Procédures légères

Génétiquement modifiées pour reproduire une ataxie neurodégénérative rare, une partie des souris développe des troubles moteurs légers dès huit jours. 4 392 animaux vont être utilisés dans des procédures classées légères, pour maintenir et génotyper cette lignée modèle de la maladie AOA1. Le génotypage repose sur un prélèvement de tissu invasif, réalisé une fois par animal sur souris vigile. Selon leur patrimoine génétique, certaines sont orientées vers d'autres projets de recherche, les autres tuées faute de pouvoir être réutilisées ou placées.

Objectifs

L’Ataxie Apraxie Oculomotrice de type 1 (AOA1) est une maladie neurodégénérative rare caractérisée par une dégénérescence d’une zone cérébrale spécifique. Cette pathologie est liée à une mutation génétique qui conduit à une incapacité à réaliser des mouvements volontaires et un handicap moteur sévère. La mise au point d’un traitement pour l’AOA1 est cruciale pour les patients atteints de cette maladie qui ne bénéficient actuellement d’aucune solution thérapeutique. Il existe un modèle murin de la pathologie pertinent pour l’évaluation de stratégie thérapeutique avant leur évaluation chez l’Homme. L’objectif du projet sera de réaliser des prélèvements invasifs de tissu permettant de connaitre le patrimoine génétique des animaux produits afin de maintenir la colonie de ce modèle murin génétiquement modifié, pour permettre par la suite de tester différentes approches thérapeutiques dans des projets dédiés.

Bénéfices attendus

L’Ataxie Apraxie Oculomotrice de type 1 (AOA1) est une maladie neurodégénérative rare de la famille des ataxies cérébelleuses autosomiques récessives. Ce trouble neurologique héréditaire se caractérise par une ataxie cérébelleuse à début précoce (âge moyen d’apparition : environ 4 ans) et entraine un handicap moteur sévère, avant l’âge de 25 ans. A ce jour, il n’existe aucun traitement curatif pour les patients. Le bénéfice du projet sera de connaitre le patrimoine génétique des animaux que nous produisons afin de maintenir une lignée de souris génétiquement modifiées, modèle de cette pathologie. Ceci nous permettra de générer des lots expérimentaux pour différents projets de recherche portant sur l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de l’AOA1. A plus long terme ce projet pourrait donc permettre d’améliorer les connaissances sur l’AOA1 et contribuer à l’amélioration de la prise en charge des patients.

Procédures

Afin de connaitre leur patrimoine génétique tous les animaux produits auront un petit prélèvement de tissu, effectué une fois sur animal vigile (moins d’une minute par animal). Dans de très rares cas (problème technique), un deuxième prélèvement pourra être nécessaire (1 fois, moins d’une minute par animal, vigile). Une partie des animaux présentera des troubles moteurs légers détectables à partir de l’âge de 8 jours mais qui ne présenteront pas d’impact significatif sur l’animal.

Impact sur les animaux

Les animaux ressentiront une légère et brève douleur au moment du prélèvement pour connaitre leur patrimoine génétique. Il existe également un risque de saignement à la suite du prélèvement. Ils pourront ressentir un stress lors des manipulations. Une partie des animaux du projet peuvent présenter des légers troubles moteurs liés à leurs modifications génétiques (phénotype dommageable) observables à partir de l’âge de 8 jours, mais qui n’entrainent pas d’effets indésirables significatifs.

Devenir

En fonction de leur patrimoine génétique, une partie des animaux sera dirigée vers d’autres projets de recherche, en utilisation continue. Tous les autres animaux seront euthanasiés car ils ne pourront pas être réutilisés dans d’autres projets ou replacés du fait de leur modification génétique.

Remplacement

Il a été démontré qu’un modèle cellulaire d’AOA1 peut être généré à partir de cellules souches de patients. Bien que ce modèle cellulaire constitue un outil pertinent pour l’étude des altérations moléculaires et cellulaires associées à la pathologie, il présente des limitations majeures. En particulier, il ne permet pas de reproduire le phénotype ataxique ni d’évaluer les conséquences fonctionnelles et comportementales de la maladie. Dans ce contexte, le recours à un modèle animal apparaît indispensable afin de reproduire de manière adéquate les troubles moteurs et neurodégénératifs observés chez les patients. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de recourir à des études pré-cliniques chez l’animal. La souris représente un modèle pertinent pour approfondir la compréhension des mécanismes physiopathologiques de l’AOA1 et pour évaluer des approches thérapeutiques, notamment de thérapie génique, susceptibles de ralentir la progression de la maladie et potentiellement la guérir. Étant donné qu’un modèle de l’AOA1 associé à la mutation génétique que nous voulons cibler a déjà été créé chez cette espèce, ce modèle constitue un outil particulièrement pertinent et approprié pour nos études de recherche.

