Procédures légères

3 030 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la moitié réutilisée dans d'autres projets, l'autre tuée pour des prélèvements terminaux. Ils reçoivent des candidats médicaments par diverses voies puis sont placés sur un axe en rotation, le rotarod, pour mesurer les effets moteurs, avec des prélèvements de sang et parfois une chute de l'axe. Le porteur décrit un léger stress et une douleur comparable à une piqûre d'aiguille. Il indique qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne suffit à évaluer la coordination motrice et présente l'animal comme un "passage obligatoire" avant l'homme.

Objectifs

Ce projet a pour but d’évaluer les effets potentiels d'un candidat médicament sur le système nerveux central des rongeurs ( rat et souris) en particulier les effets moteurs des candicats médicaments (type sédatif ou myorelaxant) en utilisant le test du rotarod.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments traitants les troubles du système nerveux central, et la réduction des effets secondaires des médicaments candidats sur la coordination motrice pour le patient. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Du fait de la cible thérapeutique, ce composé pourrait avoir aussi une application en médecine vétérinaire.

Procédures

Les animaux seront administrés avec les composés à tester par différentes voies (-2 min par administration) puis seront placés sur l’axe du rotarod pour une durée de 3 à 5 minutes maximum. Des prélèvements de sang sur animal vigile pourront être effectués (2 minutes par prélèvement). Et l'animal pourra être anesthésié en fin d'expérience pour les prélèvements terminaux de fluides corporels et tissus.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront des administrations de candidats médicaments et des prélèvements de sang qui peuvent être réalisés sur animal vigile ou anesthésié suite auxquelles ils pourront ressentir une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille. Les animaux pourraient présenter un léger stress par le fait de devoir s'accrocher à un axe en rotation. Les animaux pourront de même ressentir une légère douleur liée à la chute de l'axe en rotation du rotarod.

Devenir

Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal ou réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthodes de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une molécule sur la coordination motrice. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat et la souris sont les espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 12 par groupe.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire , • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets d'un nouveau médicament sur la coordination motrice. Seuls des animaux adultes seront utilisés. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

20 phoques crabiers vont être utilisés en Antarctique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis relâchés dans leur habitat. Chaque individu est approché à la perche, sédaté puis anesthésié de vingt à quarante-cinq minutes, le temps de coller une balise sur sa fourrure, de prélever 18 ml de sang et une vibrisse, la balise tombant à la mue suivante. Le porteur décrit un stress de courte durée et s'appuie sur des études antérieures pour affirmer que les instruments n'ont pas d'impact mesurable sur les phoques. Il justifie l'espèce et le milieu par le fait que le phoque crabier, premier consommateur de krill, ne peut selon lui être remplacé ni par une autre espèce ni par des données historiques.

Objectifs

Les zones englacées sont particulièrement sensibles au réchauffement global. Pour prédire la capacité d’adaptation de prédateurs dépendant de la banquise dans ce contexte de changement climatique dans les différentes régions antarctiques, il est important de déterminer au préalable comment ils utilisent leur environnement physique et biologique. Ces prédateurs consomment de grandes quantités de ressources marines, parmi lesquelles le krill (Euphausia superba) occupe une place prépondérante. Cette espèce — dépendante de la banquise pour son développement larvaire — consomme du phytoplancton et est consommée par des prédateurs, elle assure ainsi une large part du transfert de carbone des producteurs primaires (vivant sous la banquise) vers les maillons trophiques supérieurs. Les futurs changements de l’étendue de la banquise antarctique dans un climat plus chaud pourraient affecter de manière négative les populations de krill, et par conséquence celles de leurs prédateurs. Toutefois, l’évolution future de l’ensemble du réseau trophique reste difficile à prévoir tant la compréhension des différentes composantes de l’écosystème antarctique et de leurs interactions est incomplète, voire approximative. A titre d’exemple, la connaissance de la distribution et de l’abondance du krill en hiver ainsi que des zones d’alimentation des prédateurs du krill sont à ce jour très limitées, notamment dans les régions encore peu touchées par les variations de la banquise, telles que l’Antarctique de l’Est. En effet, les études dans ces zones englacées sont difficiles car peu accessibles. Le présent projet a pour but de combler ce déficit de connaissances, en étudiant l’écologie des phoques crabiers et des écosystèmes dans lesquels ils évoluent, ainsi que de documenter l’évolution au cours du temps de ces systèmes et prédire le devenir des populations de ce prédateur marin. Les phoques crabiers sont les plus grands consommateurs de krill (60 à 70 millions de tonnes de krill par an) et les plus abondants au monde (10 à 15 millions), ainsi les changements dans son écologie, sa distribution et son comportement reflètent les changements dans la population de krill de l’Antarctique. Grâce à des techniques de bio-télémétrie, on enregistre les plongées des phoques, les phases d'accélération et leur position, on pourra déterminer les zones d’alimentation clés et la distribution du krill très importante pour l’écosystème.

Bénéfices attendus

Ces résultats appuieront la consolidation de la base scientifique d'une gestion écosystémique de la pêche au krill par la Commission pour la conservation de la faune et la flore marines de l'Antarctique. En effet, il n'y a pour le moment pas de pêche significative de krill dans l'Antarctique de l’Est, mais des notifications récentes de navires norvégiens et chinois suggèrent un intérêt croissant de l'industrie pour cette région et pour cette ressource. Cette étude permettra la mise en place d'une surveillance sur la distribution du krill et des zones d'alimentation des prédateurs du krill en l'absence de pression de pêche afin d'anticiper les éventuelles menaces pour l'écosystème centré sur le krill. Ce projet remplira de fait 1) un des objectifs du programme de contrôle de l'écosystème de la Commission pour la conservation de la faune et la flore marines de l'Antarctique, c'est-à-dire distinguer les changements dus à l'exploitation des ressources marines des changements dus à la variabilité environnementale. Ce projet contribuera également à 2) "l'évaluation des risques" dans la zone afin d'essayer de comprendre l'impact possible de la pêche sur l'écosystème. Enfin les modèles d'habitat du krill utilisés pour élaborer les projections des populations de krill et les stocks comportent des limitations spatiales et temporelles importantes et connues en raison du manque de données disponibles, en particulier pendant la saison hivernale. Cette recherche fournira 3) des informations sur la distribution et l'abondance de cette espèce sous la glace de mer et pendant l'hiver, mais aussi sur son importance cruciale pour ses prédateurs, les phoques crabiers (dans le cadre de ce projet) et les relations fonctionnelles qu'ils entretiennent, en surveillant les changements dans les interactions trophiques.

