Procédures légères

1 100 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, gardées vivantes puis destinées à être tuées par des étudiants lors de travaux pratiques d'anatomie. Il s'agit d'anciennes reproductrices ou d'invendues d'élevage, qui reçoivent une injection intrapéritonéale puis servent à des tests comportementaux pour initier des étudiants aux gestes de l'expérimentation. Le porteur revendique ces évaluations comme un outil indispensable à la formation de techniciens de laboratoire. Il affirme que l'évaluation comportementale ne peut se faire que sur animaux vigiles et qu'aucun remplacement n'est possible.

Objectifs

Le BUT Génie Biologique option Biologie médicale et biotechnologies forme des techniciens supérieurs et les initie à différentes techniques d'expérimentation animale qu’ils peuvent être amenés à mettre en pratique au cours de leur carrière professionnelle de technicien de laboratoire de recherhe et/ou développement dans une institution publique, en industries pharmaceutiques ou cosmétiques.. Pour compléter leur initiation aux gestes de l'expérimentation animale (préhension, contention, administration de substances, étude des fonctions physiologiques et de leur régulation pharmacologique), ils réalisent des études comportementales sur animaux vigiles. Ces études représentent un outil indispensable à l’évaluation de déficits dans les pathologies neurodégénératives. Pour illustrer cette approche, les séances de travaux pratiques de ce projet permettront aux étudiants de réaliser différents tests simples sur des souris. Les résultats obtenus seront exploités et analysés au cours de séances de travaux dirigés et compléteront l'enseignement théorique où différentes pathologies humaines sont abordées avec en parallèle leur modélisation préclinique.

Bénéfices attendus

Ces évaluations comportementales sont réalisées à partir de tests simples permettant d'initier les étudiants aux conditions particulières nécessaires à leur bonne réalisation. En effet ces études demandent de travailler en respectant des conditions environnementales strictes (calme, silence, lumière) de manière à ne communiquer aucun stress aux animaux. Pour les mêmes raisons, les étudiants sont habitués à manipuler les souris en amont des séances de comportement. L'acquisition de ces pratiques leur sera utile dans leur future vie professionnelle.

Procédures

Les animaux subiront une injection intrapéritonéale soit de sérum physiologique (souris contrôles) soit de substances pharmacologiques (souris traitées). Ensuite les animaux réaliseront les différents tests comportementaux décrits dans les procédures. Chaque souris ne réalisera que 5 tests au maximum au cours de 3 séances différentes (3h de TP par séance, 15 minutes de tests pour une souris au maximum par séance), séances séparées d'une semaine.

Impact sur les animaux

Les animaux recevront une injection intrapéritonéale de sérum physiologique ou de substances pharmacologiques 30 minutes avant la réalisation des tests qui peut induire une légère douleur de courte durée. Lors de des tests d'évaluation de la résignation les souris peuvent ressentir un stress modéré de courte durée.

Devenir

A l'issue des différentes procédures, les animaux sont tous gardés en vie et replacés à l'animalerie. Ces animaux seront ensuite utilisés pour des études d'anatomie au cours de séances de travaux pratiques des étudiants en BUT 1 BMB et en première année de Licence biologie animale (Faculté des Sciences et Technologies). Tputes les souris sont ainsi réutilisées.

Remplacement

L'évaluation comportementale ne peut se faire que sur des animaux vigiles et aucune solution de remplacement n'est possible.

Réduction

Les animaux vont réaliser les différents tests successivement sans jamais en répéter un. De cette manière, nous pouvons réutiliser les animaux plusieurs fois. Les séances de 1ère et 2ème année sont planifiées sur des semaines consécutives sur les mois de novembre et décembre, ce qui permet d'utiliser les mêmes lots d'animaux pour les différentes séances. Toutes les souris utilisées sont des animaux de réforme, anciennes reproductrices ou invendues de l'élevage.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans l’animalerie de l’IUT dans une salle très proche des salles de TP et disposent d’objets d’enrichissement dans leurs cages. Ils sont observés quotidiennemnt et pesés chaque semaine. Les animaux sont amenés en salle de TP 30 à 45 minutes avant le début de la séance pour une période d’habituation.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal standard dans les études comportementales, elle se prête à ce type de manipulation. De plus ces souris seront réutilisées au cours de séances de travaux pratiques d’anatomie réalisées sur souris euthanasiées par les étudiants de première année de BUT Génie biologique, option Biologie Médicale et Biotechnologies. Adultes, animaux de réforme de poids variable en fonction des disponibilités du fournisseur (entre 30 et 45 grammes)

