Procédures légères
Effets d’inactivations ciblées des gènes foxl2b sur le sexe de la truite
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
1 204 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour inactiver le gène foxl2 et étudier son rôle dans la différenciation sexuelle. Le protocole produit des oeufs microinjectés, génotype les alevins par prélèvement d'un fragment de nageoire, puis croise les individus pour obtenir des lignées mutantes analysées après mise à mort. Le porteur indique attendre peu de souffrance, l'inactivation d'un gène gonadique provoquant surtout une inversion sexuelle, et tue tous les animaux pour prélever leurs gonades. Il présente cette recherche fondamentale comme pouvant ouvrir des applications de "contrôle sexuel" en aquaculture des salmonidés.
Objectifs
La duplication ancestrale et complète du génome des salmonidés a profondément façonné́ la structure et le contenu en gènes des génomes des salmonidés. L’évolution de la fonction des gènes issus de cette duplication est importante à la fois d’un point de vue fondamental et finalisé. Ce projet a pour but d’explorer dans quelle mesure ces gènes dupliqués peuvent être redondants au niveau de leur fonction en utilisant, comme un cas d’étude, une approche d'inactivation ciblée d’un gène dupliqué et conservé en deux copies chez la truite arc-en-ciel, le gène foxl2. Ce gène est un gène conservé qui est impliqué́ dans le développement ovarien et la différenciation du sexe chez les vertébrés. Le projet génèrera des lignées de truite arc-en-ciel chez lesquelles les deux copies du gène foxl2 seront inactivés soit individuellement, soit simultanément, et ce de façon à comprendre quels sont les rôles respectifs de chaque copie dans la différentiation et le développement de l’ovaire.
Bénéfices attendus
Les connaissances générées par ce projet nous permettront de mieux comprendre l’évolution des gènes dupliqués chez la truite arc-en-ciel. Ces résultats sont particulièrement importants d’un point de vue de la connaissance de l’évolution des gènes pour mieux comprendre le rôle des gènes en copies dupliquées chez les salmonidés. Sur le plan plus finalisé, une meilleure connaissance du devenir de ces gènes en double copie chez les salmonidés peut avoir de nombreux résultats pratiques à moyen et long terme. Par exemple, cette information peut être cruciale pour des programmes de sélection qui cibleraient une seule copie de ces gènes dupliqués. De plus, comme foxl2 est un gène clé pour la différenciation ovarienne chez les vertébrés, sa caractérisation fonctionnelle précise chez les salmonidés pourrait ouvrir de nouvelles opportunités pour un meilleur contrôle sexuel chez les salmonidés.
Procédures
Trois femelles et deux mâles seront utilisés pour la production d’œufs (3 fois 5 minutes) qui seront microinjectés pour générer 3 lignées de poissons. Ces animaux seront génotypés pour à partir d’un fragment de nageoire (une fois 1-2 minutes sur chaque individu) pour sélectioner des lots de 20 géniteurs présentant des mutations perte de fonction. Ces géniteurs seront marqués individuellement (une fois 2 minutes par individu). Différents croisements seront ensuite réalisés à partir de ces animaux pour produire des lignées non mosaiques puis homozygotes qui seront analysées aprés euthanasie sur la base de leur phenotype sexuel (macroscopique, histologique et moléculaire) et génotype (pour la mutation et pour leur sexe genotypique).
Impact sur les animaux
Le gène foxl2 est connu pour son rôle dans la différenciation et le développement ovarien. C’est un gène gonadique dont l’inactivation est peu susceptible d'induire de la souffrance, de l’angoisse ou du stress dans les lignées mutantes que nous souhaitons construire chez la truite arc-en-ciel. A notre connaissance, toutes les inactivations de foxl2 effectuées jusqu’à maintenant montrent que foxl2 est un gène clé́ pour la différenciation des cellules de la granulosa et pour le maintien des ovaires avec un phénotype d’inversion sexuelle partielle ou complète des gonades. C’est par exemple le cas chez le tilapia du Nil qui est la seule espèce de poisson où ce gène a été́ inactivé, et ou le phénotype rapporté chez les femelles mutantes homozygotes est une inversion sexuelle complète. Aucune différence dans l'histologie gonadique n'a été́ trouvée entre les animaux contrôles, les animaux mutés à l’état hétérozygote (pas d’inversion du sexe) et les mutants homozygotes (complètement inversés). Nous nous ne nous attendons donc pas sur la base des analyses de la littérature à ce que ces mutations chez la truite conduisent à une souffrance physiologique ou un stress. Nous serons néanmoins attentifs à des éventuels phénotypes dommageables par une observation régulière des poissons issus de ces lignées mutées, en recherchant notamment des critères phénotypiques comme l'apparition d'un gonflement abdominal, ou comportementaux (nage, alimentation, position dans le bac) afin de réajuster notre protocole éthique si un phénotype dommageable ou de stress était observé.
Devenir
Aprés chaque procédure tous les animaux utilisés seront euthanasiés et les animaux euthanasiés des lignées finales non mosaiques seront eux utilisées pour des prélèvements d'organes nécessaires aux analyses (gonades pour analyses histologiques et moléculaires).
Remplacement
L’objectif de ce projet est d'explorer l'effet de ces différentes mutations foxl2 sur le phénotype sexuel adulte. La gonade étant un organe complexe et aucune alternative in vitro ou in silico pour ce type de recherche n'est actuellement disponible.
Réduction
Les effectifs de poissons expérimentaux (femelles pour la production d’œufs, embryons injectés et alevins génotypés) seront réduits au maximum et nous favoriserons le génotypage précoce des individus potentiellement porteurs de mutations, à un stade embryonnaire non autonome (alevins avant la première prise alimentaire). Ce génotypage précoce permettra de ne conserver que 10 à 20 individus par lignée porteuse de mutation(s) à l'âge adulte.
Raffinement
Les procédures de raffinement seront basées sur l'utilisation appropriée des anesthésiques pendant toute la procédure d'échantillonnage (par exemple, une anesthésie non létale avec de la tricaïne avant tout échantillonnage ou manipulation des poissons). Les animaux seront enlevés dans les conditions optimales de l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité et alimentation). Tous les prélèvements se feront selon des procédures établies et approuvées par la structure bien-être. Nous nous ne nous attendons donc pas sur la base des analyses de la littérature à ce que ces mutations chez la truite conduisent à une souffrance physiologique ou un stress. Nous serons néamoins attentifs à des éventuels phénotypes dommageables par une observation régulière des poissons issus de ces lignées mutées, en recherchant notament des critères phénotypiques comme l'apparition d'un gonflement abdominal, ou comportementaux (nage, alimentation, position dans le bac) afin de réajuster notre protocole éthique si un phénotype dommageable ou de stress était observé.
Choix des espèces
Notre étude portant sur le devenir des gènes issus de la duplication specifique du génome des Salmonidés, la truite est donc une des espèces sur laquelle nous pouvons développer ce projet. Cette espèce est une espèce robuste dont l'élevage et la reproduction sont bien maitrisés en pisciculture (et dans nos installations expérimentales). L'espèce est grégaire et supporte des densités d'élevage importantes. C’est une des espèces de salmonidés les plus élevés avec le Saumon Atlantique. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusée dans la communauté scientifique (environ 50 000 références). La production des oeufs se fera à partir de femelles sexuellement matures et ovulantes. Les génotypages se feront au stade oeillé ou alevin. Ils seront réalisés le plus tôt possible pour limiter le nombre de prélèvements sur des animaux au stade autonome.
Electrorétinographie et thérapie génique chez des souris modèles de myopathie de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
744 souris modèles de la myopathie de Duchenne vont être utilisées, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés et sans réveil pour une partie. Sous anesthésie, elles reçoivent des injections intraoculaires et intraveineuses et des enregistrements d'électrorétinogrammes par électrodes posées sur la cornée, après un test comportemental en environnement nouveau, pour étudier les troubles visuels de la maladie et une thérapie génique. Le porteur indique que les injections oculaires peuvent provoquer déshydratation, ulcère de la cornée ou cataracte, et que les souris sont tuées pour analyser leurs rétines, 80 individus surnuméraires étant gardés pour la reproduction. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro ou in silico pour ces tests fonctionnels.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est causée par des mutations du gène DMD qui conduisent à une dégénérescence musculaire pouvant être associée à des troubles cognitifs et divers autres troubles sensoriels et cérébraux. Les patients atteints de DMD peuvent notamment développer des rétinopathies. Ce projet a pour but de mieux comprendre le rôle des protéines de la famille des dystrophines, qui sont impliquées dans cette maladie et présentes dans la rétine, d’étudier les conséquences pathologiques de leur perte chez des souris modèles de la DMD, et les possibilités de traitement basés sur des approches de thérapie génique. Ce projet est important pour le diagnostic et le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement des troubles affectant le système nerveux dans la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD).
Bénéfices attendus
Les patients atteints de DMD peuvent développer une rétinopathie proliférative, une cataracte, des anomalies de l'électrorétinogramme (ERG), une altération de la sensibilité aux contrastes, des pertes de vision des couleurs et des seuils élevés de détection des stimuli visuels dans l'obscurité. Ces troubles ont été très peu étudiés mais ne peuvent plus être aujourd’hui considérés comme secondaires, car vu l’évolution des thérapies et prises en charge dans cette maladie, la durée de vie des patients s’accroit considérablement et les troubles affectant le système nerveux prennent progressivement une place de plus en plus importante dans la vie des patients. La présence et la sévérité des troubles sensoriels et cérébraux semblent liées à la position des mutations dans le gène et au nombre de protéines impactées (plusieurs protéines dystrophines sont produites par ce gène), et une meilleure connaissance des effets de différentes mutations a donc un intérêt diagnostique majeur qui permettra d’anticiper la sévérité et l’évolution des troubles sensoriels et cognitifs dans cette maladie. Ces évaluations sont très rarement effectuées chez les patients, d’où les connaissances très parcellaires de ces dysfonctions. De plus, les approches thérapeutiques développées ces dernières années et actuellement en phase d’essai clinique ont principalement été validées pour leurs effets sur les muscles, mais leur capacité à améliorer les fonctions liées au système nerveux restent très peu étudiée. Il est donc important d’apporter des réponses à ces questions au cours d’études précliniques sur des modèles animaux de la maladie, porteurs de différentes mutations. Les résultats de ce projet permettront ainsi de préciser les relations entre mutations et sévérités des déficits visuels. Nous évaluerons également si ces troubles sont sensibles aux thérapies géniques actuellement disponibles et s’ils peuvent servir de marqueur, non seulement pour le diagnostic, mais aussi pour suivre de manière peu invasive l’impact d’un traitement sur le système nerveux. Le cas échéant, ce projet aura démontré que l’évaluation des fonctions visuelles a un intérêt majeur en clinique pour cette maladie.
Procédures
Test comportemental : 3 essais quotidiens de 10 min espacés d’une heure, pendant 3 jours – Animal placé dans un environnement nouveau et libre de ses mouvements sur une surface de 8 cm2 au cours de chaque essai. Anesthésie générale et placement d’électrodes (lentilles de contact sur la cornée et électrode sous-cutanée), enregistrement d’électrorétinogrammes (30 min). Anesthésie générale et analgésie pour injections intraoculaires (intra-vitréennes) : durée de l’injection inférieure à 3 min. Anesthésie générale pour injections intraveineuses (sinus retro-orbitaire) : durée de l’injection inférieure à 1 min.
