Procédures légères

144 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent sous anesthésie l'injection d'un agent d'imagerie radiomarqué, passent une imagerie d'environ quarante-cinq minutes, puis sont tués pour le prélèvement des organes. Le porteur indique que la contention pour l'anesthésie peut causer un certain stress et que les composés testés n'ont pas provoqué d'effet secondaire chez la souris. Il affirme qu'un système in vitro ne peut déterminer toutes les propriétés d'une substance, faute de circulation sanguine, et retient donc le rat pour l'étude de la biodistribution.

Objectifs

Lors du développement de nouveaux médicaments et/ou sondes d’imagerie, il est nécessaire d’étudier la façon dont la molécule d’intérêt se distribue et est éliminée de l’organisme. Cette étape permettra de valider qu’un agent diagnostic sera éliminé rapidement de l’organisme sans causer de toxicité ou qu’un composé thérapeutique restera suffisamment longtemps dans l’organisme pour exercer son action. Pour cela, nous avons d’abord vérifié sur culture cellulaire que les composés à étudier ne sont pas toxiques. Les composés à étudier ont, d’autre part, déjà été injectés à la souris sans causer d’effets secondaires. Nous avons ensuite procédé au radiomarquage de la molécule (ajout d’une molécule radioactive pour pouvoir la détecter : l’Indium111 dans le cas présent) puis au contrôle sur culture cellulaire que le composé modifié est toujours actif. Puisqu’il est impossible dans un système in vitro de déterminer toutes les propriétés d'une substance, car aucune circulation sanguine ou système excréteur n'est présent, la seule alternative est l’utilisation d’animaux. L’espèce de choix pour l’étude de la biodistribution est le rongeur. Des études préliminaires ont montrés que certains composés de la même pouvaient avoir un comportement différent chez le rat et la souris. De plus certains modèles pathologiques de rat sont plus représentatifs de la maladie cancéreuse humaine que la souris. C’est pourquoi le présent projet sera mené chez le rat (d’autres travaux menés conjointement seront réalisés chez la souris pour identifier des différences de comportement selon les espèces et permettre ainsi une meilleure prédiction du comportement des composés chez l’homme). L’objectif de notre projet vise donc à suivre 2 composés, chez des rats sains, après administration par voie intraveineuse grâce à l’utilisation de l’imagerie et du comptage de la radioactivité.

Bénéfices attendus

Les études que nous mènerons dans le cadre de ce projet nous permettront de caractériser précisément le comportement de 2 composés dans l’organisme afin d’orienter les développements ultérieurs vers le diagnostic ou la thérapie, ou d’écarter des composés à risque pour la suite des développements.

Procédures

Préhension et mise sous anesthésie (2 fois maximum : injection et imagerie – quelques secondes) - Injection d'un agent d’imagerie seul ou avec compétiteur sous anesthésie (1 fois, quelques minutes) - Imagerie (1 fois, 45 minutes maximum) suivie de l’euthanasie et du prélèvement des différents organes

Impact sur les animaux

La préhension pour induction de l’anesthésie pourrait causer un certain stress aux animaux. Les injections, imageries et euthanasies seront réalisées sous anesthésie par du personnel expérimenté et ne devraient pas provoquer de nuisances supplémentaires. Les composés à tester ont déjà été injectés à l’animal et n’ont pas provoqué d’effet secondaire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. Le prélèvement des organes étant nécessaire pour réaliser des analyses complémentaires et affiner les résultats d’imagerie par comptage précis de la radioactivité, l’euthanasie des animaux est inévitable.

Remplacement

Les molécules qui seront évaluées dans ce projet auront été, au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Puisqu’il est impossible dans un système in vitro de déterminer toutes les propriétés d'une substance, car aucune circulation sanguine ou système excréteur n'est présent, la seule alternative reste l’utilisation d’animaux.

Réduction

Dans le cadre de cette étude, les composés seront évalués à l'aide de techniques d'imagerie préclinique in vivo couplées à des techniques de comptage de la radioactivité ex vivo. Ces techniques étant particulièrement sensibles et spécifiques, seuls de faibles effectifs sont nécessaires pour obtenir des données fiables et précises tout en réduisant le nombre d’animaux au maximum (n=4 par groupe).

Raffinement

Les gestes de ce projet (injection, imagerie, euthanasie) se dérouleront tous sous anesthésie et sur lit chauffant réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Les animaux seront observés quotidiennement et le suivi pondéral sera réalisé 2 fois par semaine. Aucun effet indésirable n’est attendu mais des points limites adaptés ont été définis. Toute observation d’un signe de souffrance sera suivi de l’arrêt immédiat du protocole et de l’euthanasie.

Choix des espèces

L’espèce de choix pour l’étude de la biodistribution est le rongeur. Des études préliminaires ont montrés que certains composés de la même pouvaient avoir un comportement différent chez le rat et la souris. De plus certains modèles pathologiques de rat sont plus représentatifs de la maladie cancéreuse humaine que la souris. C’est pourquoi le présent projet sera mené chez le rat. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 6 et 8 semaines d’âge), puisque les études prévues par la suite seront réalisées sur des animaux adultes présentant un cancer.

60 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réutilisées. Sans intervention invasive, elles sont soumises à un jeûne de quinze heures et à une exposition au froid de quinze minutes, puis placées cinq minutes dans une enceinte de mesure des échanges gazeux, pour des travaux pratiques d'étudiants en licence. Le porteur indique que le jeûne et le froid provoquent une angoisse légère et que les manipulations s'arrêtent en cas d'agitation, d'agressivité ou de prostration. Il précise que les mêmes souris sont réutilisées pour une seconde séance puis remises à la disposition de la plateforme, et retient cette espèce parce qu'elle est "couramment utilisée" pour former les futurs chercheurs.

