Procédures légères

30 cochons et 30 moutons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent des prélèvements sanguins réguliers et des interventions chirurgicales sous anesthésie pouvant durer plusieurs heures, pour évaluer jusqu'à une dizaine de dispositifs destinés à l'hémostase chirurgicale. Tous sont euthanasiés en fin de projet pour une évaluation nécropsique et histopathologique des tissus et des implants. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal, que l'expérimentation sur l'"organisme entier" est "incontournable" et qu'aucun modèle cellulaire ne peut la remplacer.

Objectifs

L'hémostase est l'ensemble des mécanismes biologiques qui assurent le maintien du sang à l'intérieur des vaisseaux et qui se mettent en place pour arrêter le saignement lorsqu'un vaisseau est blessé spontanément ou secondairement à une intervention chirurgicale. Quand les techniques conventionnelles sont insuffisantes, l’hémostase peut être améliorée en chirurgie par les hémostatiques chirurgicaux. Les hémostatiques chirurgicaux regroupent des médicaments et des dispositifs médicaux qui ont un champ d’utilisation très large à l’hôpital. Ceci est expliqué par les nombreux facteurs de risques hémorragiques liés aux patients et à la chirurgie. A ce jour, il n’existe encore aucune stratégie thérapeutique validée pour orienter le chirurgien vers le choix de produit le plus adapté à chaque situation. Ce projet de recherche s’intéresse au traitement des plaies vasculaires et à l’hémostase chirurgicale et a pour objectif ultime de développer de nouvelles approches multimodales. Ces stratégies intéressent directement le développement de modèles animaux pertinents afin de valider de nouvelles approches thérapeutiques pour s'assurer de l'innocuité et de l'efficacité de ces dispositifs. On entend par dispositif implantable tout dispositif destiné à être implanté de façon invasive en totalité dans le corps humain ou à remplacer une surface épithéliale grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer en place après l'intervention. Jusqu'à une dizaine de dispositifs pourront être évalués dans ce projet. En l'absence de méthodes de remplacement pour reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire, l'évaluation et le développement des nouveaux dispositifs et techniques pour l’hémostase chirurgicale par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives requièrent une phase pré-clinique de recherche et de développement sur l'animal vivant. Les objectifs du projet sont doubles : raffiner les prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) dans la phase initiale du projet, puis ces versions entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs, méthodes et techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité et de l’efficacité des implants pour maîtriser l’hémostase chirurgicale et péri-chirurgicale, éviter leur rejet, et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation qui handicapent les patients, et réduire le traumatisme tissulaire, corollaire de ces interventions, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - la mise à jeun (12 heures) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - les suites post-opératoires (inflammation, douleur : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique), pour cela des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple la protection des plaies, l'usage de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables. A l’heure actuelle ce projet ne peut pas être réalisé à l’aide de modèles cellulaires ou simulé par d’autres techniques de remplacement.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, Rayons X …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en oeuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, des protocoles de prises en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (Anti Inflammatoire Non Stéroïdiens et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifique sont appliqués tout au long du projet. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie qui ressemble à celle de l’Homme avec les mêmes dimensions, ce qui impose l’expérimentation sur des gros animaux pour mimer l’anatomie de patients humains qui vont de l’enfant à l’adulte de grande taille. Les différences interspécifiques de la nature tissulaire, de la forme, de la taille anatomique et aussi de la fonction requièrent l’emploi de plusieurs espèces différentes pour optimiser l’expérimentation et l’évaluation des dispositifs évalués dans ce projet. Les animaux utilisés pourront être de tous les stades de développement : juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.

342 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des souris modèles de trisomie 21 reçoivent jusqu'à trente-deux injections et passent des tests d'apprentissage et de mémoire (labyrinthe en Y, reconnaissance d'objet, piscine de Morris), tandis que des souriceaux subissent des injections intracérébrales sous anesthésie par le froid, pour tester des molécules contre la trisomie 21 et la maladie d'Alzheimer. Le porteur signale des risques d'hématomes, d'hydrocéphalie chez environ 10 % des animaux et d'hypothermie, tous étant tués pour prélever le cerveau. Il affirme qu'"il n'existe pas de méthode alternative" au modèle souris.