Impact sur les animaux
Le phénotype dommageable potentiel dans ces lignées à cet âge est de l’anxiété et une plus forte réactivité au stress, de manière temporaire en fonction des conditions et évènements. Le test comportemental peut potentiellement induire un léger stress, dû à l’introduction dans un environnement nouveau et à la surface limitée de mouvement (8 cm2). Les injections intraoculaires et les enregistrements électrophysiologiques sont susceptibles d’induire une déshydratation oculaire, un ulcère de la cornée ou une cataracte.
Devenir
A la suite des tests comportementaux et des électrorétinogrammes, et après une période de récupération (1 semaine) les animaux seront euthanasiés pour prélèvements et analyses de leurs rétines pour préciser les bases cellulaires des altérations visuelles. Suite aux expériences incluant un traitement par thérapie génique, et après une période de récupération (1 semaine) les animaux seront euthanasiés pour prélèvements et analyses de leurs rétines pour vérifier et quantifier la réexpression des dystrophines induites par les traitements. Une partie des femelles et mâles surnuméraires sera gardée en vie et utilisée pour former de nouveaux accouplements (n=80), les autres seront euthanasiées.
Remplacement
Les recherches précliniques pour ces pathologies n’ont pas de modèle in silico ou in vitro et sont initialement menées sur des souris. Notre projet a pour but d’effectuer des tests fonctionnels qui nécessitent l’utilisation d’animaux vivants. Les traitements les plus prometteurs sont habituellement testés dans une seconde étape sur de plus gros mammifères, par nos collaborateurs ou d’autres laboratoires, avant d’envisager leur entrée en phase d’étude clinique si on pense qu’ils peuvent conduire à de nouveaux médicaments.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour une démonstration statistique convaincante des objectifs. Sur la base de nos récentes études, la réussite des expériences nécessite 12 souris par groupe expérimental. Nous utilisons des tests statistiques adaptés aux petits échantillons et des analyses statistiques régulières en cours d’expérience permettent d’interrompre éventuellement l’expérience avant d’atteindre l’effectif maximal. De plus, nous utilisons une approche longitudinale permettant d’obtenir les données comportementales, électrophysiologiques et morphologiques à partir d’un même groupe expérimental ; pour les injections intra-vitréennes, un seul œil est traité par souris, l’autre œil servant de contrôle interne non-injecté pour évaluer les effets de l’injection en évitant un groupe supplémentaire ; la répétition des mesures qui sont ensuite moyennées au sein de chaque expérience permet de réduire encore la variabilité et donc le nombre d’animaux. Un nombre réduit de souris non atteintes par la pathologie sera utilisé dans des groupes servant à contrôler les effets des injections. Alors que certaines procédures impliquent la comparaison de 4-5 modèles porteurs de mutations différentes, l’approche thérapeutique se focalise sur 2 souris modèles, l’une présentant les altérations les plus sévères, l’autre étant représentatives d’une importante population de patients. Enfin, l’expérience basée sur l’administration périphérique du traitement ne sera effectuée que si la procédure précédente a montré des effets thérapeutiques encourageants. L’ensemble de ces mesures permet de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés dans l’ensemble du projet.
Raffinement
Les injections/anesthésies, la récupération post-opératoire et les études fonctionnelles ont été optimisées en concertation avec notre vétérinaire. Elles comprennent une anesthésie/analgésie générale et locale au niveau de l’œil, une prévention de la déshydratation oculaire et un collyre cicatrisant antibactérien et anti-inflammatoire en fin d’expérience pour éviter notamment les risques d’ulcères cornéens. Toutes les manipulations sont effectuées par des personnels qualifiés parfaitement formés aux procédures mis en place dans ce projet, et le taux d’échec des expériences est très faible. Afin d’évaluer si un animal présente néanmoins des signes de souffrance ou d’inconfort, nous avons prévu un suivi quotidien et post-opératoire avec des grilles d’observations spécifiques, et mis en place des critères d’arrêt précis avec prise en charge des animaux le cas échéant (arrêt de la procédure, soins, ou euthanasie) en concertation avec notre vétérinaire, la cellule bien-être animal et l’équipe zootechnique. Les conditions d’hébergement sont enrichies jusqu’à la fin du projet et les souris expérimentales sont maintenues en groupe sociaux par fratrie. L’état général des animaux est suivi quotidiennement et en cas de signes de souffrance ou d’inconfort, des mesures correctives sont prévues selon un protocole mis en place avec notre vétérinaire référent.
Choix des espèces
Les explorations précliniques dans le cadre de cette pathologie sont menées sur des souris. D’autres modèles animaux de la DMD existent (rat, chien, porc), mais seule l’espèce souris permet actuellement de disposer de différents modèles mutants ou transgéniques porteurs de mutations variées et représentatives des sous-groupes de patients montrant des variations dans la sévérité des symptômes. Les souris modèles dans ce projet sont toutes sur un fond génétique spécifique, nous utiliserons donc aussi des mâles de cette souche provenant d’un éleveur agréé afin d’effectuer des croisements en « backcross » pour éviter toute dérive génétique au cours du projet. Les souris jeunes adultes seront étudiées (minimum 6-8 semaines). Des résultats récemment publiés montrent par exemple qu’en injection intraoculaire, l’ensemble de la rétine est ciblé par nos outils de thérapie génique après injection chez des jeunes adultes. Les électrorétinogrammes en condition basale ne seront pas effectués avant 8 semaines, car les réponses ne sont stables qu’à partir de cet âge, et il est important de ne pas inclure des variations liées à l’âge qui pourraient compliquer nos conclusions sur les effets des traitements.
Impact des pesticides sur le neurodéveloppement et leur rôle dans l’apparition de troubles du spectre autistique
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
2 376 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour étudier le lien entre pesticides et troubles du spectre autistique. Les femelles gestantes reçoivent un cocktail de trois pesticides à faible dose et subissent une chirurgie pour insérer des marqueurs fluorescents dans le cerveau des embryons, et la descendance passe des tests comportementaux nommés, vocalisations, interaction sociale et tests moteurs. Le porteur indique attendre chez les petits des retards de développement, des défauts d'interaction sociale et des stéréotypies, qu'il juge sans souffrance, et tue la descendance pour prélever les cerveaux. Il affirme que l'expérimentation animale est "indispensable", aucun modèle alternatif ne reproduisant selon lui la complexité du développement cérébral.
Objectifs
Une altération durant le développement du cerveau peut mener à l’émergence de troubles du neurodéveloppement parmi lesquels figurent les Troubles du Spectre Autistique (TSA) dont la grande variété des symptômes suggère une origine multifactorielle. Chez les individus atteints de TSA, des anomalies du développement du cerveau, et en particulier d’une partie appelée « cortex cérébral », ont été mises en évidence. L’objectif de notre projet de recherche est de déterminer l’influence de facteurs environnementaux, tels qu’une exposition chronique à des résidus de pesticides, sur le développement de ce cortex cérébral, dans un contexte de prédisposition génétique. Il consiste donc plus particulièrement à traiter des animaux susceptibles de développer un TSA avec un cocktail de pesticides à faible dose (dose réglementaire autorisée dans l’eau du robinet en Europe). Nous déterminerons ainsi l’impact de ces pesticides dans l’évolution de cette maladie. Notre étude permettra de mieux comprendre l’action de pesticides ingérés quotidiennement à faible dose sur le développement cérébral de souriceaux sains ou prédisposés à développer un TSA, et d’identifier les cibles pour lutter précocement contre les potentielles malformations cérébrales induites par les pesticides.
Bénéfices attendus
Ce travail permettra de caractériser l’impact d’une exposition à faible dose de pesticides sur le développement du cerveau pendant la gestation et la lactation sur des individus génétiquement prédisposés à développer un TSA (gpTSA). Cette étude aura un impact significatif car elle permettra d’identifier les stades du développement et les cibles cellulaires particulièrement sensibles aux facteurs environnementaux tout en caractérisant les défauts induits par ces polluants à l’échelle cellulaire ainsi que leur impact sur le comportement. De plus, elle offrira de nouvelles perspectives sur la précocité et l’étendue des effets délétères des polluants environnementaux sur le développement cérébral des individus sains ou gpTSA. Ces travaux permettront d’alerter sur l’impact délétère de l’ingestion chronique des polluants environnementaux même à des doses résiduelles tout en fournissant des pistes diagnostiques et/ou thérapeutiques pour lutter contre la survenue ou l’aggravation des symptômes associés aux TSA.
Procédures
Traitement des femelles/ femelles gestantes/ progénitures à une faible dose de 3 pesticides, 2 mois avant la mise en reproduction et jusqu'à la fin de l’expérimentation (environ 6mois). La première portée des femelles servira exclusivement à tests comportementaux : enregistrement des vocalisations à 3 jours et 7 jours (3x3min/souris), test d’interaction sociale à 21 et 60 jours (15 min), tests moteurs à 21 et 60 jours (10 min/souris). Durant la seconde gestation, il y aura une procédure chirurgicale sur la femelle gestante (environ 35 min) qui permettra d’insérer des marqueurs fluorescents dans le cerveaux des embryons. La progéniture sera utilisée pour : soit i) Tests comportementaux (vocalisations, interaction sociale, tests moteurs) de J3 à J60, soit ii) Imagerie à travers le crâne sur animal anesthésié (environ 30 min), soit iii) directement mise à mort pour prélèvement du cerveau.
Impact sur les animaux
En ce qui concerne le traitement aux pesticides, d'après de précédentes études conduites chez la souris, même à long terme (10 mois), aucune souffrance, perte de poids, stress, ou comportement anormal n'a été relevé chez les animaux sauvages traités. Cependant en débutant les traitements dès la gestation, nous nous attendons à avoir un retard de développement (yeux, oreilles, motricité), des défauts d'interaction sociale ou encore des comportements répétés associés à l’autisme (stéréotypies), sans que cela n'induise de souffrance. Concernant la chirurgie sur femelle gestante, pour éviter la souffrance, l'animal bénéficie d'une anesthésique générale et d’une couverture analgésique (anti-douleur). Une grille de suivi est mise en place évaluant : la complexité du nid, la présence de sang dans la cage, la posture, la mobilité et l'état du pelage. Ces critères sont évalués quotidiennement durant les trois jours suivant l'acte chirurgical. En fonction du score obtenu durant cette évaluation, l'état de souffrance de l'animal est défini, ce qui va permettre de statuer sur la conservation de la femelle jusqu'à la date initialement prévue ou sur l’obligation d’abréger sa souffrance immédiatement.
Devenir
Mise à mort de la progéniture pour prélèvement des cerveaux afin d’explorer l’impact des pesticides au niveau cellulaire (morphologie, nombres, anomalies diverses). Les géniteurs seront également mis à mort dès lors qu'ils ne pourront être réutilisés pour reproduction (âge trop avancé, chirugie ou fin du projet).
