamique, spatiale et temporelle, contrôlée des mécanismes immunologiques in vivo. Le modèle murin est particulièrement adapté du fait des nombreuses similitudes dans l’organisation anatomique, cellulaire et fonctionnelle de la rate avec la rate humaine. Par ailleurs, le modèle de leucémie murine récapitule la maladie humaine. Des souris de fond génétique C57BL/6 adultes âgées entre 6 et 14 semaines en début de procédure seront utilisées car le système immunitaire est mature et la transplantation de cellules leucémiques permet d’induire une leucémie à cet âge semblable à la maladie humaine adulte.
Etude préliminaire de la caractérisation des connectivités rétino-tectales et rétino-corticales chez les Platyrhiniens
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Singes écureuils : 3
4 primates, un ouistiti et trois singes écureuils, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun reçoit deux injections dans les yeux sous anesthésie, avec un risque déclaré d'inflammation, d'ulcération de la cornée ou de baisse de vision, puis est tué sept jours plus tard pour prélever ses yeux et son cerveau. Cette étude préliminaire vise à cartographier les connexions visuelles pour comprendre l'évolution de la vision binoculaire. Le porteur affirme qu'aucune méthode de substitution n'existe et que le primate non humain est le modèle le plus proche de l'humain, précisant que trois de ces individus ont déjà servi dans un autre projet.
Objectifs
La perception visuelle de la profondeur est possible par le chevauchement de ce qui est perçu par l’œil gauche et l’œil droit. Cette visualisation de la profondeur est rendue possible par la position frontale des yeux au niveau de la tête. Les neurones ganglionnaires situés dans la rétine et recevant les informations visuelles se projettent des deux côtés (hémisphères droit et gauche) du cerveau vers les noyaux visuels dont la zone du thalamus (corps genouillé latéral) qui joue un rôle de relais et est connecté au cortex visuel primaire (zone située à l’arrière du cerveau dans le lobe occipital). Ces projections entre la rétine et le thalamus se retrouvent chez la plupart des vertébrés. Cependant, la proportion des projections qui sont connectées au même côté du cerveau est très minoritaire chez les rongeurs (2-3%) tandis qu’elles représentent une part importante chez les primates (40%). Certaines études portant sur la latéralité des projections visuelles chez le primate présentent des résultats contradictoires sur la présence des projections visuelles bilatérales notamment chez le singe écureuil et leur présence semble éphémère chez le ouistiti. Les différences observées montrent les difficultés de mettre en évidence la présence ou non de ces projections chez le singe écureuil et le ouistiti commun. Ces deux espèces montrent des caractéristiques cérébrales intermédiaires, entre le macaque et le rongeur, ce qui en fait des modèles très importants pour étudier l’évolution de l’apparition de la vision binoculaire par l’intermédiaire de l’existence des projections visuelles bilatérales. Ce projet est une étude préliminaire afin de caractériser les connections permettant la stabilisation de l’image et la coordination des mouvements de la tête et des yeux ainsi que les connections impliquées dans la perception visuelle consciente chez les primates originaires d’Amérique (par exemple : singe écureuil et ouistiti commun) en comparaison avec ceux originaires d’Afrique et d’Asie (par exemple : macaque).
Bénéfices attendus
Savoir comment les neurones ganglionnaires se projettent de la rétine aux centres visuels cérébraux, dont le thalamus, nous permettrait de mieux comprendre l’organisation de la vision binoculaire des primates et de mieux comprendre son évolution chez les vertébrés.
Procédures
Pour chaque individu, deux injections intraoculaires (1 pour chaque œil) seront réalisées sous anesthésie. La durée de l’intervention est estimée à 2h par individu. Les animaux seront ensuite euthanasiés, 7 jours après les injections. La durée de l’intervention est estimée à 30 minutes par individu.
Impact sur les animaux
L’ensemble des injections sera réalisé sous anesthésie. Lors de l’anesthésie, les animaux pourraient présenter une instabilité de leurs constantes physiologiques (rythmes cardiaque et respiratoire…). Une douleur peut être induite lors de l’injection oculaire. Même si rarement, plusieurs complications post-injection peuvent survenir avec des degrés de gravités différents (inflammation de la cornée, infection, ulcération de la cornée, dégradation transitoire de la vision).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés 7 jours après l’injection dans les deux yeux afin de récupérer leurs yeux, le chiasma optique (zone dans le cerveau où les nerfs optiques provenant de l’œil gauche et de l’œil droit se croisent) et le cerveau pour des analyses post mortem.
Remplacement
Ce projet a pour objectifs de comprendre et de manipuler l’organisation des connexions entre l'oeil et les zones cérébrales impliquées dans la vision chez le singe écureuil et le ouistiti commun afin d’améliorer nos connaissances sur l’organisation de la vision binoculaire chez les vertébrés. Les processus impliqués dans le développement de la vision binoculaire sont complexes et mettent en jeu de multiples interactions cellulaires entre deux zones éloignées du cerveau. Cette complexité rend difficile/impossible à l’heure actuelle, la modélisation des processus et nécessite des systèmes intégrés. Dans ce contexte, il est impossible de remplacer l’utilisation d’animaux vivants par des méthodes alternatives. Ainsi, le modèle animal et en particulier l’utilisation du primate non-humain est donc le plus prédictif et le plus pertinent pour espérer une transposition à l’homme la plus fiable possible.
Réduction
Pour cette étude pilote, nous utiliserons seulement deux lots d'animaux : 1 saïmiri et un marmouset pour la 1e technique d'injection et 2 saïmiris pour la 2e technique d'injection. Certains de ces individus utilisés sont des animaux non naïfs qui ont participé à un autre projet scientifique classé comme modéré portant sur la menstruation humaine (APAFIS#31395-202103251034478 v7).
Raffinement
Les animaux seront manipulés seulement à deux moments, lors de l’injection oculaire puis lors de l’euthanasie pour le prélèvement des organes. En dehors de ce deux procédures les animaux évolueront dans leurs groupes sociaux respectifs. Toutes les animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires...), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises...). Ce programme est supervisé par le responsable du bien-être animal et validé par la structure en charge du bien-être animal. Les deux manipulations se feront sous anesthésie générale . Une fois anesthésiés, les animaux seront placés sur une surface chauffante pour maintenir leur température corporelle et différents paramètres seront surveillées (fréquence cardiaque, fréquence respiratoire...). Les mesures mises en place (anesthésie, analgésie (méthode pour diminuer ou supprimer la douleur), asepsie (méthode préventive pour limiter les contaminations). Ce genre de procédure n'est habituellement pas douloureux après l'opération et ne nécessite pas de traitement anti-douleur de manière systématique. L'animal est gardé sous surveillance pendant 24h en zone d'isolement avec un autre congénère avant réintroduction dans son groupe et évalué quotidiennement par le personnel et le vétérinaire. En cas de signes de douleurs (immobilité, troubles de l'appétit...), un traitement anti-douleur pourra être donné. La période en zone d'isolement pourra être prolongé (24h supplémentaire) si la récupération de l'animal n'est pas validée par l'équipe vétérinaire. Au bout de 48h, après rétablissement complet validé par l'équipe vétérinaire, l'animal pourra être réintroduit dans son groupe sous surveillance accrue (vétérinaire et équipe responsable du bien-être).
Choix des espèces
Ce projet a pour objectifs de comprendre l’organisation des connexions entre l'oeil et les zones cérébrales impliquées dans la vision chez le singe écureuil et chez le ouistiti commun afin d’améliorer nos connaissances sur le développement de la vision binoculaire chez les vertébrés. Les processus impliqués dans le développement de la vision binoculaire sont complexes et mettent en jeu de multiples interactions cellulaires entre deux zones éloignées du cerveau. Le niveau de complexité anatomique de ces structures ainsi que la volonté d’obtenir un modèle suffisamment proche de l’Homme font du primate non-humain un modèle particulièrement approprié pour notre étude. Dans ce contexte, il est impossible de remplacer l’utilisation d’animaux vivants par des méthodes alternatives. Des études ont permis de montrer la présence de connexions entre l'oeil et les zones cérébrales visuelles, des deux côtés du cerveau chez le macaque et l’Homme mais leur absence chez les rongeurs. Le choix de modèles pour cette étude s’est porté sur le singe écureuil et le ouistiti commun car ces espèces sont des primates partageant des caractéristiques visuelles et cérébrales communes avec d’autres primates provenant d'Afrique et d'Asie (par exemple : macaques) mais aussi des différences évolutives dues à leur appartenance aux primates originaires d'Amérique.
Neurophysiologie du chant
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
750 diamants mandarins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Placés en isolement acoustique, ils subissent chacun une chirurgie intracérébrale de trois à sept heures pour recevoir des injections, des électrodes ou des lésions du cerveau, puis sont tués pour l'analyse de leur cerveau. Le porteur présente le chant de ces oiseaux comme un modèle du langage humain et justifie les enregistrements électrophysiologiques par le fait qu'ils sont impossibles chez l'humain. Il indique que l'IRM n'offre pas la résolution recherchée et que les oiseaux sont maintenus au contact de congénères pour limiter les effets de l'isolement.