Réduction

Du fait de la nature du projet (prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux), il n’y aura pas de tests statistiques. Nous piloterons notre élevage afin de ne produire que le nombre d’animaux nécessaires pour correspondre à nos besoins stricts pour les projets de recherche et le maintien de notre lignée. Nous prévoyons donc de produire au cours du projet un nombre total maximal de 4392 souris afin de constituer nos cohortes d’étude (contrainte de génotype). Nous contrôlerons les accouplements pour générer uniquement les animaux nécessaires, ainsi, en fonction de nos besoins expérimentaux au cours des 5 années du projet il est possible que nous produisions finalement moins que ce nombre maximal. Les animaux produits seront en utilisation continue dans des projets d’évaluation de thérapies dans lesquels les effectifs par groupe auront été définis à l’aide de tests statistiques afin d’inclure uniquement le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement exploitables. De plus nous inclurons dans ces groupes les mâles et les femelles, en effet nous pouvons utiliser les 2 sexes dans ce modèle murin préclinique car la mutation d’intérêt n’est pas liée au sexe, ce qui limitera le nombre d’animaux à produire.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils auront à disposition de l’eau et de la nourriture à volonté, ainsi qu’un enrichissement de leur environnement (bâtonnet de bois à ronger et coton pour nidifier au minimum). Les animaux en provenance d’un fournisseur bénéficieront d’une semaine d’acclimatation avant leur mise en accouplement. Une attention particulière est portée aux animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne par la zootechnie, la mise en place de points limites et de soins adaptés. Le prélèvement pour le génotypage est de la plus petite taille possible et réalisé sur de jeunes animaux (moins de sensibilité à la douleur et cicatrisation rapide), c’est un geste rapide et maitrisé qui est réalisé par des personnes compétentes dans un endroit calme dédié. Les petits sont replacés rapidement avec leur mère et le reste de la portée pour leur redonner un environnement réconfortant. Ils sont surveillés immédiatement puis environ 30 minutes après pour s’assurer de l’absence de saignement et de la bonne prise en charge par la mère. Le matériel est propre et désinfecté entre chaque animal pour limiter le risque d’infection et de contamination croisée. Une partie des animaux pourra présenter des troubles moteurs en lien avec leur modification génétique (phénotype dommageable). Ces troubles ne seront réellement impactant qu’à partir de l’âge de 200 jours environ or les animaux concernés seront transférés dans des projets dédiés aux expérimentations dès l’âge de 21 jours environ. Les techniques de raffinement spécifiques à ce phénotype dommageable sont donc prévues exclusivement dans les projets expérimentaux.

Choix des espèces

Nous avons besoin d’un modèle animal fiable pour reproduire et étudier la pathologie et pertinent pour tester par la suite différentes approches thérapeutiques. La souris est un modèle bien connu, son génome est connu et de nombreux outils sont disponibles pour le modifier, permettant ainsi d’introduire des mutations génétiques spécifiques pour la modélisation de pathologies humaines. Dans notre cas cette espèce représente un modèle pertinent puisqu’un modèle de l’Ataxie Apraxie Oculomotrice de type 1 (AOA1) associé à la mutation génétique que nous voulons cibler a été créé chez cette espèce. Cette lignée permet de reproduire les signes observés chez les patients atteints d’AOA1. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera réalisé à l’âge de 7 à 10 jours. Cet âge nous permettra de bénéficier de la cicatrisation rapide observée chez les jeunes animaux et de connaitre très tôt leur génotype afin de les transférer dans les projets d’expérimentation à partir du sevrage.

64 320 souris vont être utilisées pour maintenir et génotyper des lignées destinées à l'étude des maladies rénales chroniques, dans des procédures classées légères. Chacune subit un unique prélèvement de queue de quelques secondes, seul acte du protocole. Le porteur présente ces modifications génétiques comme sans conséquence dommageable pour les animaux. Les souris sont tuées après reproduction ou quand leur génotype ne correspond pas, celles qui conviennent partant vers d'autres projets où elles seront mises à mort.

