Procédures légères
Etude de la relation entre l’épigénome des bovins et leurs performances
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
100 vaches de race Holstein vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réutilisées. Chaque animal fait l'objet d'une seule prise de sang à la veine caudale, complétée par un questionnaire sur l'élevage. Le porteur cherche à relier l'épigénome des bovins à leurs "performances" de production et à définir de nouveaux indicateurs de sélection. Il présente cette démarche comme utile au "bien-être" des vaches et à un "élevage durable", alors que l'objectif décrit reste l'expression de leur potentiel de production.
Objectifs
Depuis plusieurs décennies, la sélection génétique des animaux de rente a permis de net progrès dans les capacités de production, d’efficacité alimentaire et de santé. Néanmoins, dans un certain nombre de cas, le potentiel génétique de l’animal semble sous-exprimé sous l’influence de facteurs environnementaux. L'épigénétique est actuellement reconnue comme l'un des domaines les plus prometteurs des sciences biologiques, basé sur l’étude des mécanismes moléculaires directement impliqués dans le contrôle du fonctionnement du génome, en réponse à l’environnement. Ce projet doit contribuer à améliorer la compréhension des processus épigénétiques mis en œuvre et à intégrer ses nouvelles données aux connaissances génétiques afin de fournir une prédiction précise du phénotype chez les bovins. Les relations entre épigénome des bovins et leurs performances seront évaluées, sous différents environnements (différents types d’alimentation, d’hébergements ou encore effet du stress thermique). Le projet met en place un nouvel outil, dit « puce d’épigénotypage », à partir d'une simple prise de sang. Elles seront réaliser sur 100 vaches de race Holstein pour lesquelles des données de santé, de production, de conduite et d’environnement seront collectées. Cette démarche nous permetra de déterminer dans quelle mesure les biomarqueurs épigénétiques peuvent expliquer une partie de la variance phénotypique observée. Des modèles statistiques seront développés pour combiner les informations génomiques et épigénomiques afin d'améliorer les modèles de prédiction génomique. Ce projet établira les relations entre variations phénotypiques observables, la génétique, l’épigénome et l’environnement. La démarche mise en œuvre va contribuer à mieux définir les caratéristiques de chaque individu et offrira de nouveaux modèles d’évaluation plus fiables. Il consistera dans l’identification de nouveaux indicateurs de gestion intégrant des données épigénétiques. Il sera utilisé pour rechercher des animaux capables de s'adapter aux changements environnementaux de par leur plus grande plasticité épigénétique et génomique. Ces connaissances aideront à définir de nouvelles stratégies de sélection visant des animaux plus robustes, aptes à exprimer leur potentiel dans des conditions variables tout en maintenant leur santé et bien-être pour un élevage durable.
Bénéfices attendus
En concertation avec le responsable de l'établissement, l’ensemble des vaches des différents troupeaux seront incluses dans le protocole de prélèvements. Le prélèvement consiste en une simple prise de sang à la veine caudale lors d’une contension au cornais ou dans un couloir de contention. Toutes les vaches, exceptées celles porteuses d’une pathologie avérée et suivant un traitement médicamenteux, seront incluses, quelques soient leur âge, leur parité ou stade physiologique. Au moment du prélèvement, un maximum de données relatives à l’élevage et à l’animal seront collectées à partir d’un questionnaire : système d’élevage, conduite du troupeau, alimentation et historique de vie de l'animal, ainsi que des relevés climatiques (températures et hydrométrie).
Procédures
Une seule prise de sang par voie caudale, faite de manière rapide (moins d'une minute par animal) par du personnel formé.
Impact sur les animaux
Il peut rarement se produire un léger hématome au niveau du site du prélevement qui disparait naturellement au bout de quelques jours.
Devenir
La prise de sang n’aura aucun effet indésirable et sera sans effet secondaire sur les vaches ; par conséquent, nous considérons qu’aucun changement n’interviendra dans la conduite des vaches.
Remplacement
Ce projet est conduit sur l’espèce bovine pour l’espèce bovine. Il ne peut donc y avoir de remplacement. Il s’agit d’une démarche de biologie intégrative pouvant prendre en compte tous les processus biologiques et ne pouvant être conduite qu’au niveau de l’animal entier. Le choix de la race Holstein tient à sa prépondérance dans la production de lait française : nous étendrons l’étude à d’autres races laitières et allaintantes dès obtention des financements.
Réduction
Le nombre de vaches à inclure dans l’analyse est de 100. Notre démarche s’apparente aux analyses épidémiologiques menées chez l’homme, le nombre important d’individus à inclure dans le protocole permet d’appréhender la grande variabilité phénotypique.
Raffinement
La procédure de prise de sang par la veine caudale est une procédure classique en élevage pour un suivi sanitaire des animaux de ferme, pour lesquels les animaux sont habitués (prophylaxie). Les animaux sont déjà très largement habitués aux systèmes de contention qui seront mis en place (cornadis ou couloir de contention). Les prises de sang seront réalisées par du personnel qualifié et aguerri à ce geste simple.
Choix des espèces
Ce projet s’interesse à l’espèce bovine et toute la démarche expérimentale proposée doit aboutir à la création d’un nouvel index de management permettant une intégration de l’historique de vie de l’animal. Cet index doit être un indicateur du bien etre et de la santé des vaches. L’établissement de cet index sera associé à une série de recommandations dont l’objectif final est l’expression du potentiel génétique de l’animal dans le respect de ses besoins. Une simple prise de sang reste un geste très peu invasif et peu douloureux, n’occasionnant qu’une gêne transitoire. Il n'existe pas de contre indication à utiliser différents stades de développement. C'est pourquoi toutes les vaches du troupeau seront incluses dans le protocole car il s'agit de caractériser leur épigénome, quelques soient leur âge ou stades physiologiques (en lactation ou tarie).
Développement de nouveaux radiotraceurs pour l’imagerie cérébrale en tomographie par émission de positons (TEP) chez le porc
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
40 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère. Ils subissent une IRM et deux examens d'imagerie TEP de trois heures chacun sous anesthésie générale, avec prélèvements sanguins, le second examen s'achevant par la mise à mort car la chirurgie posée empêche le réveil. Le porteur développe de nouveaux radiotraceurs pour l'imagerie du cerveau et situe l'application chez l'humain dans quelques années. Il justifie le choix du porc par la taille de son cerveau et son organisation neurochimique proches de celles de l'humain, et par un "coût raisonnable".
Objectifs
Les objectifs du projet sont la recherche et le développement de nouveaux radiotraceurs pour la TEP (tomographie par émission de positons) dans le cadre des pathologies psychiatriques (troubles de l’humeur incluant la dépression unipolaire) et neurologiques (Alzheimer et troubles neurodégénératifs associés) ainsi que les troubles de la prise alimentaire. La TEP est une technologie d’imagerie permettant d'explorer les systèmes de neurotransmission et les modifications physiopathologiques du cerveau : elle permet de visualiser et de quantifier des récepteurs ou des transporteurs participant au fonctionnement normal du cerveau, ou bien des protéines s’accumulant de manière anormale. L’objectif de ces développements et validations pré-cliniques de radiotraceurs est de pouvoir proposer, dans quelques années, des radiopharmaceutiques TEP utilisables chez l’Homme et dont l’imagerie sera un apport pour le diagnostic, la compréhension physiopathologique et l’évaluation thérapeutique.
Bénéfices attendus
La mise au point d'un radiotraceur spécifique et sélectif des récepteurs à la sérotonine permettrait une meilleure compréhension de leur implication dans certaines pathologies neurologiques telles que la maladie d’Alzheimer ou la prise alimentaire. Pouvoir proposer, dans quelques années, des radiopharmaceutiques utilisables en Tomographie par Émission de Positons (TEP) chez l’Homme et dont l’imagerie sera un apport pour le diagnostic, la compréhension physiopathologique et l’évaluation thérapeutique.
Procédures
Les animaux seront soumis à un examen d’imagerie IRM (imagerie par résonance magnétique) et deux examens d’imagerie TEP (tomographie par émission de positons). Ces examens appelés TEST et RE-TEST auront chacun une durée de trois heures durant lesquelles les animaux seront sous anesthésie générale et analgésie morphinique, des prélèvements sanguins seront réalisés lors du second examen.
Impact sur les animaux
La procédure expérimentale est décomposée en 3 examens d’imagerie une IRM (imagerie par résonance magnétique) et deux TEP. Lors du premier examen avec réveil de l’animal ; le porc sera en anesthésie générale, intubé et un aura un cathéter sur une veine de l’oreille. Les nuisances sont le stress lors de la prémédication et l’injection intra-musculaire d’un mélange de médicaments d’anesthésies sans contention de l’animal. La nuisance provient de la piqûre, ainsi que la douleur générée par l’injection du mélange. La procédure est suivie de la mise en place d’un cathéter dans une veine périphérique du pavillon de l’oreille après administration de la prémédication sédative. A partir de cette étape, l’animal est maintenu sous anesthésie générale profonde. Lors du deuxième examen sans réveil de l’animal, la prémédication est la même, l’animal est maintenu sous anesthésie générale profonde, et ceci jusqu’à sa mise à mort. Un défaut d’anesthésie général pourrait être source de nuisances et avoir comme effets indésirables : la persistance du réflexe oculopalpébral, myoclonies, mouvements respiratoires spontanés, lutte contre le respirateur, étirement ou agitation des membres, hypertension.
Devenir
A l'issu du second examen d'imagerie, l'animal sera euthanasié, en effet, la chirurgie mise en place (trachéotomie, cathéters veineux et artériels) ne permettent pas son réveil.
Remplacement
Un modèle animal est nécessaire car nous souhaitons étudier le devenir des traceurs dans les tissus. Nous avons donc besoin des organes entiers dans leur environnement ainsi que d’une circulation sanguine efficace pour assurer la biodistribution du traceur dans l’organisme.
Réduction
Le nombre prévu d’animaux est maximum. Il n’existe pas de test de puissance disponible pour déterminer le nombre optimal d’animaux, car il s’agit de nouveaux radiotraceurs dont les caractéristiques ne sont pas encore connues. Par contre, l’étude réalisée pourra servir de base pour les tests de puissance de projets futurs utilisant ce même radiotraceur. Les données seront analysées au fur et à mesure et dès que les paramètres attendus seront obtenus, le protocole s’arrêtera. De la même manière, si les paramètres attendus sont jugés non atteignables (pas de pénétration intracérébrale du traceur par exemple), la procédure s’arrêtera. Les modalités d’imagerie in vivo ont l’avantage de permettre un suivi longitudinal des animaux, diminuant ainsi leur nombre, chaque animal qui entrera en campagne d’expérimentation aura 3 examens d’imagerie (une IRM et deux TEP).