Remplacement
L'expérimentation animale est indispensable dans ce travail car aucun modèle alternatif ne nous permet actuellement de reproduire la complexité du développement cérébrale des mammifères. De plus l'étude sur l'animal est indispensable afin de pouvoir associer des défauts au niveau cellulaire à des déficits comportementaux tels que des défauts d'interaction sociale.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d'animaux pour ce projet en ne générant que les animaux au type génétique d’intérêt pour la mise sous traitement. Nous avons également décidé de ne pas réaliser de chirurgie sur la première portée des femelles et de garder la progéniture pour des analyses de comportement afin d'éviter que la perte associée à la primiparité (première portée) des femelles ne se mêle à la perte associée à la chirurgie. Ainsi les femelles ne sont pas utilisées que pour une seule et unique portée (car une femelle ayant subi la chirurgie ne pourra servir qu’une seule fois pour nos expériences), cela réduit le nombre de femelles à utiliser mais également la perte estimée au sein de la portée en comparaison à la combinaison primiparité + chirurgie. Le nombre d’animaux à utiliser a été déterminer grâce à des calculs statistiques permettant de définir le nombre d’individus par groupe nécessaire à la mise en évidence de différences significatives entre les groupes non-traités et traités aux pesticides et les différents types génétiques. De plus la moitié des cerveaux collectés sera envoyé à nos collaborateurs de manière à réduire le nombre d’animaux générés pour l’ensemble du projet de recherche incluant la collaboration.
Raffinement
Le bien-être animal est au cœur de nos préoccupations, c'est pourquoi tout au long du projet, les souris seront quotidiennement et étroitement surveillées par un personnel qualifié. Chacune des procédures chirurgicales sera réalisée sous couverture anesthésique et analgésique. Une grille de suivi permettra de mesurer l’état de bien-être général des animaux suite à un acte chirurgical en se basant sur des indicateurs physiques et comportementaux permettant de mettre des limites strictes à la douleur potentiellement endurée par celles-ci. Le comportement sera réalisé par un seul manipulateur qui aura habitué les animaux à sa présence pour éviter toute forme de stress dû à la présence de l’expérimentateur. Avant chaque test de comportement, une étape d'habituation à la manipulation et à l'environnement sera effectuée afin de réduire le stress des animaux durant l’expérience. La manipulation des animaux sera faite dans le calme et avec douceur. La séparation mère/souriceaux sera réduite au maximum avec des temps de présence de la mère entre chaque expérience nécessitant une séparation.
Choix des espèces
La souris présente une grande similarité avec l'Homme. En effet, 98% de son génome trouve son équivalent dans le génome humain ce qui permet, dans la majorité des cas de pouvoir mimer une pathologie humaine via des modèles génétiquement modifiés. De plus c'est une espèce de petite taille et sa courte durée de gestation et l'importance de ses portées en fait un modèle mammifère idéal pour les projets de recherche. Les différentes étapes du développement cérébral chez la souris étant maintenant bien décrites, ce modèle est pertinent pour la recherche neurodéveloppementale. La taille des embryons de souris est suffisante pour l'injection des marqueurs fluorescents qui nous permettent de suivre le développement du cerveaux ainsi que pour toutes les analyses qui vont en découler. De plus, il existe chez la souris de nombreux tests comportementaux spécifiques et bien décrits permettant de dissocier un comportement "normal" d'un comportement lié à un trouble du spectre de l'autisme (interaction sociale, comportement répété). L'injection des marqueurs fluorescents dans les embryons aura lieu au jour 13 de gestation afin de pouvoir marquer l'ensemble des cellules d’intérêt afin de suivre leur développement dans le cerveau. Le temps le plus précoce d'analyse est le stade embryonnaire E18 (jour 18 de gestation) qui correspond à la migration des cellules d’intérêt vers leur lieu de prédilection, ensuite il y a le stade J3 (3e jour post-natal) qui correspond au pic de prolifération des cellules d’intérêt, J7 qui correspond à la fin de leur prolifération et à la migration d’une population de neurones qui nous intéresse, J21 qui correspond à la période de maturation des différents types cellulaires d’intérêt et la quasi-finalité de la mise en place des interfaces entre les vaisseaux et les populations cellulaires d’intérêt. Nous analyserons également le stade J60 afin de déterminer si les dommages précoces induits par les pesticides sont maintenu ou spontanément rétabli après la maturation du cerveaux.
Les maladies infectieuses comme menaces de populations d’oiseaux longévifs en France: surveillance et mécanismes de transmission d’agents infectieux
- Conservation des espèces
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
1 200 oiseaux sauvages, fous de Bassan et vautours fauves, vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, avant d'être relâchés sur le lieu de capture. Chaque individu subit une prise de sang, deux écouvillonnages cloacaux et deux buccaux, et pour une partie la pose d'une balise GPS externe, pour étudier l'exposition à l'influenza aviaire et la transmission d'agents infectieux. Le porteur indique attendre très peu d'effets indésirables, la manipulation ne durant que quelques minutes. Il affirme qu'il n'est "pas possible de remplacer" ces espèces, choisies parce qu'elles ont été fortement touchées par l'influenza aviaire en 2022.
Objectifs
Les objectifs du projets sont d'acquérir des données sur les processus de transmission d'agents pathogènes dans les populations d'oiseaux sauvages et leurs implications pour ces populations. En particulier, dans le contexte de l'émergence récente de l'influenza aviaire hautement pathogène dans les populations de nombreuses espèces d'oiseaux de la faune sauvages, il s'agit d'acquérir des données sur les proprotions d'individus exposés aux virus et les modalités de transmission des virus. Les acquisitions de données et d'échantillons seront insérée dans des suivis démographiques déjà pré-existants de deux espèces emblématique, le fou de Bassan _Morus bassanus_ et le vautour fauve _Gyps fulvus_.
Bénéfices attendus
Est attendue un meilleure connaissance de l'exposition d'espèces d'oiseaux sauvages aux virus de l'influenza avaire hautement pathogène, ainsi qu'à d'autres agents infectieux, ainsi que du rôle de certains individus dans la transmission des agents infectieux. Les résultats ont vocation à être publié dans articles scientifiques et pourront être utilisés pour des décisions concernant la protection de la biodiversité. Le projet apportera spécifiquement des informations sur l'expositon des fous de bassan et des vautours fauves des populations françaises aux virus de l'influenza aviaire hautement pathogène. Les données seront acquise dans le cadre de suivis intégrés des populations concernées, c'est-à-dire des suivis incluant aussi l'acquisition de données fines sur la démographique et l'écologie du déplacement des populations.
Procédures
Les animaux font l'objet de prélèvements sur animaux vigiles (1 prise de sang, 2 écouvillonnages cloacaux et 2 écouvillonnages buccaux) et pour une part d'entre eux la pose d'un GPS (balise externe) afin d'acquérir des données sur leurs déplacement. Ces interventions dure quelques minutes de manipulation, l'individu étant ensuite relâché en nature au point de capture.
Impact sur les animaux
Très peu d'effets idésirables ou nuisance attendus sur les oiseaux, car la manipulation ne va consister qu'en la réalisation d'une prise de sang de 1 ml et la réalisation d'écouvillonnages cloacaux et buccaux.
Devenir
Tous les individus seront relâchés libres dans leur population en milieu naturel, sur le lieu de capture, quelques minutes après la réalisation des prélèvements. Les individus n'auront pas été affectés par des effets indésirable et des mesures de biosécurités sont prises pour ne pas risquer de dissémination d'agents infectieux.
Remplacement
Les objectifs étant de déterminer l'exposition de populations des espèces considérées, le fou de bassan et le vautour fauve, aux virus de l'influenza aviaire, il n'est pas possible de remplacer les espèces considérées. En revanche, les résultats obtenus avec ces espèces emblématiques pourront avoir des implications pour d'autres espèces.
Réduction
Les tailles d'échantillons considérées ont été déterminées afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en s'assurant d'obtenir des données informatives. Les données qui pourront être collectées plusieurs années de suite permettront d'optimiser l'utilisation des informations, notamment celles concernant le statut sérologique des individus.
Raffinement
Les techniques de capture et de prélèvements ont fait l'objet d'un raffinement afin de provoquer le moins d'effet négatifs sur les oiseaux.
Choix des espèces
Les espèces choisies l'ont été car elles ont été fortement affectées par l'émergence de l'influenza aviaire hautement pathogène en 2022 et qu'elles ont des traits d'histoire de vie les rendant particulièrement susceptibles à des maladies infectieuses affectant la survie des adultes. Il est aussi tout particulièrement important d'obtenir des informations sur les modes de transmission des virus de l'influenza aviaire au sein et entre colonies de ces espèces sociales qui se reproduisent en colonies. Les individus capturés pour faire l'objet de prélèvements seront majoritairement des adultes. Des prélèvements sur des jeunes au nid pourront être effectués lorsque les conditions le permettront (bonne accessibilité, dérangement limité).
Evaluation des interactions de substances pharmacologiques sur le système nerveux central et périphérique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 750
750 souris et 750 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent deux substances par injection, puis sont retournés sur le dos à plusieurs reprises pour observer le réflexe de retournement, afin de tester des candidats médicaments en interaction avec des barbituriques et de l'éthanol. Le porteur indique que les injections peuvent induire une douleur légère et que des tremblements ou des convulsions pourront apparaître, et précise que tous les animaux seront tués en fin d'étude pour rechercher une toxicité retardée sur les organes. Il conclut que ces tests réglementaires de pharmacologie de sécurité, exigés pour une autorisation de mise sur le marché, ne peuvent pas être remplacés, tout en reconnaissant l'existence de tests in vitro et in silico en amont.
Objectifs
Ce projet participe à anticiper des problématiques de toxicité pouvant apparaitre lors de l’évaluation clinique des médicaments. En effet, il est nécessaire d’évaluer avant les phases d’essais cliniques chez l’homme tout risque encouru lors de l’administration d’un candidat médicament. Le but est d’identifier les potentiels effets indésirables lors d’études dites de pharmacologie de sécurité. Le projet concerne des tests comportementaux réalisés chez le rongeur visant à étudier les effets de substances pharmacologiques susceptibles d'interagir avec des hypnotiques sur le système nerveux central. Le contexte du projet est principalement l’évaluation de la sécurité. Ces évaluations sont fortement recommandées d’un point de vue réglementaire dans le cadre de l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché (AMM).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer les potentiels effets d'aggravation de l'état de somnolence induit par les barbituriques et l'éthanol, en cas d'interaction avec le candidat médicament. Ceci avant le passage en phase clinique des nouveaux traitements.
Procédures
Il s'agit principalement d'un test d'observation basé sur le réflexe de retournement. Les principales interventions subies sont l'administration des substances (2 au total, max 30 sec chacune) et la préhension pour la vérification du reflexe de retournement (animaux mis sur le dos) (10 max, durée 15 sec chacune) sur une période de 2 heures environ. En cas de perte du réflexe de retournement (animaux restés sur le dos), les animaux sont observés pour le retour sur leurs pattes sans manipulation pendant 6 heures max.
Impact sur les animaux
Les manipulations / contentions réalisées au cours des procédures d'administration, des tests de reflexe de retournement ou de prélèvement sanguin peuvent entrainer un stress. L'administration des substances par injection dans le péritoine ou sous la peau peut induire une douleur légère. Plusieurs effets indésirables inhérents au traitement reçu (seul ou liès à l'interaction avec l'ethanol ou le barbital) pourront être détectés au cours de l’étude, en particulier des signes de toxicité tels des tremblements ou des convulsions.