Procédures

Les interventions sur les phoques crabiers se feront après la période de mue entre février et avril 2024, 20 individus maximun seront équipés et garderont leur balise entre 8 à 11 mois jusqu'à la mue suivante ou jusqu’à ce que la balise se décolle. On procèdera à une sédation sans contention à l’aide d’une perche (10 à 20 min), puis une anesthésie (20 à 45 min) durant laquelle aura lieu l’équipement de l'appareil (contenant l'accéléromètre, le capteur de profondeur, de température et le système de localisation via Argos) par collage sur la fourrure, ainsi qu’une prise de sang (18 ml une fois) et le prélèvement d'une vibrisse pour étudier le régime alimentaire des phoques crabiers (utilisation des isotopes stables du carbone et de l'azote par analyse chimique). Le matériel tombera à la mue sans recapture de l’animal.

Impact sur les animaux

L’induction de l’anesthésie sera faite à l’aide d’une perche à proche distance de l’animal mais sans contention donc les phoques subiront un stress de courte durée durant la procédure (~3 min). L’anesthésie à distance présente plus de risques chez certaines espèces de phoques que la contention et l’injection par voie intra-veineuse or, le phoque crabier est un animal agressif et sa contention est particulièrement difficile ; elle rallongerait le temps de stress auquel l’animal est exposé. Il existe des risques plus fréquents de surdosage ou sous dosage mais la procédure est en revanche moins stressante pour l’animal. La prise de sang et le prélèvement de vibrisse auront lieu durant l'anesthésie de l'animal et n'auront pas d'effet significatif sur l'animal (prélèvement de 0,036% du volume sanguin d’un individu de 300 kg et repousse de la vibrisse prélevée). Les instruments sont collés sur la tête à l’aide de colle epoxy bi-composants selon un protocole testé. Nous nous attendons à ne pas observer d’effet mesurable des instruments sur le comportement alimentaire des phoques car il a été montré qu’une caméra de section deux fois plus grande que celle utilisée ici n’avait pas d’impact significatif sur la durée moyenne des plongées, la dépense énergétique, et la fréquence des mouvements de nage des phoques de Weddell. De plus, lors d’une autre étude qui a comparé le gain de masse et le taux de survie d’éléphants de mer équipés et non équipés, aucun effet de la pose, même répétée, d’équipement n’a été détecté. Enfin une étude récente de l’effet de la pose d’instruments sur des phoques de Weddell et des éléphants de mer par la méthode de la colle epoxy a montré que cette dernière n’avait pas d’impact biologique détectable sur les animaux.

Devenir

Les individus étudiés seront libérés dans leur habitat naturel une fois équipés, le matériel ne sera pas récupéré donc pas de recapture de l'animal, les données seront transmises par satellite et les appareils tomberont à la mue annuelle de l'animal.

Remplacement

L’objectif étant d’étudier le phoque crabier et son écologie en mer dans leur milieu naturel, il ne peut pas être remplacé par une autre espèce, par des animaux d’élevage, ou encore par des expérimentations en captivité. L’écologie du phoque crabier a seulement fait l'objet d'une étude en Antarctique de l’Est. On a donc encore très peu de connaissances sur son comportement et son alimentation dans des zones très englacées comme celles-ci et on ne peut donc pas le remplacer par une autre espèce ou par des données historiques.

Réduction

La réduction est appliquée, puisque le nombre d’animaux capturés est limité à un nombre maximum de 20 individus (objectif autour de 14 individus) pour une campagne dû aux contraintes des déploiements à bord d'un brise-glace (déploiement du personnel sur la banquise pendant une durée limitée pour laquelle les conditions météorologiques doivent être optimales). Ce nombre correspond à 20 individus sur un effectif total de la population de phoques crabiers en Antarctique estimée à ~10 à 15 millions. L'estimation statistique du nombre d'individus nécessaires pour comprendre les variations de leur comportement en fonction des variations de la distribution du krill n'est pas envisageable, car l'effet mesuré est variable et se caractérise par des changements d'habitats ou de stratégies d'alimentation pas toujours facilement quantifiables, et nous ne savons pas à l’avance les comportements que nous allons observer. Dans un schéma idéal, nous souhaiterions avoir le plus de déploiements possibles (avec des stades d'âge et sexes différents) pour avoir le plus de diversité dans les relations entre l'écologie en mer de ces animaux, leur proie (le krill) et les conditions environnementales. En revanche nous essayons d'équiper le plus d'animaux possibles en prenant en compte les contraintes climatiques extrêmes du terrain, la disponibilité des animaux, les contraintes liés à leur cycle de vie (phase sur la banquise, lactation, mue) et les coûts très importants des instruments. Nos analyses multivariées à effets mixtes ne visent pas à comparer les sexes ou les stades d'âge, et le nombre d'individus défini est suffisant pour diversifier les traits individuels car chaque individu « bio- échantillonnent » son environnement dans plusieurs zones différentes.