Objectifs

Cette manipulation à deux objectifs principaux : 1. Elle s’inscrit dans démarche progressive d'apprentissage de la manipulation des animaux de laboratoire avec une mise en pratique du respect de la règle des 3R tout au long d’une procédure expérimentale scientifiquement rigoureuse. 2. Elle vise à approfondir la formation sur le métabolisme et permettra aux étudiants de mettre en relation les enseignements suivants : • La respiration à l’échelle de l’organisme, • Le métabolisme cellulaire vu en biochimie, • La Bioénergétique. Plusieurs conditions permettront d’appréhender différents aspects métaboliques : • Effet d’un jeun alimentaire, • Effet d’une exposition à un environnement froid dont le choix a été motivé par sa reproductibilité car non corrélé à des variations de comportements comme par exemple la mise lors d’une activité motrice contrainte. Ces deux stimuli reproductibles modifient le métabolisme qui sera évalué par les mesures des variations des échanges gazeux. Ces variations pourront alors être interprétées en augmentation ou diminution du métabolisme, et préciser le métabolite énergétique préférentiellement utilisé par l’organisme en fonctions du paramètre expérimental.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectifs : 1. La mise en pratique de la règle des 3R vue en théorie en amont de ce projet, de la première manipulation et de la préhension des souris de souche swiss choisie pour sa docilité ainsi que les bases de l’observation comportementale permettant d’appréhender les différences entre mal-être et bien être animal en cours de manipulation ; 2. De montrer l’influence des facteurs environnementaux comme le froid et de l’alimentation sur le métabolisme général de l’organisme en prenant les échanges gazeux respiratoire comme paramètre mesuré. Ainsi il permettra aux étudiants de mettre en relation les enseignements suivants : • Mise en pratique de la règle des 3R à tous les niveaux d’un protocole : en amont, pendant et une fois celui-ci terminé, • Les bonnes pratiques de préhension des souris, • La respiration à l’échelle de l’organisme, • Le métabolisme cellulaire vu en biochimie, • La Bioénergétique. Une attention particulière sera portée : • Sur l’importance de l’éthique en expérimentation animale dont les textes de référence sont présentés et la règle des 3R bien développée. • Sur la rigueur et l’attention portée au bien-être animal en amont, pendant et après les séances de TP, indispensable à toute expérimentation animale avec des organismes sensibles. • Sur la présentation des gestes de préhension de l’animal.

Procédures

Aucune intervention invasive ne sera pratiquée sur les animaux. Cependant les souris seront exposées aux contraintes suivantes : • Jeun alimentaire de 15h avec accès à l’eau ad libitum, • Exposition à un environnement froid durant 15 min sans hypothermie, • Stabulation dans une une enceinte métabolique durant 5 minutes pour l’enregistrement des échanges gazeux respiratoires sur les animaux vigile.

Impact sur les animaux

Les animaux seront exposés à des stimuli désagréables (jeun et froid) qui seront associés à une angoisse légère. Ces deux stimuli sont reproductibles de par la maîtrise des variables expérimentales, base d’une bonne démarche scientifique. Durant l’exposition au froid et les périodes d’enregistrement des échanges gazeux, une vigilance particulière sera portée sur le comportement des animaux notamment la présence d’un comportement d’exploration bien exprimé par l’animal pouvant être accompagné par un comportement de toilettage. Les limites de ces manipulations seront définies par des signes tels qu’une agitation importante, une agressivité ou encore une prostration. Dans ces cas l’animal ne sera plus manipulé, remis en cage et placé sous surveillance. Le calme dans la salle de manipulation (bruit de fond sonore, mouvements des personnes) fera l’objet d’une attention particulière.

Devenir

Les mesures se font sur les animaux contrôles ou à jeun à température ambiante, puis après exposition à un environnement froid. Les animaux sont gardés vivants pour une autre séance de manipulation à 48h d'intervalle minimum dans le même projet avec inversion des statuts des souris : les contrôles deviennent les animaux à jeun réciproquement A la fin du projet, après un repos d’un mois : • Les autres seront mises à la disposition de la plateforme animalerie et potentiellement réutilisés pour un autre projet, • Le cas échéant, les souris seront euthanasiées. • Selon les besoins de la plateforme animalerie, une partie des animaux pourra devenir des reproducteurs pour l’obtention de souris calibrées pour un autre projet. Dans ce cas un cycle de reproduction par femelle sera envisagé.

Remplacement

L’acquisition des connaissances pratiques sur la ventilation et de sa régulation ont été effectuées préalablement à partir d’une manipulation assistée par ordinateur sur les étudiants eux-mêmes. Cette approche ne permet pas de mettre en évidence la signification métabolique des échanges gazeux dans les situations comme le jeun alimentaire léger et l’exposition au froid et en l’absence de logiciel dédiés justifient le recours à l’expérimentation animale. Par ailleurs les manipulations pratiques par les apprenants est prégnante dans la démarche d’investigation comme dans tout processus d’apprentissage. Elles ne peuvent être remplacées par la visualisation d’une vidéo (une de plus…) où la passivité de l’étudiant l’éloigne du concret.

Réduction

Une seule souris sera manipulée par poste d’expérimentation comprenant 4 personnes. Pour une séance il y a 2 souris contrôles et 2 souris à jeun. Les résultats seront mis en commun à la fin des séances afin que chaque étudiant puisse comparer les échanges gazeux entre souris contrôle et à jeun dans les deux conditions de température. Les manipulations seront renouvelées au cours d’une autre séance dans un délai minimum de 48h avec inversion des statuts : les sujets contrôles de la 1ère séance deviendront les sujets à jeun et réciproquement. Les résultats obtenus avec l’ensemble des souris sont mis en commun pour la prise en compte des variations individuelles et la signification statistique des différences observées dans les différents lots et sexes.

Raffinement

Cette étude nécessite une préhension, une stabulation dans une enceinte métabolique. Les animaux seront habitués à ces manipulations par le zootechnicien et le concepteur durant une semaine. Un seul sexe par séance sera manipulé supprimant toute perturbation générée par la présence des 2 genres en salle. L’exposition au froid est réduite au minimum pour avoir des modifications significatives sur le métabolisme, les animaux sont placés dans une enceinte métabolique identique à l’enceinte d’enregistrement, excepté la présence des sondes au dioxygène et au dioxyde de carbone. Afin de réduire le froid au niveau des coussinets des pattes, sera placée dans le fond de l’enceinte une plaque isolante. Après exposition au froid, l’individu est placé dans l’enceinte métabolique présentant les sondes, celle-ci à température ambiante ce qui lève totalement l’exposition au froid. Durant l’exposition au froid et les périodes d’enregistrement des échanges gazeux le comportement des animaux sera surveillé notamment la présence d’un comportement d’exploration bien exprimé par l’animal pouvant être accompagné par un comportement de toilettage. Si une agitation importante (stéréotypie), une agressivité, une prostration est constatée, il y aura arrêt de la procédure, l’animal sera remis en cage et placé sous surveillance. Par séance, 2 souris en plus des 4 manipulées resteront en cage dans le cas où des souris manipulées montreraient des signes d’angoisse aigüe justifiant de l’arrêt de leur manipulation. En fin d’enregistrement, le jeun sera interrompu, et tous les animaux recevront une récompense (céréales). Le retour en cage sera surveillé par le responsable du projet afin que les individus ne retournent pas une mauvaise cage, évitant la mise en place d’une nouvelle hiérarchie et le passage d’animaux à jeun dans la cage des animaux contrôles. Les enceintes métaboliques et d’exposition au froid sont nettoyées à l’eau savonneuse rincées et séchées afin de supprimer toute odeur de stress et ainsi annihiler la transmission du stress de l’animal manipulé lors du passage de l’animal suivant. Le calme dans les salles de manipulation tant au bruit de fond sonore qu’aux mouvements des personnes fera l’objet d’une attention particulière.

