Procédures légères
La metformine peut elle promouvoir B. faecichinchillae, espèce commensale du microbiote intestinal humain possèdant des propriétés anti-diabétiques équivalentes
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
96 rats nés sans flore intestinale vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées de gravité légère. Ils reçoivent par gavage le microbiote d'un donneur humain puis une supplémentation quotidienne de metformine, subissent des prélèvements de selles hebdomadaires et des contentions en tube pour la mesure de composition corporelle, avant l'autopsie. Le projet cherche à savoir si la metformine favorise une bactérie intestinale aux propriétés antidiabétiques, en vue d'un probiotique chez l'humain. Le porteur affirme le "recours absolu" à un modèle animal, jugeant l'analyse impossible chez l'humain.
Objectifs
L’objectif du projet est de déterminer si la metformine, traitement thérapeutique du diabète de type II, peut promouvoir la population bactérienne d'intérêt, Bacteroides Faecichinchillae, possédant également des propriétés anti-diabétiques, dont les effets sur la santé seront évalués, en particulier au niveau tissulaire.
Bénéfices attendus
Si le traitement à la metformine permet de promouvoir l’espèce commensale d’intérêt, B. faecichinchillaeae, l’utilisation de cette bactérie sera proposée comme probiotique chez l’homme soit en remplacement de la metformine soit en association avec la metformine. L’administration de la souche permettrait en effet de limiter les effets secondaires observés chez l’homme suite à la prise de ce médicament.
Procédures
Les animaux seront soumis à 5 types d'interventions au cours du pojet : 1) gavage orogastrique permettant l'implantation du microbiote du volontaire chez les rats axéniques (animaux nés sans microflore bactérienne colique) : 1 seule intervention, en tout début de projet et d'une durée inférieure à la minute car elle est pratiquée par des zootechniciens formés et expérimentés 2) prélèvements de selles : 1 intervention pas semaine et par animal, d'une durée inférieure à la minute, et enfin 3) une supplémentation quotidienne de Metformine par un gavage oro gastrique (200mg/kg de poids corporel) pratiquée par des zootechniciens formés et expérimentés 4) la composition corporelle est mesurée a l'aide d'un appareil analytique type RMN qui effectue les mesures en 3 min, pendant cette durée les animaux sont contentionnés dans un tube PVC afin qu'ils restent immobiles pour la précision des mesures.
Impact sur les animaux
Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Les donneurs étant, dans le cadre de projet des volontaires sains, aucun effet indésirable n'a été constaté lors du developpement et de l'utilisation de ce modèle, l'alimentation est, de plus, adaptée et n'entraine donc pas de troubles digestifs ou de croissance. Plus de 60 ans d'utilisation de la metformine en santé humaine ont démontré l'efficacité et l'inocuité de ce médicament, toutefois, selon les doses prescrites, des effets secondaires sont observés chez près de 25 % des patients en particuliers des intolérances gastrique et nausées. Si dans la bibliographie, ces symptômes ne sont pas mentionnés dans les éudes in vivo, une attention particulière sera, cependant, portée sur une apparition potentielle de ces symptômes lors de l'observation quotidienne des animaux. Le gavage orogastrique qui va permettre l'établissement du modèle peut être source de stress, lié à la contention de l'animal. C'est pourquoi les animaux sont préalablement conditionnés à la manipulation et que le geste technique est réalisé par des zootechniciens formés et expérimentés qui vont limiter significativement la durée de ce stress potentiel (moins d'une minute). De la même façon, le prélèvement de selles chez l'animal peut être source de stress lié, également, à sa contention nécessaire, toutefois considérant la fréquence (1 fois pas semaine) et de la rapidité du geste (moins d'une minute), les effets indésirables sont très limités.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de cette procédure puis autopsiés afin de récupérer l'ensemble des organes et fluides métaboliques nécessaires aux futures analyses biologiques, génomiques et histologiques.
Remplacement
L’évaluation de l’impact de la metformine sur le microbiote nécessite le recours absolu à un modèle animal pour atteindre notre objectif. Il est en effet très difficile voire impossible d’analyser l’effet potentiel de ce produit sur le rôle de la paroi intestinale (perméabilité, immunité) et sur les métabolismes hépatiques (céramides, voies métaboliques de l'insuline, etc...) chez l’homme. De plus, ceci nécessite une alimentation contrôlée et similaire pour tous les individus ainsi que des mesures et des prélèvements particulièrement difficiles à effectuer chez l’homme.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au strict nécessaire pour observer des effets statistiquement significatifs. De plus, les tissus prélevés seront soient analysés pour répondre au questionnements scientifiques proposés par le projet, soient conservés pour de futures analyses, non prélablement prévues dans le cadre du projet, et qui pourraient complémenter les résultats obtenus.
Raffinement
Les procédures, nécessitant un raffinement de leur exécution pour limiter leur impact sur les animaux, sont les gavages orogastriques, les prélèvements de selles Celles ci seront réalisées par des zootechniciens formés et expérimentés qui permettront de limiter la durée de la procédure par animal (moins d'une minute pour le gavage et les prélèvemets de selles). De plus, avant la première intervention, une habituation à la contention sera réalisée prélalablement par ces zootechniciens permettant ainsi de diminuer le stress suceptible d'être occasionné par ce geste technique. Les animaux font l'objet d'une surveillance quotidienne pour détecter, réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse. la classification modérée lors du passage en chambre respiratoire est justifiée par le fait que les animaux doivent etre places seul dans ces equipements afin de mesurer individuellement les excretions de gaz. Quelle que soit la procédure appliquée, si un animal présentait les signes suivant : perte de poids, prostration, comportement agressif, léthargique, etc... (points limites notables) ou plaies, saignement nasaux ou fécaux, etc...(points limites graves), l'arbre de décision concernant l'application des point limites serait suivi immédiatement.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies sont des rats mâles nés axéniques de la lignée Fischer âgés de 10 semaines. Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Il permet également le recueil d’une quantité plus importante de fèces et de contenus caecaux nécessaires aux études de la composition et de l’activité du microbiote intestinal que la souris. Les rats seront âgés de 10 semaines au moment de l'implantation du microbiote de volontaire par gavage oro gastrique. Cet âge correspond à un stade de développement optimal pour l'acceptation et la stabilisation dans le temps du microbiote transplanté.
Imagerie fonctionnelle du cerveau chez les poissons cichlidés par IRM
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
540 poissons cichlidés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées de gravité légère. Ils reçoivent une injection unique de manganèse, un produit de contraste que le porteur décrit lui-même comme neurotoxique et s'accumulant dans le cerveau, subissent des tests comportementaux après une phase d'entraînement de vingt jours, puis une IRM d'environ deux heures sous anesthésie, avant que leur cerveau soit prélevé. L'objectif est de comprendre le rôle d'une structure cérébrale propre aux poissons téléostéens et l'évolution des capacités cognitives. Le porteur affirme qu'une étude fonctionnelle de ces espèces est "indispensable" et que la taille du cerveau du poisson zèbre ne suffit pas pour cette imagerie.
Objectifs
Des études montrent que certains poissons comme les labres et les cichlidés (du groupe des poissons téléostéens) sont doués de capacités cognitives dites « supérieures ». Par exemple, des tests ont mis en évidence qu’ils sont capables d’utiliser des outils, qu’ils ont la faculté de se reconnaitre (test du miroir) ou encore qu’ils ont une communication multimodale complexe. Les cerveaux des poissons téléostéens sont organisés de façon très différente de ceux des mammifères, et leurs structures et leurs fonctions demeurent peu connus. En particulier, une structure de la partie ventrale du cerveau, le lobe inférieur, n'existe que chez les téléostéens, et n’est pas retrouvée chez les mammifères ou les oiseaux. Les fonctions de cette structure demeurent inconnues, et des travaux précédents suggèrent qu’elle pourrait être impliquée dans les fonctions cognitives remarquables des cichlidés et des labres. Notre projet consiste donc à étudier l'organisation du cerveau des cichlidés via une étude IRM à la fois anatomique et fonctionnelle, nécessitant la mise en place de test comportementaux chez les espèces Amatitlania nigrofasciata (A. nigrofasciata), Neolamprologus brichardi (N. brichardi), et Pseudotropheus zebra (P. zebra). Ces trois espèces ont une taille, une anatomie cérébrale et des comportements différents. La visualisation de l’activité cérébrale du cerveau des cichlidés à la suite des tests comportementaux permettra d’élucider la fonction de leur lobe inférieur. Connaître la fonction du lobe inférieur chez plusieurs espèces de cette classe de poissons permettra de mettre en lumière comment, au cours de l’évolution, des cerveaux, très différents de ceux des mammifères par exemple, ont pu permettre l’émergence de comportements complexes.
Bénéfices attendus
Cette étude fonctionnelle de recherche fondamentale permettra de mieux comprendre comment les cerveaux de tétrapodes (amphibiens, reptiles, oiseaux et mammifères) et de téléostéens, dont les morphologies diffèrent considérablement, peuvent posséder des capacités cognitives similaires et ainsi d’élucider certains mécanismes de l’évolution de fonctions aussi complexes.
Procédures
Injection unique d’un produit de contraste sous anesthésie (moins de 5 minutes), tests de comportements pour étudier les capacités cognitives (une session d’une heure par jour pendant 2 jours post-injection, et une phase d’entrainement d’une session d’une heure par jour pendant 20 jours pré-injection) et imagerie par résonnance magnétique (IRM) sous anesthésie durant environ 2 heures afin de visualiser l’activité cérébrale induite par les tests de comportement. Le poisson est maintenu dans un tube rempli d’eau contenant de l’anesthésiant puis placé dans l’IRM pour la durée de l’acquisition (environ 2h). La température de l’eau est surveillée tout au long de l’acquisition. Chaque animal ne peut être scanné qu’une seule fois, le manganèse s’accumulant dans le cerveau et étant neurotoxique.
Impact sur les animaux
Les seules nuisances attendues sont liées au stress de l’isolement, du transport et de l’anesthésie des poissons. De plus, une douleur au site d’injection du produit de contraste est également possible.
Devenir
Même si ce projet est constitué uniquement d’une procédure de classe légère, les animaux ne pourront pas être réutilisés pour des tâches de comportement, puisqu’ils ne seront plus naïfs. De ce fait, il n’est pas possible de les réutiliser. Le replacement ou l’adoption des animaux n’est pas une solution retenue en raison du nombre d’animaux impliqués, et du fait que les effets à long terme d’injection de manganèse sur la santé des poissons ne sont pas connus. Il a été décidé de procéder à leur euthanasie. Suite à l’euthanasie, les cerveaux des animaux seront prélevés et serviront à des expériences de neuroanatomie.