Raffinement
Pour la prémédication, l’implantation du trocart se fait au niveau du jarret sans contention physique, en utilisant un prolongateur préconnecté au trocart. Lors des examens d’imagerie, l’animal sera sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée à ce type procédure, permettant à l'animal de ne ressentir aucune douleur. Nous appliquerons des points limites stricts et spécifiques de la procédure. Enfin, il sera possible aussi de collecter certains tissus en post mortem (flancs, oreilles, vessie…) pour permettre à d’autres laboratoires de réaliser des tests. Du sang pourra également être prélevé. Le cerveau sera prélevé pour alimenter une collection de données en cas de validation d’un radiotraceur candidat.
Choix des espèces
Le porc est le modèle non primate le plus proche de l'Homme, à la fois anatomiquement et physiologiquement. En effet, la taille de son cerveau est compatible avec la résolution de la caméra TEP sur laquelle seront réalisés les examens d'imagerie et son organisation neurochimique est proche de celle de lHhomme, ce qui favorise l’aspect translationnel du projet. Son volume sanguin total permet des prélèvements répétés pendant l’acquisition TEP, afin de modéliser les caractéristiques cinétiques des radiotraceurs testés. Il présente de plus un coût raisonnable par rapport aux bénéfices escomptés. Nous utiliserons des porcs jeunes adultes, d'environ 11 à 12 semaines, ayant un poids d’environ 35 kg. La taille et le poids des animaux sont compatibles avec une manutention aisée lors des expériences et sont adaptés au champ de vue de la caméra TEP.
Etude des mécanismes moléculaires régulant la maturation méiotique des ovocytes de xénope.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
100 xénopes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Les femelles sont opérées jusqu'à quatre fois au cours de leur vie pour prélever des ovocytes, ou reçoivent jusqu'à six injections hormonales, avant mise à mort. Le porteur étudie les mécanismes de la division des ovocytes et justifie ce modèle par le grand nombre d'ovocytes obtenus par individu, plusieurs centaines contre quelques unités chez la femme. Il décrit l'ovocyte de xénope comme "indispensable" à son étude et situe les retombées pour la reproduction humaine à long terme.
Objectifs
Notre laboratoire étudie les mécanismes moléculaires régulant les deux divisions cellulaires qui définissent la maturation méiotique (passage d’un ovocyte immature et ovocyte mature). Nous nous intéressons en particulier aux protéines qui contrôlent le bon déroulement de la méiose et à leurs modifications post traductionnelles impliquant des protéines kinase et phosphatase. Ce modèle est propice pour cette étude compte tenu du nombre d’ovocytes qu’il est possible d’obtenir par individu (plusieurs centaines). Ce nombre est à comparer avec celui d’une souris (quelques dizaines) ou d’une femme (quelques unités). Les connaissances actuelles montrent que l’ovocyte de xénope est un modèle de choix pour comprendre comment les ovocytes des vertébrés supérieurs (xénope, souris, femme) se divisent et deviennent haploïdes avant d’être fécondables et fécondés. Ce projet se déroulera sur 5 ans et permettra de comprendre avec plus d’information et de précision les connexions entre les voies de signalisation qui conduisent un ovocyte immature à devenir la cellule essentielle avec le gamète mâle pour la formation du futur embryon.
Bénéfices attendus
La compréhension des mécanismes gouvernant la maturation des ovocytes est un enjeu majeur de la recherche fondamentale. De plus, le modèle de l’ovocyte de xénope pallie l’absence quasi totale en recherche de l’ovocyte humain. Les résultats obtenus devraient permettre à court terme d’avoir une vision plus précise du fonctionnement de ces acteurs protéiques, des voies de signalisation qu’ils contrôlent et des régulations qui en résultent. A plus long terme, ils pourraient contribuer au développement de connaissances des mécanismes qui régissent la maturation méiotique des ovocytes humains.
Procédures
Le projet comporte deux procédures permettant l'obtention d'ovocytes : 1. par chirurgie sur animal anesthésié (procédure chirurgicale simple d'une dizaine de minutes) pour obtention d’ovocytes immatures 2. par injection hormonale pour obtention d’ovocytes matures La durée de vie de ces animaux étant d’une dizaine d’années, les femelles issues de ces procédures pourront être opérées à plusieurs reprises (4fois) au cours de leur vie en s'assurant de la complète récupération de l'animal et après accord du SBEA et du vétérinaire chaque année. Un autre lot de xénope dédiée à l’injection hormonale sera injecté plusieurs fois (6fois) au cours de leur vie au laboratoire tout en respectant un délai minimum de 4 mois. Ici encore le SBEA et le vétérinaire seront sollicités pour avis et conseil.
Impact sur les animaux
Toutes les mesures seront prises pour limiter au maximum tout stress et toute douleur à l'animal lors de la procédure de chirurgie (10 min) en réduisant notamment au maximum les étapes de manipulation de l'animal pour ne pas lui causer de stress au moment de l'anesthésie et du réveil. L’animal sera mis sous observation pendant quelques jours afin de s’assurer qu'il a pleinement recouvré son état de santé avant de retourner en stabulation avec ses congénères. La durée de vie de ces animaux étant longue (une dizaine d'années), les femelles issues de la procédure pourront être à nouveau opérées (4 fois, en respectant un intervalle de repos de 4 mois au minimum entre chaque opération) avec accord du vétérinaire. Pour les individus injectés avec l’hormone, une procédure plus légère sera appliquée avec une surveillance de deux jours et une nouvelle injection après 4 mois minimum de repos.
Devenir
La durée de vie des xénopes est longue (une dizaine d'années). Les femelles issues du lot de la procédure chirurgie pourront être à nouveau opérées, en respectant un intervalle de repos d'au minimum 4 mois entre chaque opération et après accord du SBEA et vétérinaire. Le suivi de l'animal à une fréquence journalière permet également de s'assurer de la bonne récupération de l'animal entre 2 opérations. De plus, les animaux seront systématiquement mis "au repos" pendant 4 mois de plus au moindre doute. Les animaux âgés ayant subi 4 chirurgies ne seront pas réveillées à la fin de la procédure et seront euthanasiées en respectant les dispositions règlementaires propres à l'espèce. En ce qui concerne les individus du lot de la procédure injection, ils seront injectés 6 fois en respectant une période minimum de 4 mois. Ces animaux seront aussi gardés sous surveillance journalière. Au moindre doute, l’animal sera écarté et traité individuellement afin qu’il retrouve un état normal. A la fin de la 6éme injection, l’animal sera mis à mort en respectant les dispositions règlementaires propres à l'espèce.
Remplacement
L'ovocyte de xénope est un modèle de choix pour l’étude fonctionnelle de régulateurs de la méiose. Ces ovocytes sont de grosses cellules (1mm de diamètre) et leur taille permet une manipulation aisée. Ils peuvent être micro-injectés par de nombreuses protéines, Morpholinos, Anticorps dont les effets sont ensuite facilement caractérisables et analysable grâce, entre autres, à des méthodes biochimiques. De plus, cette cellule étant biologiquement proche des ovocytes de souris et humains, les voies de signalisation caractérisées pourront s’avérer importantes pour aborder une étude de la méiose des ovocytes humains. D’autres alternatives à l’utilisation des ovocytes immatures de xénope ont été envisagées en utilisant à chaque fois que cela était possible les ovocytes pondus. En effet, ces ovocytes pondus sont obtenus après injection de l’hormone. Toutefois, le stade cellulaire des ovocytes obtenus par chirurgie est différent de celui obtenu après injection hormonale et il est impossible de réaliser la totalité des expériences sur les ovocytes pondus. Tout ceci rend l'utilisation des ovocytes de xénope indispensable pour notre étude.
Réduction
Ce projet a été conçu pour utiliser le nombre minimum d'animaux, tout en garantissant l'obtention de résultats scientifiquement pertinents et l'atteinte des objectifs de l'étude. Ainsi les besoins des utilisateurs de l’équipe de recherche seront regroupés pour limiter le nombre d'opérations réalisées (6 opérations par mois en moyenne) et à chaque procédure les ovocytes obtenus sur une xénope femelle serviront pour les lots contrôles (non-injectés) et pour les lots injectés. Nous pourrions également envisager de mutualiser les opérations avec d'autres Etablissements Utilisateurs toujours pour réduire le nombre d'animaux opérés (chaque opération peut permettre d'obtenir plus de 2000 ovocytes qui peuvent être conservés plusieurs jours suivant l'étude).
Raffinement
Toutes les mesures de raffinement appropriées seront prises pour favoriser le bien-être de l’animal dans le cadre de ce projet: 1. Les xénopes sont élevées dans une animalerie agréée où elles bénéficient d'un environnement social et physique enrichi en étant regroupées par bac de 40 à 50 individus (xénopes pour injection hormonale) et 4 à 6 individus (xénopes pour la chirurgie) (ce qui autorise une surveillance individuelle de chaque animal tout en préservant leur besoin d'interaction) 2. en laissant à leur disposition des refuges (tuyaux à plusieurs entrées/sorties) dans chaque bac. Lors de la chirurgie, la douleur sera prise en charge par l'utilisation d'anesthésiques appropriés et l'utilisation d'une alèse humidifiée permettra de maintenir une hydratation permanente de la peau. La manipulation des animaux est minimale et tout sera fait pour leur permettre un réveil d'anesthésie sans stress en abaissant le niveau de l'eau dans le bac de réveil. 3. Enfin, une attention particulière sera accordée à ne pas isoler longtemps un animal après son opération tout en lui apportant un soin optimal qui sera poursuivi lorsqu'il aura rejoint son bac en stabulation grâce à un suivi journalier des zootechniciens personnalisé de l'animal opéré. 4. Ceci sera rendu possible par l'identification aisée de l'animal dans un bac à faible densité (puçage sous-cutanné pour l'identification de l'animal). 5. Les possibilités de raffinement supplémentaire seront explorées tout au long du projet par la structure du Bien-être animal (qui comprend un vétérinaire spécialisé dans les espèces aquatiques, les statuts sanitaires) et testées pour continuer à améliorer en permanence le bien-être des animaux. Nous nous baserons sur notre grille de score qui mentionne les points limites et les actions à mener.