Choix des espèces

La souris faisant partie des animaux de laboratoire couramment utilisés, le choix de cette espèce s’impose pour la formation des futurs chercheurs. La souche swiss a été choisie pour sa faible anxiété par rapport à d’autres souches comme la souche C57Bl6 et sa faible agressivité pour un premier contact avec les étudiants. Animaux réformés. Les résultats correspondant aux échanges gazeux seront rapportés en pourcentage d’O2 et de CO2 pour 30g afin de pouvoir comparer les résultats sans pour autant utiliser des animaux calibrés produits par l’établissement éleveur.

16 jeunes bovins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis gardés vivants et placés à l'issue. Ils subissent sept prélèvements de fèces et cinq prises de sang sur animal vigile, espacés de deux semaines, pour évaluer l'effet d'un mélange de plantes sur le parasitisme intestinal. Le porteur indique que les prélèvements provoquent une gêne passagère et une douleur légère de quelques minutes et qu'aucun effet indésirable n'est attendu du produit. Il affirme qu'aucun modèle ne reproduit la complexité des interactions entre parasites et hôte et que l'essai doit se faire sur l'espèce cible, le bovin.

Objectifs

Le parasitisme gastro-intestinal a des conséquences non négligeables sur la production, la santé et le bien-être des ruminants, en particulier chez les jeunes animaux lors de leur première saison de pâturage. L’utilisation de vermifuges chimiques est aujourd’hui la méthode la plus couramment utilisée pour lutter contre les parasites. Si elle a permis de réduire considérablement le parasitisme gastro-intestinal, des résistances aux vermifuges se sont aussi développées. Des alternatives à ces produits sont donc étudiées pour tenter de réduire la pression parasitaire. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer in vivo les effets d’un mélange de plantes sur le parasitisme intestinal des ruminants afin de prévenir l’infestation et la ré-infestation des animaux au pâturage sans produit médicamenteux.

Bénéfices attendus

Le produit testé dans ce projet pourrait permettre de prévenir l’infestation et la ré-infestation des animaux au pâturage sans produit médicamenteux.

Procédures

Au cours du projet, les animaux sont soumis à sept prélèvements de fèces et cinq prélèvements de sang séparés de deux semaines chacun. Ces prélèvements s'effectuent sur animal vigile et ne durent que quelques minutes.

Impact sur les animaux

Toutes les matières premières contenues dans le produit étant déjà autorisées en Union Européenne, aucun effet indésirable lié à l'ingestion de celui-ci n’est attendu. Concernant les prélèvements, les prélèvements de fèces peuvent entrainer une gêne passagère qui cessera au moment du retrait du bras du manipulateur et du gel est utilisé pour faciliter le passage. De même, une douleur légère et passagère peut être éprouvée au moment de la prise de sang, mais celle-ci ne devrait pas durer plus de quelques minutes.

Devenir

Les seize animaux seront placés à la fin de la procédure expérimentale. En effet, ils recevront un mélange de plantes, dont chaque plante est autorisée dans l'Union Européenne, et ne subiront qu'une procédure de classe légère permettant leur placement dans de bonnes conditions.

Remplacement

Des premiers résultats in vitro ont démontré une réduction de 50% du développement et de la mobilité des strongles (parasites présents dans l’intestin des bovins) avec le mélange de plantes testé. Il est maintenant nécessaire d’évaluer l’effet du produit in vivo sur l’espèce animal cible, ici le bovin, car il n’existe actuellement pas de modèle permettant de reproduire la complexité des interactions entre les parasites et leur hôte.

Réduction

Les bovins sont conduits en conditions contrôlées et uniformes afin de minimiser les variations liées à l’environnement. Seize bovinss sont inclus dans cet essai mené en longitudinal. Ce nombre a été déterminé par une analyse statistique et s'appuie sur des résultats de la littérature.

Raffinement

Les bovins sont manipulés dans un couloir adapté à leur contention pour éviter tout risque de blessure, et lors des prélèvements de fèces, le gant du manipulateur est enduit de gel pour faciliter le passage. Afin de respecter leur bien-être et leur instinct grégaire, les animaux sont logés par quatre sur une litière de paille. Au quotidien, le personnel animalier observe le comportement de chaque animal le matin et le soir au moment de la distribution du repas afin de repérer les signes de mal-être ou de souffrance. Ces signes inhabituels sont immédiatement signalés au responsable de l’expérimentation. Ces animaux seront soignés et si jugé nécessaire par le vétérinaire retirés de l’essai.

Choix des espèces

L’essai doit nécessairement être conduit avec des bovins car c’est l’espèce cible du produit testé et le parasitisme et son interaction avec l'hôte sont spécifiques de chaque espèce. Les animaux utilisés sont de jeunes bovins sevrés, ayant entre 6 et 10 mois au début du projet. Il s'agit d'un âge critique pour l'infestation parasitaire. De plus ces animaux auront eu le temps de pâturer au minimum un mois avec des adultes, ce qui assure leur infestation.

30 puffins des Baléares vont être capturés en mer, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis relâchés dans leur milieu. Chaque oiseau subit une capture d'environ cinq minutes puis une contention d'une dizaine de minutes, le temps d'une prise de sang, d'un prélèvement de plumes et de la pose d'un GPS. Le porteur décrit un stress lié à la capture et à la manipulation et affirme, sur la base de travaux antérieurs, que ces dommages n'affecteront pas la survie des oiseaux. Il justifie le recours à l'espèce, en danger critique d'extinction, par son statut de bioindicateur non remplaçable selon lui par des cultures in vitro.

Objectifs

Le Puffin des Baléares (Puffinus mauretanicus), espèce d’oiseau nicheuse endémique des Baléares, est considéré comme l’oiseau marin le plus menacé d’Europe. L’effectif mondial de l’espèce est restreint et en déclin. Son statut de conservation est jugé en « danger critique d’extinction » en Europe depuis 2004 et l’espèce est protégée en France. La France a une responsabilité majeure dans la conservation de cette espèce en période inter nuptiale (présence dans les eaux territoriales françaises atlantiques), et dans une moindre mesure en période de reproduction (présence en Mer Méditerranée). Suite à une action conjointe de l’Office Français de la Biodiversité et de la Direction régionale de l'Environnement, de l'Aménagement et du Logement Bretagne, l’espèce a été inscrite au sein de la liste des espèces pouvant bénéficier d’un Plan National d’Action. L’élaboration de ce Plan National d’Action a été lancée en décembre 2018 et finalisé en septembre 2020. Ce Plan National d’Action vise en premier lieu la réduction des pressions qui s’exercent sur l’espèce (interactions avec la pêche professionnelle, avec les Energies Marines Renouvelables et activités nautiques, exposition à la contamination environnementale), mais aussi l’amélioration des connaissances relative à l’écologie de l’espèce et l’utilisation spatio-temporelle des eaux territoriales françaises en période internuptiale, afin d’améliorer son état de conservation. Dans ce contexte, le projet proposé vise à 1) améliorer les connaissances de l’écologie de cette espèce lorsqu’elle est présente dans les eaux territoriales françaises, et plus spécifiquement dans les eaux côtières du secteur Mor Braz, 2) évaluer son exposition locale aux perturbations anthropiques lorsqu’elle est dans ce secteur (contamination chimique, interaction avec les pêcheries). Il se matérialisera par un programme de prélèvement de tissus pour analyses isotopiques et de contaminants, sur des oiseaux capturés dans les eaux territoriales françaises. Il viendra pour cela s’adosser à une autre action de ce Plan National d’Action afin de mutualiser les manipulations de terrain, puisqu’une autre action du Plan National d’Action impliquera la capture et l’équipement d’individus par des GPS, pour du suivi télémétrique. Les prélèvements de tissus seront réalisés sur ces mêmes oiseaux capturés en mer pour ce suivi par télémétrie (suivis des déplacements par GPS).