Objectifs

Les maladies rénales chroniques représentent un problème de santé publique majeur, touchant 850 millions de personnes dans le monde. Ces pathologies, d'origine génétique ou acquise, se caractérisent par une altération progressive et irréversible de la fonction et de la structure du rein. Actuellement, il n'existe aucun traitement permettant d’enrayer efficacement cette progression, qui conduit souvent à l’insuffisance rénale terminale, nécessitant alors une dialyse ou une greffe rénale. Cette absence de solutions thérapeutiques curatives souligne la nécessité de mieux comprendre les mécanismes biologiques et cellulaires impliqués dans la progression des MRC. L’objectif de ce projet est de permettre la création et/ou le maintien de lignées murines transgéniques, avec ou sans phénotype rénal observable, afin de fournir des modèles pertinents pour l’étude de ces mécanismes. Ces lignées sont essentielles pour identifier les voies physiopathologiques impliquées et, à terme, développer de nouvelles approches thérapeutiques. Les modifications génétiques concernées n’entrainent pas de conséquences dommageables pour les souris. Ces modifications génétiques sont deteminées par génotypage qui consiste en l’analyse de l’ADN pour identifier la présence, l’abscence ou la modification d’un gène.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de générer et de maintenir des modèles de souris permettant l’étude des mécanismes de maladies rénales chroniques pour lesquelles aucun traitement n’est actuellement disponible. Une meilleure compréhension de mécanismes responsables de la destruction du rein permettra d’améliorer les traitements à destination des patients atteints par ces maladies.

Procédures

Prélèvement de queue sur animal vigile (1 fois, 5sec).

Impact sur les animaux

La contention et le prélèvement peuvent provoquer un stress et une souffrance légère et transitoire de quelques minutes.

Devenir

Les animaux sont mis à mort après accouplement ou si leur génotype n’est pas celui attendu. Les animaux de génotype souhaité mais non utilisés pour le maintien des colonies feront l'objet d'une utilisation dans le cadre de projets d'expérimentations faisant l’objet d’une demande d’autorisation séparée et seront mis à mort au terme de cette utilisation.

Remplacement

Compte tenu de l’absence de modèle cellulaire complet, il n’est pas possible du substituer des approches in vitro aux modèles murins impliqués dans ce projet. Il n’y a pas de remplacement possible fiable à l’heure actuelle pour le prélèvement de queue.

Réduction

Les stratégies d’accouplements ont été calculées selon les expériences antérieures pour générer un nombre suffisant d’animaux pour mener à bien les projets de recherche. Le nombre d’animaux est justifié par l’utilisation de différents fonds génétiques car nous avons montré que le fond génétique est un déterminant essentiel des lésions rénales. D’autre part, les deux sexes sont étudiés car la sensibilité aux lésions rénales peut différer entre mâles et femelles.

Raffinement

Les souris seront surveillées par les membres qualifiés de l'animalerie et par les responsables du projet afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne en charge du projet. Des points limites spécifiques ont été établis. Tout animal en souffrance recevra un soin adapté (anti-septique, compression). Si les points limites établis sont atteints sans possibilité de soulager l’animal, celui-ci sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Afin de permettre l’identification des souris et l’analyse de leurs gènes avant leur sevrage, le tatouage des coussinets et le prélèvement de queue sont effectués entre 7 et 10 jours de vie.

Pour entretenir une lignée de souris porteuses d'une maladie génétique rare des vaisseaux, 3 030 animaux vont être utilisés dans des procédures classées légères. Chaque petit est identifié par une puce sous la peau et génotypé par une biopsie de la queue ou de l'oreille sur animal vigile. Chez les souris atteintes, le porteur indique que la mort survient brutalement, sans signe annonciateur. Les animaux sont expédiés vers d'autres utilisations ou tués quand leur génotype ne convient pas, quand la colonie est assez grande ou en cas d'anomalie.