Devenir
L’effet à moyen et long terme des traitements reçus en interaction avec le barbital et l'éthanol n'étant pas connu (par exemple, risque de toxicité non détectable immédiatement au niveau d'un organe : foie, reins...), tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’étude)
Remplacement
Ces tests ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils permettent l’étude des potentiels effets secondaires de traitements expérimentaux dans un système complexe (interaction avec et entre les différents organes et systèmes physiologiques). Cependant, il existe des tests in vitro et in silico permettant de sélectionner en amont des molécules efficaces et dont la toxicité n’est pas avérée.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose/effet ou la comparaison par rapport à une substance de référence. Un effectif acceptable sera défini afin d'obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. Pour les données quantitatives, les tests non-paramétriques (Kruskal-Wallis et Mann-Whitney) seront appliqués et pour les données qualitatives (fréquence de réponse), le test exact de Fisher sera utilisé. Aussi, un prélèvement sanguin en fin d'étude pourra être envisagé, permettant ainsi de collecter des données biochimiques sur la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en oeuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse . Cette évaluation se fera au moment de chaque relevé (toutes les 15 minutes) et en cas d'atteinte des points limites, pourra conduire à l'euthanasie de l'animal avant la fin de l'étude. En cas de prélèvement de sang terminal, un traitement analgésique (carprofene à 5 mg/kg ou équivalent) pourra être associé à l'anesthésie (type isolflurane) afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères...).
Choix des espèces
L’utilisation de rongeurs (rats et souris) pour évaluer l’impact de substances pharmacologiques sur le système nerveux central, en particulier l’interaction avec des hypnotiques est prédictif de leur activité en clinique (potentiellement un risque d'effets secondaires lors de leur future utilisation chez certains patients). Tous les animaux seront utilisés à partir de 4 semaines de développement (après sevrage) l’âge peut varier entre 4 semaines et 2 ans, conformément à la bibliographie scientifique et aux recommandations réglementaires .
Travaux pratiques en formation expérimentation animale niveau « Applicateur de procédures expérimentales chez les rongeurs ».
- Formation professionnelle
Rats : 100
300 souris et 100 rats vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, au cours de travaux pratiques d'une formation à l'expérimentation animale. Sur chaque animal, les stagiaires répètent des gestes techniques, préhensions, contentions, injections intrapéritonéales et sous-cutanées, prélèvements sanguins caudaux et submandibulaires sous anesthésie. Les souris seront tuées à la fin des séances, le porteur préférant leur mise à mort à un retour en animalerie, tandis que les rats sont réutilisés dans un autre travail pratique de physiologie. Il affirme que le recours à des animaux vivants est "indispensable" à ce type de formation et que le remplacement y paraît "difficile à envisager".
Objectifs
Ces travaux pratiques, inscrits dans la formation diplomante expérimentation animale de niveau applicateur et portés par le Service Ressources Biologiques, vont permettre aux participants de se former aux bonnes pratiques de l'expérimentation animale et ce, afin de garantir et respecter de façon optimale le bien être des animaux lorsque ceux ci devront être utilisés dans un projet de recherche.
Bénéfices attendus
La mise en place de ces travaux pratiques utilisant des animaux vivants vont être bénéfiques tant pour le personnel que pour l'animal : 1/Le personnel : Il sera à l'issue des TP formé aux bonnes pratiques d’expérimentation animale tout en garantissant le bien être de l’animal et répondra ainsi aux exigences réglementaires lorsque celui ci devra utiliser des animaux vivants à des fins scientifiques au sein de son laboratoire. De plus, se familiariser aux espèces les plus utilisées en recherche scientifique contribuera à son propre bien être levant appréhension et donc risque de blessure. 2/L'animal : Un animal manipulé par un personnel formé est une garantie du maintien de son bien être, évitant stress et blessure.
Procédures
Pour l'étape 1, 60 souris et 20 rats seront soumis à des contentions et préhensions. Pour l'étape 2, 60 souris vigiles seront soumises à des injections principalement IP et SC Pour l'étape 3, 60 souris anesthésiées seront soumis à des prélèvements caudaux et/ou submandibulaires. Leur fréquence et durée sont comme suit : 1/Préhension et contention Préhension des souris par la queue : 5 préhensions par animal d’une durée de 3 secondes Préhension des rats par le corps : 5 préhensions par animal d’une durée de 5 secondes Préhension des rats par la base de la queue : 5 préhensions par animal d’une durée de 3 secondes Techniques de contention des souris : 1/ Immobilisation complète : 5 contentions par animal d’une durée de 10 secondes 2/ Immobilisation de la tête : 5 contentions par animal d’une durée de 10 secondes 3/ Immobilisation avec l’utilisation d’un support : 5 contentions par animal d’une durée de 5 secondes Techniques de contention des rats : 1/ D’une main, le pouce vient se placer sous la patte gauche, l’index au-dessus de la patte droite et sous la mandibule pour maintenir la tête : 3 contentions par animal d’une durée de 10 secondes 2/ Une main vient attraper la base de la queue et avec l’autre main, la peau du cou est prise avec le pouce et l’index. Les autres doigts maintiennent la peau du ventre : 3 contentions par animal d’une durée de 10 secondes 2/ Présentation des différentes voies d’administration sur animaux vigiles IP 1 par animal, injection de 2 secondes IN 1 par animal, dépôt de la goutte de 1 seconde IM 1 par animal, injection de 2 secondes PO 1 par animal, administration de 5 secondes SC 1 par animal, injection de 2 secondes 3/ Les différentes voies de prélèvement et d’administration sur animaux anesthésiés IP 1 par animal, injection de 2 secondes Pénien 1 par animal, injection de 2 secondes 2 moyens peu invasifs de prélèvements sanguins : - par voie caudale 1 par animal, prélèvement de 30 secondes - sub-mandibulaire : 1 par animal, prélèvement de 5 secondes
Impact sur les animaux
Les différentes étapes qui constitueront les TP, avec l'encadrement assidu des intervenants, peuvent induire un léger stress ainsi qu’une douleur égale à celle d’une piqûre d’aiguille selon l'expérience des participants.
Devenir
Concernant les souris, celles ci feront l'objet de plusieurs manipulations type contention, administration de produit et/ou prélèvement et ce, par des personnels plus ou moins expérimentés. Pour leur bien être nous préférons procéder à leur mise à mort à la fin du TP. En outre, les TP se déroulant en dehors du service, les animaux ne pourront plus revenir dans l'animalerie. Concernant les rats, à l'issue des TP, ils seront réutilisés dans le cadre d'un TP de physiologie faisant aussi l'objet d'une autorisation de projet.
Remplacement
La réglementation relative à l’expérimentation animale exige que toute expérimentation animale doit être faite par du personnel qualifié et reconnu comme tel. L’utilisation des animaux vivants est indispensable à ce type de formation visant à transmettre aux stagiaires les bonnes pratiques, les bons gestes et les bonnes attitudes à avoir vis-à-vis des animaux dans le cadre de procédures expérimentales. Le remplacement des animaux parait donc difficile à envisager dans ce type de formation.
Réduction
La formation est ouverte pour une capacité maximale de 54 personnes réparties en 3 groupes de 18 pour les travaux pratiques. Chaque groupe sera composé de 9 binômes qui disposeront chacun de 2 souris et 2 rats. Les intervenants assureront une partie démonstration avant de laisser les stagiaires apprendre les bons gestes. Pour cela 2 souris et 2 rats seront nécessaires pour chaque session de TP. Les rats ne seront inclus dans les travaux pratiques que pour la partie préhension- contention. Ils seront ainsi réutilisés d’un groupe à l’autre. L’effectif total nécessaire au bon déroulement des séances sera donc de 60 souris (3 sessions x 9 binômes x 2 souris par binôme + 2 souris x 3 sessions pour les intervenants) et 20 rats (9 binômes x 2 rats + 2 rats pour les intervenants) sans préférence de sexe. A raison d’une session par an sur 5 ans (durée de la saisine), le nombre d'animaux total sera de 300 souris et 100 rats soit 400 animaux.
Raffinement
En dehors des séances, les souris seront hébergées en cages de 5 individus. Quelques jours avant le début des TP, elles seront réparties par 2 afin d’éviter l'isolement social et de permettre la mise à disposition d'une cage par binôme. Les rats quant à eux seront hébergés dès le départ en cage de 2 individus. Toutes les cages d'hébergement seront enrichies avec l'enrichissement habituellement utilisé dans le service à savoir un tunnel réutilisable en polycarbonate rouge, une briquette en peuplier pour les rats et des rouleaux de cellulose pour les souris. Tous les animaux bénéficieront d’un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Lors des séances, pour minimiser le niveau de stress ou douleur des animaux, ces derniers seront au préalable manipulés quotidiennement à la fois par le personnel soigneur mais aussi par les intervenants 15 jours avant le début des TP afin de les habituer à être manipulés. En outre, une surveillance et observance clinique seront effectuées par les intervenants pour s’assurer d’une part de la bonne application des consignes de la part des participants sur les animaux et d’autre part du bien-être des animaux face à ces manipulations. Aussi, une anesthésie par injection intrapéritonéale sera réalisée avant tout prélèvement et administration de produits. Enfin, les animaux seront systématiquement retirés des TP en cas de stress ou de souffrance marquée évaluée selon les critères préalablement définis.
Choix des espèces
Cette formation diplômante est principalement à destination des étudiants des masters Neurosciences et Biologie Santé qui seront amenés à réaliser un stage de fin de cycle la plupart du temps dans un laboratoire de recherche universitaire. Ces espèces sont celles utilisées en majorité pour les études menées dans ces laboratoires. Il nous parait donc pertinent de familiariser les stagiaires à ces espèces. Pour des raisons comportementales et plus spécifiquement leur docilité, des lignées spécifiques pour les souris et les rats ont été particulièrement choisies. En effet, le bien-être du manipulateur est pris en compte. Un stress moindre lui permettra de réaliser des manipulations adéquates, et évitera ainsi tout risque de blessure pour lui comme pour l'animal en plus du stress. Enfin, afin de refléter au maximum la réalité dans les laboratoires de recherche en matière d’étude in vivo, les rats comme les souris, seront de jeunes adultes âgés de 2 à 3 mois. En effet, cette tranche d’âge correspond d’une part à celle utilisée majoritairement dans les projets de recherche ; Et d’autre part, elle correspond à une taille et à un comportement animal favorables à la praticité de manipulation et au bien-être des participants
Rôle des récepteurs Toll-like dans l’inflammation, l’autoimmunité et le syndrome métabolique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
2 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Environ 1 200 sont tuées dès le génotypage pour ne pas porter le bon profil génétique, tandis que les 1 200 autres subissent un régime gras de cinq à six mois provoquant obésité et stéatose hépatique, des prélèvements sanguins et des tests de tolérance au glucose. L'objectif est d'étudier le rôle d'un récepteur Toll dans l'obésité et l'auto-immunité. Le porteur affirme que les souris partagent "99 % des gènes" avec l'humain et écarte les organoïdes, jugés incapables de reproduire l'atteinte de plusieurs organes.