Objectifs
Le chant des oiseaux chanteurs est un comportement social acquis par imitation d'un tuteur et faisant appel à des processus sensorimoteurs. L'apprentissage du chant des oiseaux se déroule en deux phases : une phase de mémorisation du chant du tuteur, dite phase sensorielle, précède une phase de pratique du chant, dite sensorimotrice, au cours de laquelle une forme de babillage va progressivement laisser place à des éléments vocaux produits précisément, appelés « syllabes ». Une fois adultes, les oiseaux produisent des chants dit cristallisés qui possèdent les caractéristiques acoustiques et l'organisation syntaxique propres à leur espèce. Chez certaines espèces comme le diamant mandarin (Taeniopygia guttata), le chant ne varie que très peu une fois l'âge adulte atteint. Un diamant mandarin apprend de plus son chant rapidement, en trois mois environ, permettant un suivi des mécanismes impliqués tout au long du développement du chant. Un oiseau chanteur adulte doit s'entendre pour maintenir la stabilité de son chant et peut le modifier quand le retour auditif est perturbé ou absent. Le chant présente donc des points communs avec la parole chez l'humain : structure acoustique et organisation syntaxique qui varient d'une espèce à l'autre, nécessité d'un apprentissage par imitation des congénères et nécessité d'un retour auditif venant du propre chant de l'oiseau. Comme la parole chez l'humain, le comportement de chant des oiseaux chanteurs est sous le contrôle d'un vaste réseau de structures cérébrales interconnectées dénommé « système du chant » et spécialisé dans l'apprentissage, la production et la perception du chant. Pour l'ensemble de ces raisons, les oiseaux chanteurs sont un modèle de choix dans l'étude des bases neurobiologiques du langage.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche fondamentale bénéficera en premier à la communauté spécialisée dans le domaine de recherche de la neuroéthologie du chant des oiseaux. Il apportera aussi des connaissances essentielles pour mieux comprendre les potentiels déficits observés dans la parole humaine. En effet, de nombreusess études ont mis en avant les analogies du comportement de chant des oiseaux chanteurs et du langage humain. Ces analogies ont été identifiées d'un point de vue comportemental (l'acquisition du chant et du langage mettant en jeu les mêmes étapes) et neurobiologiques (analogies moléculaires et cellulaires). Par ailleurs, des lésions ou perturbations des structures cérébrales dédiées au comportement de chant induisent des déficits comportementaux semblables à ceux observés chez les humains, tels que des bégaiements ou des retards d'apprentissage. Nombre de ces déficits chez les oiseaux chanteurs rappellent les troubles de la parole observés chez les humains atteints de pathologies neurodégénératives touchant les ganglions de la base (maladie de Parkinson ou de Huntington par exemple). Enfin, les méthodologies d'étude et d'analyse déployées permettront des avancées technologiques en lien avec le traitement de grand jeu de données (big data) et pourront nourrir des projets de recherche computationnelle et de modélisation future.
Procédures
Les oiseaux seront placés en isolement social et seront soumis à diverses procédures chirurgicales intracérébrales. Chaque oiseau ne subira qu'un seul type d'intervention chirurgicale et qu'une seule fois. Suivant l'opération chirurgicale, effectuée sous anesthésie générale, la durée varie de 3 à 7h.
Impact sur les animaux
Ce projet impliquera de placer une partie des oiseaux utilisés pour les expériences en isolement dans des caissons d'isolation acoustique individuels afin d'enregistrer leurs vocalisations. Certains oiseaux subiront par ailleurs des chirurgies intracérébrales (sous anesthésie générale) afin de réaliser des injections, de poser des électrodes d'enregistrement ou des électrodes de stimulation électrique. Ces opérations sont susceptibles de générer de la douleur pendant les premières heures qui suivent la chirurgie.
Devenir
A l'issue des différentes procédures, tous les oiseaux ayant subi une opération chirurgicale seront euthanasiés. La collecte du cerveau à la fin de chacune de ces procédures est essentielle afin de 1/pouvoir identifier les projections entre les structures cérébrales d'intérêt, 2/ pouvoir identifier les points d'insertion des électrodes d'enregistrement ou de stimulation électrique, 3/pour caractériser l'étendue de la lésion cérébrale
Remplacement
Le but de nos recherches est de déterminer les mécanismes neurobiologiques mis en jeu dans l’apprentissage, la production et la perception de vocalisations. Pour cela, les oiseaux constituent un remarquable modèle d’étude, leurs vocalisations présentant des points communs avec la parole humaine et un ensemble de structures cérébrales étant dédié à la perception, la production et au contrôle des vocalisations. Les technologies actuelles (IRM) ne permettent pas d'avoir un niveau de résolution suffisamment fin pour analyser l'activité de neurones à des échelles temporelles de l'ordre de la milliseconde. Mener ces expériences reposant notamment sur des enregistrements électrophysiologiques de l’activité neuronale et des stimulations intracérébrales, qui ne sont pas possibles chez le sujet humain (sauf dans certaines conditions particulières), permet d’avancer dans la compréhension des processus neurobiologiques en général et dans le comportement vocal des oiseaux en particulier
Réduction
Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux à utiliser et d’adapter le protocole expérimental, nous conduirons les expériences sur un seul oiseau à la fois. Cela nous permettra de traiter les éventuelles difficultés les unes après les autres. Par ailleurs, cela nous permettra de ne collecter que le nombre de données nécessaires pour obtenir suffisamment de puissance statistique.
Raffinement
Avant toute procédure chirugicale, les oiseaux reçoivent une administration d'un analgésique. La chirurgie s'opère sous anesthésie générale. Lorsqu’un oiseau aura subi une opération chirurgicale, celui-ci sera maintenu seul dans une cage jusqu’à récupération (que nous estimons à 48h) mais de façon à ce qu’il puisse voir et entendre ses congénères. Des oiseaux stressés ou en souffrance ne vocalisant pas, ils seront contrôlés au quotidien. Un antalgique sera administré lors de l’opération chirurgicale et tant que l’oiseau montre des signes de douleur (inactivité, absence de vocalisations, posture prostrée). Les oiseaux seront régulièrement mis au contact de congénères pendant toute la durée des expériences afin de pallier les effets liés à l'isolement. Des points limites précoces ainsi que des procédures d'arrêt d'expériences ont été définies en fonction des observations faites quotidiennement sur les animaux.
Choix des espèces
Pour comprendre les processus sous-tendant le contrôle vocal, les oiseaux chanteurs constituent un modèle de choix. Ils présentent des capacités remarquables de modulation et de contrôle de leurs vocalisations. Ils possèdent un ensemble de structures cérébrales spécialisées dans ce comportement. Plusieurs parallèles avec l'apprentissage vocal chez l’humain existent (période sensible pour l'apprentissage, répertoire de gestes moteurs vocaux). Notons que si cette capacité d'apprentissage vocal est fréquente chez les oiseaux, elle est beaucoup plus rare chez les mammifères, et, en l'état actuel des connaissances, absente chez les invertébrés. Nous nous proposons d’étudier en particulier les diamants mandarins (Taeniopygia guttata). Ces oiseaux apprennent à produire des chants relativement rapidement, permettant de réaliser un suivi longitudinal de l'acquisition du chant. De plus, la stabilité de leur chant d'adulte permet de conduire des protocoles comportementaux efficaces pour induire de la plasticité vocale. Ces oiseaux s’adaptent parfaitement à la vie en captivité. Enfin, le réseau de structures cérébrales mis en jeu dans leur comportement vocal est très précisément connu et décrit dans la littérature, permettant une comparaison fiable des données et une mise en perspective des résultats obtenus. Tous les animaux utilisés dans cette étude seront âgés d'au moins 15 jours, mais toutes les procédures chirurgicales seront effectuées qu'après leur 40ème jour minimum. A cet âge, les diamants mandarins sont sortis de leur nid et indépendant. Ils commencent à pratiquer leur chant à cet âge là, ce qui nous intéresse tout particulièrement dans cette étude.
Développement d’un modèle murin sur rat Fischer de lambeau libre perforant ostéo-cutané par ingénierie tissulaire pour la reconstruction des pertes de substances osseuses interruptrices
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
96 rats Fischer vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures dont la souffrance déclarée va de légère à sévère, huit étant opérés puis tués sans réveil. Ils reçoivent des implants osseux vascularisés maintenus huit semaines sous la peau, puis transférés dans un défaut creusé dans la mandibule ou le fémur, avec un suivi allant jusqu'à douze semaines avant la mise à mort pour analyse. L'objectif est de mettre au point un lambeau bi-tissulaire évitant les prélèvements osseux lourds pratiqués aujourd'hui en chirurgie reconstructrice humaine. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux n'est possible, les bioréacteurs in vitro n'étant selon lui pas assez avancés, et conclut à la "nécessité" du rat comme bioréacteur in vivo.
Objectifs
Les pertes de substances pluritissulaires ostéo-cutanées ou ostéo-muqueuses suite à un traumatisme, une chirurgie cancérologique ou une infection représente un défi pour la chirurgie reconstructrice du fait des différents types de tissus à reconstruire et régénérer. Ces pertes de substance peuvent être accompagnées de séquelles fonctionnelles, sensorielles, sensitives, ou esthétiques non négligeables avec des conséquences multiples pour la victime (intégrité physique et morale affectée). Ceci étant d’autant plus vrai pour les pathologies maxillo-faciales.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de développer un modèle de lambeau chez le rat, ce lambeau se voudra bi tissulaire (osseux et cutané) et autorisera des reconstructions complexes de la mandibule en s’affranchissant de prélèvements séquellaires. En effet, les reconstructions actuelles passent par des prélèvements osseux conséquents (autogreffe osseuse nécessitant un apport de tissus mous secondaire ou alors des prélèvements libres ostéocutanés tels que une fibula avec une palette cutanée). Ces prélèvements sont lourds, responsables de douleurs, boiterie, troubles neurologiques, instabilité de cheville. Ce projet associe reconstruction osseuse par ingénierie tissulaire osseuse (impression 3D avec ensemencement cellulaire et reconstruction des parties molles par lambeau perforant (prélèvement uniquement de peau et de son pédicule vasculaire respectant les structures nobles telles que les muscles, nerfs et os). Cette construction néoformée permettra de reconstruire en un seul temps opératoire des pertes de substances complexes bi tissulaires sans séquelle sur la zone donneuse.