Objectifs

Le syndrome de Down encore appelé trisomie 21 est la forme génétique de déficience intellectuelle la plus fréquente résultant de la présence d’un chromosome 21surnuméraire. Plus des trois quarts des personnes porteuses de trisomie 21 développent une maladie d'Alzheimer au-delà de 60 ans. Un certain nombre d'études suggèrent qu'il existe des mécanismes pathogènes communs à la maladie d’Alzheimer et à la trisomie 21 comme des altérations de différents types de neurotransmetteurs impliqués dans le fonctionnement du cerveau. Face à l'origine multifactorielle de ces maladies, une thérapie combinée est envisagée. Cependant, l'association de plusieurs médicaments peut entraîner des effets secondaires supplémentaires dus à des interactions entre les différentes substances. Pour éviter ces problèmes, une nouvelle technologie a émergé ces dernières années qui consiste à utiliser des ligands multi-cibles qui rassemblent en une seule structure plusieurs activités biologiques ciblant divers neurotransmetteurs impliqués dans la maladie.

Bénéfices attendus

Les maladies neurologiques telles que la maladie d’Alzheimer et la trisomie 21 vont nécessiter un traitement au long cours avec une exposition permanente aux médicaments qui devront avoir des effets secondaires minimes. Il n'existe aucun traitement pharmacologique de la déficience intellectuelle chez les personnes atteintes de trisomie 21 et seul un traitement symptomatique est actuellement disponible pour la maladie d’Alzheimer. Le présent projet est innovant car il testera des nouvelles molécules ciblant plusieurs mécanismes présentant un intérêt thérapeutique dans la maladie d’Alzheimer et la trisomie 21. Ces nouvelles molécules seront disponibles sous une formulation conçue pour une administration intranasale qui devrait contribuer à améliorer le passage de la barrière hémato-encéphalique, ce qui limitera également les effets périphériques responsables de la plupart des effets secondaires. Nous testerons en parallèle des molécules ciblant les récepteurs GABA, le principal neurotransmetteur inhibiteur dans le système nerveux central, actives dans le traitement des déficits d’apprentissage et de mémoire dans des modèles murins de trisomie 21. Nous proposons ici une étude qui comparera les effets de deux molécules dont une qui a été utilisée en clinique chez des individus porteurs de trisomie 21.

Procédures

La première étude implique l’utilisation de modèles animaux de trisomie 21 (phénotype considérée dommageable), l'administration des médicaments quelques secondes sur animal vigile à raison de 2 fois par semaine entre 2 et 6 mois (32 injections maximum) puis un prélèvement sanguin qui durera 2-3min par animal et l’anesthésie profonde avant prélèvement du cerveau. La deuxième étude implique l’utilisation d’animaux témoins, l'administration des médicaments quelques secondes sur animal vigile, un prélèvement sanguin qui durera 2-3min par animal vigil et l’euthanasie rapide pour prélever le cerveau. La troisième étude implique l’utilisation de modèles animaux de trisomie 21 (phénotype considérée dommageable), l'administration des médicaments quelques secondes sur animal vigile avant les tests comportementaux (10 injections maximum réparties sur environ 3 semaines). Les capacités cognitives des souris seront évaluées dans 3 différents tests d'apprentissage et de mémoire: Y maze (8 minutes par animal), reconnaissance de nouvel objet (4 sessions de 10 minutes – 1 session par jour - par animal) et piscine aquatique de Morris (4 sessions de 1 minute par jour pendant 7 jours et 1 session - “probe test” - de 1 minute le jour 8 par animal). Après des tests comportementaux, un prélèvement sanguin qui durera 2-3min par animal vigil et l’anesthésie profonde avant prélèvement du cerveau. La quatrième étude implique l’utilisation de souriceaux entre la naissance et 2 jours, des injections intracérébrales qui dureront 2-3 minutes/animal (3 injections par hémisphère cérébral; 6 injections au total/animal). Après 3-10 semaines, ces souris seront anesthésiées avant l’euthanasie pour les enregistrements électrophysiologiques.

Impact sur les animaux

- Contention de l'animal pour l'injection; - Risque d’hématomes lors des injections répétées; - Risque de complications suite à l’injection intracérébrale; - Irritation de la sphère nasale suite aux injections intranasales répétées; -Phénotype dommageable (hydrocéphalie) qui apparaîtra dans environ 10% des animaux; - L'hypothermie due à anesthésie par le froid des nouveau nés pour les injections intracérébrales - Contraintes des tests comportementaux : contention, stress, réalisation individuellement (séparation du groupe), nage dans les tests de mémoire/déficit d’apprentissage.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées par des méthodes réglementaires pour prélèvement de sang et de cerveau pour des analyses biochimiques, électrophysiologiques et immunohistochimiques.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative autre que le recours aux modèles souris de trisomie 21 pour atteindre les objectifs du projet. La règle des 3R (Réduction, Remplacement, Raffinement) a été prise en compte pour la mise en œuvre du projet. Des points limites adaptées à chaue lignée de souris et chaque procédure seront mis en place.