Objectifs

L'objectif de ce projet est l’étude de modèles souris reproduisant une maladie génétique rare vasculaire du tissu conjonctif qui provoque une souplesse anormale des articulations, une peau très élastique et des tissus fragilisés dont les vaisseaux sanguins. Chez l’Homme, la majorité des décès est due à des ruptures artérielles.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est de valider des essais de différents traitements médicamenteux ayant permis d'améliorer la survie des souris développent cette maladie. A terme, les résultats de ce projet permettraient de mieux comprendre les mécanismes conduisant à ces ruptures artérielles afin de proposer des thérapies et d'améliorer le diagnostic, le confort de vie des patients et le traitement.

Procédures

Chaque petit obtenu sera marqué par injection sous cutanée d’une puce électronique pour un suivi individuel et sera génotypés pour identifier les animaux d’intérêt. L'injection de la puce est rapide et se fait par voie sous-cutanée dans la région du cou ; la contention de l'animal dure moins d'une minute. Le prélèvement de bout de queue et/ou d'oreille dure également moins d'une minute. Le prélèvement se fait sur animaux vigiles, avant le sevrage pour le prélèvement d'un bout de queue et après l'âge de 14 jours pour le prélèvement d'oreille. De manière générale, une seule biopsie est réalisée par animal, en cas de nécessité de refaire la caractérisation génétique, une deuxième biopsie par animal pourrait être réalisée en suivant les préconisations liées à l'âge de l'animal.

Impact sur les animaux

Dans le cas des souris développent la maladie, la mort survient subitement sans aucun symptôme identifié. La biopsie, en particulier le prélèvement d'un bout de queue, peut causer de la douleur et de l'inconfort aux animaux. Même si la procédure est rapide, la coupure d'un bout de queue ou la perforation de l'oreille peut être douloureuse. La manipulation des animaux pour biopsie peut causer du stress et de l'anxiété. Suite à la biopsie, les animaux pourraient être temporairement limités dans leurs activités normales, notamment si la douleur ou l'inconfort les affecte.

Devenir

Les animaux sont soit expédiés en vue de leur utilisation, soit mis à mort lorsque les résultats du génotypage ne sont pas conformes, lorsque la taille de l’élevage souhaitée est atteinte ou lorsqu’ils présentent une anomalie congénitale. Si des animaux d'intérêts ne peuvent pas être expédiés (du fait par exemple d'une annulation de l'expérience), ils seront mis à mort.

Remplacement

L’étude sur cellules en culture ne permet que d’explorer des modifications limitées dans des conditions de culture particulière. L'étude des conséquences des mutations sur animal entier est donc indispensable pour la compréhension des mécanismes globales de la maladie.

Réduction

Afin de réduite la quantité d'animaux utilisé dans ce projet, nous produirons les lots uniquement par Fécondation In Vitro (FIV). La production d'animaux par FIV permet de réduite au minimum le nombre d'animaux utilisé pour la production des lots (au vu des données que nous avons et de notre expertise nous estimons que le sperme collecté sur 2 mâles permettra de produire environ 350 petits). De plus, aucun stock d'animaux ne sera conservé pour le maintien d'une colonie ; les animaux produits par FIV seront uniquement destinés à l'expérimentation.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Des grilles de score de surveillance avec des points limites suffisamment prédictifs seront renseignées.

Choix des espèces

Ce modèle de souris transgéniques a déjà été créé et caractérisé. Nous avons donc besoin de poursuivre les études sur ce dernier. Les mâles utilisés pour les cryoconservations de sperme seront utilisés entre 10 et 20 semaines d'âges. Les mâles produits seront eux envoyés en expérimentation à 4 semaines d'âge. Seuls les mâles seront utilisés pour l'expérimentation car les ruptures artérielles spontanées sont observées essentiellement chez les souris mutées mâles (de l’ordre de 50% à 24 semaines) vs les souris femelles (de l’ordre de 20%), et un effet spécifique de la testostérone a été observé et en cours d’analyse.

Privées de système immunitaire par construction, donc incapables de repousser une infection, 1 000 souris vont être utilisées pour l'élevage, dans des procédures classées légères. Cette lignée sert à fournir aux équipes du site des animaux capables de porter des greffes de tumeurs humaines sans les rejeter. Le porteur indique qu'une infection peut évoluer vers une perte de poids marquée, une atteinte sévère d'un organe et la mort, tout en affirmant maîtriser ce risque par des conditions barrières. Les reproductrices de plus de onze mois sont tuées, les autres versées vers des protocoles expérimentaux qui les mettront à mort.