Procédures
Expérimentation animale préliminaire (14 rats, deux semaines) Expérimentation animale avec réalisation d’une construction osseuse vascularisée avec implants mis en place 8 semaines (4 groupes de 8 rats et 6 rats permettant le prélèvement de moelle). Le geste de mise en place d’un implant ayant pour durée 20 minutes. Pour la preuve de concept de réparation de substance ostéo-cutanée mandibulaire, une construction osseuse vascularisée pendant 8 semaines, puis transférée dans un défaut mandibulaire de taille critique lors d’une intervention chirurgicale de 2 heures. La consolidation de la réparation sera évaluée à une durée allant jusqu'à 8 semaines post transfert. De la même façon, l’extension de nos procédés de reconstruction aux membres inférieurs passera par une expérimentation en région fémorale avec mobilisation d’un lambeau bitissulaire ostéo-cutané pédiculé. Les implants seront ensemencés par de la moelle osseuse totale et de la RhBMP2 30ug/mL. Après une implantation pendant 8 semaines, les lambeaux seront transférés en région fémorale après création d’un défect osseux, et monitorés pendant 12 semaines.
Impact sur les animaux
Les conséquences de ces études sur les animaux seront potentiellement les suivantes : - Douleur faible lors de la première expérimentation (dissection du lambeau perforant) et deuxième (mise en place de l’implant autour du pédicule in situ) - Pas de limitation de mobilité attendue, ni de stress particulier - Les éventuels effets dureront 2 semaines lors de la première procédure, 8 semaines pour la moitié de chaque groupe dans la deuxième procédure et deux semaines supplémentaires pour l’autre moitié de chaque groupe. Concernant la chirurgie maxillo-faciale, une gêne à l'alimentation pourrait être observée et sera strictement monitorée. Concernant la chirurgie des membres inférieurs, une gêne à la mobilisation et des douleurs peuvent être attendues et seront strictement monitorées.
Devenir
L’euthanasie des animaux est nécessaire afin d’analyser les implants mis en place autour du pédicule vasculaire du lambeau.
Remplacement
L’utilisation de rongeurs reste nécessaire afin de valider les propriétés des matériaux avant d’envisager des expériences sur de plus gros animaux et l’ultime but : l’utilisation chez l’homme. Aucune méthode alternative à l’utilisation d’animaux n’est possible; les systèmes de bioréacteurs in vitro n'étant pas assez avancés pour réaliser le projet. Seul un modèle animal vivant permet de nos jours la génération d'une construction osteo-cutanée transplantable selon les principes du bioréacteur in vivo.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, l’utilisation de rat Fischer mâles permet un prélèvement de moelle osseuse plus important sans devoir prélever sur tous les rats. Une analyse statistique a été réalisée afin de déterminer le nombre minimal de rats nécessaire pour obtenir un effet statistique : afin d’obtenir une puissance statistique pertinente (P = 95%, alpha 1%), le nombre d’animaux pour les procédures 1 et 2 a été évalué à à 14 et 8 par groupe (4 groupes soit 32 rats). Un animal supplémentaire par groupe est requis afin de pallier les possibles complications expérimentales. 3 groupes de 10 rats avec 6 rats pour le matériel médullaire seront nécessaires pour la procédure 4 afin d'atteindre une puissance statistique suffisante.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans un cycle jour/nuit un cycle jour/nuit saisonnier (e.g., 12h/12h/ été, 8h/14h hivers) avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 2 pour limiter le stress de la surpopulation ou de l’isolement. Des tunnels pour les rats seront placées dans la cage pour permettre aux animaux de s’enfouir et se cacher. Chaque protocole a été choisi pour répondre à une question précise, par sa reproductibilité afin de réduire la variabilité expérimentale et par conséquent le nombre d’animaux utilisés par expérience. Le protocole sera interrompu le plus tôt possible en accord avec des points limites définis et réalisés sur le plus petit nombre d’animaux possible suffisant pour obtenir une différence statistiquement significative. La fréquence des inspections sera faite tous les jours pour ce protocole. S’ajoute à cette observation une surveillance réalisée par les animaliers lors de l’entretien des animaux. La prise en charge de la douleur des animaux sera réalisée par injection en sous cutanée de lidocaïne et de buprénorphine dès l’anesthésie et ceci avant le geste opératoire (injection répétée toutes les huit heures pour la buprénorphine pendant deux jours si besoin). Des AINS seront administrés de manière systématique pendant au moins deux jours.
Choix des espèces
Le rat permet une première approche in vivo avant de tester les hypothèses confirmées avec ce modèle sur des animaux plus similaires à l’Homme, puis chez l’Homme. C’est un modèle de référence pour la recherche fondamentale dans le cadre d’implantation allogénique afin de se concentrer sur l’effet propre des biomatériaux évitant toute réponse immunitaire non désirée et permet de sélectionner les méthodes efficaces de réparation au sein d’un grand nombre de conditions expérimentales. Les études seront réalisées avec des rats adultes, c'est-à-dire, âgés de 10 semaines (300g), ce qui correspond au modèle validé et développé depuis plusieurs années dans notre laboratoire et dans la littérature.
Développement d’un dispositif de détection automatisée des chaleurs chez la chèvre
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système urogénital
30 chèvres vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes maintenues dans l'élevage et réutilisables ensuite. Chaque chèvre reçoit deux injections dans le muscle, avec des prélèvements de lait faits à la traite, pour mettre au point un dispositif à puce RFID détectant automatiquement les chaleurs. Le porteur décrit une douleur légère de quelques secondes à l'injection et un stress léger à la contention. Il présente ce dispositif comme un moyen de faciliter l'insémination après "effet mâle" et de réduire le recours aux hormones dans l'élevage caprin.
Objectifs
Chez les ovins et caprins, il existe au cours de l’année une période d’activité sexuelle maximale (saison sexuelle), en général d’août à janvier, et une autre d’activité minimale ou de repos sexuel, en général de février à juillet. Cette saisonnalité de la reproduction conduit à des variations annuelles dans la disponibilité des produits (lait/viande), la reproduction hors saison sexuelle (désaisonnement) est alors une solution pour maintenir l’offre toute l’année. Le traitement hormonal d’induction et de synchronisation des chaleurs et des ovulations est aujourd’hui la pratique la plus efficace pour désaisonner la reproduction. Or, le contexte sociétal et réglementaire incite fortement à la recherche de méthodes alternatives réduisant voire excluant l’utilisation d’hormones, pour synchroniser les chaleurs des femelles. La pratique de « l’effet mâle » est une solution alternative permettant l’Insémination Animale (IA) hors saison sexuelle. En effet, « l’effet mâle » consiste à induire l’activité ovulatoire des femelles en anoestrus saisonnier (repos sexuel) par leur exposition à des mâles sexuellement actifs. Toutefois, son utilisation en élevage est freinée par la moindre synchronisation des chaleurs obtenue (en comparaison à celle obtenue après un traitement hormonal). C’est pourquoi la détection des chaleurs est recommandée après « effet mâle », afin d’inséminer les femelles au bon moment du cycle sexuel et obtenir une fertilité satisfaisante. Or cette détection est chronophage pour les éleveurs. L’objectif du projet est de développer un dispositif permettant d’automatiser la méthode de détection des chaleurs préconisée sur le terrain afin de pratiquer l’IA.
Bénéfices attendus
Nous cherchons à faciliter la mise en oeuvre par les éleveurs caprins d’une mise à la reproduction des chèvres par insémination animale (IA) après induction et synchronisation des chaleurs par « effet mâle ». Nous développons un dispositif simple et utilisable sur le terrain, permettant de détecter la boucle d'identification réglementaire portée par les chèvres à l’oreille (boucle contenant une puce RFID = identification par radio-fréquence) afin d'automatiser la détection des chaleurs et ainsi déterminer le moment d’IA optimum pour une bonne fertilité. En effet, Les chèvres en chaleurs sont attirées par les boucs : ceux-ci sont placés derrière une barrière avec l'antenne de lecture du dispositif, ce qui permet d'enregistrer automatiquement toutes les visites (nombre et durée) des chèvres en chaleurs auprès des boucs.
Procédures
Trente chèvres recevront chacune 2 injections par voie intra-musculaire à la base de l'encolure (une injection dure quelques secondes).
Impact sur les animaux
Lors des injections par voie intra-musculaire (au total 2 injections/chèvre), les chèvres pourront ressentir une douleur légère de très courte durée (quelques secondes), sans altération de leur état général (parfois, un hématome peut se former, régressant spontanément). Un stress léger pourra être ressenti par les chèvres lors de la contention pour les injections.
Devenir
Tous les animaux restent dans l'élevage. Ils pourront être réutilisés dans d'autres projets sous réserve d'un avis favorable du vétérinaire sanitaire de l'établissement utilisateur.
Remplacement
Ce projet concerne la détection des chaleurs lors de la mise à la reproduction de chèvres en conditions d’élevage. Il ne peut être réalisée qu’avec l’utilisation d’animaux vivants.
Réduction
Le projet utilisera 30 chèvres. Dans la conduite habituelle de l’élevage caprin de l’établissement utilisateur, un lot physique est un groupe de chèvres élevées ensembles dans un même enclos et mises à la reproduction au même moment. L’effectif de 30 chèvres/lot est donc choisi en fonction du nombre de chèvres habituellement hébergées/lot physique. Nous décrirons la cinétique des venues en chaleur de ces 30 chèvres.