Réduction

Nous utiliserons sur 4 ans un total de 342 souris. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessite et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information. Le nombre d'animaux est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre a été calculé sur la base d'études précédemment publiées, notamment des études du laboratoire.

Raffinement

Les méthodes utilisées et la manière de traiter les animaux pendant les expériences et dans l’animalerie assureront à ces derniers un minimum de contraintes et un maximum de bien-être. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les procédures expérimentales sont les plus appropriées pour minimiser toute douleur, souffrance, anxiété/détresse ou dommage que les animaux pourraient subir. Des mesures telles que la formation du personnel, la surveillance quotidienne, l'habituation, l'acclimatation et le temps de récupération sont prises pour réduire tout impact physique et psychologique potentiel des procédures expérimentales. Des points limites ont été mis en place et les mesures associées seront scrupuleusement respectées.

Choix des espèces

Les modèles de souris ont été essentiels pour mieux comprendre la trisomie 21 au cours des dernières années. Trois chromosomes de souris contiennent des régions similaires au chromosome 21 humain. Les souris modèles de trisomie 21, avec une duplication de la plupart des gènes du chromosome 21, sont actuellement disponibles. Dans la première étude, les performances comportementales seront évaluées sur les souris modèles de trisomie 21 mâles et femelles à l'âge de 6 mois après administration chronique de drogues, et les cerveaux seront prélevés suite aux tests comportementaux et à l’euthanasie. Dans la deuxième étude, les expériences de pharmacocinétique seront réalisées sur des souris témoins mâles à l'âge de 2 à 3 mois. Dans la troisième étude, les performances comportementales seront évaluées sur les souris modèles de trisomie 21 mâles et femelles à l'âge de 3 à 4 mois traités avec les composés inhibiteurs. La dernière étude, sera réalisée sur des souris entre la naissance et 3 jours qui recevront une construction virale permettant d’exprimer une protéine fluorescente dans des neurones très spécifiques permettant leur enregistrement électrophysiologique à entre 25 et 70 jours après euthanasie. Les effets du médicament sur les performances comportementales et la pathologie cérébrale seront évalués chez les souris adultes. D'autre part, l'injection intracérébrale de la construction virale chez les souriceaux est nécessaire pour une expression efficace et à long terme d'une protéine fluorescente dans un sous-type particulier d'interneurone que nous voulons étudier.

50 cochons et 25 chiens vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent des prélèvements sanguins hebdomadaires, des prélèvements de moelle osseuse et l'implantation chirurgicale sous anesthésie de dispositifs oculaires, opérations pouvant durer plusieurs heures, pour évaluer jusqu'à une dizaine de prototypes censés restaurer la vision. À la fin, tous sont euthanasiés pour prélever et analyser les tissus, le porteur invoquant une obligation règlementaire. Sur le remplacement, il affirme que l'expérimentation sur l'"organisme entier" est "incontournable" et le recours à des mammifères de grande taille "nécessaire" pour reproduire l'anatomie humaine.