40 souris femelles vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, réutilisées ensuite dans un autre établissement. Un membre postérieur immobilisé, elles passent un examen d'IRM d'au plus 90 minutes sous sédation, sans injection, puis sont transférées pour une mesure de force musculaire. L'objet est d'évaluer l'effet d'une protéine, GDF5, sur l'atrophie musculaire liée à l'immobilisation, en lien avec la perte de masse observée en apesanteur. Le porteur affirme qu'aucun protocole in vitro n'atteint le niveau d'organisation du muscle et juge les études in vivo indispensables.

Objectifs

Un des problèmes majeurs de santé liés à une expédition humaine longue en orbite est la perte de masse musculaire induite par la microgravité. Cette perte de masse intervient rapidement dès l’induction de la microgravité puis s’aggrave avec le temps. Ce phénomène s’apparente à la perte de masse induite par une inactivité prolongée des muscles comme dans le cadre d’une immobilisation longue durée. Une perte de force significative liée à cette perte de masse peut alors être perçue au retour à la gravité. Il est donc nécessaire de mettre au point des mesures pour palier à cette perte de masse afin de pouvoir envisager des missions spatiales longue durée. Au niveau des mécanismes biologiques, il a été démontré que la protéine GDF5 (Growth Differentiation Factor 5) est impliquée dans les mécanismes de maintien de la masse musculaire. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact de la voie caVβ1E/GDF5 sur l’atrophie musculaire induite par l’immobilisation des membres postérieurs de la souris. Pour cela, l’Imagerie par Résonance Magnétique Nucléaire (IRM), méthode non-invasive et atraumatique, représente une méthode de choix pour évaluer la masse musculaire in vivo et est utilisée depuis des décennies dans le diagnostic des maladies neuromusculaires grâce à ses contrastes d’imagerie adaptés à l’évaluation du muscle.

Bénéfices attendus

L'examen RMN permettra une évaluation qualitative et quantitative de l'atrophie musculaire induite par une immobilisation d'un segment de membre. De plus, l'analyse de la texture des muscles permettra de détecter une potentielle involution graisseuse du tissu contractile. Le traitement par GDF5 vise à limiter les effets délétères d'une immobilisation de membre, ou une absence de charge sur le membre comme on peut l'observer en apesanteur (par référence aux vols orbitaux).

Procédures

l'examen RMN est non invasif et atraumatique. chaque animal ne subit qu'un examen et la durée maximum est fixée à 90 minutes.

Impact sur les animaux

les contrastes utilisés en RMN sont des contrastes endogènes révélés par différentes séquence de résonnance magnétiques et ne nécessitent donc pas d'injections. L'examen RMN en lui même est non invasif et atraumatique. La seule nuisance est liée au fait de devoir sédater les animaux afin de maintenir leur immobilité durant l'examen.

Devenir

Tous les animaux (n=40) sont ensuite transférés au CEF (UMS28) pour mesure de force musculaire.

Remplacement

Le muscle est un ensemble organisé de fibres musculaires, cellules hautement différenciées et spécialisées, et du tissu interstitiel. La fonction musculaire est dépendante du fonctionnement des cellules musculaires, mais aussi d’une combinaison des fonctions vasculaire et nerveuse de l’individu. A l’heure actuelle, il n’existe aucun protocole in vitro permettant d’atteindre ce niveau de différenciation et d’organisation, ce qui rend les études in vivo indispensables pour les études sur la structure et le fonctionnement du muscle.

Réduction

Pour répondre au second R de la règle, Réduire, l’IRM apparaît comme étant une méthode de choix par son caractère non-invasif et atraumatique car elle permet la réutilisation des animaux. De plus, nous couplerons l’IRM à haut champ 7 tesla avec la technologie Cryoprobe afin d’atteindre des hautes résolutions en coupe transversales de l’ordre de 40*40 µm² sur une épaisseur de coupe de 200 µm augmentant alors significativement notre précision sur l’évaluation du volume musculaire. La minimalisation de la variabilité entre individus sera effectuée en utilisant qu’un fond génétique C57Bl/6J Rj et un seul sexe, femelle pour tous les animaux. Ces derniers proviendront aussi tous d’un même fournisseur pour minimiser les variations sanitaires.