Bénéfices attendus

Des analyses isotopiques du carbone et de l’azote dans le sang permettront d’une part d’accéder à des informations fines relatives au régime alimentaire du Puffin des Baléares sur ses quartiers français de présence inter-nuptiale, et d’autre part d’évaluer l’importance des rejets de pêche dans leur alimentation. Des analyses de contaminants (polluants organiques persistants, éléments traces métalliques, microplastiques) seront réalisées de façon à disposer d’un état initial de cette éventuelle contamination des oiseaux en vue d’un suivi à plus long terme. Ces analyses renseigneront également sur l’état de la contamination de ces oiseaux afin de mieux comprendre le risque toxicologique auquel ils font face. Le bénéfice de cette connaissance est l'amélioration de la protection de l'espèce et sa conservation.

Procédures

Chaque puffin subit 1 capture (environ 5 min) et 1 contention (environ 10 min). Pendant la contention de l'animal vigile, l'animal subit 1 prise de sang (moins de 1 min), les prélèvements de plumes (moins de 1 min) et la pose d'un GPS (environ 5 min).

Impact sur les animaux

Les principaux risques encourus par les oiseaux lors de la manipulation seront dûs au stress engendré par la capture et la manutention, c’est donc sur ces deux points que toute l’attention sera portée pour assurer le bien-être des animaux (expérience des manipulateurs (expert de la méthode de capture), rapidité d’exécution des manipulations, mesures de raffinement pour diminuer le stress). Les dommages subis n’impacteront pas la survie des oiseaux manipulés.

Devenir

Relachés dans leur milieu naturel, car espèce en danger critique d'extinction.

Remplacement

Les oiseaux marins sont des espèces sauvages, qui intègrent des contaminants présents dans le milieu, et y sont potentiellement sensibles. Ils ne peuvent être remplacés par des cultures in vitro ou des individus captifs. Ils sont des bioindicateurs de la contamination des milieux.

Réduction

Le choix des 30 individus a été déterminé à partir des différents projets de recherche sur la contamination et l’écologie des oiseaux marins (expérience de suivi de la contamination chez les oiseaux marins en arctique, antarctique, en France métropolitaine et ultramarine), et correspond au minimum accepté pour maintenir une robustesse statistique, et garantir la prise en compte de variabilités inter-individuelles dans le milieu naturel. En effet, les prélèvements effectués sur le terrain peuvent montrer de fortes variations entre individus, car les conditions environnementales ne sont pas contrôlées. Ce choix est réalisé à la lumière du projet autorisé « Surveillance de la contamination des oiseaux marins (exposition et effets) au titre de la Directive Cadre Stratégie pour le Milieu Marin », où 15 individus/site/espèce étaient prévus (poussins, donc pas d’effet du sexe). Sur cette demande, les oiseaux seront des adultes ; 30 individus permettront de quantifier la variabilité interindividuelle, due au sexe, à l’âge, aux traits d’histoire de vie de l’animal. L’ensemble des échantillons (sang, plumes, GPS) seront collecté sur les mêmes oiseaux afin de limiter le nombre d’oiseaux capturés, tout en permettant de croiser les informations obtenues et améliorer la puissance des analyses statistiques.

Raffinement

L’intervention sera rapide (moins de 1 min pour la prise de sang, moins de 10 min pour l’ensemble des manipulations incluant prélèvement des plumes et pose de GPS hors procédure). Elle sera coordonnée avec des opérations de baguage (une seule manipulation d’oiseau pour un maximum d’informations) - Les facteurs météos seront pris en compte (pas d’intervention si les risques pour les oiseaux sont élevés) - Diminution du stress des individus manipulés par apposition d’un tissu opaque sur les yeux - Les plumes de couverture (dos et ventre) seront prélevées sans les couper pour assurer une repousse rapide. - Les plumes de vol (primaires) ne peuvent etre arrachées pour ne pas handicaper l’oiseau et un petit échantillon sera donc coupé, considéré comme négligeable au regard de la surface alaire de l'oiseau - Une grande attention sera portée à la réalisation de la prise de sang (pas de création d’hématome ou de saignement, utilisation de poudre coagulante en cas de saignement, utilisation de matériel stérile à usage unique, prélèvement d'un volume sanguin négligeable au vu de la masse corporelle de l'oiseau) - Suite au prélèvement sanguin, une pression sera exercée sur la zone piquée pour faciliter la coagulation. L’oiseau sera observé pour détecter un éventuel comportement alarmant.

Choix des espèces

Le Puffin des Baléares espèce d’oiseau nicheuse endémique des Baléares, est considéré comme l’oiseau marin le plus menacé d’Europe. L’effectif mondial de l’espèce est restreint et en déclin. Son statut de conservation est jugé en « danger critique d’extinction » en Europe depuis 2004 et l’espèce est protégée en France. La France a une responsabilité majeure dans la conservation de cette espèce en période inter nuptiale (présence dans les eaux territoriales françaises atlantiques), et dans une moindre mesure en période de reproduction (présence en Mer Méditerranée). Les oiseaux capturés seront des adultes (le Mor Braz est un lieu utilisé par les oiseaux lors de la période internuptiale).

120 porcelets vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis renvoyés en élevage conventionnel. Chaque animal subit deux prélèvements de sang dans la veine jugulaire, effectués vigile, pour comparer un sevrage à 49 jours à un sevrage à 21 jours. Le porteur affirme que l'effet du sevrage sur un "organisme entier" ne peut être étudié in vitro ou in silico et conclut à la "nécessité" d'utiliser des animaux vivants. Les bénéfices avancés pour la santé et le "bien-être" en élevage porcin restent renvoyés au moyen ou long terme.