Raffinement

Les points limites de la procédure et leur raffinement sont les suivant: 1) L’état général de l’animal est évalué avant sa capture (embonpoint, absence de malformation et de plaie) ; 2) Stress lié à la capture : l'animal est anesthésié à distance à l’aide d’une perche, le stress est minimisé et la contention est absente ; 3) Surveillance de l'anesthésie: les paramètres cardiaques et respiratoires de l’individu sont surveillés ainsi que le degré d’anesthésie. 4) Récupération du matériel : pas de recupération possible dans la zone de banquise dite dérivante avec le brise-glace (les animaux sont constamment en mouvement), les balises tomberont avec le poil des phocidés au cours de la période de mue qui se déroule entre janvier et février. 5) Taille de l'instrument : Nous nous attendons à ne pas observer d’effet mesurable des instruments sur le comportement alimentaire des phoques car il a été montré qu’une caméra de section deux fois plus grande que celle utilisée ici n’avait pas d’impact significatif sur la durée moyenne des plongées, la dépense énergétique et la fréquence des mouvements de nage des phoques de Weddell. De plus, lors d’une autre étude qui a comparé le gain de masse et le taux de survie d’éléphants de mer équipés et non équipés, aucun effet de la pose, même répétée, d’équipement n’a été détecté. Enfin une étude récente de l’effet de la pose d’instruments sur des phoques de Weddell et des éléphants de mer par la méthode de la colle epoxy a montré que cette dernière n’avait pas d’impact biologique détectable sur les animaux.

Choix des espèces

Ce projet vise à améliorer notre compréhension de l’écologie des phoques crabiers et des écosystèmes dans lesquels ils évoluent, ainsi que de documenter l’évolution au cours du temps de ces systèmes et prédire le devenir des populations de ce prédateur marin. Les phoques crabiers sont les plus grands consommateurs de krill (60 à 70 millions de tonnes de krill par an) et les plus abondants au monde (10 à 15 millions), ainsi les changements dans son écologie, sa distribution et son comportement reflètent les changements dans la population de krill de l’Antarctique. Dans un contexte de climat changeant, il est très important de connaître les liens prédateurs-proies sous la banquise afin de suivre les éventuels effets sur les populations de phoques crabiers. Cette procédure concerne des animaux adultes car ce sont les individus présents sur la banquise, les juvéniles sont plus fréquemment en mer jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade reproducteur.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées de gravité légère. Elles reçoivent par gavage un traitement à tester puis les toxines de Clostridium difficile, qui provoquent une diarrhée, avant deux heures d'isolement puis la mise à mort pour prélèvements. Le projet évalue des substances protectrices de la muqueuse intestinale contre la diarrhée de la gastro-entérite. Le porteur affirme qu'un modèle animal est "nécessaire" pour reproduire la sécrétion d'eau et les atteintes de la muqueuse, impossibles selon lui à obtenir sur cellules.

Objectifs

La gastro-entérite aiguë, caractérisée par une diarrhée, reste un motif fréquent de consultation. Elle est générée par des agents pathogènes, ou leurs toxines, et elle entraine une déshydratation en particulier chez les populations à risques (enfants, personnes âgées). La réhydratation orale en première intention ainsi que le recours aux antibiotiques font partie de l’arsenal contre cette affection. Cependant, la réhydratation orale ne réduit pas la fréquence des selles et la perte de liquide et ne raccourcit pas la durée de la maladie, ce qui limite son acceptation. De plus, le recours fréquent à l’antibiothérapie entraîne des risques plus graves tels que l’antibiorésistance. Ainsi, les professionnels de la santé s'intéressent à d’autres interventions efficaces et peu coûteuses dans la gestion de la diarrhée au cours de la gastroentérite. Parmi ces interventions figurent des agents à action protectrice vis-à-vis de la muqueuse intestinale (mucoprotecteurs) dont les interactions avec le mucus permettent de former un film protecteur pour les cellules intestinales, conférant ainsi à ces agents un mode d’action non pharmacologique. Dans une étude préclinique précédente, il a été montré qu’une administration orale d’un agent mucoprotecteur extrait des graines du tamarinier Tamarindus indica, pendant plusieurs jours, réduit la sécrétion d’eau induite par la toxine cholérique. Ainsi, l’objectif de cette étude est d’évaluer et comparer les propriétés antidiarrhéiques d’autres agents mucoprotecteurs, seuls ou en combinaison, en utilisant un autre modèle de diarrhée : celui induit par les toxines de Clostridium difficile.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de cette étude contribueront au rationnel préclinique de l’utilisation des substances mucoprotectrices pour leur mise sur le marché ultérieurement dans le traitement de la diarrhée associée à la gastro-entérite. Du point de vue scientifique ils contribueront également à évaluer le rôle respectif de la toxine A et B produites par le Clostridium difficile. La toxine A provoque des effets principalement dans l'épithélium intestinal, tandis que la toxine B a une action cellulaire plus large. Pour se rapprocher de la physiopathologie de cette infection nous envisageons de tester les effets de la combinaison de toxines A+B que nous pourrons comparer aux effets de la toxine A seule.

Procédures

Tous les animaux de ce projet reçoivent par gavage le traitement à tester puis une heure après, la toxine (ou l’association de toxine) de Clostridium difficile. Le gavage sera fait d’un geste expert et très rapide (quelques secondes) avec une sonde métallique à bout arrondi adaptée à la taille de la souris. Après l’administration de la toxine les animaux seront mis dans des cages individuelles pendant une durée de 2 heures.

Impact sur les animaux

Le gavage peut engendrer un stress dû à la contention de l’animal et un inconfort dû à l’introduction de la sonde dans l’œsophage. Les animaux seront logés individuellement pendant une durée de 2 heures après l’administration des toxines du Clostridium difficile qui pourrait engendrer du stress d’isolement. L’administration des toxines de clostridium difficile A et A+B provoque une diarrhée qui peut entrainer une diminution d’activité. A la fin de l’expérimentation les animaux seront mis à mort.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure pour réaliser des prélèvements destinés à des dosages biochimiques de marqueurs d’inflammation (myélopéroxydase) et des analyses histologiques (scores microscopiques).