Choix des espèces
L’ovocyte de xénope est reconnu depuis plus de 50 ans comme modèle de choix dans l’étude des mécanismes impliqués dans les problématiques de cycle cellulaire et de développement embryonnaire. Ces ovocytes permettent de réaliser des études fonctionnelles car ils sont capables d’évoluer, hors de l’ovaire, du stade immature à celui de mature. Ce processus peut être perturbé par la micro-injection de protéines, ARNm, Morpholinos, Anticorps capables de mettre en évidence la fonction de la protéine ciblée. Outre ces caractéristiques propres à l'ovocyte, le xénope est facile à élever et à maintenir en laboratoire. Les opérations de chirurgie pour récupérer les fragments d'ovaires sont simples et rapides à réaliser par les utilisateurs formés. Les injections d’hormones pour obtenir les œufs pondus sont aussi facilement réalisables. Pour pouvoir obtenir des ovocytes, les animaux utilisés sont des animaux matures sexuellement âgés d'au moins 2 ans.
Etude de l’alvéolisation chez le rat en cas de retard de croissance intra-utérin induit par un régime hypoprotidique per gestationnel.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système respiratoire
568 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures dont les niveaux de souffrance vont de l'absence de réveil au modéré. Des rates gestantes reçoivent un régime pauvre en protéines pendant toute la gestation pour provoquer un retard de croissance chez leurs petits, puis 288 ratons subissent une injection quotidienne pendant dix jours avant mise à mort pour analyse des poumons. Le porteur indique que ce régime n'entraîne ni malformation ni surmortalité et classe l'injection comme peu douloureuse. Il présente le bénéfice, un traitement des troubles pulmonaires des grands prématurés, comme un objectif à moyen terme, et décrit le régime hypoprotidique comme le seul modèle animal reproduisant ces lésions.
Objectifs
Le retard de croissance intra-utérin (RCIU) est une adaptation à un environnement intra-utérin défavorable et a comme conséquence des altérations permanentes du métabolisme, de la croissance et du développement notamment pulmonaire et cérébral. Les conséquences du RCIU sont nombreuses et durables dans le temps. Le RCIU chez l'Homme multiplie par 6 la probabilité d'avoir un développement pulmonaire et notamment alvéolaire insuffisant chez le nouveau-né prématuré. L’alvéole pulmonaire est le principal site des échanges gazeux. Si sa taille diminue, la possibilité d’échanges gazeux entre l’air et les milieux intérieurs du corps humain diminue. En pratique, un nouveau-né prématuré a besoin d’apports en oxygène de façon prolongée car ses alvéoles ne sont pas suffisamment développées. Pour fonctionner, l’alvéole pulmonaire forme une niche de cellules en interaction et en communication. Les principales cellules participant à la croissance alvéolaire sont les pneumocytes de type 2 et les lipofibroblastes. Ces cellules sont régulées par des gènes jouant un rôle sur le métabolisme lipidique notamment le gène du Peroxisome Proliferative Activated Receptor (PPAR). Cette voie est modifiée en cas de RCIU. Le seul modèle chez l'animal reproduisant un RCIU et des troubles de l'alvéolisation est le régime hypoprotidique (Low Protein Diet (LPD) pendant la gestation. Ce projet a pour but i) d'étudier les conséquences du régime LPD sur le développement pulmonaire de rats en étudiant l’aspect du poumon ii) de mieux caractériser les différentes cellules et leur répartition et iii) de proposer des traitements innovants pour favoriser la croissance et la régénération alvéolaire grâce à des médicaments agissant sur ces voies clés du métabolisme lipidique en recréant in vitro un poumon.
Bénéfices attendus
Ce projet améliorera la compréhension des anomalies de l'alvéolisation liées au retard de croissance intra-utérin et permettra d'aboutir à moyen terme à un traitement des troubles de l'alvéolisation chez les nouveau-nés prématurés humains.
Procédures
Les rates femelles adultes gestantes seront soumises à un régime hypoprotidique (Low Protein Diet (LPD)) pendant toute la durée de la gestation (21jours) Une partie des ratons (n=32) aura une analyse de leur fonction respiratoire : âge au moment des explorations fonctionnelles : 21 à 60 jours (durée des explorations : 1 jour). Une partie des ratons (n=288) recevra du 1er jour de vie au 10ème, une injection intrapéritonéale médicamenteuse (1 injection par jour d’une durée
Impact sur les animaux
Le régime Low Protein Diet a déjà été administré chez les rates gestantes sans complication en dehors d’une diminution de la prise pondérale pendant la gestation leurs petits. Le nombre de ratons par portée était identique à celui obtenu en cas d'utilisation d'un régime contrôle. Les animaux naissent avec un retard de croissance. Ils ne présentent pas de malformation associée. Le taux de mortalité lié à ce régime est nul in utero ou après la naissance. Les injections médicamenteuses par voie intra-péritonéale sont couramment utilisées et n'induisent pas d'effet indésirable particulier pour les molécules étudiées en dehors de la douleur légère induite par l'injection elle-même. Les médicaments injectés ne sont pas décrits antérieurement comme induisant une douleur supplémentaire à l’injection. En cas de souffrance (blessure, absence de prise de poids ou perte de poids supérieure à 10%), les ratons seront mis à mort.
Devenir
Les ratons recevant les injections (procédure 2) seront gardés en vie au maximum jusqu'à J120. Les ratons de la procédure 1 (EFR) seront mis à mort à la fin de celle -ci. Les ratons seront mis mort à la fin de chaque procédure afin de procéder au prélèvement d’organes pour des études post mortem.
Remplacement
La principale cause de RCIU chez l’Homme est la prééclampsie. Il s’agit d’une pathologie exclusivement humaine. Plusieurs modèles de RCIU ont donc été mis au point chez l’animal. Le modèle de RCIU reproduisant au mieux les lésions observées chez l’Homme et le moins invasif pour l’animal est le régime Low Protein Diet (LPD). Notre première étude l'a démontré chez le rat où nous avons montré la ressemblance entre les lésions pulmonaires et cérébrales observées chez le rat et les RCIU humains. Les modèles animaux nous permettent de mieux définir les organes et types cellulaires touchés et nous précisent donc les cibles moléculaires intéressantes pour des thérapeutiques éventuelles. L'étude de l’effet d'une molécule sur un organe aussi complexe que le poumon ne nous permet pas d'utiliser pour le moment de méthodes de remplacement.
Réduction
Les ratons issus des rates exposées ou non à un régime hypoprotidique seront étudiés dans les différentes expériences. Les animaux issus d'une même portée seront tous étudiés pour les différentes techniques choisies. Les animaux seront mis à mort à J4, J7, J10, J21, J60 ou J120 de vie pour étude des modifications fonctionnelles et cellulaires. Le nombre de ratons et de groupes expérimentaux ont été limités au strict nécessaire. La quantité de 6 à 8 animaux / groupe est la quantité adéquate pour chacune de nos analyses statistiques lors de nos études morphométriques, immunohistochimiques et moléculaires précédentes (qPCR, Western blot etc...). Une fois les données relevées, les tests statistiques prévus sont le Mann - Whitney test pour la comparaison des 2 groupes entre eux : comparaison de la masse des ratons (en g), etc... Le test utilisé pour la comparaison de 4 groupes après tests ex vivo sera un Two-way ANOVA (pour tester l'effet du régime et l'effet du traitement, ainsi que la combinaison des deux).
Raffinement
Afin de respecter la règle des 3R (raffiner, réduire, remplacer) dans notre projet, les animaux seront particulièrement suivis par le personnel qualifié de l'animalerie, avec une attention particulière à l'aspect, la mesure du poids et de la quantité de nourriture ingérée (femelles gestantes) et à l'aspect et la mesure quotidienne du poids pour les ratons. Les rates seront hébergées dans des portoirs ventilés avec un environnement enrichi. Les rates auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes en carton, des balles de coton, du papier kraft ciselé pour jouer et des baguettes de bois à ronger. Lors des études précédentes, la tolérance du régime était bonne. Aucune sur-mortalité n’avait été enregistrée précédemment et aucune malformation n’a été détectée. En cas de mal être : blessure, poids trop faible (si le poids est de 20% en dessous de la moyenne de la portée), déshydratation, les ratons seront mis à mort. Pour les mères adultes une attention particulière sera portée sur la quantité de nourriture mangée et sur le suivi de leur poids. En cas de perte de poids, la rate gestante sera sortie de l'expérimentation et mise à mort.
Choix des espèces
Le rat est un animal très utilisé dans la recherche translationnelle et son développement pulmonaire et cérébral est proche de celui de l'homme. Notre première étude a montré de résultats reproductibles chez le rat et nous souhaitons le confirmer en allant plus loin dans les analyses moléculaires
Restauration des connexions entre nerfs et muscles des souris modèles pour la myopathie à némaline par thérapie génique
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
224 souris porteuses d'une mutation reproduisant la myopathie à némaline vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 122 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur indique que les mâles développent une inflammation urogénitale aboutissant à 61 % de morts à treize semaines, ainsi qu'un affaissement de la paupière et des inflammations oculaires. Une thérapie génique est injectée dans les muscles sous anesthésie, puis la force du muscle tibial est mesurée avant mise à mort. Les bénéfices pour les patients restent une perspective, l'étude s'arrêtant si la première injection n'améliore pas la connexion entre nerfs et muscles.
Objectifs
La myopathie à némaline (NM) est une maladie génétique qui touche une personne sur 50.000. Elle provoque des lésions des muscles qui entraînent faiblesse, atrophie et diminution du tonus musculaire. Dans les formes les plus graves, les patients décèdent dans les premières années de vie. Les souris avec lesquelles nous travaillons ont une mutation génétique qui reproduit les symptômes des patients. Des études cliniques et des travaux de recherche récents ont montré que le réseau neuronal des patients, comme des souris, était endommagé à l’endroit où les nerfs entrent en contact avec les muscles. Ce qui peut expliquer une partie de la faiblesse musculaire.
Bénéfices attendus
Notre approche de thérapie génique vise à réparer la connexion entre les nerfs et les muscles. Cette approche nouvelle a été testée dans d’autres maladies génétiques comme la sclérose latérale amyotrophique et a montré des résultats encourageants. Nous commencerons notre étude par une injection du traitement dans les muscles des souris. Nous réaliserons une étude fonctionnelle dans le respect du bien-être des animaux, en respectant la règle des trois R. Si les résultats de la première injection n’apportent pas d’amélioration de la connexion entre nerfs et muscles, l’étude ne se poursuivra pas, ce sera un état de no go. Dans le cas contraire, go, nous poursuivrons notre étude sur animaux entiers.
Procédures
Mesure de la force musculaire in situ du muscle Tibialis anterior, sur animaux vivants anesthésies : environ 1h15 par souris. Prélèvements des TA droits et gauches animaux vivants anesthésiés : prélèvements uniques, environ 5 min par souris.