Remplacement
Les poissons téléostéens ont été récemment cooptés au rang d’animaux modèles pour les analyses anatomiques étudiant les structures cérébrales qui sous-tendent les fonctions motrices et sensorielles, ainsi que des comportements dits « de fonctions cérébrales supérieures » (émotions, motivation, apprentissage). Ces différents types de comportements ont déjà été observé chez A. nigrofasciata, Neolamprologus brichardi, et Pseudotropheus zebra, mais chaque espèce présente des comportements particuliers et qui lui sont propres. De plus, leurs cerveaux sont anatomiquement différents. Pour mettre en évidence quelles parties du cerveau de cichlidé sous-tendent ces remarquables capacités cognitives, une étude fonctionnelle de ces espèces est indispensable. De plus, la taille du cerveau des espèces de téléostéens traditionnellement utilisées (poisson zèbre, médaka), ne permet pas de réaliser l’imagerie nécessaire à ce projet avec une résolution suffisante. L’utilisation de cichlidés, et en particulier de ces trois espèces, dont la taille du cerveau permet l’imagerie, semble donc toute indiquée.
Réduction
Pour ces expérimentations, le nombre d’animaux utilisés sera limité aux besoins statistiques de nos analyses, et nous privilégierons des tests statistiques qui permettront de limiter le nombre d’individus nécessaires. Des études IRM précédemment publiées chez les mammifères, oiseaux et amphibiens nous permettent de déterminer le nombre d’individus nécessaires.
Raffinement
Dès la réception des animaux, leur bien-être sera particulièrement observé par des zootechniciens compétents. Afin de limiter la souffrance potentielle pour les animaux, nous utilisons une grille d'évaluation des points limites qui prend en compte des comportements ou signes visibles de mal-être. Avant l’injection de manganèse, une anesthésie sera réalisée. Des cachettes (tubes en PVC) seront ajoutées à l'hébergement pour fournir de l'enrichissement. Un contact visuel entre les poissons sera possible puisque les aquariums seront placés les uns à côté des autres. Le transport sera de courte durée et les poissons seront maintenus au chaud par des chaufferettes, puis placés dans un incubateur permettant de les maintenant à la temperature necessaire en attente de leur passage à l’IRM. Une fois anesthésiés et dans l’IRM, l’anesthésie et la température de l’eau seront contrôlées en continue tout au long de l’acquisition.
Choix des espèces
Les poissons ont été récemment cooptés au rang d’animaux modèles pour étudier les régions du cerveau impliquées dans les comportements dits « de fonctions cérébrales supérieures » (émotions, motivation, apprentissage). Ces différents types de comportements ont déjà été observé chez les espèces de poissons cichlidés. Pour mettre en évidence quelles parties du cerveau de cichlidé sous-tendent ces remarquables capacités cognitives, une étude fonctionnelle de ces espèces est indispensable. De plus, la taille du cerveau des espèces de téléostéens traditionnellement utilisées (poisson zèbre, médaka), ne permet pas de réaliser l’imagerie nécessaire à ce projet avec une résolution suffisante. L’utilisation de cichlidés, dont la taille du cerveau permet l’imagerie, semble donc toute indiquée. Pour notre étude, nous utilisons des animaux adultes, puisque les comportements qui nous intéresse ne sont réellement développés qu’à l’âge adulte chez ces animaux.
Effets physiopathologiques de l’alimentation maternelle chez des souris transgéniques ayant une délétion du facteur de transcription Tbx3 dans les neurones à POMC, kisspeptine ou AgRP (1/2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système urogénital
5775 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 160 étant opérées et tuées sans réveil. Elles sont contenues dans un tube pour l'analyse corporelle, soumises à des jeûnes répétés jusqu'à 24 heures suivis de prélèvements sanguins, à une immobilisation et à des tests comportementaux anxiogènes, dans la première partie d'une étude sur l'effet d'une alimentation maternelle hypercalorique. Le porteur renvoie les retombées contre l'obésité et le diabète au "long terme". Il affirme qu'aucun modèle in vitro ni informatique ne remplace l'animal vivant pour ces effets.
Objectifs
Dans le cerveau, différents neurones interagissent entre eux pour contrôler des processus biologiques essentiels. Parmi eux, certains déterminent ce que l’on nomme la « balance énergétique », à savoir l’équilibre entre la prise, le stockage et la dépense de calorie, qui détermine le poids corporel. Des dysfonctionnements dans ces neurones peuvent conduire à des maladies telles que l’obésité et le diabète de type 2. D’autres sont quant à eux connus pour contrôler la puberté et la fonction reproductive. En outre, ces neurones-ci sont particulièrement sensibles aux variations de l’équilibre énergétique. Par exemple, un manque d’énergie peut rapidement diminuer la fertilité, jusqu’à la reconstitution des réserves énergétiques. Un point commun marquant entre les neurones qui contrôlent la balance énergétique et ceux qui contrôlent la fonction reproductive est qu’ils produisent une molécule commune. Cette molécule est cruciale dans la détermination de l’identité et le fonctionnement de ces neurones. De précédentes études ont par ailleurs montré que le régime alimentaire de souris femelles gestantes pouvait affecter le développement neuronal de leurs embryons, notamment via des altérations dans la production de cette molécule. Notre objectif dans ce projet est donc d’étudier le lien entre l’alimentation maternelle et l’action de cette molécule dans nos différents neurones d’intérêt. Nous étudierons les différentes fonctions biologiques contrôlées par ces neurones, à savoir la puberté, le métabolisme (contrôle du poids corporel et du taux de sucre dans le sang) et l’anxiété. Pour ce faire, nous utiliserons différentes souris transgéniques, chez lesquelles les neurones que nous étudions ne peuvent plus produire cette molécule commune. Les mères de ces souris seront nourries soit avec un régime standard pour rongeurs, soit avec un régime hypercalorique et riche en graisses, pour tester l’effet de l’alimentation maternelle sur le développement des petits. Une batterie d’évaluations cliniques et de tests comportementaux et métaboliques nous permettront de répondre aux objectifs scientifiques cités ci-dessus.
Bénéfices attendus
Notre projet apportera des informations nouvelles sur la manière dont l’exposition maternelle à une alimentation hypercalorique interagit avec une molécule produite par nos neurones d’intérêt pour affecter la reproduction et le métabolisme de la descendance. À plus long terme, ce projet pourrait conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre les maladies qui découlent d’une alimentation maternelle hypercalorique (obésité, diabète de type 2, etc.).
Procédures
Voici la liste des gestes techniques réalisés sur les animaux : - Analyse de la composition corporelle (1848 souris) : cette analyse nécessite que la souris soit bloquée en position fœtale à l’extrémité d’un tube en plastique, pour une durée maximale de 5 minutes, sans anesthésie. Les souris subiront 2 analyses de ce type au cours de ce projet, espacées de 9 semaines. - Tests de contrôle de la glycémie (1848 souris) : ces test d’une durée maximale de 2 heures nécessitent de réaliser, après un jeûne de 3 à 16 heures, une injection d’une solution ou un gavage oral, puis de réaliser jusqu’à 7 prélèvements sanguins à différents temps post-injection (espacés de 15 minutes minimum), pour mesurer la quantité de glucose ou d’insuline dans le sang. Ces tests sont réalisés sans anesthésie. Quatre tests seront réalisés sur les mêmes souris, séparés d’un délai d’une semaine. - Evaluation de la maturité sexuelle (1848 souris) : chez les femelles, un petit volume de sérum physiologique sera instillé dans le vagin. Cet examen est quotidien, pendant 2 semaines, et sera réalisé 2 fois (puberté et âge adulte). Chez les mâles pré-pubères, une légère pression est appliquée autour du pénis pour décalotter le gland. Cette manipulation sera réalisée quotidiennement, jusqu’au jour où le décalottage est observé. Chaque examen/manipulation dure environ 10 secondes par souris. - Implant sous-cutané (792 souris) : dans l’une de nos expériences, nous effectuerons un traitement hormonal sur plusieurs jours. Pour ce faire, une unique chirurgie sera réalisée afin d’implanter un tube en silicone sous la peau des souris, qui délivrera le traitement en continu. Cette opération, d’une durée d’environ 30 min, est réalisée sous anesthésie générale, et la douleur est prise en charge grâce à une combinaison de différents médicaments (anesthésique locale, morphinique et anti-inflammatoire). - Tests d’anxiété (1056 souris) : 5 tests seront réalisés pour mesurer le niveau d’anxiété des souris, à raison de 2 tests par semaine, espacés d’au moins 2 jours, sur des souris vigiles. Dans la plupart des tests, la souris est libre d’explorer des environnements plus ou moins inconfortables pendant une durée limitée (entre 5 et 30 minutes). Le test le plus anxiogène nécessite deux jeûnes de 24 heures (séparés d’une semaine) ; le second jeûne étant également couplé à une immobilisation des souris pendant les 15 dernières minutes. Chaque test ne sera réalisé qu’une fois.
Impact sur les animaux
Un protocole d’adoption est prévu pour certains animaux de ce projet. L’échange des portées va stresser les mères et les petits et il se peut qu’il y ait un rejet d’adoption. Cela n’aura lieu qu’une seule fois dans la vie des animaux. Certains tests de comportement sont susceptibles de générer de l’anxiété, via notamment l’exposition à un nouvel environnement inconfortable pour les souris (lumière, espace à découvert…). Nous effectuerons toujours le test le moins anxiogène en premier et avec un maximum de 2 tests par semaine. Ces tests durent entre 5 et 30 minutes. Le test le plus anxiogène, réalisé en dernier, implique deux mises à jeun des souris pendant 24 heures. Ces deux jeûnes seront espacés d’une semaine. La seconde mise à jeun s’accompagne également d’un stress d’immobilisation de 15 minutes. Chaque test ne sera réalisé qu’une seule fois par souris. Les souris impliquées dans les études métaboliques subiront également un léger stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle, qui se déroule dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. Ces animaux seront également soumis à 4 tests de régulation de la glycémie, qui débutent par un jeûne de 3 à 16 heures, pouvant engendrer une perte de poids le jour suivant. Les prélèvements sanguins effectués dans le cadre de ces tests sont réalisés suite à une légère entaille (unique) à l’extrémité de la queue. Cette région n’est que peu innervée, donc moins sensible, mais une douleur peut être ressentie au moment de l’entaille. Il y aura un délai d’une semaine entre chaque test. Des douleurs post-opératoires sont attendues lors la pose chirurgicale d’un implant (tube en silicone) sous-cutané pour délivrer en continu des traitements hormonaux, du fait de l’incision qui sera réalisée (environ 1,5 cm). Ces douleurs devraient s’estomper dans les jours suivant la chirurgie, grâce au traitement analgésique mis en place.