Remplacement

Le modèle animal reproduisant les caractéristiques de la diarrhée infectieuse (sécrétion d’eau et les altérations de la muqueuse intestinale associées) est nécessaire pour une approche globale de cette pathologie. Il n’est pas possible de la reproduire sur un modèle cellulaire. Pour évaluer si un traitement est efficace, il faut nécessairement utiliser un modèle intégré in vivo

Réduction

Les expérimentations sont basées sur la comparaison de 5 groupes. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque groupe expérimental a été calculé pour atteindre une validité statistique suffisante tout en réduisant au minimum le nombre d’animaux utilisés. En se basant sur la variabilité interindividuelle obtenue dans les études précédentes utilisant le même modèle, l’effectif calculé pour chaque groupe est n=12.

Raffinement

A leur arrivée les animaux seront hébergés au calme dans des conditions normalisées et suivis quotidiennement pour leur apporter tous les soins nécessaires. Leur milieu sera enrichi en buchettes de peuplier pour satisfaire leur besoin de ronger. Après une période 4 jours de repos pour qu’ils récupèrent du transport et s’habituent à leur nouvel environnement, ils seront manipulés régulièrement pour être pesés (2 fois par semaine) puis habitués à la contention (1 fois par jour) en vue du gavage (quelques secondes). Trois jours avant la procédure ils seront habitués à être mis dans des cages individuelles (30 minutes par jour pendant 3 jours). Le jour de l’expérimentation (10 à 15 jours après l’arrivée) les souris seront gavées d’un geste expert et rapide et seront surveillées pendant les 2 heures après l’administration de la toxine où elles resteront dans les cages individuelles. Toutes les mesures ont été prises pour réduire l’inconfort (période d’acclimatation, habituation) et prévenir toute douleur ou anxiété susceptible d’être subie par les animaux (Détection de toute anomalie ou apparition de mal être). Si malgré les mesures prises, une souffrance était constatée sur un animal la procédure serait arrêtée.

Choix des espèces

Les souris sont communément utilisées pour mimer des conditions physiopathologiques observées chez l’homme et appréhender les mécanismes d’action impliqués grâce à la disponibilité des outils nécessaires pour l’étude des modifications immunitaires et histologiques. Elles sont ainsi utilisées pour l’exploration de la physiopathologie digestive. Les souris de souche NMRI ont un système immunitaire peu sollicité ce qui le rend sensibles à toute type de contamination, ainsi à ce titre nous utiliserons le modèle de diarrhée induite par les toxines de Clostridium difficile chez cette souche de souris. Les souris seront utilisées à l’âge adulte : 6 semaines. L’utilisation d’animaux adultes est nécessaire pour évaluer les effets des substances pharmacologiques sur une barrière intestinale parfaitement développée, sachant qu’en condition périnatale la barrière intestinale présente des caractéristiques biologiques complètement différentes de la condition adulte.

360 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées de gravité légère. Une partie subit des tests de performance comportementale, une autre une exposition de 48 heures à une eau appauvrie en sel qui provoque un déséquilibre osmotique, avant prélèvement des tissus. Le projet utilise des lignées dont les récepteurs au cortisol, l'hormone de stress, sont inactivés, pour comprendre leur rôle. Le porteur relie ces travaux au bien-être des animaux non-humains en élevage et à l'amélioration des méthodes d'aquaculture, bénéfices renvoyés au développement futur d'indicateurs.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser le rôle de chaque récepteur au cortisol (hormone de stress) dans la régulation de l’homéostasie ionique et hydrique ainsi que dans des activités comportementales du poisson. L’exposition du poisson à une situation stressante active l’axe corticotrope et conduit très rapidement à la libération de cortisol dans le sang. Ce cortisol va modifier différents processus comportementaux et métaboliques, dont le métabolisme hydrominéral, via des voies de signalisation mettant en jeu les 2 récepteurs au cortisol. Concernant l’homéostasie ionique et hydrique (métabolisme hydrominéral), plusieurs études ont montré le rôle déterminant du cortisol dans la régulation des échanges ioniques et la perméabilité de la branchie, principal organe impliqué dans la régulation de la balances hydrominérale. Par contre, pour des raisons techniques, le rôle des récepteurs au cortisol dans le maintien de l’homéostasie ionique et hydrique est controversé. Plusieurs travaux ont aussi étudié les rôles de ces 2 récepteurs sur le comportement des poissons. Tout comme pour le maintien de l’homéostasie, des résultats contradictoires sont mesurés sur le rôle des récepteurs. Plusieurs travaux suggèrent une notion de complémentarité fonctionnelle des 2 récepteurs et l'hypothèse d'une réponse compensatrice, quand l'un des 2 récepteurs est muté. Mais pour l’instant, rien n’a été clairement démontré. Dans ce contexte, afin de caractériser les rôles respectifs des 2 récepteurs au cortisol dans la régulation des fonctions branchiales (organe-clé de l’homéostasie chez le zebrafish) et des activités comportementales, nous proposons d'utiliser des lignées de zébrafish pour lesquels les gènes codant pour les récepteurs au cortisol sont inactivés et non fonctionnels. Les rôles de ces récepteurs seront étudiés en condition contrôle et lors de stress.

Bénéfices attendus

Des stress en relation avec la qualité d'eau et/ou conditions d'élevage ont clairement des effets néfastes sur l’homéostasie et le comportement du poisson qui peuvent se traduire par une baisse de la productivité et l’établissement de situations de mal-être alors que le bien-être des animaux en élevage est un objectif important pour la profession en réponse à la demande sociétale. Une meilleure connaissance des réponses au stress, que l'on peut obtenir dans cette étude, devrait permettre le développement d’indicateurs biologiques d’état ou d’indicateurs prédictifs de bien-être chez les poissons et le cas échéant de problèmes de santé potentiels. Ces indicateurs seront utiles pour l’amélioration des méthodes d’élevage en aquaculture, pour le choix d'espèces à domestiquer et comme critères phénotypiques dans la sélection pour des caractères d’adaptation à l’environnement.