Raffinement
Les chèvres seront dans leurs conditions d’élevage habituelles (en groupes) dans un bâtiment d’élevage conventionnel sur litière paillée (respectant une surface minimale de 1.5 m²/chèvre) et feront l’objet d’une surveillance journalière pendant toute la durée du protocole. Le milieu d’élevage est enrichi avec une brosse rotative par lot, des tapis (Grat'o gratte®) positionnés sur les claies pour se gratter les flancs et des disques suspendus à mordiller. Pour les injections par voie intra-musculaire (concernant 30 chèvres), la contention sera faite par des expérimentateurs animaliers, dont la présence journalière répétée en interaction positive (alimentation, traite, soins) est associée à une diminution du comportement de fuite des chèvres et donc de leur stress face à la contention. Les prélèvements de lait seront faits manuellement en salle de traite, ne nécessitant pas de contention supplémentaire. Une surveillance journalière de l’état général des animaux sera aussi réalisée. En cas de signes de maladie (fièvre >40°C, problèmes respiratoires, décubitus prolongé sur 48 h, anorexie, perte de poids >15%...) un traitement adapté (antidouleurs, antiinflammatoires, antibiotiques) sera mis en place par les animaliers selon le protocole de soins établi par le vétérinaire conseil de l’installation expérimentale ou avec son intervention si nécessaire.
Choix des espèces
Les caprins sont la cible d'application en élevage de ce dispositif de détection automatisée des chaleurs. Les animaux seront des chèvres adultes primipares et multipares en lactation.
Etude de l’exposition orale d’un cocktail de virus dirigés spécifiquement contre des espèces de bactéries (du genre Yersinia) avant son utilisation chez l’homme.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent dans leur eau de boisson un mélange de huit virus mangeurs de bactéries (bactériophages), avec surveillance clinique et recueil de selles pendant quatre semaines, puis une prise de sang sous anesthésie, pour vérifier l'innocuité de ce produit avant un essai chez des malades de Crohn. Le porteur affirme n'attendre aucune douleur et juge les bactériophages inoffensifs pour les mammifères, mais prévoit tout de même de tuer les souris pour prélever organes et selles. Il indique que les agences réglementaires imposent cette vérification sur des organismes vivants, sans alternative possible.
Objectifs
Les bactériophages sont des virus qui possèdent la particularité de n’infecter que les bactéries et sont spécifiques de l’espèce bactérienne qu’ils attaquent. Certains bactériophages sont déjà utilisés chez l’homme sur les aliments ou à visée thérapeutique dans les infections à bactéries multirésistantes. Nous souhaitons utiliser un nouveau mélange de huit bactériophages sur l’alimentation humaine à visée de prévention des poussées inflammatoires chez les malades de Crohn. La maladie de Crohn est une maladie inflammatoire chronique intestinale qui touche environ 60.000 personnes en France et plusieurs millions de personnes dans le monde. Ce travail vise à vérifier l’innocuité de ce mélange de bactériophages chez l’animal avant de l’utiliser chez l’homme. Il comportera une surveillance clinique et une analyse du microbiote fécal (ensemble des microorganismes vivant dans les fèces) chez les souris exposées au cocktail de bactériophages dans leur eau de boisson comparées aux souris contrôles.
Bénéfices attendus
Ce travail a pour objectif de vérifier l’absence de toxicité d'un mélange de bactériophages chez l’animal avant son utilisation chez l’homme. Il permettra de mettre en place un essai clinique chez les malades atteints de maladie de Crohn. En cas de succès, ce travail permettra de réduire l’activité de la maladie avec des bénéfices directs pour le malade : réduction du nombre de poussées inflammatoires, réduction du nombre de complications et réduction d’exposition à des médicaments immunosuppresseurs. Ce travail permettra aussi de réduire le coût collectif de la maladie en termes de nombre d’hospitalisations et de coût des traitements.
Procédures
Une surveillance clinique (aspect, comportement et pesée) sera réalisée deux fois par semaine et le recueil de selles une fois par semaine pendant 4 semaines. Lors du recueil de selles, l’animal sera isolé dans une boite en plastique pendant 30 minutes maximum. A la fin de la procédure, un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane.
Impact sur les animaux
Aucune douleur n’est à attendre. Les bactériophages sont des virus qui possèdent la particularité de n’infecter que les bactéries et sont spécifiques de l’espèce bactérienne qu’ils attaquent. Ils sont réputés inoffensifs pour les organismes tels que les mammifères (humains, animaux).
Devenir
Afin de vérifier l’innocuité des bactériophages, les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les différents organes et les selles.
Remplacement
Les bactériophages sont des organismes vivants. Les agences règlementaires en France demandent donc de vérifier leur innocuité avant leur utilisation chez l’homme. Nous ne pouvons donc nous affranchir de l’utilisation d’organismes vivants, aucune alternative de remplacement ne peut être envisagée. Cependant des techniques pour déterminer la concentration en bactériophages ont été préalablement mises au point in vitro, afin de remplacer autant que possible l'utilisation de ces animaux.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point du vue de l’analyse statistique .
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement pendant toute la durée du protocole par du personnel compétent. Tout au long de la procédure, tous les animaux seront évalués cliniquement 2 fois par semaine pour chaque animal. Ce score (prenant en compte la variation du poids de l’animal, son apparence, le changement de comportement) permettra de prendre des mesures progressives (points limites) en fonction de l’élévation du score (augmentation de la fréquence des observations, administration de solution saline pour lutter contre la déshydratation, euthanasie précoce). L’environnement des animaux sera enrichi afin de leur permettre d’avoir un comportement le plus naturel possible (cotons, maisons, cycle jour/nuit).
Choix des espèces
La souris est un animal vertébré dont l’anatomie et la physiopathologie de l’infection par voie orale sont suffisamment proches de celle de l’homme pour autoriser l’étude des thèmes mentionnés plus haut. La souris est l’espèce la plus utilisée par la communauté scientifique internationale dans la thématique de l’infection par voie orale. Nous utiliserons les animaux à l’âge adulte entre 6 semaines et 8 semaines d’âge car le microbiote intestinal est stable chez la souris à partir de 6 semaines.
Exposition périnatale au THC et au CBD et neurodéveloppement : Enquête sur le rôle du système endocannabinoïde
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
1 710 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes reçoivent pendant vingt-trois jours des injections de THC ou de CBD, et leur descendance passe des tests comportementaux de reconnaissance d'objet, de mémoire spatiale et d'apprentissage lié aux goûts et aux odeurs, une partie subissant en plus une chirurgie du cerveau avec photométrie par fibre optique. Le porteur indique que la moitié des petits sont tués au sevrage et le reste après les procédures. Il affirme que la compréhension des effets d'une exposition périnatale au cannabis sur le neurodéveloppement passe par la souris, faute de modèle in vitro reproduisant cette complexité.
Objectifs
Le cannabis est la drogue illicite la plus couramment utilisée par les femmes enceintes. Le tetrahydrocannabinol (THC), principal composant psychoactif du cannabis, ainsi que le cannabidiol (CBD), le composé non psychotrope le plus abondant du cannabis, traversent le placenta et peuvent interagir avec les systèmes endocriniens. Par conséquent, d'un point de vue scientifique, la compréhension du rôle dynamique des récepteurs cannabinoid-1 (CB1) dans les processus précoces de développement du cerveau est une question importante dans le domaine intéressant et évolutif de la recherche sur l'exposition in-utero aux drogues psychotropes et aux substances d’abus. Le projet pourrait permettre d'identifier une relation encore inconnue entre l'exposition au THC ou au CBD le développement neuronale. En plus, l’étude de l'implication du récepteur CB1 au niveau mitochondrial permettra établir un lien entre l'apparition présumée d'anomalies fonctionnelles comportementales et la perturbation bioénergétiques. Enfin ce projet permettra l'établissement de nouvelles et meilleures cibles thérapeutiques pour les maladies qui sont impliquées dans les processus énergétiques du cerveau. Ce projet vise à disséquer la contribution d'une perturbation du système endocannabinoide avec injection des drogues (THC et CBD) au stade précoce du développement dans les mitochondries de différentes cellules cérébrales dans le traitement cognitif, fournissant des informations importantes qui peuvent être utilisées dans le développement de stratégies thérapeutiques pour traiter ces troubles cognitifs.
Bénéfices attendus
Dans l'ensemble, ce projet établit une approche globale qui fournira des preuves solides reliant l'exposition neurodéveloppementale aux cannabinoïdes (THC et CBD dans notre cas) et l'implication différente des CB1R cellulaires et subcellulaires dans l'apparition présumée d'anomalies fonctionnelles comportementales et bioénergétiques. Cela pourrait conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour l'intoxication prénatale au cannabis et ses conséquences.
Procédures
Les souris gestantes receveront des injection par voie sous-cutanée (durée totale de l'injection 1 minute, 1 fois par jour, durée totale de 23 jours) et gardé en vie jusqu’au sevrage du progénie. Ensuite, la moitié des animaux sera mis à mort. Une partie des souris issues de mères traité subiront des procédures comportementales (reconnaissance d'objet (dureé 3 jours, 1 fois), mémoire spatial (dureé 10 jours, 1 fois), apprentissage liée aux gouts et aux odeurs (durée totale de 10 jours, 1 fois)) à l'adolescence (semaine 5) ou à l’âge adulte (semaine 14). Ensuite les animaux seront mis à mort. Une partie des souris issues de mères traité subiront une procédure chirurgicale et photométrie par fibre (duré de 1 heure, 1 fois) et ensuite, 3 semaine après chirurgie, seront testées dans leur cage avec un protocole de détection à travers de la fibre optique (durée totale 30 minutes, 1 fois). A la fin de cette procédure, les souris seront mis a mort.