Raffinement

Pour limiter l’angoisse et la souffrance des animaux, les animaux seront hébergés en groupes dans des cages jetables sur portoirs ventilés avec enrichissement (tube en cartons et papier absorbant pour la confection de nid). Si besoin de la nourriture pourra être déposée dans la cage. Le relevé des paramètres de l’hébergement (température, hygrométrie) ainsi que l’observation des animaux seront faits quotidiennement par du personnel compétent. Pendant les acquisitions, les animaux seront sédatés par inhalation d’un mélange O2/isoflurane et la fréquence respiratoire sera contrôlée tout au long de l’examen grâce à un capteur amagnétique. Enfin la température corporelle de l’animal sera maintenue stable autour de 37°C grâce à un tapis chauffant.

Choix des espèces

Du fait de leur petite taille et de la facilité pour les héberger, les souris sont un ordre animal facile à manipuler. De plus, de nombreux modèles de pathologies neuromusculaires ont été développés chez la souris. Les espèces de l’ordre des souris sont donc appropriées pour la recherche dans le domaine des maladies neuromusculaires. Au laboratoire, un grand nombre d’outils ont été développés pour la recherche en imagerie et en spectroscopie par résonance magnétique nucléaire pour étudier le muscle squelettique des rongeurs, en particulier des souris. De plus, la souris C57Bl6 a déjà été utilisée pour l’évaluation de l’efficacité de l’AAV9-GDF5 sur la trophicité du muscle dans le projet n°30294. Les animaux utilisés dans ce projet auront atteint l’âge adulte. L’âge des animaux qui seront étudiés dans ce projet par IRM sera compris entre 12 et 17 semaines. Cet âge permet de s’affranchir des variations de taille et de poids liées à la croissance de chaque individu. L’identification des animaux sera faite au CEF par marquage des phalanges. Les animaux, dans l’enceinte de notre EU, seront maintenus dans leur groupe d’origine

930 mésanges bleues et charbonnières sauvages vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, relâchées sur place après manipulation. Elles sont capturées, subissent une prise de sang et un prélèvement de plumes, puis un test de personnalité ou une manipulation anti-malaria, les poussins recevant en plus un déparasitage, pour étudier l'effet des parasites et du microbiote sur leur coloration et leur reproduction. Le porteur indique que chaque manipulation dure moins de dix minutes et que quarante ans de programme ont causé la mort de quinze oiseaux sur près de 24 000 capturés. Il affirme qu'aucun modèle théorique ne peut remplacer l'observation des oiseaux dans la nature.

Objectifs

Cette demande fait partie du programme de recherche « Ecologie évolutive des mésanges bleues et mésanges charbonnières en populations naturelles ». Concernant l’expérimentation animale conduite tous les ans dans le cadre de ce projet, le comité d’éthique a déjà donné un avis APAFIS #8608-2017012011062214 v4 le 5 juin 2018 pour une durée de 5 ans. Notre programme de recherche porte sur l'écologie évolutive des oiseaux sauvages. Nous ne disposons d’aucune méthode alternative qui remplacerait l’observation et la manipulation des animaux vivants pour répondre aux questions posées dans ce programme puisque les études en laboratoire ou les modèles mathématiques font largement abstraction de la grande variabilité environnementale observée dans la nature. Nous avons établi des règles strictes qui limitent au maximum le dérangement des oiseaux et pensons en avance aux statistiques à réaliser pour que nos conclusions soient solides et donc cherchons la balance entre ne pas utiliser trop d’animaux et en utiliser assez pour avoir des statistiques fiables.

Bénéfices attendus

Projet 1. Effet des parasites (malaria) sur les colorations des oiseaux. L'approche expérimentale envisagée ici permettra de tester l'importance des parasites pour l'expression des ornements intervenant dans les processus de sélection sexuelle. Cette question a jusqu'ici été abordée de manière corrélative et l'approche expérimentale sera instrumentale pour déterminer des processus causatifs. --//--Projet 2. Effet du microbiote (bactéries) sur la fitness des oiseaux. L’approche expérimentale de ce projet permettra de dépasser la simple description du microbiote et de tester des prédictions associées à notre hypothèse. Ce projet apportera des réponses fondamentales concernant les déterminants environnementaux et génétiques de la diversité microbienne chez les oiseaux en milieu naturel.