Objectifs

Le sevrage des mammifères d’élevage correspond à la fin de la consommation de lait par les jeunes, la séparation avec la mère et la mise en lot avec d’autres congénères. En élevage porcin conventionnel il est couramment réalisé entre 21 et 28 jours d’âge. Des travaux antérieurs ont montré que le sevrage dit « précoce » (antérieur à 21 jours d’âge), comparativement à un sevrage dit « conventionnel » (compris entre 21 et 28 jours d’âge), pouvait être défavorable à la santé du porcelet. En conséquence, les sevrages précoces sont parfois associés à une croissance réduite et une mortalité et des traitements antibiotiques accrus. A contrario, les effets d’un sevrage dit « tardif » (au-delà de 42 jours) sur l’adaptation physiologique du porcelet au sevrage ont fait l’objet de peu d’études, se focalisant généralement sur un nombre réduit d’indicateurs, et leurs résultats étant parfois divergents. Ainsi, des études supplémentaires apparaissent nécessaires à une meilleure compréhension de l’impact d’un sevrage tardif sur la santé et le bien-être des porcelets. L’objectif de recherche fondamental de ce projet exploratoire est ainsi d’évaluer l’impact d’un sevrage dit « tardif » sur la santé du porcelet. Dans ce cadre nous avons choisi de comparer un sevrage à 49 jours d’âge, dit « tardif » avec un sevrage « conventionnel » à 21 jours. Nous faisons l’hypothèse qu’un sevrage à 49 jours, comparativement à un sevrage à 21 jours, permettrait de préserver la santé des porcelets.

Bénéfices attendus

Ce projet exploratoire fournira des premiers éléments factuels sur les effets d’un sevrage tardif sur la santé et le bien-être en élevage porcin. Le sevrage tardif étant une composante clé de l’élevage porcin biologique, imposé par le cahier des charges (au-delà de 42 jours), ces données seront d’un grand intérêt pour cette filière mais pourront également contribuer à l’amélioration des pratiques d’élevage dans la filière conventionnelle. Ce projet pourrait donc permettre à moyen/long terme d’améliorer la santé et le bien être en élevage porcin.

Procédures

2 prélèvements sanguins par porcelet, espacés de 21 jours, seront effectués dans la veine jugulaire sur animaux vigiles . La durée de chaque prélèvement sera limitée à 30 secondes.

Impact sur les animaux

Ces prélèvements sont susceptibles d’induire un stress transitoire léger ainsi qu’une douleur légère et transitoire associée à l’introduction de l’aiguille pour les animaux.

Devenir

Les animaux poursuivront leur croissance en élevage conventionnel

Remplacement

Il n'existe pas de méthodes in vitro ou in silico actuellement qui permettent d'aborder la question de l'effet du sevrage sur un organisme entier. L’utilisation d’animaux vivants est ainsi nécessaire.

Réduction

Sur 2 mises bas successives (répétitions), 6 porcelets par portée seront suivis avec 5 portées par condition expérimentale et par répétition. 2 conditions expérimentales seront comparées, chacune comprenant 60 porcelets. 120 porcelets seront donc suivis et prélevés en post-sevrage. Ce nombre tient compte de la variabilité des paramètres sanguins mesurés et correspond à l’effectif suffisant et nécessaire pour évaluer correctement l’impact de l’âge au sevrage et l’effet classe de poids au sevrage sur ces paramètres tout en prenant en compte l’effet portée, l’effet répétition et l’effet sexe.

Raffinement

Pour réduire les effets indésirables associés à la fois aux prises de sang et aux troubles sanitaires éventuels rencontrés au cours de la vie des animaux, des arbres décisionnels gradés ont été mis en place afin d'intervenir de façon adéquate le plus rapidement possible en cas de problème. Enfin le milieu de vie des animaux sera enrichi : en post-sevrage des sacs de jute seront pendus dans les loges (changés 2 fois par semaine) et des cordes ou jouets en plastique mobiles seront fournis aux animaux. Les animaux sont hébergés dans des cases dont la surface au sol est supérieure à celle imposée par le décret 2013-118.

Choix des espèces

Le projet vise à évaluer l’impact du sevrage tardif en élevage porcin, cette espèce est donc requise pour le projet. Le projet visant à évaluer l’impact de l’âge au sevrage sur la santé des porcelets, ceux-ci seront suivis de leur sevrage jusqu’ à 70 jours d’âge (transition post-sevrage – engraissement).

124 dauphins de cinq espèces vont être biopsiés dans leur milieu naturel, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis laissés dans leur habitat. Une biopsie cutanée est prélevée par tir sur des animaux vigiles, une seule fois par individu, pour analyser leur régime alimentaire par isotopes. Le porteur s'appuie sur la littérature pour affirmer que la biopsie a un impact faible, malgré une réaction de surprise et une accélération de la nage à l'impact. Il justifie l'opération par un manque de données sur ces cétacés et l'objectif de mieux les protéger, jugeant qu'aucun autre modèle ne peut se substituer.

Objectifs

Trois espèces de dauphins côtiers sont communément observées autour de l'île: le grand dauphin de l’Indo-Pacifique, le grand dauphin commun et le dauphin long bec. De 2010 à 2013, une campagne de biopsies sur ces espèces, notamment en vue d’analyses du régime alimentaire, a été effectuée. C’est ainsi que 33 échantillons de peau et de lard de grand dauphin de l’Indo-Pacifique ont été collectés et analysés. Néanmoins, seulement 20 échantillons cutanés ont pu être collectés concernant le grand dauphin commun et 21 pour le dauphin long bec. Ce faible nombre d’échantillons rend les analyses isotopiques statistiquement peu fiables pour ces deux espèces, d’où la nécessité de collecter un nombre de biopsies supplémentaire. De plus, aucune analyse du régime alimentaire sur la peau et le lard d'espèces de cétacés pélagiques (telles que le dauphin tacheté pantropical, le dauphin d'Electre ou le dauphin de Fraser) n'a jamais été faite. Ce projet se propose d’acquérir via la collecte d’échantillons cutanés par biopsie en vue de leur analyse : *13 échantillons supplémentaires venant compléter les 20 préalablement acquis pour le grand dauphin commun, *12 échantillons supplémentaires venant compléter les 21 préalablement acquis pour le dauphin long bec, *33 échantillons pour le dauphin tacheté pantropical;, *33 échantillons pour le dauphin d'Electre et *33 échantillons pour le dauphin de Fraser. Aucune donnée n’étant disponible pour ces cinq espèces autour de l'île, ce projet permettra de combler cette lacune de connaissance.

Bénéfices attendus

La comparaison des échantillons de peau et de lard de ces cinq espèces avec celles des autres espèces de dauphins disponibles et de proies potentielles permettra d’appréhender leur régime alimentaire, encore méconnu dans la zone. Une meilleure connaissance des régimes alimentaires de ces espèces permettra de mettre en lumière les zones fonctionnelles utilisées. De plus, la mise en commun de ces données avec les données disponibles à l’échelle de la communauté des prédateurs marins, permettra de disposer d’une vision globale sur le réseau alimentaire au niveau de cet écosystème marin . Ces nouvelles données pourront inspirer les recommandations pour la conservation et la gestion raisonnée de ces espèces à l’échelle locale.

Procédures

Les biopsies cutanées seront effectuées sur animaux vigiles. Un animal sera prélevé une seule fois.