Objectifs

Les pathologies oculaires entrainent des lésions qui peuvent affecter gravement la vision de manière irréversible. Ces pathologies sont multiples et peuvent atteindre les différents segments de l’œil : dégénérescence maculaire liée à l’âge, hyperpigmentation focale, rétinopathie chronique, décollement de rétine, néovascularisation, cataracte, glaucome, greffe de la cornée… Plusieurs pathologies de cécité résultent de la perte des photorécepteurs ou des cellules ganglionnaires de la rétine qui communiquent l’information visuelle au cerveau via le nerf optique. Différentes stratégies thérapeutiques sont à l’étude pour ralentir la dégénérescence des cellules par des approches pharmacologiques ou de thérapie génique. Les prothèses rétiniennes permettent de proposer une solution pour les patients ayant perdu la vision en réactivant les cellules rétiniennes résiduelles par stimulations électriques via un dispositif électronique. Ce projet de recherche s’intéresse aux nouvelles approches thérapeutiques dans le traitement des pathologies oculaires. L’objectif est de conduire des études permettant d’évaluer de nouveaux dispositifs médicaux implantables et de nouvelles approches chirurgicales visant à restaurer la vision et les fonctions altérées de l’œil. On entend par dispositif implantable tout dispositif destiné à être implanté de façon invasive en totalité dans le corps humain ou à remplacer une surface épithéliale grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer en place après l'intervention. Jusqu'à une dizaine de dispositifs pourront être évalués dans ce projet Les différentes itérations de prototypes des dispositifs doivent être confrontées au modèle animal de grande taille qui permet de respecter les contraintes anatomiques trouvées chez l’homme en reproduisant fidèlement le contexte clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire visé pour les futures applications humaines. Les objectifs du projet sont doubles : raffiner les prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) dans la phase initiale du projet, puis ces versions entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs/méthodes/techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).

Bénéfices attendus

Les avantages escomptés du projet sont : - Une amélioration de la sécurité et/ou de l'efficacité des implants, dispositifs et techniques évalués. - Une amélioration de la durabilité des implants (permettant par exemple d’éviter le rejet de ceux-ci et les ré opérations parfois multiples des patients), la réduction de l'invasivité du geste chirurgical et des temps opératoires (permettant par exemple la réduction du traumatisme tissulaire et du risque infectieux secondaires, corollaires de ces interventions) sont d'autres bénéfices attendus du projet. - Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients, une amélioration des capacités diagnostiques de la pathologie visée peut également être obtenue

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés dont la fréquence pourra être couramment d’un prélèvement sanguin par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes, - Des prélèvements tissulaires ou de moelle osseuse pourront être réalisés sous anesthésie générale, durant la phase d'implantation chirurgicale. - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - la mise à jeun (12 heures) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - les suites postopératoires (inflammation, douleur : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique), pour cela des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple la protection des plaies, l'usage de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie peu invasives sont mises en place (Imagerie par Résonnance Magnétique, Scanner, Echographie, Rayons X …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, des protocoles de prises en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (Anti-Inflammatoires Non Stéroïdiens et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs ophtalmiques testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie qui ressemble à celle de l’Homme avec les mêmes dimensions pour mimer l’anatomie de patients humains qui vont de l’enfant à l’adulte. Pour tester l’implantation de dispositifs conçus pour s’adapter à l’œil humain, le recours à des mammifères de grande taille est donc nécessaire. L’anatomie et la physiologie des yeux des ruminants étant trop éloignées de celle de l’homme (champ de vision élargi, netteté diminuée, temps d’adaptation lumière …), les différences interspécifiques de la nature tissulaire et de la forme et taille anatomique et aussi de fonction requiert l’emploi de plusieurs espèces différentes pour optimiser l’expérimentation et l’évaluation des dispositifs de ce projet, le projet prévoit le recours à des modèles porcins et canins justifiés par une taille et une fonction oculaires proche de ceux de l’Homme. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.

2 480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Certaines reçoivent un régime enrichi en sodium ou en potassium, d'autres subissent une contention de 30 à 90 minutes dans un tube de 50 ml, pour étudier le rôle de la prolactine dans la fonction des glandes surrénales. Le porteur qualifie cette contention de "stress psychologique modéré" et emploie des souris génétiquement modifiées privées du récepteur de la prolactine. Il affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit un organisme entier, et les tue pour prélever organes et sang.

Objectifs

Les hormones produites par les glandes surrénales, des glandes endocrines qui se trouvent au dessus des reins, sont très importantes pour réguler les réponses de l'organisme au stress. Nous avons découvert récemment que la prolactine, une hormone produite par une autre glande endocrine, la glande hypophyse qui se trouve à la base du cerveau, a un rôle important dans le contrôle de la production hormonale dans les glandes surrénales chez la souris. De plus, la prolactine régule les surrénales de façon différente selon le sexe, avec les femelles plus affectées que les mâles. Cette fonction de la prolactine comme régulateur des hormones surrénaliennes semble conservée chez l'homme. L'objectif de notre projet de recherche est d'éclaircir les mécanismes de régulation de la production d'hormones surrénaliennes en conditions basales et de stress modéré aigu. Pour effectuer ces études, nous avons généré un nouveau modèle de souris dans lequel la prolactine ne peut pas agir spécifiquement au niveau des glandes surrénales, à cause de l'absence de son récepteur dans ces organes.