Objectifs
L'obésité est une épidémie mondiale qui touche aussi bien les pays riches que les pays pauvres et constitue l'un des principaux problèmes de santé publique du XXIe siècle. Un lien entre l'obésité, le syndrome métabolique et les maladies auto-immunes et l'inflammation chronique associée a été suggéré, mais les mécanismes sousjacents sont encore inconnus. Toutes ces maladies ont augmenté de façon spectaculaire au cours des dernières décennies, continuent à augmenter, menacent de réduire l'espérance de vie et infligent un fardeau aux patients et à la société dans son ensemble. Les récepteurs de type Toll (TLR) des mammifères détectent des composants microbiens conservés, partagés par de nombreux micro-organismes, ainsi que des composants endogènes provenant de cellules mourantes ou blessées, et jouent un rôle essentiel dans le pilotage de l'immunité innée et adaptative. Récemment, les récepteurs de type Toll sont apparus comme un lien critique entre l'inflammation et la contribution à l'obésité et aux maladies auto-immunes, tant chez la souris que chez l'homme. En particulier, le récepteur 7 de type Toll, qui détecte l'acide ribonucléique simple brin, contribue au développement de l'obésité et des maladies auto-immunes, comme le lupus érythémateux systémique et le syndrome de Sjögren. Ainsi, cibler les récepteurs Toll-like pourrait être une nouvelle approche thérapeutique dans la prévention ou le traitement de l'obésité et des maladies auto-immunes et inflammatoires. L'objectif du présent projet est de mieux comprendre comment l'augmentation de la signalisation du récepteur 7 de type Toll dans certains types de cellules contribue à l'obésité et à l'auto-immunité et d'émettre l'hypothèse que la réduction de la fonction du récepteur 7 de type Toll pourrait prévenir le développement de l'obésité et de l'auto-immunité et leurs effets néfastes. Plus précisément, nous cherchons à explorer la contribution du récepteur 7 de type Toll par les cellules dendritiques, les cellules B et les cellules épithéliales thymiques dans le développement de l'obésité et de l'auto-immunité en utilisant des modèles de souris transgéniques.
Bénéfices attendus
L'obésité est liée à un risque plus élevé de troubles auto-immuns et inflammatoires. Au cours des dernières décennies, l'obésité et les troubles auto-immuns ont connu une augmentation parallèle significative dans les pays occidentaux/industrialisés. Il est donc impératif de développer de nouvelles stratégies pour la prévention et le traitement de ces maladies. Le modèle murin d'obésité induite par le régime alimentaire est devenu l'un des outils les plus importants pour comprendre l'interaction entre les régimes alimentaires occidentaux riches en graisses et le développement de l'obésité, tandis que les modèles murins de lupus ont permis de faire d'importantes découvertes sur l'implication du récepteur 7 de type Toll dans les maladies auto-immunes. Le récepteur 7 de type Toll joue un rôle important dans le développement de maladies auto-immunes comme le lupus érythémateux systémique et le syndrome de Sjögren ainsi que l'obésité. Afin de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques potentielles pour l'obésité, des études animales plus mécanistes sont nécessaires pour délimiter les mécanismes moléculaires et cellulaires exacts qui sous-tendent l'auto-réactivité dans l'obésité, ainsi que la diaphonie adipeuseimmunitaire dans l'organisme. Nos études feront progresser notre compréhension de la contribution du récepteur 7 de type Toll par différents types de cellules dans l'obésité et l'auto-immunité et pourraient déboucher sur de nouvelles pistes pour la prévention et le traitement de ces troubles qui réduisent l'espérance de vie et ont d'énormes conséquences socio-économiques.
Procédures
Les animaux pré-sevrés seront soumis à un prélèvement de tissus pour le marquage et le génotypage (2400 souris). Les animaux avec le génotype approprié (1200 souris) seront soumis à un régime riche en graisses ou à un régime standard à partir de l'âge de 1,5-2 mois et pour une période de 5-6 mois. Des prélèvements sanguins (durée : 4 minutes maximal) seront effectués sous anesthésie gazeuse une fois à l'âge de 3,4-4 mois et une fois à l'âge de 5-5,5 mois. Un test de tolérance au glucose sera effectué à l'âge de 6-7 mois et un test de tolérance à l'insuline sera effectué à l'âge de 7-7,5 mois, au cours duquel des prélèvements de sang seront effectués à 5 moments différents. La durée du test de tolérance au glucose et du test de tolérance à l'insuline est de 90 minutes, tandis que le prélèvement de sang durant ces procédures dure 1 à 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à un prélèvement de tissus pour le génotypage et l'identification, ainsi qu'à une prise de sang. Ces procédures durent moins d'une minute et peuvent entraîner une gêne et un stress mineurs pour les animaux, comme une douleur ou un stress temporaire pendant la procédure, un risque d'infection ou de saignement si elle n'est pas effectuée correctement. Pour l'obésité induite par le régime alimentaire, les animaux seront nourris avec un régime standard ou un régime riche en graisses pendant une période de 4 à 6 mois. Le régime riche en graisses chez la souris peut entraîner une prise de poids importante, l'obésité, des troubles métaboliques, une stéatose hépatique et une inflammation de faible intensité. Il peut également avoir un impact potentiel sur les facteurs comportementaux et psychologiques et provoquer des troubles gastro-intestinaux en raison de l'altération du microbiote intestinal. En outre, la manipulation ou l'immobilisation des souris peut provoquer du stress et de l'anxiété, ce qui peut entraîner des changements physiologiques et comportementaux, tels qu'une augmentation du rythme cardiaque, des niveaux élevés d'hormones de stress et une modification des schémas d'exploration ou d'activité. Enfin, l'anesthésie chez les souris peut entraîner des nuisances potentielles ou des effets indésirables tels que la dépression respiratoire, la baisse de la température corporelle et des altérations de la fonction cardiovasculaire.
Devenir
Après le génotypage, les animaux avec le mauvais génotype seront mises à mort (~1200 souris), tandis que les animaux avec le bon génotype (~1200 souris) seront placés dans un régime riche en graisses ou un régime standard pendant une période de 5-6 mois et seront ensuite mises à mort pour une analyse plus approfondie. Si, au cours des procédures, les souris atteignent le point limite (score de gravité supérieur à 10), elles seront mises à mort.
Remplacement
L'obésité et les maladies auto-immunes sont des maladies chroniques complexes, qui impliquent des décennies de changements physiopathologiques et d'adaptation. Le modèle d'obésité induite par le régime alimentaire chez la souris entraîne des modifications de plusieurs organes par rapport aux souris témoins. De plus, les maladies auto-immunes sont souvent systémiques et affectent plus d'un organe, comme dans le cas du lupus érythémateux systémique ou du syndrome de Sjögren. Ce projet propose d'étudier ces processus dans des modèles murins de récepteurs Toll (TLR) de l'obésité induite par le régime alimentaire et d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents ; ceci nécessite l'évaluation des changements physiologiques et immunologiques d'un organisme vivant. D'autres alternatives ont été envisagées, notamment la culture de tissus ou les organoïdes ex vivo (par exemple, le tissu adipeux sur une puce), mais l'objectif principal de ce projet est d'étudier les changements dans divers organes (tissu adipeux, foie, rein, pancréas, thymus) pendant une longue période et l'interaction entre l'obésité et les troubles auto-immuns, ce qui n'est pas possible avec les alternatives susmentionnées.
Réduction
Afin de minimiser le nombre d'animaux par expérience, nous suivons des protocoles actualisés et standardisés pour le modèle de souris obèse induit par le régime alimentaire et pour mesurer la résistance ou la sensibilité à l'insuline. Les calculs pour déterminer le nombre approprié d'animaux pour les procédures ont été instruits par des études rapportées dans la littérature et notre expérience antérieure sur des souris transgéniques dans le cadre du syndrome métabolique et de l'auto-immunité. Le nombre d'animaux à utiliser permettra de générer des données scientifiquement robustes. Chaque souris sera soumise à de multiples tests (jusqu'à une sévérité modérée) au lieu d'utiliser des animaux différents pour chaque test, et des analyses post mortem seront effectuées sur les tissus de tous les animaux afin de garantir que le maximum d'informations soit recueilli sur chaque animal. Afin de limiter la variabilité entre les différents génotypes de souris, nous utiliserons et comparerons toujours des souris de même origine génétique et appariées en âge et en sexe. En outre, et chaque fois que cela sera possible, nous comparerons des souris transgéniques avec des souris sauvages de la même portée, afin d'éliminer l'hétérogénéité due à la variabilité du microbiote.
Raffinement
Les souris seront manipulées de manière appropriée et elles interagiront fréquemment, ce qui réduira le niveau de stress pendant les procédures. Le prélèvement de sang dans le plexus rétro-orbitaire sera effectué sous anesthésie à l'aide d'une station d'anesthésie à gaz, tandis que le prélèvement de sang dans la queue sera effectué après l'application d'un anesthésique local sur la queue. En outre, afin de préserver le bien-être des animaux au cours de la procédure, les souris seront contrôlées fréquemment à l'aide d'une feuille de score appropriée pour le bien-être des animaux, afin de s'assurer qu'aucun animal ne dépasse un niveau de détresse strictement déterminé par le score. Des interventions humaines ou des points d'arrêt seront immédiatement mis en œuvre si l'on constate qu'un animal présente des effets indésirables inattendus.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies parce qu'elles sont très similaires aux humains, puisque les deux sont des mammifères et que 99% des gènes des souris sont similaires aux gènes des humains. En étudiant la physiologie des souris, nous pouvons obtenir des informations sur la façon dont les êtres humains développent des maladies. En particulier pour les maladies chroniques comme l'obésité et l'auto-immunité, les souris sont idéales car elles vivent peu (~2 ans). De plus, les souris génétiquement modifiées rendent cette espèce idéale pour l'étude des molécules individuelles du système immunitaire. Dans notre projet, nous étudions un récepteur de type Toll, qui est conservé au cours de l'évolution entre les humains et les souris, dans le développement de l'obésité et de l'auto-immunité, en utilisant des souris génétiquement modifiées. Ces souris sont donc le modèle le plus approprié pour atteindre les objectifs de cette étude. Pour les souris issues d'un accouplement hétérozygote, la collecte de tissus pour le génotypage et le marquage des souris sera effectuée à l'âge de 7-10 jours. En effet, les souris doivent être regroupées dans des cages en fonction de leur génotype au moment de leur sevrage (21 jours), et le génotypage doit donc être effectué avant cet âge. Les souris seront utilisées à l'âge de 2 à 8 mois afin d'étudier la progression de la prise de poids et de l'auto-immunité avec le temps, puisqu'il s'agit de troubles chroniques.
Evaluation du potentiel immunorégulateur des vésicules extracellulaires : EVReg
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
202 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections de vésicules extracellulaires, des mesures de glycémie et des prélèvements sanguins, certaines développant un diabète auto-immun ou une maladie du greffon contre l'hôte, avant le prélèvement de leurs organes lymphoïdes. L'objectif est de mettre au point une mesure de l'activité immunomodulatrice de ces vésicules, en vue de la transposer ensuite vers des tests in vitro. Le porteur affirme que cette réaction immunitaire n'est "pas modélisable in vitro ni in silico" à ce stade.