Impact sur les animaux

Les biopsies cutanées sont réalisées sur de nombreuses espèces de cétacés, des plus petits dauphins aux plus grandes baleines. De nombreuses publications scientifiques sont disponibles sur l’impact de la pratique des biopsies sur les individus et les populations. Sur les grands cétacés, il a été montré que la pratique de biopsies n’a pas de conséquences importantes. Concernant les petits cétacés, et notamment le grand dauphin, les études concluent que la prise de biopsie a un impact faible sur les animaux, en termes de blessure/cicatrisation et de perturbation de l’animal. De plus, bien qu’il y ait généralement une réaction de surprise lors de l’impact (spasme du corps, accélération de la nage), les animaux reviennent rapidement à leur activité initiale.

Devenir

Les objectifs du projet impliquent l’analyse isotopique d'échantillons cutanés de cinq espèces de dauphins, et imposent donc le prélèvement de biopsies sur des animaux vivants dans leur milieu naturel. Les individus prélevés seront laissés dans leur habitat naturel.

Remplacement

Les objectifs du projet imposent le prélèvement de biopsie cutanée sur cinq espèces de delphinidés dans le but d’appréhender leur écologie trophique, en vue notamment de leur conservation. Aucun autre modèle ne peut être substitué.

Réduction

Ce projet se propose de prélever: *13 échantillons cutanés venant compléter les 20 préalablement acquis pour le grand dauphin commun *12 venant compléter les 21 préalablement acquis pour le dauphin long bec, *33 de dauphins tachetés pantropicaux, *33 de dauphins d'Electre et *33 de dauphins de Fraser. Ainsi, ce projet permettra de disposer d'un nombre d'échantillons suffisant pour permettre une analyse statistique fiable. La photo-identification des individus biopsiés permettra d’éviter de prélever le même individu à deux reprises.

Raffinement

Afin de définir précisément les points limites basés sur les indicateurs comportementaux les plus précoces, une grille de quantification des critères comportementaux, adaptée à la biopsie des delphinidés, a été élaborée. A chaque critère comportemental est assigné un score, et la somme totale des scores fournit un indice témoignant de l’état de stress de l’individu. Le point limite le plus précoce correspond à l’indice de 2. Les groupes seront approchés progressivement par les ¾ arrière, pour minimiser l’angoisse, et permettre à l’équipe de juger de l’état initial d’angoisse du groupe et de chaque individu le composant. Si le groupe est difficile à approcher (individus farouches ou score >2, état de la mer mauvais), ou que plus de 3 tentatives d’équipement auront été infructueuses, un autre groupe sera recherché. Seuls les adultes en bonne condition physique seront équipés et prélevés. Le prélèvement de biopsie sera réalisé : •après la désinfection préalable de l’emporte pièce, afin de minimiser l’infection de la plaie et d’éviter la contamination de l’échantillon de biopsie, •perpendiculairement au corps de l’animal, à une distance courte (1 à 4m), afin de disposer d’une puissance de tir optimale permettant le prélèvement d’une quantité suffisante de peau et de lard sous-cutané, et évitant toute rétention de la flèche de prélèvement sur l’animal, responsable d’angoisse et de réactions fortes. •Au niveau de la zone située sous la nageoire dorsale, zone connue pour induire le moins de réaction physique et physiologique •par des personnes formées et expérimentées, afin de limiter les tentatives en autorisant un taux de réussite optimal. La réaction de l’individu cible, ainsi que du groupe auquel il appartient, sera suivie pendant 15 minutes et les comportements seront consignés. Les blessures potentielles seront gérées dans la mesure du possible par le vétérinaire et les membres de la structure en charge du bien être animal. L’identification des individus prélevés par la méthode de photo-identification autorisera le suivi de leur cicatrisation à plus ou moins long terme, lors des diverses prospections ultérieures.

Choix des espèces

Cette campagne de biopsie s’inscrit dans un projet global, visant à la mise en commun des données isotopiques en vue de l’analyse des relations trophiques à l’échelle de la communauté des prédateurs marins. Nous disposo,ns déjà de 33 échantillons cutanés de grand dauphin de l’Indo-Pacifique. Néanmoins, seulement 20 échantillons cutanés ont pu être collectés concernant le grand dauphin commun et 21 pour le dauphin long bec. Ce faible nombre d’échantillons rend les analyses isotopiques statistiquement peu fiables, d’où la nécessité de collecter un nombre de biopsies supplémentaire. De plus, aucune analyse isotopique sur la peau et le lard d'espèces de cétacés pélagiques autour de l'île (dauphin tacheté pantropical, dauphin d'Electre et dauphin de Fraser) n'a jamais été faite. Ce projet permettra de combler cette lacune de connaissances via l’acquisition d’échantillons en vue de leur analyse isotopique. Les animaux biopsiés seront des individus adultes en bonne condition physique.

400 aloses, grandes aloses et aloses feintes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis relâchées dans le milieu naturel. Chaque poisson est capturé au passage d'une passe, anesthésié puis équipé d'un émetteur radio inséré dans l'estomac, avant d'être remis à l'eau pour suivre sa migration. Le porteur décrit une manipulation de moins de trois minutes et un marquage intragastrique choisi pour éviter une incision. Il justifie le recours à des géniteurs sauvages par l'objectif de connaître le comportement migratoire d'espèces en fort déclin et juge le remplacement impossible.

Objectifs

Pour accomplir leur cycle biologique certaines espèces de poissons doivent effectuer des migrations entre l’eau douce des rivières et l’eau salée des océans. Ce sont les poissons migrateurs amphihalins. Les populations mondiales de poissons migrateurs se sont effondrés de 76% depuis 1976 à cause principalement des entraves à la migration, la destruction des habitats et une pêche non maitrisée. Ce chiffre est particulièrement marqué sur la période en Europe avec une chute estimée à 93%. Parmi les espèces de poissons migrateurs, les aloses, appartenant à la famille des Clupéidés (harengs, sardines), grandissent en mer plusieurs années et viennent se reproduire au printemps en eau douce. Le Comité Français de l’UICN a classé en 2019 la grande alose, Alosa alosa, en danger critique et l’alose feinte, Alosa fallax, quasi menacée.

Bénéfices attendus

Le suivi des grandes aloses et aloses feintes va apporter de nombreuses informations sur l’écologie des espèces suivies sur un cours d'eau : zones colonisées, période de présence, facteurs influençant les comportements et la survie. Ainsi, par la mise en œuvre de ce suivi, il va être possible de renforcer et d’acquérir des connaissances sur le comportement migratoire des aloses en vue d’améliorer la connaissance du cycle de vie et des paramètres qui l’impactent pour cibler une meilleure gestion de la population, actuellement en forte régression, afin de les sauvegarder.