Procédures

Un nombre de 180 individus vont subir des analyses de performance comportementale de sévérité légère une seule fois de 30s pour la plus courte, à 9 minutes pour la plus longue. Un autre nombre de 90 individus seront exposés à une eau appauvrie en sels pendant 48 heures une seule fois. La diminution de la quantité en sels de l’eau se fera progressivement sur 24heures.

Impact sur les animaux

Afin de mesurer les capacités à maintenir leur homéostasie ionique et hydrique, les poissons seront exposés à un stress osmotique: exposition à une eau appauvrie en sel. Ce stress va induire un déséquilibre de la teneur en sels du poisson.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthaniés puis prélevés pour différentes analyses biochimiques, moléculaires et histologiques.

Remplacement

Il n'est pas possible d'étudier in vitro les fonctions des récepteurs sur - 1. le maitien de l'homéostasie ionique et hydrique des poissons, car nous ne disposons pas de lignées cellulaires pour les différents organes et type cellulaires impliqués dans cette fonction - 2. le comportement, parce que les analyses comportementales complexes que nous envisageons ne peuvent être réalisées que sur animal et qui plus est seulement caractérisables chez l'adulte.

Réduction

Le nombre d’animaux est adapté au plus juste pour permettre une évaluation statistique de la variabilité individuelle des réponses.

Raffinement

Tout sera mis en place dans le cadre des procédures pour limiter la souffrance et le stress des animaux. Pour la fonction en relation avec le maintien de l'homéostasie ionique et hydrique, le challenge osmotique aura lieu progressivement et ne durera que 48h, à des concentrations en sels déjà utilisés dans plusieurs autres études publiées récemment. De plus l'eau sera supplémentée en oxygène via un bullage d'air. Pour la partie comportement, un seul test comportemental sera réalisé par jour. En dehors des procédures les poissons seront élevés en groupe dans des structures d'élevage adaptées à l'espèce.

Choix des espèces

Les lignées de zebrafish avec inactivation des récepteurs au cortisol sont appropriées pour notre étude visant à étudier le rôle de chaque récepteur dans le maintien de l'homéostaise ionique et le comportement des poissons. De plus, les mécanismes impliqués dans le maintien de la balance hydrominérale ainsi que les différents traits de comportement sont bien caractérisés chez cette espèce. L'étude sera réalisée au stade adulte afin de mesurer les réponses des 2 sexes.

54 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées de gravité légère. Elles reçoivent par voie orale des bactéries intestinales, subissent des prélèvements de selles quotidiens et une prise de sang terminale, pour étudier la mémoire immunitaire des macrophages face à différentes bactéries. Le porteur précise que les souris sans germes ont un système immunitaire incomplet et utilise cette particularité pour isoler l'effet de ses bactéries. Il conclut au "besoin" d'utiliser des animaux, aucun modèle in vitro ne reproduisant selon lui la communication entre organes.

Objectifs

Le microbiote joue un rôle fondamental dans la santé, y compris la modulation de la réponse immunitaire. Les cellules du système immunitaire inné telles que les macrophages, cellules sentinelles du système immunitaire, sont capables de reconnaître et de répondre à une grande variété de stimulations. Récemment, la capacité des macrophages à développer une réponse mémoire après un premier stimulus a été décrite : ce stimulus initial détermine la réponse inflammatoire et anti-microbienne aux stimuli ultérieurs. Cependant, les mécanismes de génération de la mémoire des macrophages contre les bactéries restent mal compris. Ce projet propose d'étudier l'effet de l'inoculation intestinale de 2 bactéries modèles différentes sur les cellules précurseurs des macrophages. Pour cela, nous avons sélectionné une bactérie bénéfique, largement caractérisée, et une autre bactérie, sans effet apparent. Nous avons précédemment analysé la réponse mémoire contre ces deux bactéries in vitro, dans des macrophages de souris. In vivo, leur passage transitoire dans l'intestin des souris conventionnelles conduit à des différences phénotypiques dans les macrophages. Nous approfondirons cette caractérisation à l'aide de souris libres de germes. La génération de souris colonisées avec chaque bactérie permettra d'analyser in vivo la réponse mémoire des macrophages contre une bactérie spécifique et d'identifier les réponses qui dépendent exclusivement de notre stimulus. De même, cela nous aidera à comprendre les mécanismes par lesquels le système immunitaire inné est entraîné lors d'un premier contact avec une bactérie bénéfique ou sans effet apparent. Ce modèle nous donnera également l'opportunité d'étudier les macrophages de souris non colonisés, chez lesquelles le développement de la réponse immunitaire innée n'a pas été préalablement conditionné par une interaction avec des microorganismes intestinaux. De plus, en raison de leur manque de microbiote, les souris sans germes ont un système immunitaire incomplètement développé, nous inclurons une bactérie incapable de coloniser les souris. La colonisation transitoire de souris libres de germes permet une maturation partielle du système immunitaire. Cette approche de cinétique de colonisation en deux temps, avec une colonisation transitoire en premier avant l’inoculation de nos bactéries d’intérêt, nous permettra donc d'analyser en parallèle l'effet isolé de nos bactéries d'intérêt dans un environnement immunitaire plus développé.

Bénéfices attendus

Le bénéfice essentiel de ce projet est la génération de nouvelles connaissances concernant la maturation du système immunitaire en réaction à la présence de bactéries intestinales. Notamment, ces éléments pourraient permettre de mieux comprendre la manière dont une bactérie bénéfique peut avoir un effet positif sur la santé de l´ l’hôte. Par quelle(s) voie(s) les microorganismes utilisés peuvent-ils stimuler la maturation des macrophages de l’hôte ? A terme, ces connaissances pourraient servir éventuellement à la sélection de nouvelles souches bénéfiques.