Devenir
À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des tissus seront récupérés (cerveaux ou autres), pour des études in vitro réalisées post-mortem.
Remplacement
Le but de ce projet est d’étudier ensemble de caractéristiques biologiques (poids, composition corporelle et régulation de la glycémie, puberté), et également les comportements anxieux. Dans ce contexte, les neurones qui nous intéressent interagissent avec d’autres structures du cerveau mais également avec divers organes (foie, pancréas, organes sexuels…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre les neurones et le reste du corps. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire ou anxieux nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.
Réduction
Nous avons utilisé un test statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests, de manière à obtenir un maximum d’informations à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes souris, au lieu d’avoir recours à des lots différents. De même, l’ensemble des tests pour la caractérisation des comportements anxieux seront réalisées sur les mêmes animaux. Le nombre d’animaux que nous demandons est le nombre maximal dont nous estimons avoir besoin. Si nous nous rendons compte en cours de projet que ce nombre peut encore être réduit, il le sera bien évidemment.
Raffinement
Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux seront hébergés collectivement (2 souris par cage). 2) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier et de bâtonnets en bois pour ronger. 3) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 4) Notre étude nécessite de réaliser sur certains animaux une chirurgie pour installer un implant sous-cutané. Ces chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole analgésique approprié. Durant la chirurgie, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Le traitement anti-douleur se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. De plus, cette chirurgie constitue en elle-même un raffinement, car la pose de l’implant permet de délivrer les traitements pharmacologiques en continu pendant 6 semaines. Cela nous évite donc d’avoir à réaliser des injections répétées sur les animaux. 6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis, en fonction de différents critères cliniques et comportementaux. Une grille de scores permet de prendre des décisions adaptées en cas de modification de l’état de l’animal. Il peut s’agir soit de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude (après avis vétérinaire), soit de sa mise à mort si rien ne peut être fait pour le soulager.
Choix des espèces
La régulation du poids corporel, le comportement alimentaire et la régulation de la glycémie sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésité ont été développés chez la souris. De plus, les lignées transgéniques dont nous avons besoin pour mener à bien cette étude ont été créées chez la souris. Enfin, la forte proximité biologique entre l’Homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de cette espèce un bon modèle prédictif. Des souris pré-pubères seront utilisées pour l’étude post-mortem de leurs cerveaux, 21 jours après la naissance. Les souris qui auront l’implant sous-cutané pour les traitements hormonaux seront opérées à l’âge de 3 semaines (après sevrage, à l’entrée dans l’adolescence). L’étude de la puberté s’effectuera sur des souris âgées entre 3 et 5 semaines, à l’adolescence, puis plus tard à l’âge adulte (vers 12 semaines). L’étude du comportement anxieux et du métabolisme se fera sur des souris adultes (âgées d’environ 8 et 12 semaines, respectivement).
Rôle de l’autophagie du microenvironnement osseux dans le développement de métastases
- Recherche fondamentale
- Oncologie
430 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. On leur injecte des cellules de cancer du sein ou de la prostate directement dans l'os, ce qui provoquerait des douleurs osseuses en l'absence d'antalgique, avant leur mise à mort quinze jours plus tard pour prélever les os, afin d'étudier le rôle de l'autophagie dans les métastases osseuses. Les retombées se limitent à une meilleure compréhension du mécanisme et à la mise au point d'un composé. Le porteur affirme que l'analyse du développement tumoral chez l'animal est "indispensable".
Objectifs
L'os est un organe complexe et un site attractif pour la colonisation tumorale. Les cancers du sein et de la prostate représentent plus de 690000 cas par an en Europe. Les tumeurs secondaires (métastases) se développant dans l'os, qui sont présentes chez plus de la moitié de ces patients, constituent généralement un point de non-retour car elles sont le plus souvent incurables. Dans ce projet, nous étudions le rôle d'un système de ramassage et de recyclage des déchets cellulaires (appelé autophagie). Ce processus peut également modifier l'environnement proche de la tumeur et favoriser son développement. Le but du travail est donc d'analyser la contribution de l'autophagie osseuse dans le développement des tumeurs dans le tissu osseux. Ce projet devrait également permettre de tester le potentiel effet préventif d’un composé capable de stimuler l’autophagie osseuse.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est une meilleure compréhension du rôle de l'autophagie dans le développement des métastases du tissu osseux et la mise au point d’un composé capable de stimuler l’autophagie osseuse.
Procédures
Trois types d'interventions seront réalisées. Intervention n°1: Injection dans l'os de cellules du cancer du sein ou de la prostate (durée: 15 min) : 100 souris, un unique geste réalisé sous anesthésie générale, traitement antalgique quotidien par prise orale volontaire d'un médicament appétent, mise à mort des souris 15 jours plus tard. Intervention n°2: Injection intrapéritonéale du composé (durée: 5 min) : 90 souris, une unique injection sur souris vigile, mise à mort des souris 15 jours plus tard (ou si ce premier mode d'administration est inefficace: 3 injections séparées de 2 semaines sur souris vigiles, mise à mort des souris 15 jours après la dernière injection). Intervention n°3: Injection intrapéritonéale du composé (durée: 5 min) + injection dans l'os de cellules du cancer du sein ou de la prostate (durée: 15 min) : 240 souris, une unique injection (ou 3 injections) sur souris vigile, puis 15 jours ou 2 mois plus tard, un unique geste réalisé sous anesthésie générale, traitement antalgique quotidien par prise orale volontaire d'un médicament appétent, mise à mort des souris 15 jours plus tard.
Impact sur les animaux
En l'absence de traitement par un antalgique, les souris ressentiraient des douleurs au niveau osseux sur la patte injectée.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et les os des pattes seront récupérés.
Remplacement
Même si un maximum d'expériences sera réalisé ex vivo et in vitro, l'analyse du développement tumoral chez l'animal est indispensable à la réalisation de ce projet.
Réduction
Leur suivi quotidien permettra de détecter tout signe de souffrance ou de détresse et ainsi la prise immédiate des mesures adéquates grâce à l’application de points limites précis. Cette étude utilisera 430 souris sur 5 ans. Le nombre d’animaux utilisés a été déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement robustes à partir du nombre minimum de souris (Réduction).
Raffinement
Les souris seront en permanence sous analgésique et nous avons développé un système permettant la prise orale volontaire de ce médicament. Le jour de l'injection des cellules cancéreuses, les souris auront une anesthésie générale et seront placées sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil. Leur suivi quotidien permettra de détecter tout signe de souffrance ou de détresse et ainsi la prise immédiate des mesures adéquates grâce à l’application de points limites précis.
Choix des espèces
La souris est une espèce animale relativement proche de l’homme. De plus, la souris présente plusieurs avantages comme un cycle de vie relativement court, une natalité importante et un élevage à faible coût. Dans le cas de l’injection de cellules tumorales de cancer du sein, nous utiliserons des souris adultes contrôles et mutantes âgées de 10 à 18 semaines. Dans le cas de l’injection de cellules tumorales de cancer de la prostate, nous utiliserons des souris de plus de 6 mois car ce type de cancer se développe chez des patients plus âgés.
Effets physiopathologiques de l’alimentation maternelle chez des souris transgéniques ayant une délétion du facteur de transcription Tbx3 dans les neurones à POMC, kisspeptine ou AgRP (2/2 )
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système urogénital
5775 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 160 étant opérées et tuées sans réveil. Elles sont bloquées dans un tube pour l'analyse corporelle, soumises à des jeûnes de 3 à 24 heures suivis de prélèvements sanguins répétés, à une immobilisation de 15 minutes et à des tests d'anxiété, pour étudier l'effet d'une alimentation maternelle hypercalorique sur la descendance. Le porteur renvoie au "long terme" d'éventuelles retombées contre l'obésité et le diabète. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ni informatique ne pourrait remplacer l'animal vivant pour ces comportements.
Objectifs
Dans le cerveau, différents neurones interagissent entre eux pour contrôler des processus biologiques essentiels. Parmi eux, certains déterminent ce que l’on nomme la « balance énergétique », à savoir l’équilibre entre la prise, le stockage et la dépense de calorie, qui détermine le poids corporel. Des dysfonctionnements dans ces neurones peuvent conduire à des maladies telles que l’obésité et le diabète de type 2. D’autres sont quant à eux connus pour contrôler la puberté et la fonction reproductive. En outre, ces neurones-ci sont particulièrement sensibles aux variations de l’équilibre énergétique. Par exemple, un manque d’énergie peut rapidement diminuer la fertilité, jusqu’à la reconstitution des réserves énergétiques. Un point commun marquant entre les neurones qui contrôlent la balance énergétique et ceux qui contrôlent la fonction reproductive est qu’ils produisent une molécule commune. Cette molécule est cruciale dans la détermination de l’identité et le fonctionnement de ces neurones. De précédentes études ont par ailleurs montré que le régime alimentaire de souris femelles gestantes pouvait affecter le développement neuronal de leurs embryons, notamment via des altérations dans la production de cette molécule. Notre objectif dans ce projet est donc d’étudier le lien entre l’alimentation maternelle et l’action de cette molécule dans nos différents neurones d’intérêt. Nous étudierons les différentes fonctions biologiques contrôlées par ces neurones, à savoir la puberté, le métabolisme (contrôle du poids corporel et du taux de sucre dans le sang) et l’anxiété. Pour ce faire, nous utiliserons différentes souris transgéniques, chez lesquelles les neurones que nous étudions ne peuvent plus produire cette molécule commune. Les mères de ces souris seront nourries soit avec un régime standard pour rongeurs, soit avec un régime hypercalorique et riche en graisses, pour tester l’effet de l’alimentation maternelle sur le développement des petits. Une batterie d’évaluations cliniques et de tests comportementaux et métaboliques nous permettront de répondre aux objectifs scientifiques cités ci-dessus.