Procédures

Pour apporter des éléments à ces questions scientifiques, un suivi des 2 espèces d'aloses sera réalisé par marquage individuel en radiotélémétrie. 400 individus seront marqués afin de recueillir suffisamment de données pour obtenir des résultats fiables. Ils seront divisés en 5 lots de 80 individus par année. Ainsi, dès la sortie de l’estuaire, les poissons sont capturés lors de leur passage dans la passe-à-poissons. La capture est réalisée dans un piège présent par conception dans le dernier bassin de la passe multispécifique. La manipulation sera réalisée de façon individuelle. Chaque alose sera transférée dans un bac (brancard) préalablement rempli d’une solution anesthésiante et mis dans l’obscurité le temps d’atteindre une sédation d’immobilisation. Le poisson est marqué par l’insertion d’un émetteur intragastrique radio dans l’estomac. L’alose est transférée dans une structure de réveil (filet immergé dans la retenue amont de l’ouvrage). Lorsque le manipulateur observe le réveil, le poisson est relâché directement dans le milieu naturel pour poursuivre sa migration. Des récepteurs de radiotélémétrie sont disposés tout le long du parcours à des endroits stratégiques afin de pouvoir cartographier les déplacements spatio-temporel entre les habitats, le comportement devant les ouvrages et le franchissement des passes-à-poissons.

Impact sur les animaux

Toutes les manipulations seront faites pour éviter des nuisances et un stress supplémentaire sur les poissons. Les aloses seront marquées avec des émetteurs permettant de respecter le ratio inférieur à 2% s’assurant que la marque de perturbe pas le comportement et la flottaison du poisson. Pour réduire le stress, les poissons seront capturés de façon individuelle et transportés dans un brancard contenant une solution anesthésiante le temps de l’insertion de l’émetteur dans l’estomac, puis ils seront placés dans une structure de réveil directement dans le milieu naturel dans une zone calme mais avec un faible courant afin que dès le réveil total ils puissent poursuivre leur migration.

Devenir

Tous les poissons marqués seront conservés vivants et relâchés dans le milieu naturel.

Remplacement

L’objectif étant l’apport de connaissances sur les comportements migratoires et l’utilisation de l’habitat des grandes aloses et des aloses feintes en milieu naturel, il n’est pas possible d’appliquer la règle du remplacement. Il est donc indispensable de recourir à des individus des espèces et du stade visé (géniteurs d’aloses en migration) afin d’obtenir des données pertinentes.

Réduction

L'objectif du projet est d’enrichir les connaissances scientifiques sur le comportement des aloses pendant leur phase de migration. Il s'agit d'une approche intra-spécifique où la variabilité des trajectoires individuelles sera décrite à l'aide de statistiques descriptives et de cartographie de déplacement. Dans un système ouvert de moyenne taille comme la Charente, le choix de 400 individus sur la durée du projet correspond au minimum d'individus nécessaires pour rendre compte des variabilités intra-spécifique (sachant que la mortalité naturelle pourrait réduire légèrement cet effectif) et les paramètres environnementaux impliqués dans la phase de migration (débit, température, habitats, blocages…). Cet échantillon de 400 poissons sera divisé par lot de 80 individus marqués par année et réparti entre 50 grandes aloses et 30 aloses feintes. Le nombre annuel de géniteurs de grande alose (50) a été défini pour acquérir suffisamment de données pour fournir une image de la diversité des comportements de migration sur la partie médiane et amont du fleuve. Pour les aloses feintes, le choix de 30 individus annuellement est jugé suffisant pour des tests de faisabilité et suivre les comportements de migration sur la partie aval du fleuve. Egalement, nous avons considéré comme déterminant le franchissement des 4 ouvrages en amont du site de capture et, en se basant dans la littérature sur une perte de 40% de poissons à chaque franchissement de passe, sur 80 poissons relâchés en amont du premier ouvrage, 17 pourraient se présenter au pied du 4ième ouvrages, et 10 le franchir, ce qui permettrait d’avoir un jeu de données sur le site (rampe à macrorugosités dimensionnée pour les aloses).

Raffinement

Avant le marquage, les individus présentant des lésions externes ou amaigris sont écartés du suivi afin de ne pas leur faire subir de manipulation. Cependant, s’il est estimé que les poissons peuvent récupérés et, dans la mesure du possible, ils seront soignés notamment en ce qui concerne les lésions externes par un pansement hydrostatique. Puis, l’individu est mis dans un brancard de stabulation contenant 25 ppm de solution anesthésiante de Benzocaïne 10%. L’individu se retrouve dans l’obscurité du brancard. L’eau est claire permettant une vérification des différentes phases de l’anesthésie des individus. Le recours à une anesthésie adaptée permet de manipuler le poisson sans risque pour celui-ci et de diminuer son stress. Le stade d’anesthésie recherché est l’immobilisation. Pour cela, nous observerons que le réflexe de redressement et la mobilité sont absents, et que la réaction au stimulus et la fréquence des battements operculaires branchiaux soient réduits. Une fois le stade de l’immobilisation atteint, les émetteurs stériles, sont délicatement insérés dans l’estomac avec un tube d’insertion désinfectés. Nous avons choisi le marquage par insertion intragastrique afin de réduire la souffrance en évitant une intervention chirurgicale puisqu’il ne génère pas d’incision du muscle et donc pas de blessure. L’insertion de la marque sera rapide pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des poissons et, d’expériences dans l’insertion de ce type de marque, la manipulation n’excédera pas 3 min minutes puis les aloses seront placées dans une structure flottante (filet cage) de réveil d'1m3 directement située dans le milieu naturel dans la retenue de l’ouvrage. Un léger courant permet d’assurer de bonnes conditions de réveil et de préparer le poisson à son lâché. Une vigilance des opérateurs sera apportée au raffinement dans toutes les étapes de la procédure : Pas de changement d’eau (brancard rempli avec de l’eau de la rivière), • Tri des poissons afin de marquer des poissons sains, Capture avec épuisette réduite pour limiter les risques de pertes d’écailles et de blessure (Un seul passage unique en épuisette (de 43 cm de large et un filet en mailles fines de 4mm), Structure de réveil (filet cage) dans l’eau de la rivière pour observer le comportement du poisson marqué avant la relâche, Surveillance des poissons pendant toutes les phases, de la capture au lâcher.

Choix des espèces

L’objectif étant l’apport de connaissances sur les comportements migratoires et l’utilisation de l’habitat des grandes aloses et des aloses feintes en milieu naturel, il est donc indispensable de recourir à des individus des espèces et du stade visé (géniteurs d’aloses en migration). Nous utiliserons les géniteurs d'aloses lors de la phase de remontée sur frayère pour suivre leur comportement de migration de reproduction.

1 566 poissons zèbres au stade larvaire vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont exposés vingt-quatre heures au lopéramide, un antidiarrhéique, puis tués par homogénéisation pour analyser leur microbiote et mesurer taille et poids hors de l'eau. Le porteur n'attend aucun effet délétère, la dose étant décrite comme non toxique dans la littérature, et prévoit de ne pas conserver les larves au-delà de onze jours. Il indique que l'effet sur la dynamique du microbiote ne peut être étudié qu'in vivo, le stade larvaire présentant selon lui un système digestif comparable à celui des mammifères.