Procédures

Administrations par voie orale (- de 5 minutes par admninistration, sur animal vigile) : entre 2 et 6 administrations selon les groupes Prélèvements de fèces quotidiens (environ 5 minutes par prélèvement, sur animal vigile) : Entre 14 et 24 prélèvements selon les groupes Prélèvement de sang en fin d’essai (2 minutes), sur animal vigile: 1 seule fois pour chacun des 54 animaux Pesées des animaux (environ 30 secondes par pesée), sur animal vigile, 3 fois par semaine du début à la fin de l’essai

Impact sur les animaux

Il y aura besoin de contention pour effectuer les administrations par voie orale qui peuvent générer un bref inconfort et un peu de stress pour les animaux. Par ailleurs, en fin d´essai, nous réaliserons un prélèvement de sang. Enfin, nous aurons également besoin d’isoler les animaux dans des pots en plastique transparents afin de collecter des feces indivuellement. Cet isolement dure quelques minutes.

Devenir

La survie des animaux est incompatible avec les différents prélèvements effectués en fin d’essai.

Remplacement

De telles expériences ne peuvent pas être réalisées sur des cultures cellulaires qui ne permettent pas de reconstituer les communications entre les différents organes. La complexité de la réponse immunitaire n’est pour le moment pas accessible au travers de modèles in vitro. Dans notre cas particulier, cette réponse est induite suite à l’administration des bactéries qui passent par un tractus digestif complet et peuvent déclencher une réponse immunitaire que nous mesurons au niveau de la moelle osseuse. Il n’existe pas à ce jour de modèle permettant d’appréhender cette complexité et nous avons donc besoin d’utiliser des animaux.

Réduction

Nous utilisons toujours une approche statistique pour déterminer la taille de nos groupes en fonction de l’intensité des effets que nous souhaitons mettre en évidence et des données déjà disponibles. Dans notre cas, des données acquises dans des essais avec des souris conventionnelles nous ont permis de calculer les tailles de groupes suivants avec des paramètres classiques Nous effectuerons des tests statistiques pour les comparaisons directes entre deux groupes.

Raffinement

Tout au long des procédures expérimentales, les animaux sont observés quotidiennement. Par ailleurs, les animaux sont hébergés à plusieurs (4 ou 5) afin de ne pas exposer ces animaux sociaux à un stress lié à l’isolement. Les quelques fois où les animaux sont séparés ne représentent qu’un temps très court (5 minutes environ, pour chaque gavage et/ou récupération de fécès). Nous incluons des enrichissements dans les cages : cellulose à déchiqueter et permettant la création de nids, bâtons à ronger. Le matériel que nous utilisons (sonde de gavage) est évidemment adapté à nos animaux. Les sondes de gavages sont en plastique souple et fin (diamètre externe voisin du millimètre), à bords arrondis et de taille adaptée (4cm) pour empêcher les blessures et réduire l’inconfort. Des points limites sont définis afin de réduire au maximum la douleur ressentie par les animaux. Enfin, toutes les personnes manipulant les animaux sont formées et compétentes pour ce type d’expérimentation.

Choix des espèces

La souris est une espèce de référence en nutrition, toxicologie, cancérologie et immunologie et un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies humaines. Le besoin de travailler en environnement axénique (complètement stérile), principalement en isolateurs, compatibles avec la petite taille des animaux, constituent de plus des facteurs imposant le choix de cette espèce animale. La lignée de souris choisie est une lignée de référence dans l’étude de l’inflammation et elle a été utilisée pour les premières étapes de ce projet en souris conventionnelles. Afin de comparer les résultats avec ceux générés en souris conventionnelles disposant d’un système immunitaire mature entre 6 et 8 semaines, les animaux seront utilisés au même âge.

96 rats nés sans flore intestinale vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées de gravité légère. Ils reçoivent par gavage le microbiote d'un donneur humain puis une supplémentation quotidienne de metformine, subissent des prélèvements de selles hebdomadaires et des contentions en tube pour la mesure de composition corporelle, avant l'autopsie. Le projet cherche à savoir si la metformine favorise une bactérie intestinale aux propriétés antidiabétiques, en vue d'un probiotique chez l'humain. Le porteur affirme le "recours absolu" à un modèle animal, jugeant l'analyse impossible chez l'humain.

Objectifs

L’objectif du projet est de déterminer si la metformine, traitement thérapeutique du diabète de type II, peut promouvoir la population bactérienne d'intérêt, Bacteroides Faecichinchillae, possédant également des propriétés anti-diabétiques, dont les effets sur la santé seront évalués, en particulier au niveau tissulaire.

Bénéfices attendus

Si le traitement à la metformine permet de promouvoir l’espèce commensale d’intérêt, B. faecichinchillaeae, l’utilisation de cette bactérie sera proposée comme probiotique chez l’homme soit en remplacement de la metformine soit en association avec la metformine. L’administration de la souche permettrait en effet de limiter les effets secondaires observés chez l’homme suite à la prise de ce médicament.

Procédures

Les animaux seront soumis à 5 types d'interventions au cours du pojet : 1) gavage orogastrique permettant l'implantation du microbiote du volontaire chez les rats axéniques (animaux nés sans microflore bactérienne colique) : 1 seule intervention, en tout début de projet et d'une durée inférieure à la minute car elle est pratiquée par des zootechniciens formés et expérimentés 2) prélèvements de selles : 1 intervention pas semaine et par animal, d'une durée inférieure à la minute, et enfin 3) une supplémentation quotidienne de Metformine par un gavage oro gastrique (200mg/kg de poids corporel) pratiquée par des zootechniciens formés et expérimentés 4) la composition corporelle est mesurée a l'aide d'un appareil analytique type RMN qui effectue les mesures en 3 min, pendant cette durée les animaux sont contentionnés dans un tube PVC afin qu'ils restent immobiles pour la précision des mesures.