Impact sur les animaux
Les procédures de l’injection sous-cutanées peuvent provoquer du stress lié à l’injection, qu’en tous cas à des impacts légers sur l’état générale de l’animal, son comportement moteur et alimentaire sans présence de douleur chronique. Aussi les tests comportementaux peuvent induire du stress chez les animaux qui sont faible par rapport à leur état général. Néanmoins il peut y avoir des nuisances que peuvent générer des points limites bien décrit dans les procédures, surtout liée à la procédure chirurgicale et la récupération après chirurgie.
Devenir
Toutes les souris issue de la procédure d'injection sub-cutaneé seront gardé en vie jusqu’au sevrage des portées. Apres seront mise à mort. Les 1080 animaux qui subiront les procédures comportamentales seront mise à mort. Les 420 animaux qui subiront la procédure de photometrie par fibre seront mis a mort pour des analyses hystologiques.
Remplacement
A ce jour, l'étendue des connaissances concernant l'organisation des circuits neuronaux et neuromusculaires conservés chez les mammifères y compris l’homme et surtout leur plasticité ne permet pas la conception et la mise en place de simulations numériques fiables qui pourraient permettre d'étudier les changements qui se mettent en place. De plus, l’usage des invertébrés qui ont un système nerveux complètement différent serait inapproprié. Dans ce contexte il demeure nécessaire d'avoir recours à l'expérimentation animale. Pour comprendre les mécanismes complexes du neurodéveloppement et la façon dont l'exposition périnatale au THC et au CBD peut induire une altération à long terme des fonctions cognitives, qui dépendent du comportement actif du rongeur, nous ne pouvons pas utiliser des méthodes alternatives plus simples (cultures cellulaires in vitro, modèles informatiques in silico), car elles fournissent des informations trop limitées et ne peuvent pas reproduire toute la complexité d'un organisme vivant.
Réduction
Nous nous engageons à utiliser le nombre minimum d'animaux strictement nécessaire pour avoir des conclusions solides en utilisant des méthodes statistiques courantes (12-14 animaux par groupe). Il est important de noter que ce nombre inclut les pertes malheureuses (taux d'échec de 15%) lors des procédures neurochirurgicales. 12-14 c'est le nombre minimal d'échantillons permettant l'application de tests statistiques classiques dans le domaine, au regard du faible nombre d'individu par groupes expérimentaux, les analyses statistiques basées sur des tests non paramétriques (Wilcoxon, Mann- Whitney, Kruskal-Wallis, Friedman) seront privilégiées. Les nombres prévus permettent de garantir une bonne interprétation des résultats. Néanmoins, si l’expérience nous montre que les échantillons peuvent être réduits, ils le seront en conséquence.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages collectives avant manipulation ou individuelle après manipulation (pour les procedures de injection sub-cutaneé et de comportement), avec un milieu enrichi (matériel de nidification), dans des conditions optimales de température, humidité et lumière pour les souris. Les souris seront observées quotidiennement par un personnel qualifié ainsi que par l’expérimentateur, et ce, afin que des mesures d’analgésie et de bien-être soient prises immédiatement si nécessaire. La mise en place des points limites repose sur une évaluation de l'état général et comportemental des animaux comme expliqué dans les procédures.
Choix des espèces
A ce jour, l'étendue des connaissances concernant l'organisation des circuits neuronaux conservés chez les mammifères y compris l’homme et surtout leur plasticité ne permet pas la conception et la mise en place de simulations numériques fiables qui pourraient permettre d'étudier les changements qui se mettent en place. De plus, l’usage des invertébrés qui ont un système nerveux complètement différent serait inapproprié. Dans ce contexte il demeure nécessaire d'avoir recours à l'expérimentation animale. La souris représente le modèle idéal pour ces trois raisons : 1) Possibilité d’étudier des mutants pour une protéine donnée (ici le récepteur CB1), 2) Pour une reproductibilité et comparaison avec les résultats obtenus dans le laboratoire auparavant et la communauté scientifique plus large. 3) Les infrastructures sont équipées pour être destinées à l’étude des rongeurs. Les souris utilisées pour les expériences comportementales, des injections virales intracérébrales et photométrie en vivo seront âgées de 5 à 14 semaines. Les protocoles que nous avons établis seront développés à l'âge adolescente/adulte des souris en évitant les problèmes de développement et la variabilité associée. Cela nous permettra également de comparer avec d'autres études sur le terrain. De plus, comme nous n’attendons pas des différences entre les résultats de la progéniture femelle et mâle, nous utiliserons donc des souris mâles et femelles prouvant une vulnérabilité indépendante du sexe.
Elevage et maintien de souris transgéniques modèles pour l’étude du rôle pathogénique du stroma médullaire dans la leucémie myélomonocytaire chronique ou dans le contexte d’une hématopoïèse clonale.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
10 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la plupart tuées à l'issue et 280 transférées vers d'autres projets. Ce projet consiste à élever et maintenir des lignées transgéniques pour l'étude d'une leucémie, avec biopsie de l'oreille et pose d'un transpondeur RFID sous anesthésie locale. Le porteur indique que les reproducteurs sont tués après six portées au maximum et que les animaux au mauvais génotype non utilisables sont tués, les autres étant gardés vivants pour des projets de recherche autorisés. Il affirme que la plupart des expériences se font à partir de sang ou de moelle de patients et réserve le recours aux souris aux questions liées au vieillissement de la moelle "non réalisables chez l'homme".
Objectifs
Notre équipe explore les mécanismes physiopathologiques à l’origine d’une leucémie chronique appelée leucémie myélomonocytaire chronique. C’est une affection maligne associée au vieillissement de la moelle osseuse hématopoïétique, le tissu qui fabrique les cellules sanguines. C’est une affection sévère puisque l’espérance de vie est en moyenne de 2 à 3 ans après le diagnostic. Le seul traitement susceptible de guérir de cette leucémie est la greffe de cellules souches hématopoïétiques allogéniques mais ce traitement est souvent irréalisable compte tenu de l’âge des patients – en moyenne 70 ans et ne fonctionne pas très bien avec des rechutes fréquentes. Il n’y a pas de solution médicamenteuse efficace. L'objectif de ce projet est de développer et de maintenir des lignées transgéniques importantes pour répondre aux questions (gènes impliqués, pistes thérapeutiques nouvelles) que posent cette maladie, au nombre de 10 dans ce contexte, utilisées dans 3 projets autorisés différents.
Bénéfices attendus
Identification de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les leucémies aiguës mégacaryoblastiques pédiatriques.
Procédures
Une biopsie de tissu au niveau de l'oreille de 1 mm de diamètre, durée 15 secondes. Une injection de transpondeur RFID sous anesthésie locale, durée 1 minute.
Impact sur les animaux
La biopsie d'environ 1 mm de diamètre au niveau de l'oreille entraîne une douleur de courte durée. L'injection d'un transpondeur RFID de la taille d'un grain de riz sous anesthésie locale entraîne également une douleur de faible intensité. Ces interventions n'ont pas de conséquence à moyen ou long-terme.
Devenir
Réutilisés: animaux n'ayant pas le bon génotype transférés vers un autre projet- Euthanasie des reproducteurs après 6 portées au maximum et des animaux génétiquement modifiés non utilisables pour d'autres buts - Autres animaux gardés en vie pour utilisation continue dans des projets autorisés de recherche de l'équipe.
Remplacement
Aussi souvent que possible, les expériences réalisées dans ce programme le sont à partir de cellules de patients collectées lors de bilans de surveillance. Cependant, la réponse à certaines questions ne peut pas être obtenue chez l’homme ni dans des systèmes de culture cellulaire 2D ou 3D in vitro. Il s’agit de connaître 1)le rôle du vieillissement sur l’évolution de la composition de la niche médullaire (l’analyse de souris de génotype identique et d’âge variable permet de maîtriser ce paramètre considéré comme important puisque la maladie étudiée est une maladie directement liée au vieillissement, ce que révèle l’analyse génomique des cellules leucémiques des patients) 2)la dynamique de l’impact d’un clone leucémique sur la composition de la niche médullaire qui, elle aussi, nécessite des analyses répétées au cours du vieillissement, non réalisables chez l’homme. 3)l’impact d’un taux accru d'une protéine impliquée sur la croissance d’un clone leucémique et sa compétitivité vis-à-vis d’un clone sauvage est une troisième question à laquelle il n’est pas possible de répondre à partir d’échantillons issus de patients. Ces données doivent nous permettre d’évaluer l’utilité d’une approche thérapeutique visant à maîtriser la production de la protéine impliquée chez les patients lorsqu’un clone leucémique a été détecté. Dans ce programme de recherche, les animaux ne sont utilisés que lorsque la réponse aux questions générées par l’exploration de la leucémie étudiée ne peut être obtenue chez l’homme et par des expériences à partir de modèles in vitro : la plupart des expériences du programme de recherche sont réalisées à partir de prélèvement de sang ou de moelle obtenus de patients avec leur accord.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire a été calculé au plus juste en utilisant le calculateur d'élevage du laboratoire Jackson et en se basant sur l'expérience acquise avec ces lignées dans le passé. Les individus n'ayant pas le bon génotype seront , quand c'est possible, transférés à d'autres projets et utilisés.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d'une surveillance clinique quotidienne et d'un environnement enrichi en tout temps. Des points limites ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront hébergés en groupes de 5 avec un enrichissement de la cage (swizzlenest, barre à ronger, tunnel ou maison en carton). L'eau et la nourriture leurs sont proposés à volonté et lorsque les animaux présentent une faiblesse, un complément alimentaire (Dietgel) leur est proposé avec facilité d'accès.