Bénéfices attendus
Notre projet apportera des informations nouvelles sur la manière dont l’exposition maternelle à une alimentation hypercalorique interagit avec une molécule produite par nos neurones d’intérêt pour affecter la reproduction et le métabolisme de la descendance. À plus long terme, ce projet pourrait conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre les maladies qui découlent d’une alimentation maternelle hypercalorique (obésité, diabète de type 2, etc.).
Procédures
Voici la liste des gestes techniques réalisés sur les animaux : - Analyse de la composition corporelle (1848 souris) : cette analyse nécessite que la souris soit bloquée en position fœtale à l’extrémité d’un tube en plastique, pour une durée maximale de 5 minutes, sans anesthésie. Les souris subiront 2 analyses de ce type au cours de ce projet, espacées de 9 semaines. - Tests de contrôle de la glycémie (1848 souris) : ces test d’une durée maximale de 2 heures nécessitent de réaliser, après un jeûne de 3 à 16 heures, une injection d’une solution ou un gavage oral, puis de réaliser jusqu’à 7 prélèvements sanguins à différents temps post-injection (espacés de 15 minutes minimum), pour mesurer la quantité de glucose ou d’insuline dans le sang. Ces tests sont réalisés sans anesthésie. Quatre tests seront réalisés sur les mêmes souris, séparés d’un délai d’une semaine. - Evaluation de la maturité sexuelle (1848 souris) : chez les femelles, un petit volume de sérum physiologique sera instillé dans le vagin. Cet examen est quotidien, pendant 2 semaines, et sera réalisé 2 fois (puberté et âge adulte). Chez les mâles pré-pubères, une légère pression est appliquée autour du pénis pour décalotter le gland. Cette manipulation sera réalisée quotidiennement, jusqu’au jour où le décalottage est observé. Chaque examen/manipulation dure environ 10 secondes par souris. - Implant sous-cutané (792 souris) : dans l’une de nos expériences, nous effectuerons un traitement hormonal sur plusieurs jours. Pour ce faire, une unique chirurgie sera réalisée afin d’implanter un tube en silicone sous la peau des souris, qui délivrera le traitement en continu. Cette opération, d’une durée d’environ 30 min, est réalisée sous anesthésie générale, et la douleur est prise en charge grâce à une combinaison de différents médicaments (anesthésique locale, morphinique et anti-inflammatoire). - Tests d’anxiété (1056 souris) : 5 tests seront réalisés pour mesurer le niveau d’anxiété des souris, à raison de 2 tests par semaine, espacés d’au moins 2 jours, sur des souris vigiles. Dans la plupart des tests, la souris est libre d’explorer des environnements plus ou moins inconfortables pendant une durée limitée (entre 5 et 30 minutes). Le test le plus anxiogène nécessite deux jeûnes de 24 heures (séparés d’une semaine) ; le second jeûne étant également couplé à une immobilisation des souris pendant les 15 dernières minutes. Chaque test ne sera réalisé qu’une fois.
Impact sur les animaux
Un protocole d’adoption est prévu pour certains animaux de ce projet. L’échange des portées va stresser les mères et les petits et il se peut qu’il y ait un rejet d’adoption. Cela n’aura lieu qu’une seule fois dans la vie des animaux. Certains tests de comportement sont susceptibles de générer de l’anxiété, via notamment l’exposition à un nouvel environnement inconfortable pour les souris (lumière, espace à découvert…). Nous effectuerons toujours le test le moins anxiogène en premier et avec un maximum de 2 tests par semaine. Ces tests durent entre 5 et 30 minutes. Le test le plus anxiogène, réalisé en dernier, implique deux mises à jeun des souris pendant 24 heures. Ces deux jeûnes seront espacés d’une semaine. La seconde mise à jeun s’accompagne également d’un stress d’immobilisation de 15 minutes. Chaque test ne sera réalisé qu’une seule fois par souris. Les souris impliquées dans les études métaboliques subiront également un léger stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle, qui se déroule dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. Ces animaux seront également soumis à 4 tests de régulation de la glycémie, qui débutent par un jeûne de 3 à 16 heures, pouvant engendrer une perte de poids le jour suivant. Les prélèvements sanguins effectués dans le cadre de ces tests sont réalisés suite à une légère entaille (unique) à l’extrémité de la queue. Cette région n’est que peu innervée, donc moins sensible, mais une douleur peut être ressentie au moment de l’entaille. Il y aura un délai d’une semaine entre chaque test. Des douleurs post-opératoires sont attendues lors la pose chirurgicale d’un implant (tube en silicone) sous-cutané pour délivrer en continu des traitements hormonaux, du fait de l’incision qui sera réalisée (environ 1,5 cm). Ces douleurs devraient s’estomper dans les jours suivant la chirurgie, grâce au traitement analgésique mis en place.
Devenir
À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des tissus seront récupérés (cerveaux ou autres), pour des études in vitro réalisées post-mortem.
Remplacement
Le but de ce projet est d’étudier ensemble de caractéristiques biologiques (poids, composition corporelle et régulation de la glycémie, puberté), et également les comportements anxieux. Dans ce contexte, les neurones qui nous intéressent interagissent avec d’autres structures du cerveau mais également avec divers organes (foie, pancréas, organes sexuels…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre les neurones et le reste du corps. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire ou anxieux nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.
Réduction
Nous avons utilisé un test statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests, de manière à obtenir un maximum d’informations à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes souris, au lieu d’avoir recours à des lots différents. De même, l’ensemble des tests pour la caractérisation des comportements anxieux seront réalisées sur les mêmes animaux. Le nombre d’animaux que nous demandons est le nombre maximal dont nous estimons avoir besoin. Si nous nous rendons compte en cours de projet que ce nombre peut encore être réduit, il le sera bien évidemment.
Raffinement
Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux seront hébergés collectivement (2 souris par cage). 2) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier et de bâtonnets en bois pour ronger. 3) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 4) Notre étude nécessite de réaliser sur certains animaux une chirurgie pour installer un implant sous-cutané. Ces chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole analgésique approprié. Durant la chirurgie, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Le traitement anti-douleur se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. De plus, cette chirurgie constitue en elle-même un raffinement, car la pose de l’implant permet de délivrer les traitements pharmacologiques en continu pendant 6 semaines. Cela nous évite donc d’avoir à réaliser des injections répétées sur les animaux. 6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis, en fonction de différents critères cliniques et comportementaux. Une grille de scores permet de prendre des décisions adaptées en cas de modification de l’état de l’animal. Il peut s’agir soit de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude (après avis vétérinaire), soit de sa mise à mort si rien ne peut être fait pour le soulager.
Choix des espèces
La régulation du poids corporel, le comportement alimentaire et la régulation de la glycémie sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésité ont été développés chez la souris. De plus, les lignées transgéniques dont nous avons besoin pour mener à bien cette étude ont été créées chez la souris. Enfin, la forte proximité biologique entre l’Homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de cette espèce un bon modèle prédictif. Des souris pré-pubères seront utilisées pour l’étude post-mortem de leurs cerveaux, 21 jours après la naissance. Les souris qui auront l’implant sous-cutané pour les traitements hormonaux seront opérées à l’âge de 3 semaines (après sevrage, à l’entrée dans l’adolescence). L’étude de la puberté s’effectuera sur des souris âgées entre 3 et 5 semaines, à l’adolescence, puis plus tard à l’âge adulte (vers 12 semaines). L’étude du comportement anxieux et du métabolisme se fera sur des souris adultes (âgées d’environ 8 et 12 semaines, respectivement).
Optimisation d’un nouveau biomédicament dans le traitement des carcinomes à petites cellules du poumon et à cellules de Merkel dans un modèle souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
320 souris vont être utilisées, 310 tuées à l'issue et 10 gardées vivantes pour l'apprentissage d'un prélèvement, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du poumon et de carcinome de Merkel sous la peau, des injections intraveineuses répétées en cône de contention et des prélèvements de sang, pour tester un biomédicament anticancéreux avant un essai clinique. Le porteur renvoie ces retombées cliniques au conditionnel, l'objectif immédiat restant de fixer la dose optimale du produit. Il affirme que le comportement du médicament dans un "organisme entier" rend le modèle murin "indispensable".
Objectifs
Notre projet a pour objectif d’utiliser un anticorps médicamenteux qui a montré in vitro son efficacité thérapeutique sur les cellules de cancers cutanés et pulmonaires agressifs. L’objectif du présent projet est d’optimiser le schéma thérapeutique du produit étudié dans le but de mettre en place un essai clinique chez l’humain. Ce projet doit donc permettre de déterminer l'effet dose- réponse du traitement envisagé, la dose minimale efficace et la dose optimale permettant d’observer une réponse objective durable sur la régression tumorale.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre de déterminer l’effet dose- réponse du traitement envisagé, la dose minimale efficace et la dose optimale permettant d’observer une réponse objective durable sur la régression tumorale en modèle de xénogreffe murin de lignées de CCM et de SCLC. Ainsi, ces résultats permettront tout d’abord l’obtention d’informations préliminaires sur la tolérance de produit, permettant d’orienter une étude de tolérance à mener sur une seconde espèce de rongeur (rats). L’objectif plus global est donc d’optimiser le schéma thérapeutique du produit étudié dans le but de contribuer à la mise en place d’un essai clinique de phase 1.
Procédures
Les souris recevront par voie sous-cutanée des cellules de CCM (carcinome à cellules de Merkel) et des SCLC (cancer à petites cellules du poumon) afin d'établir le modèle tumoral. Les animaux seront injectés au maximum deux fois par semaine en intraveineuse avec le biomédicament ou le placebo. Pour cela les souris seront placées dans un cône de contention le temps de l'application de la pommade anesthésiante et de l'injection en intraveineuse (5-10 minutes par intervention). Un prélèvement unique de sang en submandibulaire sera réalisé sur chaque animal durant l'étude à 4 jours et 21 jours après inclusion dans l'étude (intervention d'environ 5 minutes).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront subir un stress lors des différentes contentions pratiquées : une contention pour l’injection des cellules tumorales en sous cutanée, et pour le prélèvement en submandibulaire. Un cône de contention en inox sera utilisé pour maintenir les souris lors des injections en intraveineuse, le stress induit par cela sera limité par l’habituation au cône réalisée avant le début de l’inclusion dans l’étude. Une gêne ou légère douleur pourra être subies par les souris lors du prélèvement en submandibulaire, des injections en sous cutanées ou en intraveineuse mais cela sera limité par l’application de la pommade anesthésiante. Les tumeurs étudiées sont non douloureuses chez l’Homme, chez la souris aucun signe de douleurs n’a été observé durant les études in vivo précédentes. Le point limite décrit pour la taille tumorale permet à la souris de ne pas être gênée par la tumeur que ce soit sur son activité locomotrice ou alimentaire. Une sédation avec injection en intrapéritonéal sera effectuée avant la mise à mort par élongation cervicale afin de limiter toutes douleurs chez l'animal.