Bénéfices attendus

Notre projet va contribuer grandement à la compréhension du rôle de la prolactine dans le contrôle de la production des hormones dans les glandes surrénales et donc pourrait avoir des applications très utiles pour mieux maîtriser les réponses de l'organisme au stress.

Procédures

Certains animaux seront soumis à un régime modifié soit par l'eau de boisson avec ajout de certaines substances pendant 2 jours ou 15 jours soit par la nourriture (régime haut en sodium ou potassium) pendant 1 ou 2 semaines. Certains animaux seront soumis à une contention pendant 30 ou 90 min.

Impact sur les animaux

L'inactivation conditionnelle du gène codant pour le récepteur de la prolactine dans les glandes surrénales ne provoque pas d'effets indésirables évidents chez les souris dans lesquelles ce récepteur a été inactivé, les animaux ont un comportement normal et se reproduisent normalement. Certains animaux vont être exposés à un stress psychologique modéré provoqué par une contention dans un tube Falcon 50 ml (mobilité réduite/inactivité) pendant un maximum de temps de 90 min.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans les procédures de notre projet seront mis à mort à la fin de ces procédures, pour la nécessité de récupérer leurs organes et leur sang pour effectuer nos analyses.

Remplacement

Malheureusement aucun système in vitro ne permet de reproduire l’ensemble des mécanismes physiologiques d’un organisme entier. Il n'est donc pas possible de remplacer ce modèle animal pour étudier les effets physiologiques de la signalisation de la prolactine sur la croissance et la fonction des glandes surrénales, y compris dans les phénomènes de réponse au stress.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé pour chaque procédure de notre projet sera restreint au strict minimum dans le respect des règles des 3 Rs. Le nombre d'animaux corresponds au nombre maximal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs calculé par un logiciel de statistique. Les prédictions suggèrent 62 animaux par groupe (mâles et femelles) qui permettra une analyse statistique valide afin d'exclure toutes répétitions additionnelles.

Raffinement

Les animaux seront hébergés selon les conditions habituelles et disposeront de l’enrichissement nécessaire (abris, litière, bâtonnets de bois, ouate), avec température et hygrométrie contrôlée. Les animaux seront suivis par le personnel de notre animalerie et par les personnes en charge du projet. Nous serons vigilants quant à la détresse, ou tout comportement anormal des souris. Advenant que les animaux présentent ces signes, ils seront pris en charge selon la procédure en vigueur afin d’éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Le choix de l'espèce animal a été déterminée par la faisabilité de l'inactivation de notre gène d'intérêt (le récepteur pour la prolactine) spécifiquement dans les glandes surrénales dans cette espèce et par la richesse et la qualité des données préliminaires présentes dans la littérature. Nous allons utiliser seulement des animaux adultes des deux sexes pour ce projet.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Soixante reçoivent des électrodes crâniennes posées par chirurgie, puis sont isolées et câblées pour enregistrer leur sommeil, dont une privation de six heures, tandis que quarante subissent des tests de mémoire par reconnaissance d'objets après privation de sommeil. Le porteur reconnaît que la chirurgie entraîne des effets dommageables et isole les souris câblées en cage individuelle. Il décrit le sommeil de la souris comme un modèle "irremplaçable" et les tue pour valider l'inactivation génétique dans le cerveau.

Objectifs

Le contrôle de la neurotransmission permet d’adapter les réponses des neurones aux modifications de l’environnement. Ces dernières années, nous avons montré que les microglies, qui sont les macrophages du cerveau, sont fortement impliquées dans le contrôle de la fonction des neurones. Ce résultat est également potentiellement important dans des situations non physiologiques puisque les microglies sont activées dans la quasi totalité des maladies du cerveau. Nous voulons maintenant montrer que les microglies contrôlent certaines fonctions cérébrales et identifer les mécanismes mis en jeu. Il y a en effet pour l’instant peu de données qui analysent l’implication des microglies dans les fonctions dites supérieures du cerveau. Des études préliminaires nous ont permis de montrer que dans le cortex, les microglies sont nécessaires à la régulation de neurones du cerveau qui sont clés dans la régulation du sommeil. Le présent projet s’appuie sur ces observations et cherche à comprendre l’implication des interactions microglie-neurones dans la régulation du sommeil et des fonctions qui dépendent du sommeil comme la mémoire. Ce projet sera réalisé chez la souris car elle permet: 1) de mettre en place des outils de génétique pour d'identifier les molécules impliquées dans l'action des microglies (souris génétiquement modifiées) et 2) de subdiviser le sommeil en sommeil lent et sommeil paradoxal, les deux stades de sommeil qui sont également présents chez l'homme. Ainsi, nous utilserons 2 modèles de souris génétiquement modfiées chez lequelles nous analyserons: 1) la structure du sommeil après implantation d'électrodes pour enregistrer les états de vigilance et 2) la mémoire grâce à des tests comportementaux qui reposent sur la reconnaissance d'objet.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre de nouveaux rôles de la microglie dans le fonctionnement cérébral et dans le contrôle du sommeil. Ces cellules étant activées dans toutes les pathologies du cerveau, on peut espérer que cette étude permettra une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques cellulaires de ces maladies.