Choix des espèces
Le choix de la souris est dicté : 1) par la bonne connaissance que nous avons de l’hématopoïèse murine qui reproduit de nombreux aspects de l’hématopoïèse humaine ; 2) la disponibilité de modèles génétiquement modifiés permettant de répondre aux questions que nous nous posons ; 3) son vieillissement relativement rapide, compatible avec les analyses envisagées Les biopsies et les identifications seront faites à 4 semaines.
Étude des fonctions génétiques et des caractéristiques épigénomiques des noyaux musculaires à la jonction neuromusculaire et à la jonction myotendineuse à l’aide d’AAV.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
2 832 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 2 560 dans des procédures classées en souffrance sévère, pour étudier les gènes de deux jonctions musculaires à l'aide de virus. Chaque animal reçoit des injections de virus adéno-associés, passe des tests de force de préhension nommés, String, Grip et Hanging, et parfois un exercice excentrique intense d'une heure, avant d'être tué pour prélever ses muscles. Le porteur écrit que les injections et les tests "ne causeront pas d'effets indésirables", tout en classant l'essentiel des animaux en gravité sévère et en évoquant des effets inattendus liés à la diffusion des virus dans d'autres tissus. Il affirme que ces expériences ne peuvent pas être menées in vitro et met en avant la réduction du nombre d'animaux permise par le criblage viral.
Objectifs
Habituellement, les cellules du corps humain ont un noyau par cellule. En revanche, les cellules musculaires squelettiques possèdent des centaines de noyaux à l'intérieur d'une seule cellule. Un sous-ensemble de ces nombreux noyaux remplit des fonctions spécialisées. Les noyaux situés dans la partie centrale des cellules musculaires sont en contact avec les motoneurones. Cette région est appelée la jonction neuromusculaire (JNM). La contraction de nos muscles commence au niveau de la JNM lorsque les motoneurones stimulent les cellules musculaires. Une JNM défectueuse est observée dans diverses maladies musculaires et peut entraîner de nombreux symptômes dévastateurs. Les noyaux situés aux extrémités des cellules musculaires sont en contact avec les tendons. Cette région est appelée jonction myotendineuse (JMT). Elle est responsable de l'amortissement de la force contractile du muscle. La JMT est la partie la plus touchée par les blessures lorsque nous faisons de l'exercice et revêt donc une grande importance pour la régénération et la réadaptation musculaires. Ces régions sont toutes les deux essentielles au bon fonctionnement du muscle squelettique, et il est nécessaire de mieux comprendre leur fonctionnement. Récemment, mon équipe a identifié de nombreux gènes qui ne sont exprimés que dans les noyaux de la JNM ou de la JMT. Cette découverte nous offre une nouvelle opportunité d'étudier la biologie de ces deux jonctions. Sur la base de ce contexte, nous avons deux objectifs dans ce projet. 1) Nous allons étudier les fonctions des gènes spécifiques de la JNM ou de la JMT que nous avons découverts. Nous injecterons dans le muscle des virus porteurs de petites séquences d’ARN ciblant les gènes d’intérêts qui réduiront leur expression lorsqu'ils sont présents dans une cellule. Si ces gènes jouent un rôle important dans la fonction de la JNM ou de la JMT, la perte de son expression entraînera des symptômes liés à une déficience de l’une ou l’autre de ces jonctions. 2) Nous isolerons des noyaux au niveau de la JNM ou de la JMT pour étudier plus en détail l'organisation des structures dans ces noyaux. Cela nous permettra de comprendre comment ils se spécialisent alors qu'ils se trouvent à l'intérieur de la même cellule. Pour ce faire, nous injecterons des virus exprimant des protéines fluorescentes uniquement dans les noyaux de l’une ou de l’autre de ces jonctions. La fluorescence nous permettra d'isoler ces noyaux.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra d'identifier de nouveaux gènes qui sont essentiels à la fonction de la JNM ou de la JMT et fournira également des informations sur la façon dont ces domaines musculaires sont formés. Cela présente de nombreux avantages dans les domaines de la biologie musculaire, de la biologie de l'exercice et des maladies qui provoquent des défaillances d’une de ces deux jonctions. La conception de notre projet a également pour avantage de réduire le nombre d'animaux utilisés. À terme, l'analyse complète de la fonction d'un gène nécessite la génération de lignées de souris génétiquement modifiées. Cependant, la modification génétique des souris est très longue et coûteuse, et il est donc difficile d'étudier tous les gènes par cette méthode. Dans notre étude, nous utilisons des virus pour réduire l'expression des gènes recherchés. Cela nous permet de tester rapidement la fonction d'un grand nombre de gènes candidats et d'identifier les gènes à privilégier pour une étude plus approfondie à l'avenir. Par conséquent, notre conception a l'avantage de réduire considérablement le nombre d'animaux par rapport à l'étude de chaque gène individuel par modification génétique.
Procédures
1. Injection intramusculaire, intraveineuse ou intrapéritonéale : Il s'agit d'interventions très rapides dont seule l’introduction de l’aiguille provoque une douleur. L'injection ne dure que quelques secondes et l'intervention sur chaque souris ne prendra que quelques minutes. Ensuite, elles retourneront dans leur cage d'origine. 2. Mesure de la force de préhension (String, Grip et Hanging) et entraînement ou non à l'exercice excentrique : Il s'agit de procédures non invasives durant lesquelles les souris ne souffrent pas. Les souris feront 1 série de mesure de la force de préhension et/ou non 1 entrainement à l’exercice excentrique une seule fois 4 à 10 semaines après l’injection de virus adéno-associés. Les mesures de force de préhension des 3 tests (String, Grip et Hanging) ne prennent qu’1 à 2 min par souris avec 10 min entre chacun des 3 essais/test et 20 min entre 2 tests. L’exercice excentrique comprend 3 jours de 15 à 20 min d’habituation suivi d’un jour d’exercice de 60 min comparable à un exercice physique intense. Elles seront ensuite euthanasiées 30 min, 1 jour, 2 jours et 3 jours après l’exercice excentrique ou immédiatement après les mesures de force de préhension pour les animaux qui ne feront pas l’exercice excentrique pour réaliser un suivi de la réparation musculaire.
Impact sur les animaux
Les procédures d'injection ou les tests de phénotypage musculaire eux-mêmes ne causeront pas d'effets indésirables. Cependant, comme la délivrance systémique de virus adéno-associés peut également diminuer l'expression des gènes candidats dans d'autres tissus que les muscles ciblés, des effets indésirables inattendus, en raison de leur faible musculature, pourraient être observés.
Devenir
Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons les biopsies musculaires de tous les animaux à la fin de chaque procédure. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçons pas et ne ferons pas adopter les animaux.
Remplacement
Les souris sont nécessaires pour ces expériences dans le but de nous permettre de comprendre les propriétés physiologiques des cellules musculaires après manipulation des gènes cibles. Les modifications génétiques qui ne sont possibles que chez la souris nous permettent d'étudier la fonction des gènes dans des conditions biologiques appropriées et donc la physiopathologie. Notre travail se concentre en particulier sur les sous-types nucléaires spécifiques à l'intérieur des cellules musculaires qui sont formés par l'interaction entre les cellules musculaires et d'autres types de cellules au niveau des JNM et des JMT. De plus il est impossible de mesurer les effets de la réduction de l’expression des gènes cibles sur la force musculaire avec une études réalisée sur des cellules. Ces expériences ne peuvent pas être réalisées in vitro car elles impliquent différents types de cellules et de structures complexes.
Réduction
Nous prenons plusieurs mesures pour réduire le nombre d'animaux utilisés. Mesure 1 : Avant d'injecter les virus capables de réduire l’expression des gènes d’intérêts chez les animaux in vivo, nous confirmerons leur efficacité dans des cellules en culture. Mesure 2 : La conception de notre projet présente l'avantage de réduire le nombre d'animaux utilisés pour les expériences. En effet, le nombre de nouveaux gènes candidats dont nous avons découvert l'expression dans les noyaux de la JNM ou de la JMT rend difficile l'étude de tous les gènes en générant des lignées mutantes. Par conséquent, le criblage des gènes candidats prometteurs par une étude utilisant des virus a pour avantage de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés à l'avenir. Mesure 3 : Pour un des objectifs, le prélèvement de l'échantillon de contrôle et de l'échantillon expérimental sera réalisé sur le même animal (par ex : muscle tibial antérieur gauche = contrôle et muscle tibial antérieur droit = expérimental) ce qui permettra de réduire de moitié le nombre total d'animaux utilisés. Mesure 4 : Pour les tests fonctionnels, de multiples expériences seront réalisées chez la même souris. Mesure 5 : Nous déterminerons la meilleure construction permettant de marquer les noyaux de la JNM ou de la JMT. Pour l'isolement de ces noyaux, nous injecterons les deux muscles afin de maximiser le nombre de noyaux extraits d'une souris. Mesure 6 : La puissance statistique a été utilisée pour calculer le nombre de souris minimum nécessaire afin de déterminer si une différence statistiquement significative existe entre 2 ou plusieurs groupes.
Raffinement
Au cours de notre projet, tout signe de douleur sera pris en charge par des mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé (0 à 3). Si une douleur est présente, elle sera traitée soit par l’administration d’un analgésique, soit par l’euthanasie prématurée des animaux concernés. Niveau 0 : aucune douleur, aucun inconfort détecté. Niveau 1 : douleur légère, dans ce cas les souris seront contrôlées quotidiennement. Niveau 2 : la douleur est présente, dans ce cas un analgésique sera administré à la souris et elle sera sous surveillance. Niveau 3 : douleur intense, dans ce cas un analgésique plus puissant sera administré et les animaux seront surveillés régulièrement. Ils seront euthanasiés prématurément si nécessaire pour éviter une douleur chronique. Après les procédures expérimentales, les souris seront suivies quotidiennement. Le suivi de nos souris comprend une observation du comportement général (perte de poids, apathie, yeux fermés) et de la paralysie des membres postérieurs. Pour les souris qui ont des difficultés à manger de la nourriture solide (croquettes), de la nourriture en gel sera placée dans la litière de la cage. Les procédures expérimentales seront effectuées sous anesthésie générale afin d'éviter toute gêne ou douleur qui pourrait en résulter. Les souris seront placées sur une plaque chauffante à 37°C pour éviter l'hypothermie et un gel oculaire sera appliqué sur les yeux pour éviter toute sécheresse.