Impact sur les animaux

Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Les donneurs étant, dans le cadre de projet des volontaires sains, aucun effet indésirable n'a été constaté lors du developpement et de l'utilisation de ce modèle, l'alimentation est, de plus, adaptée et n'entraine donc pas de troubles digestifs ou de croissance. Plus de 60 ans d'utilisation de la metformine en santé humaine ont démontré l'efficacité et l'inocuité de ce médicament, toutefois, selon les doses prescrites, des effets secondaires sont observés chez près de 25 % des patients en particuliers des intolérances gastrique et nausées. Si dans la bibliographie, ces symptômes ne sont pas mentionnés dans les éudes in vivo, une attention particulière sera, cependant, portée sur une apparition potentielle de ces symptômes lors de l'observation quotidienne des animaux. Le gavage orogastrique qui va permettre l'établissement du modèle peut être source de stress, lié à la contention de l'animal. C'est pourquoi les animaux sont préalablement conditionnés à la manipulation et que le geste technique est réalisé par des zootechniciens formés et expérimentés qui vont limiter significativement la durée de ce stress potentiel (moins d'une minute). De la même façon, le prélèvement de selles chez l'animal peut être source de stress lié, également, à sa contention nécessaire, toutefois considérant la fréquence (1 fois pas semaine) et de la rapidité du geste (moins d'une minute), les effets indésirables sont très limités.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de cette procédure puis autopsiés afin de récupérer l'ensemble des organes et fluides métaboliques nécessaires aux futures analyses biologiques, génomiques et histologiques.

Remplacement

L’évaluation de l’impact de la metformine sur le microbiote nécessite le recours absolu à un modèle animal pour atteindre notre objectif. Il est en effet très difficile voire impossible d’analyser l’effet potentiel de ce produit sur le rôle de la paroi intestinale (perméabilité, immunité) et sur les métabolismes hépatiques (céramides, voies métaboliques de l'insuline, etc...) chez l’homme. De plus, ceci nécessite une alimentation contrôlée et similaire pour tous les individus ainsi que des mesures et des prélèvements particulièrement difficiles à effectuer chez l’homme.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au strict nécessaire pour observer des effets statistiquement significatifs. De plus, les tissus prélevés seront soient analysés pour répondre au questionnements scientifiques proposés par le projet, soient conservés pour de futures analyses, non prélablement prévues dans le cadre du projet, et qui pourraient complémenter les résultats obtenus.

Raffinement

Les procédures, nécessitant un raffinement de leur exécution pour limiter leur impact sur les animaux, sont les gavages orogastriques, les prélèvements de selles Celles ci seront réalisées par des zootechniciens formés et expérimentés qui permettront de limiter la durée de la procédure par animal (moins d'une minute pour le gavage et les prélèvemets de selles). De plus, avant la première intervention, une habituation à la contention sera réalisée prélalablement par ces zootechniciens permettant ainsi de diminuer le stress suceptible d'être occasionné par ce geste technique. Les animaux font l'objet d'une surveillance quotidienne pour détecter, réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse. la classification modérée lors du passage en chambre respiratoire est justifiée par le fait que les animaux doivent etre places seul dans ces equipements afin de mesurer individuellement les excretions de gaz. Quelle que soit la procédure appliquée, si un animal présentait les signes suivant : perte de poids, prostration, comportement agressif, léthargique, etc... (points limites notables) ou plaies, saignement nasaux ou fécaux, etc...(points limites graves), l'arbre de décision concernant l'application des point limites serait suivi immédiatement.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies sont des rats mâles nés axéniques de la lignée Fischer âgés de 10 semaines. Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Il permet également le recueil d’une quantité plus importante de fèces et de contenus caecaux nécessaires aux études de la composition et de l’activité du microbiote intestinal que la souris. Les rats seront âgés de 10 semaines au moment de l'implantation du microbiote de volontaire par gavage oro gastrique. Cet âge correspond à un stade de développement optimal pour l'acceptation et la stabilisation dans le temps du microbiote transplanté.

540 poissons cichlidés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées de gravité légère. Ils reçoivent une injection unique de manganèse, un produit de contraste que le porteur décrit lui-même comme neurotoxique et s'accumulant dans le cerveau, subissent des tests comportementaux après une phase d'entraînement de vingt jours, puis une IRM d'environ deux heures sous anesthésie, avant que leur cerveau soit prélevé. L'objectif est de comprendre le rôle d'une structure cérébrale propre aux poissons téléostéens et l'évolution des capacités cognitives. Le porteur affirme qu'une étude fonctionnelle de ces espèces est "indispensable" et que la taille du cerveau du poisson zèbre ne suffit pas pour cette imagerie.

Objectifs

Des études montrent que certains poissons comme les labres et les cichlidés (du groupe des poissons téléostéens) sont doués de capacités cognitives dites « supérieures ». Par exemple, des tests ont mis en évidence qu’ils sont capables d’utiliser des outils, qu’ils ont la faculté de se reconnaitre (test du miroir) ou encore qu’ils ont une communication multimodale complexe. Les cerveaux des poissons téléostéens sont organisés de façon très différente de ceux des mammifères, et leurs structures et leurs fonctions demeurent peu connus. En particulier, une structure de la partie ventrale du cerveau, le lobe inférieur, n'existe que chez les téléostéens, et n’est pas retrouvée chez les mammifères ou les oiseaux. Les fonctions de cette structure demeurent inconnues, et des travaux précédents suggèrent qu’elle pourrait être impliquée dans les fonctions cognitives remarquables des cichlidés et des labres. Notre projet consiste donc à étudier l'organisation du cerveau des cichlidés via une étude IRM à la fois anatomique et fonctionnelle, nécessitant la mise en place de test comportementaux chez les espèces Amatitlania nigrofasciata (A. nigrofasciata), Neolamprologus brichardi (N. brichardi), et Pseudotropheus zebra (P. zebra). Ces trois espèces ont une taille, une anatomie cérébrale et des comportements différents. La visualisation de l’activité cérébrale du cerveau des cichlidés à la suite des tests comportementaux permettra d’élucider la fonction de leur lobe inférieur. Connaître la fonction du lobe inférieur chez plusieurs espèces de cette classe de poissons permettra de mettre en lumière comment, au cours de l’évolution, des cerveaux, très différents de ceux des mammifères par exemple, ont pu permettre l’émergence de comportements complexes.