Impact sur les animaux
Les nuisances que ce modèle peut rencontrer sont liées au fait qu’il exprime une forme mutée de l’actine alpha-squelettique. Les mâles développent une inflammation du tract urino-génitale causées par une faiblesse des muscles de l’urètre impliqués dans l’éjection du bouchon copulatoire. Cette nuisance est spécifiquement liée aux mâles murins et entraîne une aggravation de l’état qui aboutit à 61% de morts à 13 semaines. Elle cause un ptosis progressif et des inflammations oculaires qui sont traitées avec une crème antibiotique. Les femelles ne sont affectées que très tardivement par le ptosis (32 semaines). Actes péjoratifs liés aux interventions : - injection du traitement, précédée d’une injection par voie intrapéritonéale d’un mélange de deux anesthésiques à raison de 5 ml/kg de poids: la kétamine et la xylazine. Fréquence 1, durée 30 minutes.
Devenir
Procédure 1: Les animaux issus des croisements mais ne présentant pas de pathologie et non nécessaires au maintien de l’élevage seront euthanasiées. Toutes les souris présentant le phénotype pathologique seront incluses dans les procédures expérimentales 2 et 3 décrites dans cette demande. Certaines des souris issues des croisements mais ne présentant pas de pathologie seront utilisées pour les croisements nécessaires au maintien de l’élevage. Procédures 2 et 3 : Tous les animaux inclus dans une procédure expérimentale seront euthanasiés à la fin de la procédure expérimentale ou euthanasiés en cours de procédure si leur état de santé le nécessite.
Remplacement
Nous avons d’abord testé le vecteur de thérapie génique sur des cellules musculaires en culture. Nous n’utilisons les souris que pour évaluer des paramètres non mesurables in vitro : tension mécanique, toxicité hépatique, réponse immunitaire…
Réduction
Nous avons calculé le nombre d’animaux nécessaires pour réduire leur nombre au strict minimum. De plus, si traitement injecté dans les muscles ne corrige pas l’état de la connexion entre nerfs et muscles des souris malades (no go), il n’y aura pas de poursuite de l’étude.
Raffinement
Nous avons mis en place une surveillance quotidienne des animaux, avec pesée bi-hebdomadaire et définis des points limites basés sur le poids et le comportement des souris. En cas de souffrance ou de perte de poids sur plusieurs jours consécutifs, les animaux seront euthanasiés. Les injections de traitement intramusculaires seront réalisées sous anesthésie générale. Les injections intraveineuses peu douloureuses, seront réalisées sans antalgie. L’efficacité du traitement sera évaluée par analyses fonctionnelles légères, indolores, basées sur la participation de l’animal. Avant sacrifice, l’animal sera anesthésié et recevra une dose d’analgésique pour procéder à la mesure de force du muscle Tibialis Anterior. L’animal sera euthanasié juste après.
Choix des espèces
Les souris KI(Acta1)H40Y ont été choisies comme animaux modèles pour trois raisons : 1) Ces animaux ont pu être modifiés génétiquement afin de présenter la mutation du gène ACTA1 sur l’acide aminé 40, afin de reproduire une myopathie à némaline. 2) Ces souris sont le modèle du petit animal le mieux caractérisé : elles reproduisent avec fidélité les signes cliniques (faiblesse musculaire) et moléculaires (hypotrophie des myofibres, présence de bâtonnets intracellulaires, dégradation des jonctions neuromusculaires…) caractéristiques de la maladie humaine. 3) Fgfbp1 est un gène fortement sous-exprimé dans les souris KI(Acta1)H40Y. Ce gène est impliqué dans le maintien des jonctions neuro-musculaire, qui sont endommagée dans les muscles de ces souris. Une part importante du phénotype des souris est lié à la perte de force musculaire. Nous comptons sur la restauration des jonctions pour augmenter la force des souris mutantes. Les souris mâles 129PAS WT et les femelles KI(Acta1)H40Y 129PAS hétérozygotes pour la mutation sur le gène Acta1 seront mises en reproduction entre l’âge de 6 semaines et de 1 an, ou seront euthanasiés si les accouplements ne sont plus productifs ou si les points limites sont atteints. Les symptômes de la maladie apparaissent dès la troisième semaine de vie chez les souris KI(Acta1)H40Y hétérozygotes mâles et femelles. Notre étude vise à corriger les symptômes de la myopathie à némaline: les animaux mâles porteurs de la mutation seront donc utilisés peu de temps après l’apparition des premiers symptômes (essentiellement un gain de poids plus faible que les animaux sains).
Etude de pharmacologie (biodistribution, élimination) de nouveaux agents diagnostiques et thérapeutiques chez le rat – Etude 2
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
144 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent sous anesthésie l'injection d'un agent d'imagerie radiomarqué, passent une imagerie d'environ quarante-cinq minutes, puis sont tués pour le prélèvement des organes. Le porteur indique que la contention pour l'anesthésie peut causer un certain stress et que les composés testés n'ont pas provoqué d'effet secondaire chez la souris. Il affirme qu'un système in vitro ne peut déterminer toutes les propriétés d'une substance, faute de circulation sanguine, et retient donc le rat pour l'étude de la biodistribution.
Objectifs
Lors du développement de nouveaux médicaments et/ou sondes d’imagerie, il est nécessaire d’étudier la façon dont la molécule d’intérêt se distribue et est éliminée de l’organisme. Cette étape permettra de valider qu’un agent diagnostic sera éliminé rapidement de l’organisme sans causer de toxicité ou qu’un composé thérapeutique restera suffisamment longtemps dans l’organisme pour exercer son action. Pour cela, nous avons d’abord vérifié sur culture cellulaire que les composés à étudier ne sont pas toxiques. Les composés à étudier ont, d’autre part, déjà été injectés à la souris sans causer d’effets secondaires. Nous avons ensuite procédé au radiomarquage de la molécule (ajout d’une molécule radioactive pour pouvoir la détecter : l’Indium111 dans le cas présent) puis au contrôle sur culture cellulaire que le composé modifié est toujours actif. Puisqu’il est impossible dans un système in vitro de déterminer toutes les propriétés d'une substance, car aucune circulation sanguine ou système excréteur n'est présent, la seule alternative est l’utilisation d’animaux. L’espèce de choix pour l’étude de la biodistribution est le rongeur. Des études préliminaires ont montrés que certains composés de la même pouvaient avoir un comportement différent chez le rat et la souris. De plus certains modèles pathologiques de rat sont plus représentatifs de la maladie cancéreuse humaine que la souris. C’est pourquoi le présent projet sera mené chez le rat (d’autres travaux menés conjointement seront réalisés chez la souris pour identifier des différences de comportement selon les espèces et permettre ainsi une meilleure prédiction du comportement des composés chez l’homme). L’objectif de notre projet vise donc à suivre 2 composés, chez des rats sains, après administration par voie intraveineuse grâce à l’utilisation de l’imagerie et du comptage de la radioactivité.
Bénéfices attendus
Les études que nous mènerons dans le cadre de ce projet nous permettront de caractériser précisément le comportement de 2 composés dans l’organisme afin d’orienter les développements ultérieurs vers le diagnostic ou la thérapie, ou d’écarter des composés à risque pour la suite des développements.
Procédures
Préhension et mise sous anesthésie (2 fois maximum : injection et imagerie – quelques secondes) - Injection d'un agent d’imagerie seul ou avec compétiteur sous anesthésie (1 fois, quelques minutes) - Imagerie (1 fois, 45 minutes maximum) suivie de l’euthanasie et du prélèvement des différents organes
Impact sur les animaux
La préhension pour induction de l’anesthésie pourrait causer un certain stress aux animaux. Les injections, imageries et euthanasies seront réalisées sous anesthésie par du personnel expérimenté et ne devraient pas provoquer de nuisances supplémentaires. Les composés à tester ont déjà été injectés à l’animal et n’ont pas provoqué d’effet secondaire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés. Le prélèvement des organes étant nécessaire pour réaliser des analyses complémentaires et affiner les résultats d’imagerie par comptage précis de la radioactivité, l’euthanasie des animaux est inévitable.
Remplacement
Les molécules qui seront évaluées dans ce projet auront été, au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Puisqu’il est impossible dans un système in vitro de déterminer toutes les propriétés d'une substance, car aucune circulation sanguine ou système excréteur n'est présent, la seule alternative reste l’utilisation d’animaux.
Réduction
Dans le cadre de cette étude, les composés seront évalués à l'aide de techniques d'imagerie préclinique in vivo couplées à des techniques de comptage de la radioactivité ex vivo. Ces techniques étant particulièrement sensibles et spécifiques, seuls de faibles effectifs sont nécessaires pour obtenir des données fiables et précises tout en réduisant le nombre d’animaux au maximum (n=4 par groupe).
Raffinement
Les gestes de ce projet (injection, imagerie, euthanasie) se dérouleront tous sous anesthésie et sur lit chauffant réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Les animaux seront observés quotidiennement et le suivi pondéral sera réalisé 2 fois par semaine. Aucun effet indésirable n’est attendu mais des points limites adaptés ont été définis. Toute observation d’un signe de souffrance sera suivi de l’arrêt immédiat du protocole et de l’euthanasie.
Choix des espèces
L’espèce de choix pour l’étude de la biodistribution est le rongeur. Des études préliminaires ont montrés que certains composés de la même pouvaient avoir un comportement différent chez le rat et la souris. De plus certains modèles pathologiques de rat sont plus représentatifs de la maladie cancéreuse humaine que la souris. C’est pourquoi le présent projet sera mené chez le rat. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 6 et 8 semaines d’âge), puisque les études prévues par la suite seront réalisées sur des animaux adultes présentant un cancer.
Travaux pratiques en licence sur les échanges gazeux respiratoires et leurs significations métaboliques
- Enseignement supérieur
60 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réutilisées. Sans intervention invasive, elles sont soumises à un jeûne de quinze heures et à une exposition au froid de quinze minutes, puis placées cinq minutes dans une enceinte de mesure des échanges gazeux, pour des travaux pratiques d'étudiants en licence. Le porteur indique que le jeûne et le froid provoquent une angoisse légère et que les manipulations s'arrêtent en cas d'agitation, d'agressivité ou de prostration. Il précise que les mêmes souris sont réutilisées pour une seconde séance puis remises à la disposition de la plateforme, et retient cette espèce parce qu'elle est "couramment utilisée" pour former les futurs chercheurs.