Choix des espèces
Pour caractériser la physiologie du muscle, nous devons réaliser des expériences in vivo chez la souris car les modifications génétiques par injection de virus adéno-associés sont mieux établies dans ce modèle. Ces facteurs nous permettent d'obtenir un maximum de résultats par animal et de minimiser le nombre total d'animaux utilisés. En outre, le projet est basé sur nos récents travaux chez la souris qui ont permis de découvrir des gènes exprimés dans les noyaux de la JNM ou de la JMT. Par conséquent, la souris est le modèle le plus approprié pour ce projet. Pour les 2 objectifs, les injections de virus adéno-associés seront effectuées à l'âge de 2 à 3 mois (jeune adulte) car c'est le moment où nous avons caractérisé l'expression des gènes spécifiques de la JNM et de la JMT dans notre étude récente.
Surveillance écotoxicologique des vautours en France
- Conservation des espèces
- Protection de l’environnement
800 vautours sauvages vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, avant d'être relâchés sur place. Chaque oiseau est capturé à la nasse, maintenu les yeux bandés par deux manipulateurs et prélevé à la veine brachiale en cinq minutes, pour mesurer son exposition au plomb, aux pesticides et à d'autres toxiques. Le porteur indique que la capture peut stresser et le prélèvement induire une douleur faible, et transfère en centre de soin les oiseaux dont l'état empêche un relâcher immédiat. Il affirme qu'aucun remplacement n'est possible, l'objectif étant d'évaluer l'exposition d'individus sauvages d'espèces protégées comme le gypaète barbu.
Objectifs
Les intoxications ont précédemment été montrées comme étant l'une des principales causes de mortalité chez les rapaces charognards en France que ça soit par l'ingestion directe d'appâts destinés à d'autres espèces ou par l'ingestion de cadavres exposés à des pesticides, des rodenticides, des médicaments vétérinaires ou des métaux lourds comme le plomb. La présence d'espèces de vautour protégées, et dont certaines populations sont en danger critique d'extinction, justifie la nécessité de surveiller les menaces toxiques potentielles et d'identifier leurs sources afin de mieux lutter contre les menaces existantes et de détecter des menaces émergeantes. L'objectif principal de ce projet est donc d'étudier la présence de divers toxiques dans le sang chez des vautours vivants afin d'évaluer les risques toxiques auxquels ces vautours sont exposés. En parallèle, ces prélèvements sanguins pourront aussi servir à d'autres études épidémiologiques afin de limiter le nombre de prélèvements réalisés sur ces espèces.
Bénéfices attendus
Monitorer l’exposition des rapaces à de potentiels toxiques permettra d'améliorer les connaissances que nous avons de l'exposition globale à des toxiques de différentes espèces de rapaces en France et potentiellement de détecter de nouvelles menaces toxicologiques émergentes. Identifier la nature et ainsi que l'origine des menaces toxiques aidera par la suite lutter plus efficacement contre les menaces existantes et permettra d'évaluer l'apport des mesures de préservation mises en place contre ces menaces. Les connaissances acquises sur diverses espèces sentinelles pourront ensuite servir à la mise en place de politiques de protection et de conservation d'espèces protégées comme le gypaète barbu.
Procédures
Les animaux sont gardés dans une nasses le temps que tous soient manipulés un par un. Cela représente au maximum 3h durant l'été le temps mais les oiseaux peuvent parfois être gardé une nuit hors période de reproduction (automne/hiver) avant les manipulations. Dans le cadre de notre projet du sang est prélevé sur animaux vigiles. Le prélèvement est réalisé hors de la vue des autres animaux en maximum 5 minutes. L'individu prélevé à les yeux bandés, est maintenu par deux manipulateurs expérimentés avant d'être relâché immédiatement après.
Impact sur les animaux
Les captures sont suceptibles d'occasionner un stress et la prise de sang peut également induire une douleur faible.
Devenir
Tous les animaux seront relâchés afin de permettre leur suivi et le maintien des populations existantes. Dans le cas d'oiseaux dont le statut physiologique ne permet pas le relâché immédiat ceux-ci seront transférés en centre de soin pour une prise en charge avant relâché ulterieur.
Remplacement
L'objectif du projet est d'évaluer les toxiques auxquels sont exposés des populations de rapaces sauvages. Pour ce faire, les prélèvements doivent nécessairement être réalisés sur des individus sauvages non captifs représentatifs de leur population. Aucun remplacement n'est donc possible.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'individus capturés par espèce cible les prélèvements sanguins seront réalisés de manière opportuniste lors de captures effectuées dans le cadre de programmes de baguage et un seul prélèvement sera effectué par individu (chaque individu étant identifiable par sa bague et relâché immédiatement après la prise de sang). Le nombre d'oiseaux impliqués dans l'étude est basé sur l'estimation du nombre d'oiseaux habituellement capturés sur les différents massifs (30-40 individus) sur les 5 années du projet et correspond à un maximum d'oiseaux pouvant être prélevés. Le nombre d'oiseaux prélevés doit permettre une détermination plus sensible de l'exposition à des toxiques ainsi que l'étude des facteurs (géographique, temporel, âge, sexe, etc.) pouvant influencer cette exposition.
Raffinement
Les vautours sont capturés par nasses de façon passive afin de limiter le stress lié à la capture en elle-même. Les animaux sont ensuite sortis un par un pour être manipulés hors de la vue de leurs congénères. L'individu manipulé à les yeux bandés et est maintenu par deux manipulateurs expérimentés. Dans le cadre de notre projet le sang est prélevé sur animaux vigiles en 5 minutes maximum afin de réduire le temps de manipulation. Le choix du prélèvement sanguin plutôt que du prélèvement de plume, moins invasif, se justifie par le manque de fiabilité actuel des analyses et dosages de plombs sur les plumes du fait d'un manque de connaissance sur la cinétique de pousse des plumes et ainsi que des variations de concentration dans les différentes parties d’une même plume et entre différentes plumes. Afin de minimiser l'impact du prélèvement sanguin sur les oiseaux, celui-ci sera réalisé dans le respect des bonnes pratiques vétérinaires. Pour cela la ponction veineuse sera réalisée à la veine brachiale car cette veine est très apparente, de grosse taille et très facile à prélever. La peau autour de la veine est désinfectée à l’alcool 70° ou à la chlorhexidine avant prélèvement. Un point de compression avec un coton pendant 1 minute est ensuite effectué après avoir arrêté la compression (coagulation rapide). En cas d’hémorragie, une mèche de coalgan sera appliquée et maintenue 1 min supplémentaire. Le prélèvement n’excédera pas 5mL ce qui reste inférieur aux directives européennes relatives au volume pouvant être prélevé lors d'une prise unique (un vautour fauve faisant environ 10kg). Une fois les manipulations terminées l'oiseau est immédiatement relâché si son état physiologique le permet. Si l'état physiologique de l'animal ne permet pas le relâché celui-ci sera conduit dans un centre de soin spécialisé proche pour une prise en charge médicale.
Choix des espèces
Il s'agit d'étudier l'exposition à divers toxiques chez les vautours, les espèces les plus communes servant également d'espèces sentinelles pour les espèces les plus menacées. L’objectif serait donc de cibler principalement des vautours fauves, volants (adultes et immatures), sans considération particulière pour le sexe, à hauteur de 30-40 individus par massif par an. Cependant toutes les captures opportunistes des vautours moines, gypaètes et percnoptères, volants, sont également ciblées. Les individus volants, de par leur écologie, sont plus susceptibles d'être intoxiqués que les jeunes au nid et sont donc plus représentatifs du risque encouru par les populations de vautours.
Contraintes énergétiques du manchot royal pendant la reproduction: aspects comportementaux et éco-physiologiques
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
94 manchots royaux vont être utilisés, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré, avant d'être relâchés dans leur colonie. Sous anesthésie, chaque oiseau reçoit par chirurgie des sondes de température et des électrodes implantées, une biopsie de muscle pectoral et des prélèvements de sang, plus des loggers externes, pour étudier la plongée en apnée et le sommeil en mer. Le porteur indique qu'un individu équipé peut retarder son départ en mer et provoquer l'abandon de l'oeuf par son partenaire, et suit la survie et la reproduction à long terme grâce à une puce implantée. Il justifie l'étude d'une espèce protégée par des applications possibles "One Health", tout en rangeant la plupart des bénéfices dans la connaissance fondamentale.