Procédures

La procédure sommeil durera 6 semaines. Nous réaliserons une procédure chirurgicale pour implanter des électrodes qui nous permettront de réaliser les enregistrements de sommeil chez la souris. Cette implantation se fera par une courte chirurgie (

Impact sur les animaux

La procédure d'implantation d'électrode et d'enregistrement du sommeil, entraine sans aucun doute des effets dommageables car ils nécessitent de réaliser une chirurgie d'environ minutes. Pour réaliser les enregistrement de sommeil, les souris sont isolées dans des cages individuelles (les souris sont cablées ce qui oblige à les isoler). La procédure de privation de sommeil qui est induite par ajout de nouveaux objets dans la cage de vie de la souris occasionne une gêne de courte durée et qui n'est réalisée qu'une seule fois.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l'étude car nous analyserons ensuite leur cerveau pour valider l'inactivation génétique.

Remplacement

Le sommeil est une activité complexe et integrée. Il ne peut s'étudier que sur des animaux entiers. Par ailleurs, le sommeil des souris se subdivise en sommeil lent et sommeil paradoxal (comme chez l'homme) contrairement à d'autres modèles animaux de laboratoire ce qui en fait un modèle à l'heure actuelle irremplaçable. De plus, nous souhaitons étudier l'importance de certaines molécules produites par les microglies et pour cela nous utiliserons des outils génétiques disponibles chez la souris. Nous serons néanmoins vigilants quant au développement de méthodes alternatives pendant la durée de ce projet.

Réduction

Dans un souci de réduction du nombre d’animaux utilisés, le design des expériences comportementales et des expériences de physiologie a été calculé au plus juste, en tenant compte de la puissance des analyses statistiques et de nos expériences précédentes. Ce projet impliquera 100 souris.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en conditions standard, entre 2-4 souris du même sexe par cage sur des portoirs ouverts. La température et les cycles jour-nuit sont contrôlés. Un enrichissement cellulosique, renouvelé à chaque change (1/semaine), permet la confection d’un nid végétal. Le raffinement des méthodes expérimentales visant à réduire à son maximum la souffrance animale est mise en oeuvre grâce à l’utilisation d’anesthésiques et d'antalgiques appropriés lors de chirurgies, à la mise en place de soins post-opératoires et de points limites clairement établis. Pour la chirurgie, les animaux reçoivent 1) un analgésique sédatif et myorelaxant et 2) un anesthésique général injectés par voie intrapéritonéale et la douleur traitée par 1) un anesthésique local au niveau de la zone d'incision et 2) l'injection d’un analgésique avant et 24 heures après la chirurgie. Une période de récupération post-chirurgicale de 10 jours est respectée permettant de déceler d’éventuelles complications (

Choix des espèces

Travailler sur la souris permet de travailler dans la continuité de nos études précédentes. Cela permet également de bénéficier des nombreux outils pharmacologiques et génétiques déjà élaborés, diminuant par là le recours à des animaux pour mettre au point les techniques. Par ailleurs, nous cherchons à identifier de nouveaux mécanismes de régulation du sommeil et les souris nous permettent de réaliser ce projet car elle possèdent des cycles de sommeil qui comprennent le sommeil lent et le sommeil paradoxal. Les états de vigilance sont analysés sur des jeunes adultes de 2 à 5 mois. A cet age, la régulation des états de vigilance et des comportements est stable (pas d'interférence liée au développmeent ou à la vieillesse). Les expériences de comportement se feront sur des jeunes adultes de 2 à 5 mois, comme dans les articles de références utilisant le mêmes tests pour évaluer la mémoire des souris.