Procédures

Les deux expériences proposent un nombre maximal d'oiseaux utilisés de 930. Ce nombre est dicté par la grande variabilité des individus en populations naturelles, les faibles taux naturels de retour (50%) et de recrutement (10%). Les oiseaux (adultes ou poussins) sont manipulés très rapidement : moins de deux minutes pour chacune des expériences. Le raffinement est effectif par la brièveté des manipulations. Pour l’expérience 1, les adultes sont lâchés sur place et pour l’expérience 2 les poussins sont laissés dans le nid. Les adultes auront quatre actes légers consécutifs, à savoir capture, prise de sang, prélèvement de plumes puis soit un test de personnalité soit l’expérimentation anti-malaria. Les poussins, eux, auront une prise de mesures systématiquement et certain d’entre eux auront l’expérimentation de déparasitage. La durée de ces actes est de moins de 10min ce qui constitue un dérangement minime pour ces oiseaux qui sont relâchés directement sur le lieu de capture.

Impact sur les animaux

L’euthanasie ne sera réalisée qu’en cas d’absolue nécessité, lorsque la manipulation de l’oiseau a entrainé une lésion grave et mortelle. Protocole : l’euthanasie se fera selon les règles établies et reconnues par les comités d’éthique, c’est-à-dire soit par euthanasie gazeuse à l'isoflurane, soit par dislocation cervicale. A titre indicatif, le bilan de notre programme mésanges, après 40 ans d’activité et la capture de 23,879 individus adultes est de 15 oiseaux morts du fait d’une manipulation (dont 4 crises cardiaques et 5 euthanasies suite à des blessures graves). La probabilité que nous ayons à faire une euthanasie est donc faible.

Devenir

Expérience 1. Tous les animaux sauvages sont relâchés dans leurs conditions naturelles après la prise de sang. Les oiseaux captifs retournent en volière et seront relâchés à la fin de toutes les expériences. --/-- Expérience 2. Tous les animaux sont relâchés dans leurs conditions naturelles après l’expérience.

Remplacement

Les mésanges nichent facilement dans des nichoirs et la manipulation de leurs poussins ainsi que la capture des individus n'entrainent aucun abandon de nichées. Nos recherches sur le long terme (40 ans) sur les mésanges nous offrent une opportunité unique de mesurer les traits d’intérêts sur des oiseaux dont toute la généalogie est connue, ce qui permet notamment d’envisager des analyses de génétique quantitative pour estimer l’hérédité des caractères. Par ailleurs, ce modèle d’étude est unique car il permet de travailler à la fois en population naturelle et à l’aide d’expérimentations en conditions contrôlées au laboratoire. Aucun modèle théorique ne peut remplacer l’étude des oiseaux dans la nature pour répondre à ces questions.

Réduction

Pour le nombre d’animaux utilisés, nos connaissances en statistiques (analyses de puissance avec le logiciel R) nous permettent de savoir qu’il faut au moins 20 à 50 individus par traitement pour pouvoir tester l’effet d’une expérience. Pour l’expérience 1, 160 seront manipulés en population naturelles car leur taux de mortalité naturelle en population naturelle est de 50% d’une année à l’autre et donc nous aurons 40 pour chaque groupe. En Captivité 50 sont prévu car nous ne prévoyons pas de mortalité au cours de l’expérience. Pour l’expérience deux 720 poussins sont prévus car en population naturelle leur recrutement est de 90% en population naturelle et donc devrions avoir environ 72 poussins l’année après l’expérience pour les deux groupes.

Raffinement

Le protocole envisagé n’est pas douloureux, pour réduire l’angoisse de l’individu les actes prévus seront court (moins de 10 min par adultes et 5 ??? par poussins).

Choix des espèces

Les mésanges font l'objet d'études dans de nombreux laboratoires européens, et en particulier dans notre laboratoire du CEFE de Montpellier cette espèce est étudiée depuis plus de 40 ans par notre équipe. Les bases de données relatives aux comportements et à l'écologie de cette espèce sont telles que la mésange est devenue un important modèle d'étude pour la compréhension des mécanismes comportementaux d'animaux sauvages. Expérience 1 : stade poussins Nous cherchons à mesurer l’effet de la modification du microbiote sur la personnalité des poussins. Cela demande de venir 4 fois pour nourrir les oiseaux avec l’antibiotique. Les poussins sont facilement accessibles et sont en nombre suffisant pour tester cela. Expérience 2 : stade adulte. La mortalité juvénile (de 90%) nous obligerait à injecter de l’anti paludéen sur un grand nombre de poussin.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. On leur provoque une sécheresse oculaire par des injections de scopolamine quatre fois par jour et une exposition à un courant d'air continu dix heures par jour pendant douze jours, avec suivi de la production de larmes et de l'état de la cornée. Le projet étudie le rôle d'un récepteur, RAGE, dans cette pathologie, sur des souris dont ce gène est inactivé. Le porteur affirme que l'étude "ne peut pas" être menée chez le patient pour des raisons éthiques et que la règle des 3R ne permet pas de remplacer le modèle animal.