Objectifs
L’étude des adaptations à des conditions extrêmes permet de découvrir des mécanismes fondamentaux impossibles à observer en se confinant aux modèles classiques. Notre approche est d’équiper l’animal sauvage de ‘bio-logger’ de mesure, évoluant librement in natura. Cette approche fondamentale en écophysiologie perdure à long-terme dans le cadre d’un programme de recherche mené au milieu de l’océan Indien, avec le modèle manchot royal (MR), spécialiste de la plongée en apnée et de l’épargne énergétique. Néanmoins, le réchauffement si rapide à ces latitudes australes impacte les MR des colonies étudiées, où leurs proies se concentrent plus loin au large et plus profondément. Une de nos hypothèses est que les MR de grandes tailles seraient plus adaptés à prolonger leur apnée en profondeur, un avantage décisif dans le contexte actuel pour la chasse et leur succès reproducteur. D’où la question (Q1) de l’effet de la taille sur l’efficacité énergétique des plongées ou du voyage en mer, des données maintenant accessible grâce à la mesure de la fréquence cardiaque via l’enregistrement en continu de leur électrocardiogramme. Le sommeil est un besoin essentiel pour l’animal (observé aussi chez les méduses), dont la fonction primaire serait une façon risquée (inconscience, donc risque de prédation) d’épargner l’énergie, avec chez les endothermes une association possible avec la thermorégulation. Rien n’est encore connu de la façon dont les endothermes dorment en haute mer et notre objectif est de tester cette hypothèse chez le manchot royal, aussi bien pendant son jeûne à terre que pendant son long voyage en mer. La question est de découvrir dans un premier temps (Q2) : ‘Comment ces manchots dorment (fréquence-durée-moment-qualité) à terre ou en mer et existe-t-il un lien avec leur thermorégulation ?’ Ceci grâce notamment à l’enregistrement de leur électro-encéphalogramme. Enfin, sachant que les stocks d’oxygène embarqués ont un rôle déterminant dans la capacité d’apnée, on se posera aussi la question (Q3) : Quelles sont les causes de la variabilité des capacités de transport et de stockage de l’oxygène chez le manchot royal ? Ceci grâce à un prélèvement unique de sang et de muscle pectoral. Nous profitons des périodes d’incubation à terre pour capturer-instrumenter sous anesthésie et relâcher dans la colonie ces individus, qui pourront récupérer de la chirurgie avant de partir en mer au retour de leur conjoint.
Bénéfices attendus
Trouver des applications biomédicales est une des justifications de l’expérimentation animale, surtout si cela concerne des individus d’espèces sensibles, vivants dans des espaces protégées, tels les manchots royaux des îles subantarctiques. C’est quelquefois le cas de nos recherches, avec par ex. la découverte ‘non-intentionnelle’ d’un antibiotique stomacal testé sur l’œil humain. Par ailleurs, envisager la santé humaine dans le paradigme ‘Une seule santé (One Health)’ devient évident et urgent : mieux comprendre les contraintes auxquelles sont confrontées les espèces ou des écosystèmes entiers, afin de réduire ces nuisances liées à l’homme, sera bénéfique pour leur santé, dont celle des humains. D’où le soutien de nos tutelles scientifiques pour nos approches fondamentales ou appliquées, sur le modèle manchot royal. Concernant l’hypothèse d’un lien positif taille/aptitude à l’apnée, via l’épargne énergétique (Q1) ou les pigments respiratoires (Q3), les bénéfices attendus de ces expérimentations sont plutôt dans le domaine de la connaissance fondamentale. Car si ce lien existe, cela ne veut pas dire que les MR vont pouvoir s’adapter assez vite. Il faudrait pour cela vérifier en parallèle l’héritabilité de ces traits et un effet positif sur le succès reproducteur des grands individus. C’est pourquoi des investigations dans le cadre d’un doctorat sont en cours via l’utilisation d’un Data-set de suivi à long-terme sur 30 années consécutives. Par ailleurs, le fait de mesurer la fréquence cardiaque instantanée pour quantifier la dépense d’énergie des manchots intéresse particulièrement un collègue spécialiste de l’arythmie cardiaque chez l’homme. Son objectif est de mieux comprendre ces aspects adaptatifs chez des espèces à locomotion verticale (le MR à terre) ou dans des contextes d’anoxie ou d’asphyxie (le MR en mer). Concernant les questionnements sur le sommeil (Q2), cette approche pourrait nous faire comprendre certains paradoxes de la phase de ‘repos’ de surface pendant la nuit en mer (phases courtes d’échappement de la thermorégulation). Mais surtout nous faisons le pari, avec l’un de nos collaborateurs et spécialiste internationalement reconnu dans ce domaine, qu’étudier cette fonction in natura, surtout dans le contexte si particulier du MR en haute mer, peut nous faire faire un grand pas en avant dans la compréhension des mécanismes ayant façonné cette fonction vitale, encore si imparfaitement étudiée dans sa diversité.
Procédures
La majorité des individus (entre 34/58 et 70/94) vont subir : (1) une capture (juste avant ou au début d’un jeûne d’incubation), précédée de 30min d’une sédation ; (2) un transport cagoulé (de 3min jusqu’à la salle d’intervention) ; (3) une anesthésie associée à une analgésie (de 25 à 100 min) permettant de pratiquer (4) différentes mesures et prélèvements (sang+ plumes) et marque colorée+ puce RFID à vie ; (5) la pose de 2 loggers fixés au plumage du dos; (6) la tunnélisation de sondes de température et électro-physiologiques (fréquence cardiaque, frisson thermique, sommeil) ; et (7) un réveil sur le lieu même de la capture. C’est pendant leur voyage en mer que les données de comportement et de physiologie sont enregistrées et elles ne seront récupérées qu’à leur retour dans la colonie, 20 j (en été) ou 40j (en hiver) plus tard. Tous ces individus seront recapturés 2-3 jours après avoir repris l’incubation, puis anesthésiés (25min max) pour décrocher les loggers et les sondes, puis remis au réveil sur leur œuf dans la colonie. Un sous-groupe de 24 individus subissant le cycle capture-pose équipement-voyage en mer et recapture-déséquipement est à part car : (i) la capture1 aura lieu au départ en mer et la pose d’un logger externe seul ne justifie pas d’anesthésie, alors que (ii) c’est seulement à la recapture au retour de mer qu’une anesthésie générale sera pratiquée (30min), pour réaliser une biopsie.
Impact sur les animaux
Les nuisances concernent potentiellement deux points : un effet handicap en mer et un effet post-procédure à plus long terme. Concernant les handicaps pendant le voyage où l’individu est équipé, nous avons pu rencontrer exceptionnellement dans le passé un problème de retard au ‘vrai départ en mer’, l’individu restant au voisinage de la colonie 5-7jours au lieu de moins de 24h après l’échange avec son conjoint, entrainant un échec reproducteur par abandon de l’œuf du conjoint (attendant trop longtemps le retour de l’individu équipé). Dans tous les cas, le fait de travailler sur des modèles animaux faisant partie d’une espèce protégée, et sur le territoire d’une réserve nationale, implique de mettre en place un suivi systématique du devenir de ces individus à moyen ou long-terme (survie), ainsi que leur succès reproducteur sur une période dépassant celle de l’expérimentation. De ce fait tous les individus anesthésiés sont équipés d’office d’une puce RFID interne à vie, ce qui peut permettre de les suivre à plus long-terme (plusieurs années) et mesurer des effets indésirables non perceptibles pendant la procédure.
Devenir
Cent pour cent des individus seront replacés en liberté en fin des procédures, leur succès reproducteur étant suivi jusqu’à la mue de leur poussin grâce à sa marque colorée.
Remplacement
Le principe général de cette étude est d’utiliser un modèle d’espèce sauvage évoluant dans son environnement naturel et dans un contexte extrême d’un point de vue énergétique : la plongée en grande profondeur en apnée et en eau froide chez des organismes à sang chaud. Il est en l’occurrence impossible de trouver une méthode de remplacement adaptée.
Réduction
Sur la base des connaissances précédemment acquises, le nombre d’individus étudiés a été déterminé au plus juste pour obtenir des résultats exploitables et statistiquement fiables.
Raffinement
1/ Anesthésie, médication et chirurgie. Un raffinement a été apporté à toutes les étapes de manipulation des oiseaux pour une réduction des risques de stress ou de la douleur de la capture au relâcher définitif ; d’infection en cours de chirurgie et les jours suivants, cela selon 3 protocoles d’anesthésie et de médication bien spécifiques. Les gestes de ‘tunnélisation’ sont maitrisés depuis >15 ans pour les mesures de la fréquence cardiaque et du frisson thermique. Dans le cas de l’implantation d’électrodes sur la tête (étude du sommeil), l’approche utilisée ici est le résultat d’une collaboration avec des spécialistes du sommeil chez les oiseaux. En été antarctique 2019, des collègues ont déployé avec succès 28 manchots à jugulaire partant pendant 2j en mer, ce qui nous permet de proposer ici des protocoles adaptés et raffinés. Notons enfin que des gestes ont été simplifiées pour ne pas cumuler sur l’individu un temps de chirurgie prolongé et limiter le nombre d’incisions.
Choix des espèces
Cette étude a pour objet de révéler des adaptations physiologiques encore inconnues en utilisant un modèle particulièrement adapté à sa niche écologique particulière : la plongée en apnée en eau froide chez les endothermes marins. Par ailleurs, l’approche qui nous semble la seule valide est d’étudier ces adaptations en équipant les individus pour un suivi in natura grâce au bio-logging. Cela suppose d’utiliser une espèce assez grande pour limiter le risque d’un handicap lié à cet équipement ; et d’avoir une très grande expérience de ce qu’il est possible de réaliser au niveau expérimental sans compromettre la qualité des résultats et risquer des nuisances pour les individus concernés. Seul le manchot empereur serait une espèce assez étudiée et aussi adaptée (voir plus), mais ce serait un non-sens étant donné le très faible effectif de la seule colonie d’étude accessible, en Terre Adélie. Il est de ce fait interdit d’utiliser ce modèle pour toute intervention de chirurgie expérimentale. Pour les trois procédures, le choix du stade de développement est celui des reproducteurs, donc adultes. Ce sont les seuls accessibles, dans la colonie de reproduction, pour pouvoir effectuer une séquence de capture-équipement, relâcher-voyage en mer-recapture-déséquipement et relâcher final.