Objectifs
Cette manipulation à deux objectifs principaux : 1. Elle s’inscrit dans démarche progressive d'apprentissage de la manipulation des animaux de laboratoire avec une mise en pratique du respect de la règle des 3R tout au long d’une procédure expérimentale scientifiquement rigoureuse. 2. Elle vise à approfondir la formation sur le métabolisme et permettra aux étudiants de mettre en relation les enseignements suivants : • La respiration à l’échelle de l’organisme, • Le métabolisme cellulaire vu en biochimie, • La Bioénergétique. Plusieurs conditions permettront d’appréhender différents aspects métaboliques : • Effet d’un jeun alimentaire, • Effet d’une exposition à un environnement froid dont le choix a été motivé par sa reproductibilité car non corrélé à des variations de comportements comme par exemple la mise lors d’une activité motrice contrainte. Ces deux stimuli reproductibles modifient le métabolisme qui sera évalué par les mesures des variations des échanges gazeux. Ces variations pourront alors être interprétées en augmentation ou diminution du métabolisme, et préciser le métabolite énergétique préférentiellement utilisé par l’organisme en fonctions du paramètre expérimental.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectifs : 1. La mise en pratique de la règle des 3R vue en théorie en amont de ce projet, de la première manipulation et de la préhension des souris de souche swiss choisie pour sa docilité ainsi que les bases de l’observation comportementale permettant d’appréhender les différences entre mal-être et bien être animal en cours de manipulation ; 2. De montrer l’influence des facteurs environnementaux comme le froid et de l’alimentation sur le métabolisme général de l’organisme en prenant les échanges gazeux respiratoire comme paramètre mesuré. Ainsi il permettra aux étudiants de mettre en relation les enseignements suivants : • Mise en pratique de la règle des 3R à tous les niveaux d’un protocole : en amont, pendant et une fois celui-ci terminé, • Les bonnes pratiques de préhension des souris, • La respiration à l’échelle de l’organisme, • Le métabolisme cellulaire vu en biochimie, • La Bioénergétique. Une attention particulière sera portée : • Sur l’importance de l’éthique en expérimentation animale dont les textes de référence sont présentés et la règle des 3R bien développée. • Sur la rigueur et l’attention portée au bien-être animal en amont, pendant et après les séances de TP, indispensable à toute expérimentation animale avec des organismes sensibles. • Sur la présentation des gestes de préhension de l’animal.
Procédures
Aucune intervention invasive ne sera pratiquée sur les animaux. Cependant les souris seront exposées aux contraintes suivantes : • Jeun alimentaire de 15h avec accès à l’eau ad libitum, • Exposition à un environnement froid durant 15 min sans hypothermie, • Stabulation dans une une enceinte métabolique durant 5 minutes pour l’enregistrement des échanges gazeux respiratoires sur les animaux vigile.
Impact sur les animaux
Les animaux seront exposés à des stimuli désagréables (jeun et froid) qui seront associés à une angoisse légère. Ces deux stimuli sont reproductibles de par la maîtrise des variables expérimentales, base d’une bonne démarche scientifique. Durant l’exposition au froid et les périodes d’enregistrement des échanges gazeux, une vigilance particulière sera portée sur le comportement des animaux notamment la présence d’un comportement d’exploration bien exprimé par l’animal pouvant être accompagné par un comportement de toilettage. Les limites de ces manipulations seront définies par des signes tels qu’une agitation importante, une agressivité ou encore une prostration. Dans ces cas l’animal ne sera plus manipulé, remis en cage et placé sous surveillance. Le calme dans la salle de manipulation (bruit de fond sonore, mouvements des personnes) fera l’objet d’une attention particulière.
Devenir
Les mesures se font sur les animaux contrôles ou à jeun à température ambiante, puis après exposition à un environnement froid. Les animaux sont gardés vivants pour une autre séance de manipulation à 48h d'intervalle minimum dans le même projet avec inversion des statuts des souris : les contrôles deviennent les animaux à jeun réciproquement A la fin du projet, après un repos d’un mois : • Les autres seront mises à la disposition de la plateforme animalerie et potentiellement réutilisés pour un autre projet, • Le cas échéant, les souris seront euthanasiées. • Selon les besoins de la plateforme animalerie, une partie des animaux pourra devenir des reproducteurs pour l’obtention de souris calibrées pour un autre projet. Dans ce cas un cycle de reproduction par femelle sera envisagé.
Remplacement
L’acquisition des connaissances pratiques sur la ventilation et de sa régulation ont été effectuées préalablement à partir d’une manipulation assistée par ordinateur sur les étudiants eux-mêmes. Cette approche ne permet pas de mettre en évidence la signification métabolique des échanges gazeux dans les situations comme le jeun alimentaire léger et l’exposition au froid et en l’absence de logiciel dédiés justifient le recours à l’expérimentation animale. Par ailleurs les manipulations pratiques par les apprenants est prégnante dans la démarche d’investigation comme dans tout processus d’apprentissage. Elles ne peuvent être remplacées par la visualisation d’une vidéo (une de plus…) où la passivité de l’étudiant l’éloigne du concret.
Réduction
Une seule souris sera manipulée par poste d’expérimentation comprenant 4 personnes. Pour une séance il y a 2 souris contrôles et 2 souris à jeun. Les résultats seront mis en commun à la fin des séances afin que chaque étudiant puisse comparer les échanges gazeux entre souris contrôle et à jeun dans les deux conditions de température. Les manipulations seront renouvelées au cours d’une autre séance dans un délai minimum de 48h avec inversion des statuts : les sujets contrôles de la 1ère séance deviendront les sujets à jeun et réciproquement. Les résultats obtenus avec l’ensemble des souris sont mis en commun pour la prise en compte des variations individuelles et la signification statistique des différences observées dans les différents lots et sexes.
Raffinement
Cette étude nécessite une préhension, une stabulation dans une enceinte métabolique. Les animaux seront habitués à ces manipulations par le zootechnicien et le concepteur durant une semaine. Un seul sexe par séance sera manipulé supprimant toute perturbation générée par la présence des 2 genres en salle. L’exposition au froid est réduite au minimum pour avoir des modifications significatives sur le métabolisme, les animaux sont placés dans une enceinte métabolique identique à l’enceinte d’enregistrement, excepté la présence des sondes au dioxygène et au dioxyde de carbone. Afin de réduire le froid au niveau des coussinets des pattes, sera placée dans le fond de l’enceinte une plaque isolante. Après exposition au froid, l’individu est placé dans l’enceinte métabolique présentant les sondes, celle-ci à température ambiante ce qui lève totalement l’exposition au froid. Durant l’exposition au froid et les périodes d’enregistrement des échanges gazeux le comportement des animaux sera surveillé notamment la présence d’un comportement d’exploration bien exprimé par l’animal pouvant être accompagné par un comportement de toilettage. Si une agitation importante (stéréotypie), une agressivité, une prostration est constatée, il y aura arrêt de la procédure, l’animal sera remis en cage et placé sous surveillance. Par séance, 2 souris en plus des 4 manipulées resteront en cage dans le cas où des souris manipulées montreraient des signes d’angoisse aigüe justifiant de l’arrêt de leur manipulation. En fin d’enregistrement, le jeun sera interrompu, et tous les animaux recevront une récompense (céréales). Le retour en cage sera surveillé par le responsable du projet afin que les individus ne retournent pas une mauvaise cage, évitant la mise en place d’une nouvelle hiérarchie et le passage d’animaux à jeun dans la cage des animaux contrôles. Les enceintes métaboliques et d’exposition au froid sont nettoyées à l’eau savonneuse rincées et séchées afin de supprimer toute odeur de stress et ainsi annihiler la transmission du stress de l’animal manipulé lors du passage de l’animal suivant. Le calme dans les salles de manipulation tant au bruit de fond sonore qu’aux mouvements des personnes fera l’objet d’une attention particulière.
Choix des espèces
La souris faisant partie des animaux de laboratoire couramment utilisés, le choix de cette espèce s’impose pour la formation des futurs chercheurs. La souche swiss a été choisie pour sa faible anxiété par rapport à d’autres souches comme la souche C57Bl6 et sa faible agressivité pour un premier contact avec les étudiants. Animaux réformés. Les résultats correspondant aux échanges gazeux seront rapportés en pourcentage d’O2 et de CO2 pour 30g afin de pouvoir comparer les résultats sans pour autant utiliser des animaux calibrés produits par l’établissement éleveur.
Impact des populations spécifiques de macrophages et de leur interaction avec le microbiote sur le développement du cancer colorectal
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
2 889 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Un cancer colorectal leur est induit chimiquement ou par greffe de cellules tumorales par voie intrarectale, avec un suivi par coloscopie sous anesthésie une à deux fois par semaine pendant plusieurs semaines. Le porteur indique que ces procédures peuvent provoquer une perte de poids, des saignements dans les selles et le rectum, des diarrhées et une occlusion. Il affirme que le développement des tumeurs et leurs interactions avec le microbiote et les cellules immunitaires nécessitent l'animal, les molécules étant d'abord testées in vitro.
Objectifs
Lors de la croissance tumorale, les cellules cancéreuses interagissent étroitement avec les cellules immunitaires. Par exemple, les lymphocytes T aident l’organisme à combattre les cellules tumorales tandis que les macrophages facilitent le développement des tumeurs. Dans le cadre du cancer colorectal, il a été montré que la composition de la flore intestinale, en particulier certains types de champignons, peut aussi jouer un rôle dans le développement des tumeurs. Notre projet vise à identifier les interactions entre les macrophages et les champignons de la flore intestinale avec les cellules cancéreuses colorectales. En particulier, ce projet a pour but de déterminer si un déséquilibre de la flore intestinale peut influencer les effets pro-tumoraux des macrophages et ainsi, avoir un impact sur la croissance tumorale.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre à court terme d’étudier le dialogue entre une population cellulaire particulière impliquée dans la détection des champignons de la flore, les champignons eux-mêmes et les cellules du cancer colorectal. De plus, les macrophages a BLP ont été observé chez des patients atteints de cancer colorectal au niveau des marges saines du côlon. Il va aussi permettre d’améliorer les connaissances sur les interactions entre les champignons de la flore intestinale et le cancer, sujet encore méconnu. A long terme, il pourrait permettre d’identifier la dysbiose (déséquilibre de la flore intestinale) comme un marqueur précoce de cancer colorectal et ainsi, améliorer la prise en charge des patients.