Objectifs

L'oeil sec est une pathologie de la surface oculaire, très fréquente, touchant environ 50 à 60 % des personnes de plus de 50 ans. Notre objectif est de caractériser le récepteur RAGE, ses voies cellulaires, et l'expression phénotypique du syndrome sec oculaire dans plusieurs tissus et fluides de l'oeil (cornée, conjonctive, cellules à mucus, larmes) ainsi qu’au niveau physiologique (développement de la maladie) chez des souris KO RAGE -/- et chez des souris "sauvages" soumises à des conditions environnementales connues pour être à risque de syndrome sec oculaire. La conduite de cette étude sur l’oeil sec in-vivo ne peut pas être menée directement chez le patient pour des raisons éthiques évidentes. Ainsi, celle-ci nécessite un organisme vivant, afin d’avoir une vue d’ensemble sur le développement de la maladie et sur les acteurs impliqués dans la survenue et le caractère cyclique de cette pathologie. Considérant la règle des 3R, nous ne pouvons pas recourir au remplacement du modèle animal décrit.

Bénéfices attendus

Le récepteur des produits avancés de glycation (RAGE) est un récepteur ubiquitaire dans l'organisme, connu pour être pro-inflammatoire, pro-thrombogène, ou encore pro-apoptotique au niveau cellulaire. Notre objectif est de caractériser le récepteur RAGE, ses voies cellulaires, et l'expression phénotypique du syndrome sec oculaire dans plusieurs tissus et fluides de l'oeil (cornée, conjonctive, cellules à mucus, larmes) ainsi qu’au niveau physiologique (développement de la maladie) chez des souris KO RAGE -/- et chez des souris "sauvages" soumises à des conditions environnementales connues pour être à risque de syndrome sec oculaire. Ainsi, nous essayons par ce projet de mieux connaitre les voies d'activation cellulaire de RAGE dans la pysiopathologie du syndrome sec oculaire. Un des bénéfice majeur de ce travail pourrait être une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques complexes du syndrome sec oculaire, notamment les voies d'activation de l'inflammation au niveau de la surface oculaire.

Procédures

Des souris KO RAGE -/- et des souris "sauvages" RAGE +/+ de la lignée C57 Black 6 (âgées de 4 à 6 semaines) seront soumises à des stimuli environnementaux connus pour être à risque de survenue de sécheresse oculaire (comme une attention soutenue sur une tâche nécessitant de la concentration, et/ou une condition venteuse avec hygrométrie faible). En parallèle, des souris témoins des 2 fonds génétiques seront utilisés comme contrôle de l’expérimentation. Dans un premier temps, l’ensemble des souris seront placées dans leur cage en condition standard pendant 8 jours: température 23 +/- 2°C, humidité 50 à 75%, alternance 12 heures lumière - obscurité (8h to 20h), et eau/alimentation ad libitum. Pour les groupes « oeil sec », l’induction du syndrome se fera par l’injection sous-cutanée 4 fois par jour (8h00, 12h00, 14h00 et 17h00) de scopolamine (0.5 mg/0.2 ml; Sigma-Aldrich) en alternant le flanc gauche et droit. Les souris seront de plus exposées à un courant d'air continu à partir d'un ventilateur placé à 15 cm devant la cage (courant d’air de 2-4 m/secondes) dans une pièce à environnement contrôlé (30-35 % humidité, 23°C, alternance jour/nuit 12h) et ce pendant 10 heures par jour durant 12 jours consécutifs. Le modèle de maladie de l’oeil sec proposé dans ce projet a déjà largement été utilisé sans effet nocif perceptible lié au traitement à la scopolamine ni à une faible humidité [Luo, L. et al., 2004 ; Yeh, S. et al., 2003]. Pour les groupes témoins, les souris seront placées dans un environnement non stressant contenant 50 à 75% d'humidité à la température de 23 +/- 2°C, sans exposition à l'air forcé et eau/alimentation ad libitum. Lors de l’expérimentation, des tests « non invasifs » seront réalisés afin d’évaluer au jour le jour l’avancée du syndrome . Tout d’abord, la perte de production de larmes sera testée en utilisant des fils de coton imprégnés de rouge de phénol qui seront placés dans le ménisque des larmes du canthus latéral pendant 30 secondes (1 fois par jour pendant la durée de l'expérimentation). Ce test est considéré comme équivalent au test de Schirmer mené chez les patients souffrant d’un syndrome de l’oeil sec (bandelette buvard graduée permettant de quantifier la production lacrymale sur 5 minutes). En parallèle, l’étude de l’intégrité des épithéliums sera réalisée en utilisant l’instillation de fluorescéine (1%) et l’utilisation d’une lampe à fente (1 fois par jour pendant la durée de l'expérimentation).