Objectifs
L’objectif général de notre projet est l'évaluation du potentiel immunomodulateur des vésicules extracellulaires (EV) de sources cellulaires variées, à usage thérapeutique. Il n'existe actuellement aucun test standardisé dans la littérature pour évaluer le potentiel immunorégulateur des EVs. Selon les études en effet, les chercheurs utilisent des métriques très différentes (dosage des protéines totales, quantité d'une protéine, nombre de particules, activité enzymatique ...). Notre projet vise d’une part à proposer une méthode de qualification et de mesure objective de l'activité immunomodulatrice des EV de toutes provenances, et d’autre part l’identification des cibles immunitaires précises in vivo en fonction de la voie d’administration, dans le but de pouvoir dans un 2ème temps transposer l’évaluation thérapeutique des EV de l’in vivo vers des tests in vitro ou ex vivo.
Bénéfices attendus
La publication d'un test robuste de mesure des effets immunomodulateurs des EV permettrait la standardisation des pratiques entre laboratoires et entre EV de différentes sources ; elle permettrait également de valider les méthodes de production et de purification de façon à préserver ou maximiser le potentiel des EV.
Procédures
Les manipulations prévues sur animaux vigiles consistent en des pesées (192 animaux max, hebdomadaires ou bi-hebdomadaires), mesures de glycémie (60 animaux, bi-hebdomadaire), et injections intrapéritonéales (60 animaux, maximum bi-mensuel). Les manipulations sur animaux anesthésiés inclueront des injections (192 animaux max, EV administrées en 2 injections ou en injection unique), et ponctions sanguines (192 animaux max, prélèvements hebdomadaires). Les injections, ponctions sanguines, pesées et mesure de glycémie sont des opérations rapides d'une durée maximale de quelques minutes.
Impact sur les animaux
Les interventions prévues sur les animaux ne doivent pas engendrer d’inconfort, de douleur ou de gêne notable, et sont de courtes durées. L’inconfort des injections i.d. ou des prélèvements au niveau du sinus rétro-orbitaire sera anticipé par une manipulation sous anesthésie générale gazeuse. Pour le suivi du diabète, la mesure de la glycémie sur microgoutte ponctionnée à la queue ne doit pas engendrer de douleur, et cette mesure ne nécessite qu’une contention légère et rapide. Dans le cadre du modèle de transfert de diabète, les symptômes et complications liés à une hyperglycémie (perte de poids, perte d’appétit, état clinique dégradé) sont évités par un diagnostic précoce. Les symptômes seront surveillés pour une prise en charge rapide le cas échéant. Dans le cadre du modèle d’humanisation, la maladie du greffon contre l’hôte engendre également des symptômes cliniques indésirables (perte de poids, apathie, symptômes digestifs…), mais le suivi du poids permet une détection rapide de l’apparition de la maladie, et les points limites décrits sont suffisamment précoces pour éviter une souffrance des animaux.
Devenir
Le devenir terminal des souris est la mise à mort pour prélèvement et analyse des cellules sanguines et des organes lymphoïdes, que le terme de l'expérience soit échu ou que les points limites soient atteints.
Remplacement
L'étude de la réaction immunitaire en fonction de la voie d'administration des EV n'est actuellement pas modélisable in vitro ni in silico. Le manque d'éléments de standardisation empêche le calcul à priori des doses équivalentes entre deux lots d'EV : notre projet vise précisément à améliorer cet état de l'art.
Réduction
Le nombre d'animaux est réduit par l'utilisation des noeuds lymphatiques individuels : chaque individu fournissant plusieurs noeuds lymphatiques, l'appariement des données avec contrôle interne par animal permet de réduire grandement le nombre d'animaux. Par ailleurs, l'utilisation d'une procédure de diabète accéléré permet, grâce à une pénétrance maximale de la maladie, de diminuer nettement le nombre d'animaux à observer dans le cas d'un diabète spontané. Les groupes ont été réduits au minimum pour permettre la validation de nos hypothèses. Des analyses statistiques permettront une exploitation des résultats d'incidence de diabète ou de maladie de greffon contre l'hôte, mais aussi de dosages des marqueurs immunitaires et inflammatoires du sang, et analyses ex vivo de la réactivité des organes lymphoïdes et populations cellulaires.
Raffinement
L'étude chez les souris traitées vs non-traitées comportera un suivi du poids, de la glycémie (selon les groupes), ainsi que systématiquement de ponctions sanguine terminale. Après l'euthanasie, les organes lymphoïdes, selon les groupes les pancréas, seront également prélevés pour études fonctionnelles in vitro, ou études moléculaires, biochimiques ou transcriptionelles. Les animaux ne sont pas manipulés avant une semaine d'acclimatation pour les nouveaux arrivants. Les animaux nés au sein de l'EU sont manipulés et habitués aux manipulations avant le début des procédures. Tous les animaux sont hébergés en cages par groupe de 5 maximum par fratrie et par sexe. Les animaux sont observés quotidiennement par le personnel de l'EU et par les expérimentateurs de façon pluri-hebdomadaire. Les cages sont nettoyées chaque fois que nécessaire (minimum une fois par semaine) en génant les animaux le moins possible, tout en maintenant en permanence de l'enrichissement changé régulièrement, incluant de la cellulose compressée, des jouets en bois (bille, quille), des hamacs, des igloos, des roues, des tubes en plastique rouge ou en carton, sans exclure l'utilisation d'autre enrichissement selon les disponibilités. Ce matériel est autoclavé avant utilisation.
Choix des espèces
L'utilisation d'un modèle de diabète de type 1 auto-immun chez la souris NOD, modèle très bien décrit dans la litérature et utilisé depuis longtemps en laboratoire, permet d'accélérer les procédures mises en place tout en réduisant le nombre d'animaux. Ce modèle de diabète accéléré chez la souris permettra d'évaluer précisément ce que le projet prévoit de quantifier : l'effet immunomodulateur des EV. Par ailleurs, les autres modalités expérimentales disponibles dans cette espèce sont facilement disponibles, ce qui garantit une exhaustivité supérieure aux autres espèces. Les souris utilisées dans ce projet seront majoritairement des souris jeunes adultes au-delà de six semaines. En effet, les souris obtenues du fournisseur à l’âge de 6 semaines peuvent s’acclimater pendant 2 semaines avant d’être utilisées en protocole. Au-delà de 8 semaines, elles ont un poids suffisant et stabilisé autour de 25g, permettant d’avoir des lots homogènes et des résultats reproductibles. Seules les souris issues du modèle d'humanisation seront traitées entre 4 et 6 semaines, afin de maximiser la réussite de la greffe de cellules souches hématopoïétiques.
Hypertension oculaire chez le lapin
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
5 100 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Une hypertension oculaire leur est provoquée par injection de solution saline dans le vitré ou par surcharge en eau, suivie d'examens ophtalmologiques, d'administrations de gouttes jusqu'à huit fois par jour et parfois de la pose chirurgicale d'un implant. L'objectif est de développer des traitements contre l'hyperpression oculaire du glaucome, les yeux étant prélevés à l'issue. Le porteur qualifie les atteintes de faibles et transitoires et affirme qu'"aucune méthode alternative" ne reproduit l'œil dans sa globalité.
Objectifs
Le glaucome est une maladie grave et fréquente, le plus souvent indolore, qui touche principalement les personnes âgées de plus de quarante-cinq ans et peut entrainer une perte de la vision. Aujourd’hui dans le monde, soixante-dix millions d’individus sont atteints, dont un million en France. L’augmentation de la pression à l’intérieur de l’oeil est la principale cause de glaucome. La pression oculaire est due au liquide transparent contenu à l’intérieur de l’oeil: l’humeur aqueuse produite et évacuée par les structures à l’intérieur de l’oeil. Lorsque le système d’évacuation de l’humeur aqueuse est déficient, elle s’accumule, la pression augmente et endommage les cellules nerveuses de la rétine et le nerf optique responsables de la vision. L’objectif du projet est la mise en place, au sein de l’établissement utilisateur, de modèles expérimentaux d'hyperpression oculaire chez le lapin, afin de contribuer au développement de nouveaux traitements médicaux visant à diminuer cette hyperpression et à protéger les cellules rétiniennes permettant la vision.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu du projet est de proposer des modèles expérimentaux qui permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements. La recherche de traitements contre le glaucome est en constante évolution et nécessite de pouvoir les tester dans les meilleures conditions possibles et dans le plus grand respect du bien-être animal.
Procédures
Selon la procédure, l'induction de l'hypertension oculaire peut se faire soit directement au niveau de l'œil par une injection dans le vitré de solution saline, soit par l’ingestion d'un volume d'eau. La première technique dure moins d’une minute, la seconde est un peu plus longue, pour le bien-être de l’animal puisqu’elle dure au maximum deux-trois minutes afin de réduire les rares effets indésirables (stress, agitation, fausse route). Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives (mesure de la PIO grâce un appareil dédié́, lampe à fente, imagerie). Ces examens sont réalisés en routine chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation ou en clinique vétérinaire. Ces examens sont extrêmement courts puisqu’ils ne durent que quelques minutes (quelques secondes pour les plus court à cinq minutes maximum pour les plus longs comme l’imagerie) et pourront être réalisés plusieurs fois par jour pour les mesures de la pression intraoculaire à quotidiennement pour les observations et le suivi des animaux. Les administrations, elles, pourront se faire plusieurs fois par jour et sur la durée de l’étude quand elles sont sous forme de gouttes ou d’injections. La fréquence de ces administrations dans la majorité des cas n’excèderont pas 6 à 8 administrations par jour pour le cas des gouttes ophtalmiques. Dans ce cas, l’animal est maintenu immobile moins d’une minute. Pour la pose d’implant, l’acte nécessite une anesthésie et éventuellement des points de sutures au niveau des conjonctives ou de la cornée. Cet acte chirurgical dure cinq minutes tout au plus et sera réalisé généralement une seule fois, puisque l’implant à vocation à délivrer son contenu sur une longue période.
Impact sur les animaux
Le projet a pour but de trouver des traitements permettant une diminution de la pression intraoculaire. L’augmentation de la pression intraoculaire induite par les différents protocoles est faible et transitoire. Elle n’occasionnera aucune douleur pour l’animal tout au plus une gêne de courte durée (quelques minutes après l’injection intravitréenne). Les procédures décrites sont réalisées par un personnel formé et dans des conditions réduisant au maximum les risques de nuisances ou d’effets indésirables. Le stress occasionné lors de la prise des mesures sera de courte durée puisque que ces examens ne durent que quelques secondes et qu’une anesthésie locale est appliquée si nécessaire. Il en va de même pour le stress lié à l’induction. Dans le protocole décrivant la surcharge hydrique, l’animal sera maintenu plus fermement et une sensation de lourdeur au niveau de l’estomac est envisageable mais elle aussi sera de courte durée, l’excès hydrique étant rapidement éliminé par les urines. Les fausses routes sont exceptionnelles mais si malheureusement une telle situation devait arrivée l’animal serait mis à mort rapidement après l’apparition des signes. Les nuisances subies par les voies digestives supérieures seront minimisées par l’utilisation de tubulures souples non perforantes. Enfin les éventuelles nuisances induites par les administrations seront surtout liés à la contention de l’animal mais là aussi elles seront de courtes durées, de l’ordre de quelques secondes à moins de quelques minutes (inférieures à 5 minutes).