Bénéfices attendus

Cette étude fonctionnelle de recherche fondamentale permettra de mieux comprendre comment les cerveaux de tétrapodes (amphibiens, reptiles, oiseaux et mammifères) et de téléostéens, dont les morphologies diffèrent considérablement, peuvent posséder des capacités cognitives similaires et ainsi d’élucider certains mécanismes de l’évolution de fonctions aussi complexes.

Procédures

Injection unique d’un produit de contraste sous anesthésie (moins de 5 minutes), tests de comportements pour étudier les capacités cognitives (une session d’une heure par jour pendant 2 jours post-injection, et une phase d’entrainement d’une session d’une heure par jour pendant 20 jours pré-injection) et imagerie par résonnance magnétique (IRM) sous anesthésie durant environ 2 heures afin de visualiser l’activité cérébrale induite par les tests de comportement. Le poisson est maintenu dans un tube rempli d’eau contenant de l’anesthésiant puis placé dans l’IRM pour la durée de l’acquisition (environ 2h). La température de l’eau est surveillée tout au long de l’acquisition. Chaque animal ne peut être scanné qu’une seule fois, le manganèse s’accumulant dans le cerveau et étant neurotoxique.

Impact sur les animaux

Les seules nuisances attendues sont liées au stress de l’isolement, du transport et de l’anesthésie des poissons. De plus, une douleur au site d’injection du produit de contraste est également possible.

Devenir

Même si ce projet est constitué uniquement d’une procédure de classe légère, les animaux ne pourront pas être réutilisés pour des tâches de comportement, puisqu’ils ne seront plus naïfs. De ce fait, il n’est pas possible de les réutiliser. Le replacement ou l’adoption des animaux n’est pas une solution retenue en raison du nombre d’animaux impliqués, et du fait que les effets à long terme d’injection de manganèse sur la santé des poissons ne sont pas connus. Il a été décidé de procéder à leur euthanasie. Suite à l’euthanasie, les cerveaux des animaux seront prélevés et serviront à des expériences de neuroanatomie.

Remplacement

Les poissons téléostéens ont été récemment cooptés au rang d’animaux modèles pour les analyses anatomiques étudiant les structures cérébrales qui sous-tendent les fonctions motrices et sensorielles, ainsi que des comportements dits « de fonctions cérébrales supérieures » (émotions, motivation, apprentissage). Ces différents types de comportements ont déjà été observé chez A. nigrofasciata, Neolamprologus brichardi, et Pseudotropheus zebra, mais chaque espèce présente des comportements particuliers et qui lui sont propres. De plus, leurs cerveaux sont anatomiquement différents. Pour mettre en évidence quelles parties du cerveau de cichlidé sous-tendent ces remarquables capacités cognitives, une étude fonctionnelle de ces espèces est indispensable. De plus, la taille du cerveau des espèces de téléostéens traditionnellement utilisées (poisson zèbre, médaka), ne permet pas de réaliser l’imagerie nécessaire à ce projet avec une résolution suffisante. L’utilisation de cichlidés, et en particulier de ces trois espèces, dont la taille du cerveau permet l’imagerie, semble donc toute indiquée.

Réduction

Pour ces expérimentations, le nombre d’animaux utilisés sera limité aux besoins statistiques de nos analyses, et nous privilégierons des tests statistiques qui permettront de limiter le nombre d’individus nécessaires. Des études IRM précédemment publiées chez les mammifères, oiseaux et amphibiens nous permettent de déterminer le nombre d’individus nécessaires.

Raffinement

Dès la réception des animaux, leur bien-être sera particulièrement observé par des zootechniciens compétents. Afin de limiter la souffrance potentielle pour les animaux, nous utilisons une grille d'évaluation des points limites qui prend en compte des comportements ou signes visibles de mal-être. Avant l’injection de manganèse, une anesthésie sera réalisée. Des cachettes (tubes en PVC) seront ajoutées à l'hébergement pour fournir de l'enrichissement. Un contact visuel entre les poissons sera possible puisque les aquariums seront placés les uns à côté des autres. Le transport sera de courte durée et les poissons seront maintenus au chaud par des chaufferettes, puis placés dans un incubateur permettant de les maintenant à la temperature necessaire en attente de leur passage à l’IRM. Une fois anesthésiés et dans l’IRM, l’anesthésie et la température de l’eau seront contrôlées en continue tout au long de l’acquisition.

Choix des espèces

Les poissons ont été récemment cooptés au rang d’animaux modèles pour étudier les régions du cerveau impliquées dans les comportements dits « de fonctions cérébrales supérieures » (émotions, motivation, apprentissage). Ces différents types de comportements ont déjà été observé chez les espèces de poissons cichlidés. Pour mettre en évidence quelles parties du cerveau de cichlidé sous-tendent ces remarquables capacités cognitives, une étude fonctionnelle de ces espèces est indispensable. De plus, la taille du cerveau des espèces de téléostéens traditionnellement utilisées (poisson zèbre, médaka), ne permet pas de réaliser l’imagerie nécessaire à ce projet avec une résolution suffisante. L’utilisation de cichlidés, dont la taille du cerveau permet l’imagerie, semble donc toute indiquée. Pour notre étude, nous utilisons des animaux adultes, puisque les comportements qui nous intéresse ne sont réellement développés qu’à l’âge adulte chez ces animaux.