Objectifs

Les cancers du sang, comme les leucémies et les lymphomes (une forme de leucémie localisée à un organe, comme la rate ou l'estomac), étaient autrefois très souvent mortels. Aujourd’hui, une nouvelle approche, appelée thérapie par cellules CAR-T, a profondément changé la donne. Elle consiste à prélever des cellules du système immunitaire du patient, à les modifier en laboratoire pour qu’elles reconnaissent et attaquent les cellules cancéreuses, puis à les réinjecter au patient. Grâce à cette technique, certaines personnes peuvent aujourd’hui guérir. Cependant, ce traitement peut parfois provoquer des effets secondaires importants. Notre projet vise à réduire ces effets indésirables en améliorant et en modifiant génétiquement ces cellules afin de les rendre plus sûres. Avant de pouvoir proposer ces nouvelles cellules à des patients dans le cadre d'un essai clinique, nous devons toutefois vérifier leur efficacité et leur sécurité. Pour ce faire, il est indispensable d'utiliser un modèle expérimental chez la souris. Nous travaillons avec une lignée de souris dépourvue de système immunitaire. L'absence de système immunitaire permet à ces lignées murines de supporter la greffe de tumeurs humaines sans risque de rejet. Il est ainsi possible d'amplifier les tumeurs obtenues à partir de prélèvements de patients (des cellules qui ne peuvent pas être cultivées en éprouvette) et de reproduire une pathologie proche de la leucémie humaine afin de tester l'efficacité des nouvelles thérapies. Notre projet a été approuvé par deux agences d'évaluation de la recherche.

Bénéfices attendus

Ce projet d’élevage permettra de fournir des souris sans système immunitaire (appelées souris immunodéficientes) aux équipes de recherche de notre site. Ces souris sont indispensables pour tester de nouveaux traitements contre le cancer dans des conditions proches de la réalité, avant de pouvoir les proposer à des patients.

Procédures

Ce projet consiste dans l'élevage d'une lignée de souris. Un mâle sera mis en couple avec 2 femelles et les souriceaux seront séparés après le sevrage (3 à 4 semaines d'âge). Les souris n'auront aucun prélèvement.

Impact sur les animaux

En raison de leur immunodéficience, ces souris sont sensibles aux infections. Les animaux immunodéprimés ne sont pas en mesure de se débarrasser des infections qu'ils contractent. Dans certains cas, les signes cliniques restent modérés, mais l’infection peut rapidement évoluer vers une dégradation brutale de l’état général, une perte de poids et une atrophie musculaire marquées, ainsi qu'une atteinte sévère de l’organe infecté (difficulté à respirer pour les poumons, plaies sanguinolentes pour la peau, etc.). En l’absence de traitement, l’infection persistante peut entraîner la mort. Tenant compte du statut sanitaire de la colonie et de la mise en place des conditions barrières strictes les risques infectieux seront reduits au minimum.

Devenir

Les souris reproductrices qui auront plus de 11 mois seront euthanasiées. Les souris qui présenteront des plaies dues à des bagarres et qui en souffriront seront également mises à mort. Globalement, au cours de la procédure d'élevage, une attention extrême sera portée pour qu'aucune souris ne se retrouve en état de souffrance. Les souris impliquées dans d'autres procédures expérimentales, en dehors de l'élevage, seront mises à mort en fonction des points limites explicitement précisés dans les protocoles écrits pour ces manipulations, en dehors du projet d'élevage.

Remplacement

L'étude des cellules leucémiques de patients n'est pas possible in vitro (en éprouvette), car les conditions de culture actuelles ne permettent pas de les maintenir et de les faire se développer. De plus, l'évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cadre de traitements contre le cancer nécessite l'utilisation de modèles animaux permettant de reproduire les interactions entre les cellules tumorales et le microenvironnement cellulaire (c'est-à-dire les autres cellules de l'organisme en contact avec la tumeur). À ce jour, l'utilisation de souris immunodéficientes reste obligatoire pour de nombreux projets de recherche fondamentale et translationnelle, c'est-à-dire une recherche qui vise à trouver de nouvelles méthodes de traitement.