252 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une blessure musculaire provoquée par électrostimulation sous anesthésie, jusqu'à quatre mesures de force sous anesthésie et jusqu'à quatre injections intraveineuses, pour étudier le rôle des cellules immunitaires dans la régénération du muscle. Le porteur reconnaît un cumul d'actes qui induit du stress, puis les tue pour analyser leurs tissus. Il affirme qu'un "système biologique entier" est requis et écarte les analyses in vitro pour "difficultés méthodologiques".

Objectifs

Le muscle squelettique peut se réparer complètement après une blessure grâce au processus de régénération musculaire. Il a été montré que ce processus dépend de l’implication des cellules immunitaires après une blessure sévère. Toutefois, le rôle de ces cellules est encore inconnu dans le cadre de blessure légère. L’objectif de cette étude est d’évaluer le rôle des cellules immunitaires dans un modèle standardisé de blessure musculaire induit par des stimulations électriques

Bénéfices attendus

Le projet vise à comprendre le rôle des cellules immunitaires dans la réparation du tissu musculaire. A terme, ce projet pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des atteintes musculaires associées à plusieurs pathologies (cancer, myopathie…).

Procédures

Les souris sont soumises à un protocole d’électrostimulation (sous anesthésie générale, durée 10-15 minutes), une mesure de force musculaire (4 au maximum, anesthésie générale de 5-10 minutes) et des injections intraveineuses (4 au maximum)

Impact sur les animaux

Des nuisances et effets indésirables légers sont attendus du fait d’un cumul d’actes (injections, anesthésies, blessure musculaire), qui induisent du stress et peuvent diminuer la réponse immunitaire.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en vue de réaliser des analyses tissulaires post-mortem.

Remplacement

L’implication et le rôle des cellules immunitaires dans la régénération requiert un système biologique entier pour évaluer leur impact au niveau du fonctionnement du muscle. Des analyses in vitro ne peuvent être considérées en raison des difficultés méthodologiques permettant d’isoler spécifiquement ces cellules. Ces éléments justifient le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures. Nous utilisons un dispositif expérimental totalement non-invasif qui permet de réaliser des protocoles d’exercice et de mesurer la force musculaire de manière concomitante sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. La réalisation complète du projet est conditionnée à la mise en évidence de la diminution des cellules immunitaires dans le sang lors d’une première phase expérimentale.

Raffinement

Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. La procédure expérimentale utilisée inclut un recours systématique à l'anesthésie générale adaptée lors des injections, de l’électrostimulation et de la mesure de la force musculaire.

Choix des espèces

Des travaux précédents ont montré que les processus mis en œuvre au cours de la régénération musculaire chez la souris sont proches de ceux observés chez l'homme. Le projet porte sur le rôle des cellules immunitaires dans la régénération musculaire. Des souris adultes, âgées de 12 semaines, sont donc utilisées.

2 375 hamsters communs vont être utilisés, dont 375 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec l'intention de les relâcher dans la nature. Ils subissent l'implantation chirurgicale d'enregistreurs de température, des prises de sang sous anesthésie et la pose de puces, pour étudier en enclos l'effet de différents régimes sur leur reproduction et leur hibernation. Le projet vise la préservation d'une espèce en fort déclin en plaine d'Alsace, liée aux monocultures de blé et de maïs. Le porteur précise que les hamsters seront tués si les autorisations de lâcher ne sont pas obtenues.

Objectifs

Le hamster commun est inféodé à la plaine agricole en Alsace où les cultures de blé et de maïs représentent plus de 80% de la surface agricole utile certaines années. Nous avons montré que ces 2 monocultures ne répondaient pas aux besoins nutritionnels de l’espèce : une carence en protéines dans le blé cause une importante mortalité juvénile tandis que dans le maïs, une carence en vitamine B3 et son précurseur le tryptophane, entraîne du cannibalisme chez 90% des femelles. Pour pallier à ces carences et améliorer la reproduction des hamsters en milieu naturel, nous recherchons des cultures qui sont naturellement riches en acides aminés essentiels et d’intérêt technico-économique pour les agriculteurs. En conditions semi-contrôlées en enclos, nous allons soumettre des hamsters mâles et femelles à différentes associations de cultures et mesurer l’effet de ces régimes sur le succès reproducteur des hamsters et sur leur hibernation.