Objectifs

La flore microbienne joue de nombreux rôles en santé humaine mais peut être affectée par diverses perturbations extérieures telles que les antibiotiques ou stress chimique. L’étude de l’impact de ces perturbations dont les médicaments sur le microbiote connait un intérêt grandissant afin de développer à l’avenir des approches complémentaires pour réduite leurs effets indésirables. Ces effets bien que décrits restent peu caractérisés du fait de la diversité et complexité de la flore intestinale chez les mammifères et des limites pratiques intrinsèques aux modèles in vivo correspondants (coûts d’hébergement, manipulation...). Dans ce contexte, la larve du poisson zèbre constitue un modèle de choix puisque la flore y est moins complexe, l’observation microscopique non invasive plus aisée, tout en arborant un système digestif et une réponse immunitaire innée comparables aux mammifères, en faisant ainsi un modèle pertinent pour étudier les interactions hôte-microbiote. Notre objectif est ici d’analyser l’impact du lopéramide, un médicament anti-diarrhéique couramment prescrit en clinique et utilisé pour mimer les dysfonctionnements intestinaux sur modèles animaux, sur la composition et la stabilité du microbiote naturel du poisson zèbre et d’identifier les éventuelles conséquences sur l’hôte.

Bénéfices attendus

La flore joue un rôle important sur notre santé. La compréhension des interactions hôte-microbiote et les perturbations pouvant l’affecter sont indispensables au développement d’approches thérapeutiques et/ou préventives rationnelles. En effet, ceci s’intègre dans l’intérêt grandissant pour l’étude de l’impact de médicament couramment utilisés chez l’Homme sur le microbiote et le développement futur d’approches complémentaires pour contrer ou réduire les effets indésirables ainsi identifiés.

Procédures

Les poissons-zèbres au stade larvaire seront exposés pendant 24 heures au lopéramide, une molécule qui réduit le mouvement péristaltique intestinal. Cette procédure est considérée comme légère puisque cette molécule n’est pas létale à la dose utilisée ni même n’a jamais montré d’effets indésirables dans la littérature.

Impact sur les animaux

Aucun effet délétère du lopéramide n’est attendu car c’est une dose décrite précédemment comme non toxique. Néanmoins, une observation quotidienne des poissons sera réalisée et les poissons ne seront pas conservés plus de onze jours post-fertilisation pour limiter leur inconfort au vu de notre procédure d’élevage, à savoir des plaques 24-puits avec un poisson par puits contenant deux millilitres d’eau.

Devenir

L’ensemble des poissons utilisés dans cette étude sera mis à mort pour pouvoir analyser l’impact du traitement sur la composition du microbiote et ses éventuelles conséquences sur la croissance et/ou le développement des larves. La mise à mort des poissons est nécessaire car d’une part l’analyse du microbiote se fait par extraction après homogénéisation des poissons et d’autre part, l’impact sur la croissance (détermination du poids et mesure de la taille) ne peut se faire qu’hors eau, c’est-à-dire une fois les poissons mis à mort.

Remplacement

Tandis que l’impact du lopéramide sur les bactéries commensales fait l’objet d’une caractérisation in vitro, l’impact sur la composition et la dynamique de réponse du microbiote et ses éventuelles conséquences ne peut être étudié que dans un contexte in vivo. Le poisson zèbre est un modèle in vivo bien caractérisé et cette procédure implique de n’exposer au lopéramide que des poissons au stade larvaire de développement dont les systèmes digestif et immunitaire (réponse innée) sont organisés comme ceux des mammifères, un point déterminant dans le cadre de notre étude.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé afin d’être minimum tout en permettant l’application des approches statistiques choisies et est ainsi basé essentiellement sur des données précédemment publiées. Dans le cas des analyses de la composition du microbiote par séquençage 16S, le nombre de larves par groupe a été calculé à partir de donnés précédemment publiée, et a donc été fixé au nombre de 5 à chaque temps d’exposition pour chaque condition. Ce nombre permettra d’aborder la variabilité liée à ce type d’échantillon sans affecter la puissance statistique des tests choisis. L’analyse statistique pour la comparaison du microbiote par séquençage des larves au cours du temps s’appuiera ainsi sur l’utilisation d’un modèle comparatif du type modèle de Kruskal-Wallis. Les p-valeurs seront ajustées par une méthode type Benjamini-Hochberg afin de prendre en compte la multiplicité des tests. Pour l’analyse morphométrique des larves au cours du temps, le test statistique de Kruskal-Wallis non-paramétrique suivie de Wilcoxon sera appliqué, avec 10 larves par temps d’échantillonnage et par condition pour comparer les larves traitées au lopéramide contre celles contrôles exposées au DMSO.

Raffinement

La procédure consiste à exposer des larves de poissons-zèbres ayant une flore naturelle ou contrôlée à une dose non toxique de lopéramide puis à suivre l’impact sur la composition du microbiote au cours du temps et les conséquences éventuelles. Aucun effet délétère du lopéramide n’est attendu car c’est une dose décrite précédemment comme non toxique (Shi, 2014). Néanmoins, une observation quotidienne des poissons sera réalisée et les poissons ne seront pas conservés plus de onze jours post-fertilisation pour limiter leur inconfort au vu de notre procédure d’élevage, à savoir des plaques 24-puits avec un poisson par puits contenant deux millilitres d’eau. Nous nous appuierons également sur certains des critères présentés pour l’évaluation quantitative de points limites qui sont applicables dans ce modèle comme comme la prostration ou la nage anormale et certains aspects physiques. Les anomalies de développement et/ou morphologie seront ainsi recherchées. La détection d’un de ces points limites conduira à la mise à mort du poisson.

Choix des espèces

La flore intestinale joue un rôle important sur notre santé. La compréhension des interactions hôte-microbiote et leur réponse aux stress sont indispensables au développement d’approches thérapeutiques rationnelles complémentaires aux existantes pour le traitement de la diarrhée, et cela ne peut se faire sans le recours à l’expérimentation animale. Le Danio zébré est un modèle in vivo bien caractérisé (notamment du fait de son utilisation en biologie du développement), avec un génome connu et de nombreuses lignées transgéniques déjà disponibles. De plus, nos procédures impliquent de n’exposer au lopéramide que des poissons au stade larvaire de développement dont les systèmes digestif et immunitaire (réponse innée) sont organisés comme ceux des mammifères, un point déterminant dans le cadre de notre étude. Outre l’obtention de pontes, réalisée dans l’animalerie Zorgl’Hub, qui nécessite des poissons-zèbre adultes, mâles et femelles, mais non inclus dans ce projet car simplement géniteurs, nos procédures impliquent de n’exposer au lopéramide que des poissons au stade larvaire de développement. L’utilisation de poissons au stade larvaire de développement se justifie au niveau scientifique et éthique puisque ces derniers possèdent déjà un système digestif et une réponse immunitaire innée comparables à ceux des mammifères.