Réduction

Nous adapterons l'élevage aux besoins des équipes de recherche. Nous connaissons bien cette lignée de souris immunodéficientes (nombre et taille des portées), ce qui nous permet de gérer l'élevage de manière optimale. Pour chacun des projets des autres DAP, 80 souris sont nécessaires pour évaluer un type de thérapie cellulaire (40 souris témoins et 40 souris traitées). Cet effectif a été calculé en tenant compte de la variabilité interindividuelle observée dans les modèles tumoraux, afin de permettre la réalisation d’un test t de Student (niveau de signification : 5 %, puissance : 90 %, moyenne du groupe témoin : 10, moyenne du groupe expérimental : 7, écart-type : 4,1) (https://sealedenvelope.com/power/continuous-superiority/).

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes afin de respecter leur comportement naturel. Ils seront hébergés dans des portoirs ventilés en surpression, c'est-à-dire dans des endroits qui les protègent des agents infectieux. Ils recevront de la nourriture irradiée conditionnée en double emballage, ce qui les protège des infections. Leur manipulation se fera systématiquement sous une hotte (endroit stérile) afin d'éviter toute contamination par des microbes. De plus, l'ensemble des pièces d'hébergement sont en surpression, ce qui signifie qu'aucun microbe ne peut y pénétrer. Les souris feront l'objet d'une surveillance quotidienne afin de détecter d'éventuels signes de souffrance liés à une infection, en tenant compte de leur apparence et de leur comportement. Des contrôles sanitaires (trois à quatre fois par an) permettront de s'assurer du maintien de la barrière sanitaire et de l'absence d'agents pathogènes dans leur pièce d'hébergement. Un contrôle sanitaire signifie pour les souris une analyse en laboratoire de biologie de leurs urines, selles et serum, afin de détecter d'éventuelles infections.

Choix des espèces

L'utilisation de souris immunodéficientes pour mettre en place un modèle de greffe de cellules cancéreuses humaines est largement décrite dans la littérature scientifique. Ces modèles sont robustes et reproductibles. Les souris seront accouplées à partir de 8 semaines d'âge (maturité sexuelle) et gardées en couple jusqu'a 11 mois. Nous allons utiliser exclusivement des souris sans apparition du phénotype dommageable En tout cas, tenant compte du statut sanitaire de la colonie et de la mise en place des conditions barrières strictes le risque d’apparition du phénotype dommageable est reduit au minimum.

Mises à mort une à cinq jours après une stimulation hormonale pour prélever leurs ovules et leurs embryons, ou tuées pour récupérer testicules et spermatozoïdes, 3 420 souris vont être utilisées dans des procédures classées légères. Les femelles adultes reçoivent deux injections d'hormones à 48 heures d'intervalle, les souriceaux mâles un traitement oral quotidien pendant sept jours suivi d'une injection. Le porteur revendique la souris comme "modèle de choix", ses régulations épigénétiques étant "bien conservées" avec l'humain. La finalité déclarée, comprendre le déclin de la fertilité humaine, reste générale, quand le prélèvement des gamètes impose la mise à mort de chaque animal.

Objectifs

Nous cherchons à comprendre comment l’épigénétique régule la fertilité. L’épigénétique correspond à de petites marques chimiques naturelles, déposées sur l’ADN ou sur les histones, les protéines autour desquelles l’ADN s’enroule. Ces marques déterminent si un gène est allumé ou éteint. Elles jouent donc un rôle central dans l’identité des cellules et leur bon développement. Les cellules reproductrices ou gamètes —les ovules et spermatozoïdes— possèdent des profils épigénétiques uniques, indispensables pour qu’ils accomplissent correctement leur rôle lors de la fécondation. Dans un contexte de baisse de la fertilité humaine, liée à l’exposition croissante à certains polluants, il devient essentiel de comprendre quand ces marques se forment lors du processus développemental qui conduit à la production de gamètes (gamétogenèse), où elles se placent dans le génome, comment elles sont établies et pourquoi elles influencent la qualité des gamètes ainsi que le développement de l’embryon après fécondation. En conclusion, notre étude a le potentiel de mieux comprendre l’origine des infertilités chez la femme et l’homme, dont l’incidence augmente dans les pays industrialisés.