Bénéfices attendus

Ce projet aura des retombées scientifiques en fournissant de nouvelles connaissances sur les besoins nutritionnels d’une espèce hibernante, qui seront valorisées au travers de communications scientifiques écrites et de conférences. Il contribuera également à la préservation d’une espèce en déclin en proposant de nouvelles pratiques culturales permettant un meilleur succès reproducteur et une et une meilleure survie hivernale de l’espèce. Enfin, ces nouvelles pratiques agricoles devraient bénéficier plus largement à toute la biodiversité des agrosystèmes et répondre aux nouveaux enjeux technico-économiques des agriculteurs.

Procédures

Implantation/desimplantation de ibuttons (15 min par chirurgie) et prise de sang (2 min par prise de sang, 1 prise de sang par animal par an, 2 prises de sang au total par animal) sous anesthésie : 75 hamsters par an. Transpondage (implantation en sous cutané d’une puce individuelle) et prélèvements poils sur animal vigile : toute la descendance produite, 400 hamsters par an environ.

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés à la chirurgie : Procédure modérée : douleur liée à la laparotomie, inflammation, infection, perte de poids, hématome lié à la prise de sang. Effets liés aux manipulations en enclos : stress lié au transport, lâcher, capture, et manipulation : implantation interscapulaire de transpondeur, douleur aigue transitoire liée à l’injection du transpondeur. Perte de poids lié au changement de régime alimentaire

Devenir

Lâcher en milieu naturel pour le renforcement des populations sauvages, sous réserve d'obtention des autorisations de la DREAL et de l'OFB (en charge des opérations : financement, recherche des parcelles où lâcher les hamsters) et de la DDPP. Si nous n'obtenons pas les autorisations de lâcher en milieu naturel, les hamsters seront euthanasiés.

Remplacement

Cette étude concerne la préservation du hamster commun en plaine d’Alsace et ne peut être réalisée sur une autre espèce, ni par des études de modélisation.

Réduction

Nous allons expérimenter sur 12 femelles et 3 mâles par condition expérimentale. Ce nombre d'individus est le minimum pour qu'une différence éventuelle entre les différents groupes puisse être statistiquement décelée. Les résultats seront soumis à des tests non paramétriques du fait du faible effectif des groupes. Le sex ratio déséquilibré est lié à la biologie de cette espèce : les mâles ont un domaine vital plus grand que les femelles, et lâcher un plus grand nombre de mâles par sous-enclos entraînerait des agressions entre congénères.

Raffinement

En animalerie : Les animaux sont élevés en cages individuelles, car le hamster d’Europe n’est pas une espèce sociale et fait preuve d’agressivité envers ses congénères. Des objets visant à enrichir le milieu (tubes) et des éléments permettant le comportement de construction de nid sont placés dans les cages. Nous réaliserons une surveillance accrue des animaux opérés et un analgésique sera administré en post-opératoire dans l’eau de boisson pendant 3 jours. Les hamsters seront lâchés en enclos uniquement après complète cicatrisation et s’ils présentent une bonne condition corporelle. A noter que nous réalisons ces procédures d’implantation intra-péritonéale d’enregistreurs de température chez cette espèce depuis 10 ans, sans qu’aucune complication post-opératoire n’ait été observée. En enclos : Les hamsters seront transportés à l’enclos à 10 min de l’animalerie dans des boîtes adaptées avec du papier absorbant. Les lâchés seront réalisés en soirée au moment du pic d’activité de l’espèce. Nous serons très vigilants au bien-être des animaux dans l’enclos en réalisant des observations régulières (pièges photos et captures). Un suivi de la masse corporelle et de l’aspect général permettra d’évaluer leur état nutritionnel et sanitaire et d’agir en conséquence : supplémenter leurs apports alimentaires dans l’enclos ou ramener l’animal au laboratoire pour le soigner ou l’euthanasier en fonction du niveau d’atteinte de points limites.

Choix des espèces

Ce programme de recherche s’intéresse spécifiquement à la préservation de cette espèce. Les populations sauvages sont en déclin en raison notamment des pratiques agricoles intensives. Notre objectif est d’améliorer les pratiques agricoles afin de restaurer l’état des populations de hamsters communs. Les animaux seront étudiés à partir de l’âge de 4 mois et jusqu’à l’âge de 1,5 ans. Au-delà, une plus grande variabilité interindividuelle du succès reproducteur est observée et pourrait biaiser nos résultats.