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo sur les tissus impactés (évaluations histologiques, dosages de biomarqueurs et de produits...).
Remplacement
A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’oeil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’oeil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse,..) de physiologie différente soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux compte tenu des particularités de l’organe concerné par le projet et l’absence de modèle alternatif.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction des données bibliographiques et historiques de l'établissement et du nombre d'études estimées. Il tient également compte des variations du métabolisme et de la robustesse des résultats calculés à partir de tests statistiques. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les lapins seront placés préférentiellement par deux si les conditions expérimetales le permettent dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture rationnée et enrichissement. Les examens non invasifs pour évaluer la pathologie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou en cabinet vétérinaire. Les examens de l'oeil qui requièrent un immobilisme de l'animal pourront être réalisés sous anesthésie pour son confort. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l‘établissement.
Choix des espèces
A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’oeil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’oeil est composé de différents tissus de physiologie différente soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux compte tenu des particularités de l’organe concerné par le projet et l’absence de méthode alternative. De nombreuses études sur la pression intraoculaire sont réalisées chez le lapin en raison des similitudes avec l'oeil humain (taille de l'oeil, structures, mécanismes impliqués) permettant de recueillir des résultats extrapolables à l'humain et de tester des traitements ou des dispositifs médicaux directement transposables chez l'homme. Nous avons donc choisi cette espèce pour mener à bien le projet. Les lapins sont de jeunes adultes et ont minimum 8 semaines, âge minimum pour la maturation de l'oeil.
Effet du développement précoce du microbiote sur l’efficacité alimentaire chez le poulet de chair.
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
480 poussins vont être utilisés, tous abattus à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun reçoit à un jour de vie un unique gavage oral d'un mélange de bactéries, avec un stress de contention et une légère irritation de l'œsophage, puis est élevé trente-cinq jours avant d'être envoyé à l'abattoir pour la vente de sa viande. L'objectif est d'évaluer si l'implantation précoce d'un microbiote améliore l'efficacité alimentaire des poulets de chair. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne modélise la croissance des animaux à partir de leur microbiote.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont de mieux comprendre l’influence en particulier du microbiote intestinal (bactéries du tubes digestifs) sur l’efficacité alimentaire (consommation et croissance) des poulets. L’objectif est ainsi de distribuer à des poussins d’un jour un mélange de bactéries d’intérêt identifiées et isolées comme étant responsables de l’efficacité alimentaire (bonne croissance pour consommation alimentaire modérée) chez des poulets de chair au stade d’abattage. Cette approche s’inspire d’une démarche biomimétique (c’est-à-dire de l’observation du comportement en milieu naturel pour s’en inspirer) en permettant de constituer une flore digestive diverse à de jeunes oiseaux qui en sont dépourvus du fait de leur conditions d’accouvage et d’élevage (pas de transfert de contact avec des oiseaux adultes comme cela se passerait dans le milieu naturel). Chez les animaux d’élevage (porc ou volaille), plusieurs travaux ont montré qu’implanter précocement dans la vie de l’animal une flore fécale d’animal adulte avait des effets bénéfiques sur la santé digestive de l’animal et une meilleure résistance aux risques pathogènes environnementaux. Notre hypothèse est qu’une implantation précoce de bactéries sélectionnées spécifiquement pourrait aussi permettre une meilleure croissance des animaux (efficacité alimentaire).
Bénéfices attendus
Le résultat de cette étude pourrait permettre de voir si une orientation très précoce de la flore intestinale du poussin intervient sur sa croissance et son gabarit à l’âge classique d’abattage. Cette méthode permettrait une bonne croissance de la volaille sans nécessité d’ajouter d’autres produits à l’alimentation du poulet. La diversification précoce de la population bactérienne intestinale chez le jeune poussin mime ce qui se passe dans l’environnement naturel et permet également une meilleure résilience de l’animal face aux différents stress (ambiance, pathogènes) inerrants aux conditions d’élevage, et donc un meilleur bien-être. Les études sur le transfert fécal sont encore très limitées chez l’homme et inexistantes en routine chez les animaux d’élevage. Cette étude pionnière va permettre d’obtenir des résultats zootechniques et de quantifier les effets de la solution développée. Une fois la dose et le consortium validé, il est prévu à moyen terme un mode d’administration, nécessitant encore un développement technique, qui soit non contraignant pour les oiseaux.
Procédures
Il s’agit d’un gavage oral réalisé une seule fois sur 480 poulets . La phase totale d'inoculation (gavage) dure moins de 30 secondes par oiseau.
Impact sur les animaux
La procédure de gavage durera quelques secondes et sera réalisée par du personnel qualifié. Le mélange de bactéries administré se compose de bactéries intestinales de poulets adultes sains non pathogènes ; elles font donc partie de la flore commensale des oiseaux. Il n’est donc pas attendu de nuisance conséquente à la solution administrée. Les nuisances pouvant être attendues relevent plus exactement de l'acte de gavage en lui-même : stress dû à la contention et légère irritation au niveau de l'oesophage le jour suivant suite cette procédure. Les procédures d’élevage habituelles seront respectées.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront élevés pendant 35 jours comme dans un élevage standard de poulets. Ensuite, ils sont envoyés à l’abattoir pour valorisation de la viande sur le marché de l'agroalimentaire comme dans les élevages de poulets standards.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode in vitro pour modéliser la croissance des animaux à partir de la composition de leur microbiote. L’objectif de cette étude est de valider un mélange de bactéries sur l’efficacité alimentaire et donc la consommation d’aliment et la croissance des animaux, il est nécessaire de faire appel à des oiseaux.
Réduction
6 groupes x 16 répétitions (modules de 5 poulets). Ce nombre a été calculé afin de pouvoir observer des différences significatives (pour une valeur de probabilité de 5%, soit une chance sur 20 que notre hypothèse soit fausse) sur les performances zootechniques entre les groupes (amélioration de l’indice de consommation de 2%). Le nombre de 16 (modules) a été déterminé par un test statistique de puissance de notre dispositif expérimental. Le choix de 6 groupes a été fait afin d'avoir un groupe témoin (qui recevra de l'eau), et 5 groupes essais pour pouvoir tester simultanément différentes concentrations et différents mélanges bactériens afin de déterminer une dose optimale et un mélange optimal en un seul projet.
Raffinement
La procédure sera réalisée par des personnes expérimentées et qualifiées. Une surveillance accrue sera faite dans les heures et le jour suivant la procédure. Les oiseaux sont élevés dans les conditions d’élevage standard de 1 jour à 35 jours. Les conditions de température et d’hygrométrie respectent ainsi le cahier des charges décrit ci-après. La température est de 34°C à l’arrivée des poulets et pendant les 2 jours suivants (J0 à J2 d’essai). Puis la température est abaissée progressivement pour arriver à 30°C à J9 d’essai, puis 26°C à J20 d’essai et finir à 21°C de J29 à J35 d’essai. Les conditions d’hygrométrie minimales sont de 30. Après les premières 24h de lumière continue à l’arrivée des poulets, la lumière fonctionne de 4h à 22h de J1 à J35 d’essai. Un sur-grillage plastique est placé au sol des modules afin d’améliorer le confort pour les pattes des poulets. Un papier de démarrage avec de l’aliment est aussi placé les 3 premiers jours. Pendant toute la durée de l’essai, des liens de couleur rouge sont suspendus dans les modules, ils constituent un enrichissement (lien à picorer).
Choix des espèces
Il s’agit de l’espèce cible. Les poussins sont reçus, âgé d’un jour, comme dans les conditions d’élevage habituelles. Ils sont élevés jusqu’à 35 jours, correspondant aux conditions standard d’élevage de poulet de chair. La procédure est réalisée le premier jour de vie du poussin pour s'assurer que le mélange de bactéries lui soit bénéfique dès le premier jour de vie.
Contrôle sur cobayes d’allergène (de diagnostic) à usage vétérinaire : brucelline, tuberculine aviaire ou bovine
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
900 cobayes vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré, 600 tués à l'issue et 300 proposés à l'adoption. Ils reçoivent des injections intramusculaires puis huit injections intradermiques sur les flancs tondus, avec un risque d'abcès aux points d'injection, pour le contrôle réglementaire de lots d'allergènes de diagnostic de la tuberculose et de la brucellose. Les 600 tués le sont faute de données sur les effets à long terme de la procédure, leurs corps étant ensuite utilisés à des fins pédagogiques. Le porteur indique que l'OMSA recommande le cobaye, espèce jugée la plus "sensible", et n'utilise que des femelles, les mâles étant trop "agressifs" en cage commune.
Objectifs
La brucellose et la tuberculose sont deux maladies animales transmissibles à l’homme réglementées, dont le contrôle chez les ruminants domestiques reste une priorité de santé publique vétérinaire en raison de leur fort impact sanitaire et économique. Une surveillance programmée est donc mise en place. Un des outils de diagnostique de la brucellose et de la tuberculose repose sur l’injection aux animaux d’extraits protéiques (brucelline ou tuberculine) dits allergènes. Un animal contaminé par la maladie présentera une réaction locale au point d’injection avec l’allergène correspondant. Dû à de possible réactions croisées, une réaction locale au point d’injection conclura uniquement à une suspission de contamination par la maladie testée. Conformément à la réglementation, les allergènes utilisés dans ce cadre doivent faire l’objet d’un contrôle des lots de fabrication obligatoire avant leur mise sur le marché. Ainsi cette expérimentation permet de vérifier deux points : la non-sensibilisation des animaux à l’allergène (pas d’effet local induit par le produit) et un contrôle d’activité (présence d’une réaction locale lorsque l’animal a été préalablement sensibilisé par la tuberculose ou la brucellose). Si les lots satisfont à ces deux tests ils pourront être mis sur le marché. L’objectif de ce projet est donc d’apporter des éléments nécesaires à la mise sur le marché d’outils de diagnostique pour la brucellose et la tuberculose bovine et aviaire.
Bénéfices attendus
Cette expérimentation animale permet de réaliser les tests de contrôle officiels obligatoires des lots de brucellines et des tuberculines animales (aviaire et bovine) utilisées dans le diagnostique de la brucellose et de la tuberculose. Conformément à la réglementation chaque lot de brucellines et des tuberculines (aviaire et bovine) produits doivent être testés (épreuce de non-sensibilisation et contrôle de l'activité) avant leur mise sur le marché.