Impact sur les animaux

La provocation expérimentale d'un oeil sec n'est pas anticipé comme étant une condition risquant de provoquer une douleur majeure ou une angoisse animale. Les symptômes de syndrome sec oculaire sont une sensation de corps étrangers, une brulure oculaire, une rougeur oculaire et une irritation de surface. Cependant, en cas de constation d'un comportement douloureux (intolérance majeure à la lumière, animal prostré, ne s'alimentant plus) ou d'un ulcère cornéen profond (stromal profond de la cornée) et/ou à risque de perforation cornéenne, l'animal sera anesthésié et sacrifié par surdosage en produits anesthésiques (Pentobarbital 150 mg/kg en injection intrapéritonéale), aboutissant à une apnée conduisant au décès. Ce type de symptômes ou constation clinique est exceptionnellement lié à un syndrome sec oculaire chez l'Homme. Ils sont le plus souvent dus à des commorbidités oculaires sous jacentes (pathologies inflammatoires, troubles liés à l'innervation cornéenne, anomalies des cellules souches limbiques, pathologies infectieuses cornéennes).

Devenir

Tous les animaux sont sacrifiés avant prélèvement de leurs globes oculaires.

Remplacement

La conduite de cette étude sur l’oeil sec in-vivo ne peut pas être menée directement chez le patient pour des raisons éthiques évidentes. Ainsi, celle-ci nécessite un organisme vivant, afin d’avoir une vue d’ensemble sur le développement de la maladie et sur les acteurs impliqués dans la survenue et le caractère cyclique de cette pathologie. De nombreux travaux déjà publiés sur l’étude des anomalies de la surface oculaire (cornée, conjonctive, larmes) ont établi que l’utilisation du modèle souris apparaissait comme la meilleure solution. De plus, l’équipe de recherche possédant et utilisant déjà la lignée RAGE -/-, ce choix apparait de fait logique et justifié. Enfin, ce cercle vicieux de l’oeil sec et son processus pathologique dynamique pourront être étudiés sur ce modèle et corrélés avec les agressions subis par l’oeil humain et les capacités de cicatrisation de ce type de tissu vivant. Considérant la règle des 3R, pour le remplacement nous avons réalisé toutes les premières études en utilisant des cellules en culture afin d'éviter l'inclusion d'un trop grand nombre d'animaux.

Réduction

Afin d'inscrire cette expérimentation animale dans le cadre de la Règle des 3R (Réduire, Raffiner, Remplacer), nous réduirons notre étude à 4 groupes distincts (pour tenir compte de la variabilité expérimentale): chaque groupe sera constitué de 10 souris pour un effectif total de 40 souris. Pour rappel: Ce protocole expérimental utilisant la souris nécessitera la constitution de 4 groupes distincts dont les effectifs ont été calculés pour réduire au maximum le nombre de souris afin d'optimiser la puissance statistique. En tenant compte de la variabilité expérimentale concomitante à la conduite de tels projets chaque groupe sera constitué de 10 souris pour un effectif total de 40 : Groupe 1 : Souris Wild-Type *Groupe contrôle (effectif :10); Groupe 2 : Souris RAGE -/- *Groupe contrôle (effectif :10); Groupe 3 : Souris Wild-Type *Groupe OEil-sec (effectif :10); Groupe 4 : Souris RAGE -/- *Groupe OEil-sec (effectif :10). Ces effectifs nous permettront d’obtenu des tests statistiques non paramétriques (Kruskal-Wallis et Mann-Whitney U test).