Devenir
L'évaluation de la masse finale des tumeurs impose la mise à mort de l'ensemble des souris tumorisée. Les 10 souris prévues pour l'apprentissage du geste technique de prélèvement en submandibulaire seront gardées en vie.
Remplacement
L’efficacité du biomédicament a été préalablement démontrée in vitro et in vivo sur les cellules de cancers cutanés et pulmonaires agressifs. L’étude préliminaire in vivo a consisté à évaluer l’efficacité d'une première posologie qui induisait une stabilisation de la croissance tumorale. D'autres schémas thérapeutiques ont ensuite été testés entrainant une regression quasi complète des tumeurs. Cette nouvelle étude consistera à tester différents schémas thérapeutiques afin d'optimiser l'efficacité du traitement sur d'autres lignées tumorales afin de prendre en compte la diversité des CCM (Carcinome à cellules de Merkel) et des SCLC (cancer à petites cellules du poumon). Cette nouvelle étude apportera des informations clés pour la détermination de la dose et du schéma thérapeutique optimal permettant à la fois une réponse anti-tumorale complète et une bonne tolérance du produit. Ces éléments, essentiels pour le développement d’un nouveau biomédicament et de son évaluation en phase I, nécessitent le passage par un modèle in vivo.
Réduction
La détermination du nombre de groupes et les doses testées sont basées sur les résultats des tests de cytotoxicité in vitro et in vivo préalablement réalisés au laboratoire réduisant ainsi le nombre de souris utilisées. Le nombre de souris utilisé permettra la réalisation de tests statistiques robustes.
Raffinement
Pour les injections en intraveineuse, les souris seront maintenues dans un cône de contention en inox, pour leur générer moins de stress lors de cette manipulation, les souris seront habituées à cette contention 2 fois par semaine avant leur inclusion dans l’étude. De plus, une pommade anesthésiante sera appliquée avant chaque injection en intraveineuse, et une friandise sera donnée aux souris après. Afin de limiter les souffrances lors de l'euthanasie, un sédatif sera injectée en intrapéritonéal avant le sacrifice.
Choix des espèces
Le seul modèle disponible étant des lignées carcinomateuses humaines, l’utilisation d’un modèle murin immunodéficient est indispensable. Les souris NOD/ SCID sont un modèle de référence dans les études de xénogreffes. Le seul modèle disponible étant des lignées tumorales humaines, l’utilisation d’un modèle murin immunodéficient est indispensable. Les souris utilisées sont un modèle de référence dans les études de xénogreffes. Les souris seront receptionnées à 6 semaines de vie, et utilisées à 7 semaines après leur semaine d’acclimatation. Elles seront ainsi dans un stade physiologique de croissance, stade utilisé usuellement dans ce modèle de carcinome et optimal pour évaluer toute toxicité pouvant être liée au traitement par le biomédicament.
Etude des niveaux de contaminants sanguins chez la Cistude d’Europe en France
- Conservation des espèces
630 cistudes d'Europe, une tortue d'eau douce menacée, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes relâchées sur leur site de capture. Chaque individu subit une seule prise de sang lors d'une contention de moins de dix minutes, avant d'être relâché dans les deux heures. Le porteur présente l'espèce comme une sentinelle de la pollution des zones humides et vise à mesurer les contaminants circulants. Cette étude relève de l'écologie de la conservation et n'implique ni mise à mort ni maintien prolongé en captivité.
Objectifs
La dégradation de la qualité de l’eau due à l’intensification des activités humaines est au cœur des préoccupations actuelles. La connaissance des contaminants présents dans les milieux aquatiques attire donc une attention considérable avec des phénomènes d’amplifications dans les chaines alimentaires et des risques sanitaires pour les populations. Les zones humides constituent des réservoirs de biodiversité mais sont fortement impactées par les activités humaines et sont exposées à la pollution chimique. La contamination des masses d’eau (canaux d’irrigation, de drainage et marais) par les rejets agricoles, industriels et urbains a été principalement quantifiée sur les peuplements piscicoles avec la détection de composés organochlorés. Les reptiles sont peu étudiés en écotoxicologie alors qu’ils peuvent apporter des informations sur la contamination et l’impact sur les individus notamment chez des espèces à grande longévité. Dans ce contexte nous proposons d'étudier la Cistude d’Europe, Emys orbicularis, une tortue d’eau douce longévive (espérance de vie > 40-60 ans) qui fait face à un déclin important. Située en haut du réseau trophique, la cistude constitue une excellente espèce sentinelle pour le suivi des polluants et les résultats obtenus dans ce projet fourniront les toutes premières données sur l’état de contamination d’une tortue d’eau douce de France métropolitaine. Une des questions centrales repose sur les variations spatiales des niveaux de contaminants dans le sang qui peuvent fortement dépendre des habitats aquatiques et de la nature des pressions humaines. Ces résultats seront comparés avec des données collectées sur des individus captifs qui serviront de références.
Bénéfices attendus
La cistude d'Europe est une espèce de tortue d’eau douce longévive prédatrice (espérance de vie > 40-60 ans) qui fait face à un déclin important du fait de multiples pressions liées aux activités humaines. Sa très faible mobilité en fait une excellente espèce indicatrice de la pollution locale. Elle bénéficie d’un plan national d’action (PNA) mobilisant un large réseau d’organismes gestionnaires et d’associations de protection de la nature. La clarification des contaminants circulants chez cette espèce est identifiée comme une axe prioritaire d'étude par le plan d'action. Ce projet répond donc spécifiquement à cette problématique.
Procédures
Une prise de sang unique sera réalisée sur chaque individu vigile (volume 1,5 millilitre). Le temps de contention pour la prise de sang est court (
Impact sur les animaux
La contention et à la mise en bac individuel pourront générer un inconfort transitoire. Le temps de contention pour la prise de sang est court (
Devenir
Tous les individus seront maintenus en vie et relachés sur leur site de capture.
Remplacement
L'étude de l'influence des niveaux de contaminants sanguins chez les reptiles a des implications importantes pour la recherche en écologie de la conservation. Ce projet porte spécifiquement sur la Cistude d'Europe. Il n'existe donc pas d'alternative à l'utilisation d'un modèle animal pour cette étude.
Réduction
Le nombre d'individus sera réduit au minimum (30 par site) afin d'évaluer les taux de contaminants qui varient entre les individus. L'étude porte sur 20 sites répartis dans 3 régions et un site compararatif en captivité soit 630 individus au total. Cet effectif est nécessaire pour décrire les variations naturelles des niveaux de contaminants.
Raffinement
La prise de sang sera réalisée par phlébotomie au niveau de la veine coccygienne (« caudale »). Ce site de prélèvement est préféré par rapport au sinus cervical (base du cou) qui impose une contention manuelle de la tête qui peut être très stressante chez cette espèce. La prise de sang dans la veine coccygienne est une technique spécifique maîtrisée dans l'équipe ce qui permet d'assurer une procédure rapide et ainsi minimiser le stress induit. Lors de la période d'attente (avant prise de sang) et d'observation (après), les animaux seront placés en bacs individuels avec obstruction visuelle. Il n'existe pas de risque hémorragique avec la ponction caudale mais un léger saignement peut cependant être observé. Dans ce cas un point de pression sera appliqué sur le site de prélèvement. Cette méthode est très bien tolérée par l'espèce et permet un suivi individuel. Tout au long de la procédure de prise de sang le comportement des individus sera suivi pour détecter toute agitation éventuelle. En cas de comportements anormaux, la prise de sang sera interrompue.
Choix des espèces
La cistude d'Europe est une espèce de tortue d’eau douce longévive prédatrice (espérance de vie > 40-60 ans) qui fait face à un déclin important du fait de multiples pressions humaines. Sa très faible mobilité en fait une excellente espèce indicatrice de la pollution locale. Elle bénéficie d’un plan national d’action (PNA) mobilisant un large réseau d’organismes gestionnaires et d’associations de protection de la nature. La clarification des contaminants circulants chez cette espèce est identifiée comme un axe prioritaire d'étude identifié par le plan d'action. Ce projet répond donc spécifiquement à cette problématique. Adultes uniquement (masse >300g) afin de mesurer les effets de l'accumulation avec l'âge (supérieur à 10 ans).
Etude d’enzymes olfactives impliquées dans l’olfaction chez le lapereau.
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
210 lapereaux vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Âgés de un à deux jours, ils sont séparés de leur mère et exposés à des odeurs pendant 45 minutes, puis mis à mort immédiatement pour prélever leurs tissus olfactifs, afin d'étudier des enzymes de l'olfaction. Le porteur reconnaît un stress lié à la séparation de la mère et à la mise à mort. Il affirme qu'aucune culture cellulaire ne peut remplacer le tissu de lapereau et rattache les retombées à la survie des animaux non-humains en élevage.
Objectifs
Un sens de l'odorat fonctionnel est essentiel pour évaluer et apprécier les aliments, recevoir des informations sur les congénères détecter les menaces à l'aide de molécules odorantes transportées par l'air. Ainsi, un odorat défaillant est associé à une dégradation de la qualité de vie liée à une incidence plus élevée de troubles psychiques tels que la dépression et le sentiment d'insécurité sociale. Par ailleurs, il existe une population croissante de personnes âgées dont l’odorat est altéré par le vieillissement ainsi que par des traitements médicamenteux. Enfin, la perte d’odorat est un symptôme précoce des maladies dégénératives (Alzheimer, Parkinson) et des infections virales (COVID-19). Notre projet a pour objectif d’étudier des enzymes (protéines) présentent dans les tissus olfactifs de la cavité nasale dont le double rôle est (i) d’éliminer les molécules odorantes après qu’elles aient été détectées afin d’éviter de saturer le système olfactif et (ii) de produire, à partir des molécules odorantes de nouvelles molécules odorantes pouvant également être détectées et donc intervenir dans la perception olfactive. Ce mécanisme est très innovant dans la compréhension du processus de l’olfaction, il peut expliquer les troubles olfactifs dont souffrent certaines personnes en particulier lors de pathologies ou de leur traitement. Le lapereau est un modèle unique car il présente un réflexe de succion lorsqu’il perçoit de manière olfactive la phéromone mammaire, une molécule odorante naturellement émise dans le lait de la lapine. Nous avons beaucoup travaillé sur ce modèle et démontré la fonction des enzymes olfactives dans la perception de la phéromone mammaire. Ici, notre objectif est d’analyser la régulation des enzymes (expression et activité) après exposition des tissus olfactifs à des odorants et après apprentissage d’une molécule odorante par exposition in vivo.