Procédures
Nous allons évaluer les effets d’une croissance tumorale induite chimiquement, sur les macrophages à BLP. La croissance tumorale sera suivie par coloscopie (imagerie) sur les animaux anesthésiés (durée de l’anesthésie : 10 minutes) à raison de 1 à 2 fois par semaine pendant 6 à 8 semaines, protocole d’imagerie suivi pour toutes les procédures ici. Dans une deuxième procédure visant à optimiser le protocole de greffe tumorale, différents lots de souris seront greffés avec une tumeur au niveau du colon, sous anesthésie (durée de l’anesthésie inférieure à 20 min) : la surface du côlon sera lésée et les cellules tumorales déposées par voie intrarectale. La croissance tumorale sera suivie par coloscopie. Dans une 3ème procédure visant à inhiber les macrophages à BLP, des souris anesthésiées (durée de l’anesthésie inférieure 20min) recevront des molécules à tester (voie d’administration propre à chaque molécule). Dans une 4ème procédure, nous réaliserons la même inhibition des BLP mais dans un modèle de cancer colorectal induit chimiquement. Suivant les molécules validées in vitro puis testées ici, il sera peut-être nécessaire d’avoir recours à nouveau à une anesthésie (locale et/ou systémique). La croissance tumorale sera surveillée par coloscopie. Dans une 5ème procédure visant à déterminer l’effet de l’inhibition des macrophages sur la croissance tumorale induite par greffe colique, les animaux seront anesthésiés (10 minutes) pour être greffés avec des cellules tumorales par voie intra-rectale. Suivant les molécules validées in vitro puis testées ici, il sera peut-être nécessaire d’avoir recours à nouveau à une anesthésie (locale et/ou systémique). La croissance tumorale sera surveillée par coloscopie. La même expérience sera réalisée dans des souris génétiquement modifiées permettant de reproduire les effets des traitements utilisés précédemment et ayant fonctionné mais de manière plus spécifique. Enfin, pour déterminer l’effet d’une altération de la flore intestinale sur la croissance tumorale par induction chimique, les animaux recevront un traitement antifongique dans l’eau de biberon. La croissance tumorale sera suivie par coloscopie. Ceci sera comparé avec le modèle de greffe colique. Les souris anesthésiées seront greffées au niveau du côlon (administration des cellules tumorales par voie intra rectale) (durée de l’anesthésie : 10 minutes). La croissance tumorale sera suivie par coloscopie.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés lors des procédures d’AOM DSS peuvent présenter une perte de poids, des saignements dans les selles et rectaux. Le poids des animaux sera mesuré quotidiennement tout au long de la procédure et une surveillance par coloscopie sera faite. Les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie intra-rectale développeront des tumeurs. Elles seront surveillées régulièrement par endoscopie pendant maximum deux mois (fin de l’expérience). Les nuisances attendues lors de la greffe (déshydratation, perte de poids, diarrhées, saignements) sont liées à l’endommagement de l’épithélium et à la croissance tumorale. Suite à la greffe, une occlusion peut apparaître ainsi qu’une éventuelle perte de poids au cours de l’expérience.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Nous allons tester tous les inhibiteurs/activateurs in vitro sur des macrophages cultivés avec des cellules du côlon normales ou cancéreuses. Ceci nous permettra d’évaluer en temps réel et de manière dynamique les interactions entre ces deux types cellulaires. En revanche, il est nécessaire de réaliser les expériences sur des animaux afin de modéliser (i) le développement des tumeurs colorectales et (ii) les interactions entre les différentes populations immunitaires et (iii) les cellules cancéreuses.
Réduction
Seuls les inhibiteurs/activateurs présentant un effet en culture seront testées sur les animaux. Une procédure visant à raffiner le protocole de greffe tumorale sera réalisée afin de limiter le nombre d’animaux des procédures suivantes. Par ailleurs, les procédures sur animaux seront réalisées séquentiellement : certaines procédures ne seront réalisées que si les expériences précédentes montrent un effet intéressant. Le suivi par endoscopie permettra d’évaluer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour observer les effets de chaque geste, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux pour les procédures suivantes. Le nombre d’animaux a été déterminé par une approche statistique.
Raffinement
En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, les animaux sont suivis attentivement (mesure de la tumeur, poids, aspect et comportement) afin de détecter tout signe de souffrance ou d’angoisse, et d’assurer leur bien-être. Une grille de score adaptée aux procédures réalisées est mise en place pour évaluer de manière objective l’état des animaux. Un suivi de l’évolution tumorale sera réalisé par imagerie. Du gel nutritif et hydratant sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire, et limiter la perte de poids et la déshydratation qui peuvent être causés par les traitements pour la déplétion des macrophages. En cas de déshydratation, une réhydratation parentérale sera réalisée. Les gestes douloureux seront réalisés sous anesthésie générale et complétés par l’administration d’un analgésique. Les gestes nécessitant l’immobilisation des animaux seront également réalisés sous anesthésie générale
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en immunologie et cancérogenèse. La forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins en font un modèle idéal. Par ailleurs, nous utilisons des modèles murins génétiquement modifiés déjà développés et bien caractérisés qui sont les plus adaptés à ce projet. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, afin d’avoir un système immunitaire adulte.
Effet d’un mélange de plantes sur le parasitisme interne chez le jeune bovin
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
16 jeunes bovins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis gardés vivants et placés à l'issue. Ils subissent sept prélèvements de fèces et cinq prises de sang sur animal vigile, espacés de deux semaines, pour évaluer l'effet d'un mélange de plantes sur le parasitisme intestinal. Le porteur indique que les prélèvements provoquent une gêne passagère et une douleur légère de quelques minutes et qu'aucun effet indésirable n'est attendu du produit. Il affirme qu'aucun modèle ne reproduit la complexité des interactions entre parasites et hôte et que l'essai doit se faire sur l'espèce cible, le bovin.
Objectifs
Le parasitisme gastro-intestinal a des conséquences non négligeables sur la production, la santé et le bien-être des ruminants, en particulier chez les jeunes animaux lors de leur première saison de pâturage. L’utilisation de vermifuges chimiques est aujourd’hui la méthode la plus couramment utilisée pour lutter contre les parasites. Si elle a permis de réduire considérablement le parasitisme gastro-intestinal, des résistances aux vermifuges se sont aussi développées. Des alternatives à ces produits sont donc étudiées pour tenter de réduire la pression parasitaire. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer in vivo les effets d’un mélange de plantes sur le parasitisme intestinal des ruminants afin de prévenir l’infestation et la ré-infestation des animaux au pâturage sans produit médicamenteux.
Bénéfices attendus
Le produit testé dans ce projet pourrait permettre de prévenir l’infestation et la ré-infestation des animaux au pâturage sans produit médicamenteux.
Procédures
Au cours du projet, les animaux sont soumis à sept prélèvements de fèces et cinq prélèvements de sang séparés de deux semaines chacun. Ces prélèvements s'effectuent sur animal vigile et ne durent que quelques minutes.
Impact sur les animaux
Toutes les matières premières contenues dans le produit étant déjà autorisées en Union Européenne, aucun effet indésirable lié à l'ingestion de celui-ci n’est attendu. Concernant les prélèvements, les prélèvements de fèces peuvent entrainer une gêne passagère qui cessera au moment du retrait du bras du manipulateur et du gel est utilisé pour faciliter le passage. De même, une douleur légère et passagère peut être éprouvée au moment de la prise de sang, mais celle-ci ne devrait pas durer plus de quelques minutes.
Devenir
Les seize animaux seront placés à la fin de la procédure expérimentale. En effet, ils recevront un mélange de plantes, dont chaque plante est autorisée dans l'Union Européenne, et ne subiront qu'une procédure de classe légère permettant leur placement dans de bonnes conditions.
Remplacement
Des premiers résultats in vitro ont démontré une réduction de 50% du développement et de la mobilité des strongles (parasites présents dans l’intestin des bovins) avec le mélange de plantes testé. Il est maintenant nécessaire d’évaluer l’effet du produit in vivo sur l’espèce animal cible, ici le bovin, car il n’existe actuellement pas de modèle permettant de reproduire la complexité des interactions entre les parasites et leur hôte.
Réduction
Les bovins sont conduits en conditions contrôlées et uniformes afin de minimiser les variations liées à l’environnement. Seize bovinss sont inclus dans cet essai mené en longitudinal. Ce nombre a été déterminé par une analyse statistique et s'appuie sur des résultats de la littérature.
Raffinement
Les bovins sont manipulés dans un couloir adapté à leur contention pour éviter tout risque de blessure, et lors des prélèvements de fèces, le gant du manipulateur est enduit de gel pour faciliter le passage. Afin de respecter leur bien-être et leur instinct grégaire, les animaux sont logés par quatre sur une litière de paille. Au quotidien, le personnel animalier observe le comportement de chaque animal le matin et le soir au moment de la distribution du repas afin de repérer les signes de mal-être ou de souffrance. Ces signes inhabituels sont immédiatement signalés au responsable de l’expérimentation. Ces animaux seront soignés et si jugé nécessaire par le vétérinaire retirés de l’essai.
Choix des espèces
L’essai doit nécessairement être conduit avec des bovins car c’est l’espèce cible du produit testé et le parasitisme et son interaction avec l'hôte sont spécifiques de chaque espèce. Les animaux utilisés sont de jeunes bovins sevrés, ayant entre 6 et 10 mois au début du projet. Il s'agit d'un âge critique pour l'infestation parasitaire. De plus ces animaux auront eu le temps de pâturer au minimum un mois avec des adultes, ce qui assure leur infestation.
Développement d’une solution préventive des infections urinaires chez la femme
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
70 rates vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, vingt-quatre en gravité légère et quarante-six en gravité modérée. Elles reçoivent jusqu'à quatre administrations d'une solution non dévoilée sous anesthésie gazeuse et subissent des anesthésies répétées à l'isoflurane sur quatre semaines, avant d'être tuées pour analyse histologique. Le porteur garde le produit secret, non breveté, et le présente comme une alternative aux antibiotiques contre les cystites récidivantes. Il affirme "incontournable" le recours à l'animal, les modèles artificiels ne reproduisant pas selon lui la physiologie du système urogénital.
Objectifs
La cystite aiguë est une infection urinaire localisée au niveau de la vessie très fréquente chez la femme. Elle survient consécutivement à l’entrée de bactéries naturellement présentes dans le tube digestif (Escherichia coli dans 90% des cas) par le méat urinaire. Ces bactéries remontent dans l’urètre pour atteindre la vessie et se multiplier, ce qui provoque l’infection. Les symptômes de ces infections urinaires sont notamment une pollakiurie (envie fréquente d’uriner) et une miction douloureuse accompagnée de brûlures mictionnelles. Malgré l’existence de compléments alimentaires préventifs, conjuguée à l’application des mesures hygiéno-diététiques, ces cystites peuvent être récidivantes et impactent le quotidien des femmes. En cas d’infection, le recours à une antibiothérapie (administration orale d’antibiotiques monodoses) est la règle, exposant à des risques d’antibiorésistance. Ainsi, de nombreuses femmes utilisent déjà les différentes solutions de prévention mais aucune n’est pleinement satisfaisante. Dans ce contexte, ce projet consiste à développer une solution de prévention des infections urinaires bactériennes chez la femme. La solution que nous développons est une alternative aux antibiotiques. Nous n’en dirons pas plus sur cette dernière qui n’est pas encore brevetée et est tenue par le secret industriel.