Bénéfices attendus

La souris, espèce Mammifère, est le modèle de choix pour des expériences relatives au domaine de la biologie de la reproduction, domaine dont relève nos projets de recherche. La gamétogenèse et les régulations épigénétiques qui l’accompagnent sont bien conservées entre la Souris et l’Homme, ce qui nous permet d’appliquer directement les connaissances obtenues par l’étude de cet animal à la reproduction humaine. De plus, nous utilisons une collection de modèles de souris génétiquement modifiées qui nous permettent de comprendre comment et pourquoi les marques épigénétiques sont indispensables à la production d’ovules et de spermatozoïdes et pour la fertilité. Cette recherche a un intérêt direct pour appréhender les origines, génétiques et environnementales, du déclin actuel de la fertilité humaine.

Procédures

Dans un premier lot, les souris femelles adultes vigiles sont soumises à deux injections successives d’hormones, avec une durée de 48h entre l’injection de chacune des hormones. Les femelles sont mises à mort entre 1 et 5 jours après la dernière injection d’hormones. Dans un deuxième lot, un traitement est administré oralement aux souriceaux mâles dès leur naissance. Ce produit, mélangé à de la gomme alimentaire, est fourni à l’aide d’une pipette souple une fois par jour pendant 7 jours. Puis, les souriceaux reçoivent un second traitement (injection unique sur animal vigile).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues après les injections sont des douleurs liées à la piqûre elle-même, et sont de courte durée. Les produits injectés n’ont pas d’effet douloureux en eux-mêmes ou d’autre effet néfaste sur l’animal. Il en est de même pour l’administration orale aux souriceaux. Les nuisances sont principalement dues à la contention de l’animal et sont aussi d’une durée de quelques secondes. Le produit en lui-même n’est pas toxique et n’entraine pas d’effet secondaire.

Devenir

Il est nécessaire de mettre à mort les femelles superovulées pour recueillir les ovules, et les embryons après fécondation. Il est aussi nécessaire de mettre à mort les mâles synchronisés pour récupération des testicules et des spermatozoïdes

Remplacement

Les toutes premières étapes de la gamétogenèse peuvent être modélisées in vitro, reproduisant de manière assez conforme ce qui se passe au tout début du développement embryonnaire (jours 6-10 de gestation chez la souris). Notre laboratoire utilise ce type d’approches, pour étudier le développement très précoce. Cependant, les conditions de culture cellulaire ne permettent pas de reproduire l’ensemble de la gamétogenèse dans une boîte de culture, jusqu’à la production finale d’ovules et de spermatozoïdes matures, capables de réaliser le processus de fécondation. La gamétogenèse est en effet un processus de différenciation très complexe - qui dépend de signaux présents dans le testicule ou l’ovaire - dont la chimie et la cinétique de production ne sont pas totalement connues et qui ne peut être mimé de manière efficace et reproductible dans une boîte de culture.

Réduction

La finalité même des procédures ici présentées est de réduire le nombre d’animaux utilisés, en augmentant le rendement de production des gamètes, spermatozoïdes chez les mâles et ovules chez les femelles. Nous avons de plus raffiné nos procédures expérimentales pour réduire le nombre de gamètes utilisés par expérience et réduire ainsi le nombre de souris.

Raffinement

Les injections d’hormones et l’administration orale sont des procédures peu douloureuses et ne nécessitent pas d’anesthésie. De plus, les produits administrés ne sont pas toxiques et n’entrainent pas d’effet secondaire délétère. Une grille de score est mise en place afin d’évaluer de façon objective l’état des animaux et proposer une réponse adaptée.

Choix des espèces

La gamétogenèse et les régulations épigénétiques qui l’accompagnent présentent chez les mammifères des caractéristiques uniques, absentes chez des espèces comme la mouche ou le poisson zèbre. En revanche, ces processus sont fortement conservés entre la souris et l’être humain, ce qui fait de la souris un modèle privilégié pour étudier la biologie de la reproduction. Les connaissances obtenues chez cet animal peuvent ainsi être transposées plus directement à l’Homme. Pour le protocole de superovulation en vue de collecter les ovules matures, nous utilisons des jeunes femelles adultes, âgées de 5 à 8 semaines. C’est à cette période que les femelles sont les plus réceptives à l’injection d’hormones.. Pour le protocole de synchronisation de la spermatogenèse, nous utilisons des mâles jeunes non sevrés (entre 2 jours et 3 semaines post-naissance). Pour obtenir des populations de cellules homogènes, il est nécessaire d’induire la synchronisation dès le premier cycle de spermatogenèse, qui commence à la naissance.