Bénéfices attendus
Une meilleure connaissance de l’expression et de la localisation des enzymes olfactives de métabolisme de la phéromone mammaire, devrait nous aider à mieux comprendre la perception de cette phéromone par le lapereau ce qui pourrait permettre des retombées sur l’amélioration de la survie de l'animal en conditions écologiques ou d'élevages.
Procédures
Les lapereaux nouveau-nés sont exposés à des odeurs pendant 45 min en déposant quelques gouttes de l’odorant sur un papier filtre déposé dans une boule à thé. Cette dernière est placée dans une boite en polystyrène entre les copeaux et en contact avec les lapereaux. Les odeurs étudiées sont le 2-methyl-but-2-énal (la phéromone mammaire = PM), l’hexanal et la pentanedione à la concentration de 10-5 g/ml (concentration réactogène de la phéromone mammaire) et 10-2 g/ml. La mise à mort à lieu immédiatement après les 45 minutes d’exposition.
Impact sur les animaux
Il peut y avoir un stress au moment de la séparation de la mère pour l’expostion des laperaux aux odorants puis la mise à mort. Lors de la séparation de la mère les petits sont transférés (par le personnel animalier) dans la salle d’euthanasie dans un nid rempli de coton afin de limiter le stress.
Devenir
L’ensemble des analyses seront effectuées sur des prélèvements post-mortem, tous les animaux seront mis à mort
Remplacement
Il n’est pas possible de se passer des tissus de lapereau pour l’objectif de l’étude. Compte tenu de la complexité de ce tissu épithélial, aucune culture cellulaire ne peut présenter les caractéristiques d’un prélèvement chez le lapereau.
Réduction
Pour chacune des procédures, un maximum de 5 lapereaux sont utilisés pour chaque condition expérimentale, permettant une exploitation statistique des résultats (Test T) et une optimisation en vue de la Réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cage de 3 avec enrichissement de milieu, les animaux ne subissent aucun geste technique durant leur hébergement.
Choix des espèces
Le lapereau présente un système olfactif très proche de l’homme et des enzymes aux fonctions équivalentes. Des résultats très probants ont déjà été publiés par notre équipe sur ce modèle permettant de mieux comprendre la fonction des enzymes du métabolisme des odorants. Le lapin est un modèle unique de perception d’une molécule odorante particulière aux propriétés phéromonales. Les animaux sont des lapereaux âgés de 1 à 2 jours. Il s’agit de l’âge optimal de réponse à la phéromone mammaire dont l’étude de la perception est l’objet de nos travaux.
Etude des mécanismes moléculaires et cellulaires de la sarcopénie chez le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
4 392 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 3 960 d'entre eux et sévère pour 432. Une partie subit un prélèvement de nageoire sous anesthésie pour le génotypage, et les lignées reproduisent un vieillissement musculaire pouvant entraîner amaigrissement et changements de comportement, pour étudier la sarcopénie. Le porteur indique qu'une perte de poids supérieure à 20 % déclenche l'arrêt du protocole. Il présente le poisson zèbre comme un modèle plus rapide et moins coûteux que le rongeur, et prévoit la mise à mort pour prélever le muscle.
Objectifs
La sarcopénie se définit comme une baisse progressive et généralisée de la masse musculaire, de la force et de la performance physique pour des patients en âge gériatrique. Cette pathologie est accompagnée d’une dépendance vis-à-vis d’autrui ainsi qu’un surcout des soins de santé. L’étiologie de cette pathologie est multifactorielle. La perte du maintien du pool de cellules satellites, une diminution de la vascularisation, l’altération de la balance entre la synthèse et la dégradation protéique, le dysfonctionnement mitochondrial ou encore la sénescence des cellules peuvent contribuer à l’apparition et/ou au développement de la sarcopénie. Dans ce contexte notre objectif est de déterminer, grâce à des approches génétiques chez le poisson zèbre, et de mieux comprendre les mecanismes cellulaires et moléculaires en jeu, au cours de l'atrophie musculaire au cours du vieillissement.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires en jeu au cours de la perte de masse musculaire liée à l'age. Nous pourrons évaluer quels évènements biologiques sont à l'origine de la sarcopénie, identifier ce qui entre les vaisseaux, les mitochondries ou les cellules satellites ont le plus d'impact. Ceci permettra de designer de nouvelles approches thérapeutiques visant un compartiment biologique en particulier.
Procédures
Aucune procédure chrirugicale n'est prévue dans la DAP. La seule intervention prevue concerne le genotypage où quelques millimètres de la nageaoire caudale seront prélevés sous anesthesire afin d'en extraire l'ADN génomique et pouvoir identifier les individus porteurs des mutations recherchées. Le nombre d'individus génotypés sera de 2592. La durée de l'intervention sous anesthesie est de quelques secondes, et cette procédure n'est réalisée qu'une seule fois par individu.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indesirables chez le poisson concernent principalement les conséquences du vieillissement, qu'il soit systémique chez le poissons TERT-/- ou musculaire chez le sarcofish. Autres effets à evaluer concernent les conséquences du traitement au tamoxifène (avec des effets toxiques possibles). Les individus peuvent présenter une perte de poids, ou émaciation, accompagnés de changement comportementaux de type anixiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium).
Devenir
L'ensemble des poissons utilisés dans cette étude seront euthanasiés puisqu'il nous est nécessaire de prélever principalement le muscle squelettique (et d'autres tissus) pour étudier/évaluer les composantes moléculaires (attrition des télomères, cassures du double brin d'ADN, sénescence, séquençage ARN etc) qui necessitent de prélever le tissu musculaire et donc l'euthanasie préalable des poissons.
Remplacement
Dans le cadre de ce protocole nous comptons manipuler une quinzaine de gènes et générer au total 30 lignées transgéniques. Ces manipulations génétiques combinées à la puissance exploratoire du modèle poisson zèbre font de ces poissons un modèle unique pour étudier de manière integrée le rôle de nos cibles d'intérêts dans la progression du stress métabolique et du vieillissement (principe de remplacement).
Réduction
Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observée au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 9 animaux seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques (principe de réduction).
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau: nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres conduira à une perte de poids significative qui lorsqu'elle sera supèrieure à 20% conduira à l'arret du protocole expérimental (principe de raffinement).
Choix des espèces
Le poisson zèbre ou Brachydanio rerio est génétiquement modifiable et permet des études de grandes envergures de la même portée tout en étant plus rapides et beaucoup moins couteuses, que celles menées chez le rongeur. De plus, un nombre quasi indéfini d’événements biologiques est quantifiable par des approches non invasives et quantitatives. Actuellement, un très grand nombre de lignées transgéniques ont été générées et sont disponibles dans la communauté scientifique, et permettent de répondre à de vraies questions biomédicales. En tant que laboratoire académique nous pouvons facilement avoir accès à un très grand nombre de lignées transgéniques (peu onéreuses). Pour toutes ces raisons, le ZBF est à l’heure actuelle un modèle trés pertinent utilisé dans de nombreux laboratoires académiques pour modéliser un large spectre de pathologies.
Développement et la maturation des circuits d’apprentissage d’une tâche complexe chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
1 794 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 210 d'entre elles, modéré pour 1 440 et sévère pour 144. Elles sont isolées jusqu'à un mois, subissent des craniotomies sous anesthésie et des enregistrements cérébraux par fibre optique reliée à un câble, pour étudier les circuits du comportement de nidification. Le porteur décrit l'isolement comme la nuisance principale et signale une lignée au phénotype dommageable avec retard de croissance à la naissance. Il affirme que ce comportement ne s'étudie que chez l'animal "entier" et renvoie l'apport pour les maladies psychiatriques à une meilleure compréhension.
Objectifs
Chez l'Homme ou la Souris, les petits naissent très immatures et en complète dépendance de leurs parents. Au cours des premières semaines de développement post natal chez la souris, les circuits neuronaux vont maturer et entrainer l'émergence de comportements complexes. L'objectif principal de ce projet est de comprendre le lien entre la maturation de certains circuits et l'émergence de comportements complexes. Pour cela, nous utilisons un modèle d'étude comportementale, la nidification. La nidification est un comportement inné chez la souris, effectué par les mâles et les femelles, même en milieu de laboratoire. Nous savons que le temps investi par l'animal dans le comportement de nidification dépend de noyaux neuromodulateurs situes dans le cerveau moyen : le noyau Edinger Westphal, l'aire Tegmentale Ventrale et le raphé dorsal. De manière intéressante, l'expression du comportement de nidification est très différente d'une souris à l'autre: certaines souris construisent des nids caverneux très protecteurs, alors que d'autre souris construisent des nids très simples, plats. Ces différences interindividuelles montrent que le comportement évolue probablement au cours de la vie post-natale de l'animal. Notre hypothèse de travail est donc que la maturation des systèmes neuromodulateurs pourrait expliquer l'émergence du comportement de nidification et de son inter individualité au cours du développement post-natal. Les objectifs sont donc de 1) Déterminer comment le comportement de nidifaction émerge au cours de la vie de l'animal après son sevrage 2) est- ce que le développement des axones issus de neurones neuromodulateurs dans le cerveau corrèle avec cet apprentissage 3) est-ce que des différences de d'activite des neurones modulateurs pourraient expliquer les variations individuelles?
Bénéfices attendus
Le comportement de nidification est un caractère propre aux souris et il constitue un facteur déterminant sur l'anxiété et la dépression. Il représente donc la motivation de l'animal à investir du temps dans ce comportement. Nous cherchons à comprendre comment le développement post-natal et de l’expérience individuelle façonnent les circuits. Ceci permettrait de mieux approcher les pathologies psychiatriques en comprenant l’impact des molécules pouvant moduler l'activiter générale des neurones dans la calibration des susceptibilités individuelles.