Bénéfices attendus
L’un des traitements en première instance des cystites aiguës est l’utilisation d’antibiotique en dose unique. L’antibiorésistance constitue un problème majeur de santé publique et il est primordial de trouver de nouvelles solutions thérapeutiques ou préventives évitant l’utilisation répétée d’antibiotiques. Cette solution préventive représente une alternative prometteuse ne nécessitant pas de substance active tel que les antibiotiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à 1) 4 administrations maximum sous anesthésie gazeuse à raison de une fois par semaine ; 2) des anesthésies gazeuses à l’isoflurane de courte durée (5 anesthésies par semaine de 5 minutes environ, pendant 4 semaines maximum).
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un stress léger à modérée lié à la répétition des anesthésies à l’isoflurane pour l’étude en imagerie. Dans de rare cas, les rats pourraient ressentir une gêne au niveau du site d’administration (inflammation légère à modérée) qui pourra se traduire par des comportements anormaux de léchage ou grattage excessif, auquel cas la procédure sera stoppée et l’animal mis à mort.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort et certains organes seront prélevés en vue d’effetuer une analyse histologique des tissus.
Remplacement
La solution de prévention des infections urinaires a été évalué dans des systèmes de simulation in vitro mais il devient nécessaire de le tester maintenant dans des conditions physiologiques et le recours à l’animal est incontournable car les modèles artificiels ne nous permettent pas de mimer parfaitement la physiologie du système urogénital. Ce dispositif étant amené à être utilisé de manière répétée pour des cystites chroniques, il est nécessaire de reproduire dans le temps son administration afin d’évaluer sa bonne tolérance (étude histologique des tissus) et ceci ne peut être réalisé que chez l’animal.
Réduction
Nous avons 6 formulations à tester (5 + 1 de référence). Afin de limiter le nombre d’animaux utilisé nous avons prévu une étude pilote qui permettra : 1) la mise au point technique du modèle avec la formulation de référence (12 rats au maximum) ; 2)une pré-évaluation des 6 formulations sur 2 rats pour sélectionner celles répondant au cahier des charges et d’éliminer les autres. Au maximum, les 4 meilleures formulations entreront dans la procédure 2 où nous poursuivrons l’étude sur un plus grand nombre d’animaux afin d’évaluer et valider leur performances de prévention des infections urinaires après une première administration puis, pour les formulations confirmées, après des administrations répétées, sur la base de une fois par semaine pendant un mois. L’objectif est que la solution de prévention soit efficace pour au moins 80% des animaux. Pour avoir un résultat statistiquement fiable, le nombre de rats nécessaire par groupe expérimental est estimé à 11.
Raffinement
Les procédures se feront sous anesthésie générale à l’isoflurane. Les animaux seront manipulés par la personne en charge de l'expérimentation pendant la période d'acclimatation afin de les habituer et ainsi diminuer le stress le jour de la procédure. Ils seront surveillés pendant toute la durée de la procédure afin de repérer des signes cliniques éventuels de gène ou de mal-être et des points limites adaptés seront mis en place et strictement appliqués. Les animaux seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi afin de favoriser les interactions et leur bien-être.
Choix des espèces
Nous utiliserons des rats femelles Sprague Dawley qui sont largement utilisés dans les études sur les pathologies du tractus urinaire et lesquelles une large bibliographie existe. Les rats seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines, 200-250g) car le dispositif étudié est destiné pour les adultes.
Mise en place des modèles oncologiques chez la souris NSG par greffe en zone sous-cutanée auriculaire
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 425 souris immunodéprimées vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue et soixante reproductrices réutilisées, dans des procédures de gravité légère à modérée. Elles reçoivent la greffe d'un tissu dans le pavillon de l'oreille puis l'injection de cellules tumorales humaines, suivies d'un traitement candidat et d'un suivi par imagerie, pour mettre au point un modèle de xénogreffe. Le porteur décrit des risques d'ulcération, de démangeaisons et d'automutilation au site de greffe. Il présente ce modèle comme un "raffinement" réduisant l'invasivité des greffes en oncologie et affirme "indispensable" le recours à l'animal, la culture cellulaire ne reproduisant pas l'environnement tumoral.
Objectifs
La recherche en oncologie est principalement menée sur la souris en injectant des cellules en sous cutanée ou en réalisant des greffes au niveau des organes concernés. Ces protocoles éprouvés permettent de réaliser la recherche de nouveaux traitements toujours plus efficaces. Cependant, ces méthodes présentent des limites qui sont le tissu non spécifique pour les injections en sous cutanée et l’inaccessibilité des cellules tumorales suite à la greffe de celles-ci. Ce projet vise à générer un nouveau modèle en oncologie qui permettrait de réduire et raffiner les approches d’expérimentation animale avec techniques de greffe et d’injection de cellules, mais également de se rapprocher toujours plus des conditions physiopathologiques des cancers dans lesquels le microenvironnement de la tumeur joue un rôle important. Il s’agit d’un modèle de xénogreffe humanisée dans le pavillon de l'oreille de souris immunodéprimées : un tel site, directement accessible à une observation facile in vivo notamment par imagerie par transparence, offre la possibilité d’un suivi dans le temps par imagerie in vivo ce qui de facto réduit le nombre d’animaux nécessaires. Pour élaborer notre modèle, nous utiliserons une lignée de souris immunodéprimée NSG et donc tolérante à différents types de greffe ou d’injection. Dans un premier temps, le tissu cible des cellules tumorales sera greffé afin de créer l’environnement favorable facilement accessible pour y injecter dans un second temps les cellules tumorales. Les cellules tumorales se retrouveront alors directement dans leur tissu de prédilection, au plus proche des conditions retrouvées lors des pathologies. Si ce modèle se montre concluant (croissance tumorale et vascularisation), des molécules à visée pharmaceutique connues seront testées. Grâce à l'étude de tissus humains dans un environnement in vivo, un tel modèle peut offrir une méthode au plus proche des conditions physiolopathologiques retrouvées chez les patients atteints par un cancer. Dans une logique de médecine du futur, ce modèle permet d’envisager une étude personnalisée de la maladie d’un patient afin de déterminer le traitement le plus efficace.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont tout d’abord de proposer un modèle innovant en oncologie et tout autre champ d’application comme par exemple les maladies neurodégénératives, la virologie etc... Ce modèle utilise l’oreille de la souris comme tissu cible de la greffe ou de l’injection. Les feuillets très fins qui composent ce tissu le rendent presque transparent ce qui permet de réaliser, de manière simplifiée, un suivi in vivo des processus cellulaires par fluorescence. Ces suivis sont déjà réalisables mais nécessitent une procédure expérimentale lourde pour l’animal, ou un faible niveau de résolution optique. Avec des cellules préalablement marquées à l’aide de fluorochromes, ce modèle permet une accessibilité facilitée à l’acquisition des processus cellulaires in vivo et donc à la réalisation d’études cinétiques du suivi de l’évolution tumorale. Ce projet permettra aussi d’étudier différents types de cellules tumorales dans un tissu humanisé et préalablement greffé. En effet, une grande partie des études en oncologie utilise des injections sous-cutanées pour faciliter l’étude des cellules tumorales. Ici, il est proposé d’injecter des cellules tumorales directement dans leur tissu cible, afin d’avoir un modèle plus proche des conditions pathologiques. De plus, ce modèle permettra un raffinement des greffes chez la souris puisque seule l’oreille sera opérée, avec une cicatrisation très simple, en remplacement d’interventions chirurgicales plus invasives en fonction du type de greffe. En plus de faire progresser et d’étoffer les connaissances scientifiques en oncologie, ce projet permettra d’établir un nouveau modèle qui permettra à terme de limiter le nombre d’animaux utilisés, d’alléger les interventions, et de faciliter l’accès à l’imagerie in vivo
Procédures
En fonction de la procédure, les animaux seront soumis au maximum à une intervention chirurgicale d’une trentaine de minutes pour greffer le tissu dans le pavillon de l’oreille. Cette greffe pourra être suivie par une injection de cellules tumorales dans le greffon 2 semaines après (intervention d’une quinzaine de minutes). Ces deux actes seront effectués sous analgésie et anesthésie générale. Deux semaines après, les souris seront soumises à minima à une contention de quelques minutes et à maxima à une anesthésie générale de 15 minutes pour réaliser l’imagerie. L’acquisition des images n’est pas invasive pour l’animal et sera répétée toutes les deux semaines jusqu’à la fin de la procédure. Une semaine après l’injection des cellules tumorales, l’administration d’une molécule candidate pour un traitement sera réalisée par injection sous anesthésie (15 minutes).
Impact sur les animaux
Des effets indésirables suite à la greffe de tissu dans l‘oreille pourraient être observés chez les animaux, même si une procédure expérimentale récente rapporte qu’en pratique ce n’est pas le cas. Les souris pourraient présenter une ulcération au niveau de la greffe deux à trois semaines après celle-ci, ou une gêne pouvant conduire à des phénomènes de démangeaisons voire, à l’extrême, de la mutilation. Les souris seront surveillées quotidiennement suite à la greffe. L’implantation de tumeurs chez la souris est une technique éprouvée et publiée par de nombreux laboratoires depuis plusieurs années, ce qui nous permet d’avoir du recul sur les nuisances ou effets indésirables attendus. Il se peut que ces souris perdent du poids une à deux semaines après l’injection des cellules tumorales ou qu’elles présentent une ulcération au niveau de la tumeur deux à trois semaines après l’injection des cellules tumorales. Le développement de ces tumeurs et/ou l’apparition de métastases ont un impact sur la santé de l’animal, dont les premiers signes sont un amaigrissement et des modifications comportementales. De ce fait, le suivi du poids des animaux et d’une échelle d’évaluation du bien-être animal informeront sur l’état des animaux. Ces points limites sont susceptibles d’évoluer dans le but d’être plus performants à détecter la moindre souffrance de l’animal.
Devenir
A l’exception des animaux reproducteurs qui n’auront reçu aucune chirurgie ni injection (élevage et production des animaux pour d’autres procédures), les animaux entrant dans les procédures seront euthanasiés, ce qui s’avère nécessaire pour rechercher et étudier les mécanismes permettant le maintien de la greffe mais aussi l’évolution des cellules tumorales en fonction de l’environnement dans lequel elles sont assignées. Les animaux reproducteurs seront réutilisés, toujours en tant qu’animaux reproducteurs pour d’autres projets ou le maintien de la lignée dans l’animalerie.