Procédures
Sur 8 animaux : 1 injection intramusculaire dans la cuisse de 0.5 ml de brucelline ou de tuberculine de référence diluée dans l’adjuvant du produit à tester. La durée de réalisation de cette injection est de moins de 5 minutes par animal, contention comprise. 5 semaines après cette injection intramusculaire, les 8 animaux subissent chacun 8 injections intra-dermiques de 0.1 ml, dans 8 endroits différents des deux flancs, du produit à tester ou du produit de référence dilué dans de la solution physiologique. Pour cette étape la durée d'intervention par animal est d'approximativement 13 minutes, contention et tonte de la zone où se feront les injections comprises. Sur 2 autres animaux : 1 injection intra-dermique à J0, J5, J10 et J24 de 0.1 ml de produit à tester (brucelline ou tuberculine) diluée dans de la solution physiologique, à raison de deux injections par flanc de chaque animal. La durée de réalisation de chaque injection est de moins de 5 minutes par animal, contention comprise. Sur 2 autres animaux : 1 injection intra-dermique à J24 de 0.1 ml du produit à tester (brucelline ou tuberculine) dilué dans de la solution physiologique, dans le flanc. La durée de réalisation de chaque injection est de moins de 5 minutes par animal, contention comprise.
Impact sur les animaux
Les réactions cutanées liées à la tuberculine ou brucelline sont limitées à une "rougeur" superficielle au point d'injection. Après plusieurs années d'expérience, nous n'avons jamais observé des modifications comportementales des animaux suggérant une douleur ou un inconfort. Néanmoins il est possible que des abcès apparaissent aux points d’injection intra-musculaire dans la cuisse.
Devenir
Les animaux utilisés dans l'épreuve de non-sensibilisation sont placés dans des associations de replacement d'animaux de laboratoire en vue de leur adoption étant donné que les substances injectées sont d’une part stérile et d’autre part non nocives pour l’animal. Cela correspond à 4 animaux sur un total de 12 par lot de produit à contrôler ; soit 300 animaux sur la période de 5 ans de validité de cette saisine. A l'issue de l'épreuve de test d'activité, les 8 animaux utilisés par lot de produit à contrôler sont mis à mort à la fin de la manipulation étant donné le manque de données que nous avons de l'effet de cette procédure sur les animaux à long terme ; soit 600 animaux sur la période de 5 ans de validité de cette procédure. Les carcasses de ces animaux sont ensuite utilisées à des fins pédagogiques.
Remplacement
La réglementation en vigueur impose le contrôle de chaque lot de fabrication d'allergènes avant leur mise sur le marché. Les premières étapes du contrôle des lots produits sont réalisées au laboratoire (apparence et pureté du produit) mais pour les deux tests de non-sensibilisation et de contrôle de l’activité présent dans ce projet il n’existe pas aujourd’hui d’alternative in-vitro.
Réduction
Le nombre minimal de cobayes a été calculé en utilisant un dispositif en carré latin, permettant d’utiliser chaque animal comme son propre témoin, permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux. Par ailleur, depuis 2021, nous avons obtenu des fabriquants de la tuberculine la production de lots de plus grande taille afin de reduire le nombre de lots contrôlés et ainsi le nombre d’animaux utilisés. Dans le cas de brucellines, le contrôle est mutualisé à l’échelle européenne, afin de limiter l’utilisation expérimentale d’animaux dans chaque pays.
Raffinement
Les animaux sont hébergés par groupes de 4 cobayes dans des cages munies d’une plateforme de repos avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (rondins en bois). Une période d’acclimatation d’une semaine est réalisée avant la mise en place du protocole. Les expérimentations antérieures ont montré que les deux tests réalisés n'engendraient pas d'effets secondaires chez les animaux suite aux injections intradermiques. Une surveillance quotidienne des animaux avec un contrôle visuel de l'état général des animaux (prise d'aliments et d'eau normale) et une surveillace des points d'injections intradermiques est mise en place. Si toutefois le produit à contrôler montrait une forte réaction dès la première injection à J0 alors une décision sur la continuité de l’expérimentation serait prise en fonction de la force de la réaction et en concertation avec notre vétérinaire sanitaire. Dans de rare cas il a été observé la formation d'un abcès au point d'injection intramusculaire dans la cuisse ; abcès qui s'est toujours résorbé. Dans le cas de la formation d'un abcès repéré lors de la surveillance quotidienne des animaux (surveillance identique à celle mise en place suite aux injections intradermiques), une surveillance journalière accrue serait mise en place avec prise de photos des abcès pour évaluer leur évolution dans le temps ; si l’abcès persiste ou s’amplifie le vétérinaire sanitaire est contacté pour avis (traitement mis en place ou arrêt de l’expérimentation par mise à mort de l’animal).
Choix des espèces
L'organisation mondiale pour la santé animale (OMSA) recommande l'utilisation de cobaye pour ces tests. En effet le cobaye est l'espèce la plus sensible d’un point de vue de la réaction immunitaire locale pour le contrôle des brucellines et des tuberculines animales (aviaire et bovine). Les animaux utilisés sont des adultes d'un poids maximum de 250 g pour garantir le respcet des doses utilisées. L'hébergement des animaux se faisant par groupe, uniquement des femelles sont utilisées ; les mâles présentent trop d'agressivité entre individus quand hébergés dans une même cage.
Optimisation des immunothérapies anti-tumorales utilisant le transfert adoptif de cellules T après expansion ex vivo : impact du micro-environnement lymphopénique généré
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
6 472 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Elles subissent l'ablation d'une phalange pour génotypage, une lymphopénie induite par radiothérapie ou chimiothérapie, une greffe de tumeur et de six à sept injections, avec une perte de poids possible. L'objectif est d'étudier le devenir de lymphocytes T anti-tumoraux transférés dans un environnement lymphopénique, les organes étant prélevés à l'issue. Le porteur affirme que ces questions "ne peuvent pas être abordées" par des méthodes in vitro ou in silico et invoque la proximité des systèmes immunitaires murin et humain.
Objectifs
L’objectif de ce projet s’inscrit dans l’optique de se rapprocher des approches thérapeutiques utilisées en immunothérapie anti-tumorale (à savoir chimiothérapie ou radiothérapie), et ainsi les protocoles établis dans l’équipe dans le cadre d’une précédente demande de saisines au transfert adoptif de cellules T anti-tumorales. Nous nous intéresserons aux aspects suivants : - Impact des diverses méthodes d’induction de la lymphopénie (radiothérapie vs chimiothérapie vs souris génétiquement lymphopéniques) sur le devenir des cellules T anti-tumorales. - Devenir des cellules T anti-tumorales après transfert adoptif dans des souris lymphopéniques (utilisant une des 3 approches) et en présence d’une tumeur solide ou liquide.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de notre projet sont tout d'abord une meilleure compréhension des mécanismes associés au devenir de lymphocytes T greffés dans divers environnements lymphopéniques (chimiothérapie vs radiothérapie) ainsi que les conséquences pour leur efficacité anti-tumorale. D'autre part, le développement de nouvelles stratégies anti-tumorales, basées sur les propriétés du système immunitaire pour cibler et éliminer les tumeurs, et auxquelles sont associés un conditionnement lymphopénique, a permis d’améliorer les traitements contre le cancer nous espérons que ces travaux permettront d'améliorer ces approches thérrapeutiques. Ainsi, des traitements basés sur l’injection de lymphocytes T sont maintenant approuvés en clinique pour le traitement de certains cancers hématologiques. Toutefois, malgré des résultats spectaculaires, des formes réfractaires à cette approche persistent. Différentes explications peuvent être invoquées incluant un défaut de persistance ou encore une altération de leur fonctionnalité qui pourraient être en partie la conséquence du conditionnement lymphopénique utilisé. Ainsi, il est crucial de déterminer les causes de ces échecs afin d’optimiser l’efficacité de ces nouvelles thérapies pour cet enjeu majeur de santé publique.
Procédures
Les animaux subiront différents types d'interventions, injections ou prélèvements pour lesquelles la douleur est faible à modérée et ne requièrent pas plus que quelques minutes par animal. Par souci du bien être animal et en fonction du type d'injection, l'intervention sera réalisée sous anesthésie ou contention appropriée de l'animal. En moyenne, un animal sera identifié/génotypé par ablation d'une phalange distale et subira par expérimentation: 6-7 injections intra.péritonéale (ip), 1 injection i.o (intra-orbitale) ou i.v (intra-veineuse) et, dans le contexte des études à plus long terme, pourra être prélevé (à l’aide d’un stylet au niveau de la veine mandibulaire) 1 fois toutes les 2 semaines au cours d’une expérience.
Impact sur les animaux
L'induction de l'état lymphopénique par chimiothérapie ou radiothérapie peut induire une perte de poids transitoire. Par ailleurs, la greffe de cellules tumorales peut également s'accompagner d'une perte de poids ou impacter l'étât général des souris. Toutefois, il est important de noter que la plupart des animaux seront co-injectés avec des cellules T ciblant les tumeurs, et ayant des fonctions anti-tumorales. Dès l'apparition de symptômes ou dès que les animaux atteignent un des points limites définis, les souris seront euthanasiées.
Devenir
L'ensemble des animaux sont sacrifiés en fin de protocole afin de prélever les organes d'intérêt et réaliser les différentes analyses décrites.
Remplacement
Le projet décrit dans le cadre de cette demande requiert une analyse intégrée in vivo de l’impact d’un état lymphopénique sur le devenir de cellules T anti-tumorales, en présence ou en absence de tumeurs. Ces questions ne peuvent pas être abordées à l’heure actuelle au moyen de méthodes alternatives in vitro ou in silico, et demandent ainsi de faire appel à des modèles animaux, murins dans le cas présent, en raison des grandes similitudes du système immunitaire murin et humain, ainsi que du panel important de modèles à disposition pour identifier les paramètres essentiel dans ces processus.
Réduction
Pour optimiser le nombre d’animaux maintenus et le nombre total d’animaux utilisés dans l’ensemble de l’étude, mâles et femelles adultes seront utilisés pour les expériences proposées. Par ailleurs, chaque fois que cela sera réalisable, les expériences seront combinées afin de partager les groupes contrôles employés. Les données obtenues dans nos précédents travaux ainsi que les données disponibles dans la littérature nous permettent d’évaluer le degré de variabilité expérimentale et ainsi estimer au plus juste le nombre d'animaux nécessaires pour atteindre une significativité statistique.
Raffinement
Même si les lignées murines utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype induisant une souffrance ou angoisse à l’état basal, nous nous assurerons par plusieurs mesures de réduction des sources de stress potentiels: notamment, les animaux sont maintenus à plusieurs par cage et manipulés par maximum 2 personnes dédiées. Le milieu proposé est enrichi pour favoriser la construction de nids (cotons, cabanes). Au cours des expérimentations, une observation régulière des souris sera effectuée. Une fiche de suivi « clinique » a été établie pour réaliser l’observation des animaux en expérimentation, évaluer leur état et suivre précisement les points limites. En effet, les points limites sont ainsi clairement établis (perte de poids, état général, niveau de croissance tumorale) et détaillés pour chacune des procédures de ce projet.
Choix des espèces
Comme noté précédemment, le système immunitaire murin présentant de très fortes analogies avec le système immunitaire humain, il constitue un modèle de choix pour des projets intégratifs s’attachant à l’étude des constituants du système immunitaire. De plus, les modèles murins lymphopéniques et tumoraux, de par leurs similitudes avec les conditions pathologiques humaines, représentent des systèmes uniques d’étude de ces phénomènes. Ainsi, pour se rapprocher du traitement de la pathologie humaine, les animaux utilisés dans le contexte de ce projet seront des animaux adultes matures dont l’age sera compris en moyenne entre 8-14 semaines.