Procédures
Etape 1 : Ce projet nécessite l’élevage d’une lignée qui présente un retard de croissance à la naissance, rattrapé à l’adolescence. Les souris ont un suivi renforcé des élevages sur 30 jours. Etape 2 : Nous allons procéder à la cartographie des projections neuronales de 3 système modulateurs chez des souris saines, ainsi que des souris déficientes en sérotonine. Ces animaux seront soumis à un isolement d’une semaine pour évaluation de la qualité de construction de leur nid, puis seront soumis à une craniotomie de petite taille (inférieure à 1mm) sous anesthésie générale d’une durée de 1h. Les souris sont ensuite de nouveau isolées pendant 2 semaines. Etape 3 ; Nous enregistrons aussi l’activité des neurones de la nidification par photométrie calcique fibrée. La procédure chirurgicale implique une craniotomie de petite taille (inferieure à 1 mm) et pose d’une canule intra-cérébrale. La durée de l'intervention chirurgicale est d‘environ 1h par souris, sous anesthésie. Les souris sont gardées en vie 2 à 4 semaines après leur opération et des traitements analgésiques pré, per et postopératoires sont fournis. Finalement, nous manipulons l’activité des neurones par optogénétique sans fil. La procédure chirurgicale implique une une craniotomie de petite taille (inférieure à 1mm) et pose de canule intracérébrale, procédure durant environs 1h. Les animaux sont aussi maintenus en hébergement isolé pendant l'expérience (1 mois maximum).
Impact sur les animaux
La nuisance principale de ce projet porte sur l'isolement nécessaire des animaux afin d'étudier la dynamique individuelle du comportement. Cet isolement est limite à 1 mois maximum au cours du projet. Les chirurgies d’injections intracérébrales et de cannulation cérébrales sont associées à des risques anesthésiques, hémorragie, hypothermie, ainsi que de la douleur. Nous utilisons une lignée déficiente en sérotonine, qui possède un phénotype dommageable à l’état homozygote, consistant en un retard de croissance à la naissance qui est rattrapé ensuite par l’animal. Les enregistrements de neurones par cannulation d’une fibre optique, et le suivi vidéo de la nidification nécessitent l’isolement de l’animal, ainsi que la présence d’un câble attaché à la tête de l’animal, ce qui limite ses mouvements, causant ainsi du stress: ces enregistrements sont limités à 1-4h par animal.
Devenir
Une étape de production d’animaux à phénotype dommageable est nécessaire puis à l’issue de leur inclusion dans les actes expérimentaux, l’ensemble des animaux sera euthanasié pour étude histologique de leur cerveau. Il n’y a pas de réutilisation dans d’autre projets.
Remplacement
L'utilisation d'animaux ne peut etre remplacee pour ce projet, car nous etudions l'integration du comportement par le cerveau chez l'animal entier. Cependant, si le projet permet de valider le role des neurones etudies ici dans le comportement, cela aidera a faire les prochains projets in vitro pour comprendre les mecanismes de plasticite developpementale des neurones etudies ici.
Réduction
Nous avons reduit dans ce projet le nombre d'animaux au minimum afin d'obtenir des données statistiques fiables d'après notre expérience passée sur le modèle de nidification, ce qui correspond à des lots de 36 souris sur l’ensemble du projet, nombre déterminé par calcul statistique de puissance dérivé d’un projet antérieur. Le nombre total de souris sur les 5 ans de ce projet est de 1794.
Raffinement
Nous utilisons en continu les données obtenue afin d'ameliorer l'impact du test de nidification sur le stress de l'animal. Ces améliorations sont basées sur l'utilisation d'algorithme de segmentation vidéo permettant la détection automatique du comportement dans la cage de la souris. Cette détection automatique permet de limiter le temps passe en isolement, mais aussi grâce aux données obtenues en début de projet nous permettra de ne plus avoir a isoler les animaux par la suite. Les conditions environnementales seront contrôlées tout au long de la vie de la souris. Les souris seront hébergées en groupe afin de minimiser leur stress avant leur entrée en procédure. Les souris auront un suivi quotidien lors des protocoles. Le personnel animalier s’occupera du change des cages de façon bimensuelle, voire hebdomadaire selon les besoins observés. Pour les chirurgies, on administre un analgesique et un anti-inflammatoire avant la procédure. Les chirurgies sont faites sous anesthésie générale. Les traitements post-chirurgies contiennent à nouveau anti-inflammatoires et analgésiques. Des maisonnettes en carton, du matériel de nidification, de la nourriture molle et de l’hydrogel sont fournis pour aider au bien-être des animaux en procédures. Pour chaque procédure du projet, des points limites ont été clairement définis, basés sur les indications de bien-être de l'animal et pour éviter sa détérioration. Ces points limites sont prévus pour retirer les souris des procédures à chaque fois que des signes prolongés d'incomfort, d'anxieté ou de stress sont détectés.
Choix des espèces
L’exécution motrice et motivationnelle du comportement de nidification est aussi une spécificité de l’organisation des circuits d’apprentissages moteurs des mammifères. La souris permet plus précisemment de tester le lien entre des troubles de l'humeur (stress, angoisse, motivation, comportement obsessionnels) et l'organisation des circuits cérébraux à la résolution de neurones uniques du fait des outils d'imagerie et de génétique disponibles sur ce modèle. La souris bénéficie aussi de l'existence d'Atlas numériques du cerveau à très haute résolution (plus de 1200 régions annotées en 3D), qui permettent ce type d'étude des variations structurales du cerveau à grande échelle chez de nombreux individus avec une très haute précision. Les animaux seront etudies aux stades adolescents (P21) jusqu'aux jeunes adultes (3 mois maximum). Ceci correspond à la période développementale ou l'animal devient indépendant et commence à organiser son propre nid. Nous ferons cette étude chez des mâles, car nos données publiées ont pu montrer que les souris femelles avaient moins de variations inter-individuelles sur ce comportement.
Modèles de défaillance hépatique aigüe et leur application à l’évaluation de l’efficacité de molécules.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 6335
16 420 rongeurs, souris et rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 960 d'entre eux et sévère pour 14 460. Une injection unique déclenche une insuffisance hépatique aiguë, notamment par intoxication au paracétamol, avec baisse d'activité, de prise alimentaire et de température, poils ébouriffés et signes de douleur, pour évaluer des molécules. Le porteur reconnaît ces atteintes et une mise à mort pour analyse des organes. Il indique n'utiliser des modèles cellulaires que pour une première sélection, remplaçant "partiellement" les animaux.
Objectifs
L’insuffisance hépatique aigue est définie par l’altération globale des fonctions hépatiques en un court laps de temps qui va de quelques jours à quelques semaines et qui survient sur un foie sain auparavant. La gravité de l’hépatite est définie par l’évaluation de la fonction globale du foie représentée par le taux de prothrombine. La prothrombine est une protéine synthétisée par le foie, en cas d’anomalie au niveau de cet organe, le taux de prothrombine baisse, entrainant un défaut de coagulation et donc de possibles hémorragies au niveau des organes. On parle d’hépatite aigue sévère lorsque le taux de prothrombine est inférieur à 50%. Les signes cliniques de l’hépatite aigue sévère sont assez limités au début et ne sont souvent constatés qu’une fois la maladie installée. Ces signes sont : un ictère (jaunisse), de la fatigue et des saignements. L’hépatite aigue sévère entraine en plus une inflammation systémique (de tout l’organisme) qui peut engendrer un dysfonctionnement de plusieurs organes. Le cœur et les reins peuvent être atteints avec une baisse de la fonction artérielle et des problèmes rénaux pouvant nécessiter une dialyse. L’hépatite aigue sévère est communément appelée ALF pour Acute Liver failure dans le monde scientifique. C’est cet acronyme qui sera utilisé tout au long de ce dossier pour parler de la maladie. Notre projet vise à établir un modèle qui puisse reproduire une hépatite aigue sévère (ALF), avec pour but ultime d’évaluer la capacité de molécules innovantes à atténuer la gravité de cet évènement et à protéger l’organisme des défaillances multiples.
Bénéfices attendus
En France, l’hépatotoxicité des médicaments, bien que rare, est estimée à 14 cas pour 100 000 habitants par an, dont 12% feront l’objet d’une hospitalisation et 6% en décèderont. C’est également la première cause de retrait des médicaments du marché. Les anti-convulsivants, les anti-infectieux et les anti-inflammatoires sont les familles les plus concernées. Parmi les médicaments responsables d’hépatites, le paracétamol constitue désormais la première cause d’insuffisance hépatique aigue dans les pays développés. Il existe 2 situations de toxicité de la molécule : -Le surdosage par dose massive (supérieur à 10 g en 1 prise). -La « mésaventure » au paracétamol, par toxicité à dose thérapeutiques pendant plusieurs jours, dans un contexte de prise excessive et chronique d’alcool. L’intoxication au paracétamol constitue la première cause de mortalité par suicide en Angleterre et la première cause d’hépatite fulminante. C’est également plus de 50% des hépatites aigues aux Etats-Unis. Enfin dans les pays d'Asie, la cause la plus répandue d'hépatite fulminante est l'hépatite E, bien que des données récentes indiquent que leshépatites induites aux médicaments sont en fortes progression notamment en Chine avec l'utilisation des remèdes produits à base d'herbes médicinales. L’hépatite aigue fulminante conduit au décès dans plus de 80% des cas en l’absence de traitement. C’est à partir de ce stade que la greffe de foie est envisagée. Ce projet vise donc à trouver une solution alternative à la greffe par l'administration de molécules permettant d'empêcher d'en arriver à ce stade, et de faire régresser la maladie ou de la stopper.
Procédures
Au cours des procédures décrites dans ce dossier nous procèderons à une injection unique d'une durée de 15 secondes par animal pour induire la pathologie, précédées, pour les procédures d'évaluation de candidats médicaments, d'un pré-traitement oral ou donné par injection, tous deux d'une durée de 15 secondes, administré de façon quotidienne. Ces administrations de médicaments pourront avoir lieu 1 ou 2 fois par jour sur une durée de 7 jours maximum avant l'installation de la maladie. Pour les procédures concernant le paracétamol, les inductions de l'hépatite se feront par injection unique d'une durée de 15 secondes. De même, les animaux pourrront se voir administrés un pré-traitement avec les composés à étudier, dans les mêmes proportions et conditions que celles citées ci-dessus. L'administration du paracétamol sera précédé d'une mise à jeûn qui pourra aller de 12 à 16h. Dans le cas des souris, celles-ci ne subbiront qu'un prélèvement unique et terminal sous anesthésie générale. Pour les rats, un prélèvement intermédiaire pourra être envisagé afin de caractériser le modèle au niveau des paramètres inflammatoires, ces derniers évoluant plus en amont dans le développement de la pathologie. Le prélèvement sanguin terminal se fera également sous anesthésie générale et précédera la mise à mort.