Porteuses d'une déficience génétique provoquant une myopathie progressive, 36 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélever leurs organes. Elles subissent des tests de force musculaire et de coordination, l'étude s'arrêtant vers six à neuf mois, âge où la myopathie se déclare. Le projet teste si une protéine, FrzB, améliore la fonction musculaire dans ce modèle de dystrophie liée à la calpaïne-3. Le porteur qualifie les procédures comportementales de source d'un léger stress, sans détailler les tests ni les effets de l'atteinte musculaire qu'il décrit comme progressive.

Objectifs

Les maladies musculaires peuvent entraîner une perte progressive de la force et de la mobilité. Ce projet vise à tester une nouvelle approche pour améliorer le fonctionnement des muscles dans un modèle de maladie génétique. Des souris présentant une altération musculaire seront étudiées pour évaluer leur force et leur coordination. Une protéine appelée FrzB pourrait améliorer leur état en agissant sur un mécanisme biologique impliqué dans la régulation du muscle. Les animaux seront soumis à des tests simples et peu invasifs, pouvant entraîner un léger stress. Les résultats permettront de mieux comprendre la maladie et pourraient contribuer au développement de futurs traitements.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu sera pour les patients présentant une déficience en calpaine 3. un autre bénéfice et l'amélioration de la compréhension des mécanismes impliqués dans la dystrophie liée à la calpaïne-3. Enfin si ce projet s'avère satisfaisant une validation d’une stratégie de modulation de la voie Wnt qui pourrait servir de base préclinique pour de futures approches thérapeutiques.

Procédures

Les animaux utilisés au cours de ce projet vont développer une atteinte musculaire progressive ayant surtout un impact histologique puisqu'aucun animal ne sera gardé au-delà de 6-9 mois âge auquel la myopathie clinique se déclare. Les animaux seront susceptible de ressentir un léger stress lors des procédures comportementales exploratoires longitudinales.

Impact sur les animaux

Les animaux seront explorés à des stades précoces bien avant que le phénotype soit délélère.

Devenir

Chaque animal sera mis à mort afin de récupérer les organes à la fin de la procédure.

Remplacement

Des approches in vitro ont été utilisées en amont (cellules musculaires, études moléculaires de la voie Wnt). Cependant, ces modèles ne permettent pas d’évaluer : les fonctions motrices intégrées,la coordination, les interactions systémiques. Il n’existe actuellement aucun modèle alternatif validé permettant de répondre à l’ensemble des objectifs du projet. L’utilisation du modèle murin est donc indispensable.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé à partir d’un calcul de puissance statistique a priori. Les analyses principales porteront sur : la force musculaire (grip strength), la coordination motrice (rotarod), Les données issues de la littérature et de nos études préliminaires sur le modèle C3-/- montrent : une diminution moyenne de performance d’environ 25–30 % un écart-type relatif d’environ 15–20 % Le calcul de puissance a été réalisé pour : Test : ANOVA à un facteur (3 groupes) Alpha = 0,05 Puissance (1-β) = 0,80 Taille d’effet estimée : d = 0,40 (effet modéré à important) Ce calcul indique qu’un effectif minimal de 10 animaux par groupe permet de détecter une différence significative entre groupes. Afin de tenir compte d’éventuelles pertes expérimentales (≈10 %), nous prévoyons : 12 animaux par groupe Total = 36 animaux

Raffinement

Dès la naissance des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal. Les animaux seront hébergés par groupe de 3 à 5 avant d’entrer en procédure. L’environnement sera enrichi en fonction des préférences des animaux à l’aide de bandelettes de kraft, de dômes en carton et/ou de buchettes de bois. La manipulation des animaux est faite par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention low stress (cupping). Le modèle que nous utilisons a été caractérisé d’un point de vue phénotypique, nous connaissons l’âge d’apparition des signes de souffrance ou de détresse qui est très tardif. Les points limites nous permetteront de limiter au strict minimum l’apparition de souffrance.

Choix des espèces

L’anatomie et la fonction des muscles squelettiques sont proches des muscles humains. Les souris génétiquement modifiées sont de bons modèles d’étude des atteintes du système neuromusculaire, de leur physiopathologie et de leurs causes génétiques. Les animaux seront étudiés entre 4 semaines et 16 semaines bien avant l'apparition des symptomes délétères qui eux arrivent vers 6-9 mois.