Remplacement
Ce projet propose d’optimiser un modèle murin pour les études en oncologie. De ce fait, l’utilisation d’animaux pour mettre au point ce nouveau modèle et indispensable. Au niveau oncologique, de nombreuses caractérisations ont déjà été effectuées en culture cellulaire, comme l’analyse des biomarqueurs ou l’activité des cellules immunitaires. Il s’agit maintenant d’évaluer la croissance tumorale et son développement in vivo. Pour ce faire, le modèle animal est requis afin d’évaluer la croissance tumorale dans un environnement adéquat. En effet, les greffes de tissu et/ou les cellules cancéreuses ont besoin de multiples signaux pour croître correctement, d’une interaction avec les différents tissus et en particulier avec le système vasculaire de l’hôte, ce qui ne peut être reproduit en culture cellulaire. De plus, nous nous intéressons ici à l’environnement tumoral et son influence sur le développement de la tumeur. Pour évaluer toutes ces interactions avec les différents tissus et/ou types cellulaires, le modèle animal ne peut être remplacé par un autre modèle qui ne représenterait que partiellement un organisme.
Réduction
Dans la littérature spécialisée, les expérimentations de mise au point sont habituellement réalisées sur des groupes de 5 à 15 souris immunodéficientes par condition. Chaque procédure ayant des objectifs distincts, le nombre d’animaux ainsi que le nombre de répétition maximum sont amenés à varier. Les procédures « preuve de concept » nécessite un nombre d’animaux moindre que les procédures visant à valider une hypothèse. Pour les procédures suivantes, la significativité des résultats sera obtenue par des tests appropriés . Pour ces expériences, si les résultats statistiques se montrent significatifs après une répétition, la seconde (et dernière) répétition ne sera pas effectuée.
Raffinement
Ce projet a pour objectif le raffinement des procédures expérimentales appliquées aux les animaux. En effet, pour des études avec des cellules tumorales dans le tissu homologue de la souris, il s’agit d’effectuer une chirurgie invasive (par exemple pour le cancer du rein). Ici nous proposons un raffinement avec une opération limitée au niveau l’oreille de la souris, et ne nécessitant que de la colle chirurgicale pour refermer le feuillet tissulaire décollé, ce qui est de facto moins traumatique. Du fait de la translucidité liée à la finesse des feuillets tissulaires de l’oreille, il sera possible d’étudier des processus à l’échelle cellulaire par imagerie in vivo, sans procédure expérimentale lourde pour l’animal ou avec une résolution supérieure grâce à la transillumination du tissu. De plus ce modèle permettra aussi de réduire le nombre d’animaux lors d’études cinétiques dans le temps, le même animal étant suivi de manière non invasive à différents points de la cinétique. Les animaux seront hébergés par groupes de 5, dans un environnement adapté à leur statut immunodéficient (litière et nourriture stérilisées, eau sur filtre antibactérien d’exclusion, cages avec couvercle filtrant à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h. Les animaux seront examinés quotidiennement par les zootechniciens avec la mise en place de point limite , sous la supervision du vétérinaire clinicien, également en charge du bien-être animal au niveau de l’équipe locale de la structure. L’hébergement animal est en accord avec l’annexe III de la directive 2010/63/EU. Un environnement enrichi sera fourni aux animaux, selon nos procédures standards. Suite à une procédure expérimentale, une attention particulière aux signes de douleurs et de stress sera portée tout au long de l’expérimentation. Les souris présentant ces signes recevront des analgésiques, en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
Le modèle murin (souris) est le modèle de référence dans le domaine de l’oncologie. Pour réaliser notre projet, nous nous appuyons sur des bases bibliographiques solides et différentes données déjà publiées, que nous comparerons à celles obtenues avec notre nouveau modèle. Nous utiliserons des souris âgées de 6 à 8 semaines et pesant de 20 à 25g, ce qui, d’après la littérature scientifique, correspond au stade de développement optimal pour réaliser des greffes de tumeur chez les souris immunodéprimées .
Evaluation de la modulation de l’activité neuronale et de la neurotransmission par les ultrasons focalises chez le rat sain par Tomographie par Emission de Positons (TEP)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
22 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, six en gravité légère et seize en gravité modérée. Chaque animal est anesthésié jusqu'à quatre fois pour recevoir un cathéter dans la veine de la queue, une injection puis une stimulation par ultrasons de trente minutes et une imagerie cérébrale, avant d'être tué pour prélever le cerveau. Le porteur indique un stress lié au jeûne et aux anesthésies répétées. Il décrit une première phase menée sur neurones en culture mais affirme "indispensable" le recours à l'animal pour cartographier l'activation cérébrale, en vue d'applications cliniques contre Parkinson, la dépression et Huntington.
Objectifs
Les ultrasons à basse énergie focalisés offrent la possibilité de stimuler de manière non invasive des régions spécifiques du cerveau avec une grande sélectivité spatiale en focalisant le faisceau ultrasonore sur un volume de l'ordre du millimètre cube, offrant ainsi des avantages techniques par rapport aux autres technologies concurrentes. Malgré le grand nombre d'études soulignant les effets des ultrasons dans la stimulation ou la modulation de l'activité neuronale, peu d'études ont exploré et caractérisé les mécanismes de génération et transmission des réponses créées par ce traitement. L’objectif de ce projet est d’étudier la capacité d’un traitement à ultrasons non-invasif pour activer sélectivement des régions du cerveau animal ciblées, tout en libérant de la dopamine par imagerie TEP (Tomographie par Emission de Positon). Une première procédure permettra de mesurer les effets des ultrasons sur l’activité métabolique cérébrale globale, puis, une seconde procédure mesurera ces effets sur la neurotransmission.
Bénéfices attendus
L'objectif principal de cette proposition est de développer et de décrire un mécanisme unificateur, mesurable depuis les neurones individuels jusqu'aux cerveaux entiers des modèles animaux, par lequel les ultrasons peuvent affecter temporairement ou définitivement la fonction neuronale. Les connaissances obtenues tout au long du projet proposé auront un impact important sur le développement de la technologie de la neuromodulation par ultrasons en clinique pour le traitement de divers troubles neurologiques caractérisés par des déséquilibres dans la sécrétion de neurotransmetteurs (la maladie de Parkinson, les troubles dépressifs et la maladie de Huntington).
Procédures
Les animaux seront anesthésiés jusqu’à quatre fois. Pendant ces anesthésies, un cathéter sera placé dans la queue, un produit sera injecté par ce cathéter et un traitement par ultrasons sera appliqué pendant 30 minutes. Enfin de l’imagerie sera effectuée pendant 30 à 70 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront anesthésiés jusqu’à quatre fois. Pendant ces anesthésies, un cathéter sera placé dans la veine caudale, un produit sera injecté par ce cathéter et un traitement par ultrasons sera appliqué pendant 30 minutes. Enfin de l’imagerie sera effectuée pendant 30 à 70 minutes. Les animaux subiront un stress lors de la mise à jeun et l’anesthésie (nécessaires à la réalisation de l’imagerie).
Devenir
La mise à mort des animaux sera nécessaire pour permettre le prélèvement post mortem du cerveau et la réalisation d’analyses complémentaires.
Remplacement
Une première partie de ce projet a été réalisée sur des neurones en culture in vitro pour permettre de définir les paramètres de stimulation permettant une modulation des neurotransmetteurs sans induire d’effets néfastes. En outre, l’utilisation de ces paramètres de stimulation sera confirmée par des expériences incluses dans d’autres protocoles d’expérimentation animale déjà réalisés. Le recours à l’animal reste cependant indispensable à cette étape, elle nous permettra de cartographier et décrire la distribution spatiale de l'activation neuronale par une stimulation focalisée par ultrasons à basse énergie.
Réduction
L’utilisation de méthodes d’imagerie permet un suivi longitudinal des animaux ce qui entraine une réduction notable des effectifs nécessaires à l’obtention de résultats significatifs, ceci augmenté par le fait que chaque animal inclus est son propre contrôle (diminution de la variabilité inter individuelle). Dans une étude publiée précédemment, une augmentation statistiquement significative de l’activité cérébrale produite par la stimulation par ultrasons, mesurée par une technique similaire à celle proposée dans notre projet, a été obtenue avec n=7. Cependant cette étude a été réalisée uniquement sur des mâles. Compte tenu des statistiques publiées et d’un calcul de puissance, nous estimons que n = 8 (4 femelles et 4 mâles) nous fournira les données nécessaires pour tirer les conclusions recherchées. Nous prévoyons cependant un lot supplémentaire dans le cas où le sexe impliquerait des différences nous empêchant de moyenner les résultats obtenus chez les mâles et les femelles. La seconde partie du projet portant sur la neurotransmission (contrairement à la première qui étudie le métabolisme), nous attendons une mesure plus sensible et donc anticipons un effectif moindre permettant d’obtenir une différence significative (n=6). Cette étude préliminaire pourra être complétée par un projet ultérieur en cas de résultat prometteur.
Raffinement
La mise à jeun sera précisément de 4h pour tous les individus, sans stress supplémentaire lié à un isolement (mise à jeun séquentiellement et dans une cage commune). Les stimulations LEUS et les imageries seront réalisées sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane avec un monitorage continu du rythme respiratoire. Cette méthode d’anesthésie permet de régler finement, et en temps réel, la quantité nécessaire à la sédation de l’animal et limite les risques de surdose. Tout au long du protocole, les animaux seront suivis quotidiennement avec une grille de score permettant de détecter précocement tout signe de mal-être.
Choix des espèces
Nous utiliserons des rats dans ce projet. Ce modèle a été choisi parce que le niveau d'anesthésie, paramètre clé pour une activation cérébrale réussie par ultrasons à basse énergie focalisés, est relativement facile à contrôler chez ces animaux. Le modèle de rat est également très sûr pour garantir des résultats préliminaires réussis car : 1) c'est un modèle qui a été utilisé par plusieurs équipes pour mettre en évidence la neurostimulation et la neuromodulation par ultrasons à basse énergie focalisés ; 2) nous disposons de résultats préliminaires in vivo de stimulation ultrasons à basse énergie focalisés réussie dans notre laboratoire 3) le cerveau du rat possède les grands principes d’organisation anatomique conservés chez l’homme et a une taille qui permet d’étudier de nombreuses aires cérébrales retrouvées également chez l’homme et de les cibler précisément par la focalisation du traitement par ultrasons. Pour toutes les expériences, des rats âgés de 10 semaines seront utilisés afin de maintenir la cohérence de l'âge entre les expériences de ce projet et les expériences précédemment réalisées au laboratoire.