Impact sur les animaux
Lors des procédures décrites dans ce projet, les animaux subiront des injections en intra-péritonéales ou intra-veineuses, à la suite desquelles, on s'attend à constater une diminution de l'activité, une diminution de la prise alimentaire, une diminution de la température corporelle ainsi que des signes de douleurs ou d'inconfort tels que fourrures ébourriffées, larmoiements.
Devenir
L'évaluation histologique, biochimique et transcriptomique des organes tels que le foie, le cerveau et le rein ainsi qu'une évaluation des taux plasmatiques de marqueurs inflammatoires et hépatiques nécessitent la mise à mort des animaux.
Remplacement
Une première phase de sélection des meilleurs composés est effectuée sur des modèles acellulaires ou cellulaires, contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux.
Réduction
Dans ce projet et afin de répondre à la règle des 3 R, nous avons estimé le nombre d’animaux nécessaires pour chaque procédure pour avoir une réponse statistiquement analysable afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires dans les expériences. Le nombre initial d’animaux inclus dans chaque groupe expérimental permettra de tenir compte de l’hétérogénéité de la réponse au stimulus, et permettra de disposer d’un nombre de données autorisant une analyse robuste des effets observés.
Raffinement
Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé avec des personnes habilitées, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques et analgésiques afin de raffiner au maximum les procédures. Afin de prévenir des souffrances non nécessaires, une grille de scoring permettant de quantifier la douleur perçue par l'animal sera établie et des points limites seront définis, au-delà desquels les animaux seront retirés de l'étude et mis à mort de façon éthique. Compte tenu du fait que la pathologie implique un emballement du système immunitaire et une défaillance multi -organes, il nous est impossible de remplacer cette expérimentation par des expériences in vitro.
Choix des espèces
Pour l'évaluation de composés chimiques précieux, la souris demande 10 fois moins de produit que le rat, cependant les volumes d'échantillons produits sont limités avec la souris c'est pourquoi l'étude sur rats est intéressante afin d'obtenir plus d'informations scientifiques à partir d'un seul animal. Concernant les procédures utilisant une substance toxique pour le foie associée à un agent inflammatoire, les souris comme les rats pourront être utilisés car ils sont tous deux de bons répondants d'après la littérature. Concernant les procédures utilisant le paracétamol comme inducteur de la pathologie, seules les souris mâles seront utilisées. Les rats ont la capacité de métaboliser le paracétamol, cela a pour conséquence un stress oxydatif moindre et une difficulté à induire l'hépatite fulminante. Les souris femelles ont quant à elle, plus de difficulté à développer une nécrose hépatique. De jeunes adultes offrent une une meilleure homogénéité et une meilleure réponse aux inductions de la pathologie, leur système immunitaire étant mâture. Nous utiliserons des souris pesant 25g au moment de la manipulation et des rats d'environ 300g à l'arrivée.
Contrôle qualité des médicaments radiopharmaceutiques marqués au Tc99m sur rongeurs en conformité des méthodes de la Pharmacopée EU.
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Rats : 1275
1 680 rongeurs, souris et rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil pour 1 275 d'entre eux et impliquant un niveau de souffrance léger pour 405. Anesthésiés, ils reçoivent l'injection d'un médicament radiopharmaceutique puis sont tués pour le prélèvement de leurs organes, afin de contrôler la biodistribution de chaque lot avant sa commercialisation. Le porteur indique que ce contrôle qualité est exigé par les pharmacopées européenne et américaine. Il signale qu'une évolution réglementaire a déjà permis d'arrêter la biodistribution sur 30 lots par an, sans étendre ce remplacement aux autres.
Objectifs
Ce projet a pour objet de permettre au laboratoire pharmaceutique de continuer à pouvoir contrôler des médicaments radiopharmaceutiques dans le respect des AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) octroyées par les autorités de santé de tous les pays concernés (notamment la FDA « Food and Drug Administration ») et des méthodes de la Pharmacopée Européenne. Pour cela le laboratoire pharmaceutique a besoin de pouvoir réaliser des tests de distribution physiologique appelés « tests de biodistribution » in vivo sur des rongeurs, afin de valider l’efficacité de chaque lot de médicament radiopharmaceutique concerné avant son administration humaine.
Bénéfices attendus
La mise sur le marché des médicaments marqués, à usage thérapeutique et diagnostique pour l'homme, exige des essais d'efficacité : la distribution physiologique du produit sur rongeurs. Le recours à des rongeurs dans le cadre de contrôle qualité de médicaments radiomarqués est préférable à d'autres espèces car ces animaux permettent de fournir des résultats pertinents en utilisant la voie d'administration identique à celle de l'homme lors de diagnostic par scintigraphie.
Procédures
Dans le cadre du contrôle qualité du médicament radioactif à réaliser avant mise sur le marché, le test d'efficacité du produit sur 3 rats de faible poids se fait sous anesthésie générale par un mélange d'anesthésie/analgésique chimique avant injection du produit. Le volume à injecter est fonction du poids du rat. L'acte d'injection de ce mélange de faible volume dure quelques secondes. Une fois l'animal anesthésié, au remps indiqué dans la procédure, le technicien injecte le produit radioactif de faible volume à la seringue en quelques secondes. La voie d'injection avec un médicament marqué à usage diagnostic ou thérapeutique est la voie utilisée chez l'homme. Après un temps déterminé dans la procdure, le technicien s'assure que les animanux soient toujours anesthésiés avant de mourir, avant d'effectuer les gestes chirurgicaux nécessaires au test. L'euthanasie des animaux s'accompagne d'un prélèvement de sang au niveau de l'aorte abdominale. Elle est suivie des prélèvements d'organes cités dans la procédure de contrôle en vigueur. Concernant le test d'efficacité du produit radioactif chez les 3 souris, celles-ci sont soit anesthésiées par un mélange d'anesthésie/analgésique chimique avant injection du produit, soit elles sont injectées vigiles selon la procédure de contrôle en vigueur. Une fois l'animal anesthésié, au temps indiqué dans la procédure, le technicien injecte le produit radioactif de faible volume à la seringue en quelques secondes. Dans le cas des souris anesthésiées avant injection du produit radioactif, la pratique d'euthénasie appliquée est la dislocation cervicale avant d'effectuer les gestes chirurgicaux nécessaires au test. Elle est suivie des prélèvements d'organes cités dans la procédure de contrôle en vigueur. Dans le cas de souris vigiles, l'injection du produit radioactif d'un faible volume à la seringue se fait en quelques secondes. Après un temps déterminé dans la procédure, elles sont anesthésiées par un mélange d'anesthésie/analgésique chimique en tenant compte du poids de l'animal. Le technicien s'assure que l'animal est correctement anesthésié (immobilité, myorelaxation, pas de retrait lors du pincement de la patte) avant d'effectuer les gestes chirurgicaux nécessaires au test. L'euthanasie s'effectue par section de la carotide. Elle est suivie des prélèvements d'organes cités dans la procédure de contrôle en vigueur.
Impact sur les animaux
Nous pourrions attendre des effets indésirables si les molécules étaient défectueuses. C’est le but de notre test : identifier la qualité, ou les défauts de nos molécules radiomarquées. Si elles ne sont pas marquées correctement, elles sont rarement toxiques. Si une contamination quelconque était intervenue pendant la fabrication, les animaux pourraient subir des effets indésirables, comme un choc anaphylactique, mais ils sont anesthésiés et des mesures seraient rapidement prises pour prendre en charge cette situation.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin de manipulation du fait de la manipulation de biodistribution consistant aux prélèvements d’organes.
Remplacement
Les autorisations de mise sur le marché et la Pharmacopée Européenne exigent des contrôles de qualité in vivo sur les médicaments radiopharmaceutiques avant leur administration à l'homme. Les médicaments sont fabriqués selon leur AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) et sont soumis à des tests impératifs de contrôle qualité et libératoires avant commercialisation, dont la biodistribution fait partie. Ce test est appliqué selon les méthodes décrites dans la pharmacopée européenne et américaine et/ou du dossier d'Autorisation de Mise sur le Marché. Les méthodes physico-chimiques commencent à être prises en compte selon les produits par les autorités comme il est indiqué dans le paragraphe Réduction. 1) Les obligations réglementaires (pharmacopée européenne/américaine) évoluent et permettent l'arrêt des tests de biodistribution pour certaines spécialités pharmaceutiques. Nous profitons de cette opportunité pour cesser tout test de biodistribution sur la spécialité concernée. 2) Des démarches sont entreprises pour demander une variation du dossier d'AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) ; celle-ci consiste à supprimer le test de biodistribution en s'appuyant sur la corrélation existante entre les résultats obtenus via le test de biodistribution et les tests physico-chimiques réalisés en parallèle. 3) Décision stratégique d'arrêt de certains produits pour lesquels la biodistribution était requise. 4) Lors de la formation pratique d'un nouveau technicien, l'utilisation du "rat trainer" s'est substituée à l'utlisation d'animaux pour apprendre les injections.
Réduction
Une étude de marché a induit l’arrêt de 2 produits. Une variation réglementaire du dossier d’AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) de 2 autres produits a été acceptée par l'Agence du médicament, en s'appuyant sur les tests physico-chimiques. Cela implique l'arrêt de la biosdistribution sur 30 lots/an sur les 120 lots testés à ce jour.
Raffinement
Une amélioration continue de nos locaux permet d’accroitre la prise en compte des besoins des animaux au cours de procédures. Dès que les animaux sont anesthésiés, tout est mis en œuvre pour les maintenir au chaud et éviter toute perturbation. Tous les transports entre les lieux de vie des animaux et les laboratoires sont encadrés de précautions. Un tapis chauffant, par exemple, est placé au fond de la cage pendant l’attente, puis pendant le réveil. Un personnel expérimenté et formé manipule les animaux avec précautions. Nos procédures sont de courte durée et ne sont pas douloureuses.
Choix des espèces
La mise sur le marché de produits de contraste radioactifs exige des essais d'efficacité : la biodistribution sur rongeurs (rats ou souris) comme l'imposent les autorités européennes et américaines à l'industrie pharmaceutique qui produit ces marqeurs. Les tests réalisés par groupe de 3 rongeurs adultes permettent de valider l'innocuité et l'efficacité des marqueurs utilisés chez l'homme en utilisant la même voie d'administration, afin de fournir des résultats pertinents.