Raffinement

Dans l'optique de raffiner au mieux notre protocol, nous veillerons au bien-être animal (pas de surpopulation dans les cages, éviter les actes douloureux inutiles, enrichissement des cages avec des roues de course, des tubes en plastique, boîtes en carton et des matériaux de nidification). Points Limites: la provocation expérimentale d'un oeil sec n'est pas anticipé comme étant une condition risquant de provoquer une douleur majeure ou une angoisse animale. Les signes cliniques et fonctionnels du syndrome sec oculaire sont minimes à modérés: une gène oculaire à type de grains de sable, des sensations de brûlures oculaires superficielles, un prurit, une vision trouble fluctuante. L'ensemble de ce protocole ne doit pas normalement entrainer de souffrance animale. Malgrès tout, en cas de constation d'un comportement douloureux (intolérance majeure à la lumière, animal prostré, ne s'alimentant plus) ou d'un ulcère cornéen profond (stromal profond de la cornée) et/ou à risque de perforation cornéenne, l'animal sera anesthésié et sacrifié par surdosage en produits anesthésiques (Pentobarbital 150 mg/kg en injection intrapéritonéale), aboutissant à une apnée conduisant au décès. Ce type de symptômes ou constation clinique est exceptionnellement lié à un syndrome sec oculaire chez l'Homme. Ils sont le plus souvent dus à des commorbidités oculaires sous jacentes (pathologies inflammatoires, troubles liés à l'innervation cornéenne, anomalies des cellules souches limbiques, pathologies infectieuses cornéennes).

Choix des espèces

Comme évoqué dans les paragraphes précédents, le choix de la souris comme modèle d’étude va permettre : - une analyse biomoléculaire proche de la cornée humaine du fait de sa forte homologie anatomique et fonctionnelle avec l’espèce humaine. - l’utilisation du modèle murin dans le syndrome sec expérimental qui est d’ores et déjà largement décrit et reconnu au travers de la littérature. - d’utiliser les nombreux outils moléculaires accessibles, développés et validés dans le modèle murin ; et en particulier l’utilisation de souris dont le gène étudié (RAGE) est inactivé. Nous utiliserons des souris mâles Black 6 (souris « C57BL/6JRj, Janvier Labs ») âgées de 4 à 6 semaines. Ainsi toutes les souris ont le même poids et sont sevrées de l’allaitement maternel. C’est également la période optimum pour la cicatrisation des tissus.

1 200 rongeurs, six cents souris et six cents rats, vont être utilisés dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger, réutilisés ensuite dans d'autres travaux pratiques. Ils servent à entraîner des stagiaires aux gestes de base, préhension, contention, injection intra-péritonéale de sérum physiologique, et à des tests de comportement, open-field, labyrinthe en croix surélevée, planche à trou et chambre claire-obscure. Ces manipulations n'ont pas de finalité de connaissance mais visent la formation réglementaire des concepteurs et applicateurs d'expériences. Le porteur affirme qu'aucune méthode de substitution ne restitue les comportements de l'animal et que les gestes doivent être acquis sur l'espèce cible vivante.

Objectifs

Les personnels des établissements utilisateurs d'animaux à des fins scientifiques ont pour obligation d'être compétents en expérimentation animale. Cette compétence repose pour les concepteurs sur un niveau de formation initiale, une formation spécialisée et une formation continue. Pour les applicateurs, la compétence repose sur la formation spécialisée et la formation continue. Le projet de travaux pratiques présenté ici comprend la partie pratique des deux programmes de formations spécialisées "concepteur" et "applicateur". Il comprend deux procédures expérimentales : un TP pour acquérir les gestes de base : préhension, contention, administrations, prélèvements et un TP pour se familiariser aux tests de comportements pratiqués chez les rongeurs : Open-field, Labyrinthe en croix surélévée, planche à trou, chambre claire-obscure.

Bénéfices attendus

Les bénéfices sont l'apport d'une compétence pratique à la préhension, la contention, certaines techniques d'administration et de prélèvements et de se familiariser à des tests simples mais néanmoins informatifs pour l'étude du comportement des animaux.

Procédures

Pour le TP sur les gestes de base, les actes les plus contraignants sont l'administration de sérum physiologique en intra-péritonéale (piqûre d'aiguille). Ce sont dans les deux cas des gestes brefs qui durent quelques secondes. Pour le TP sur le comportement, les actes expérimentaux réalisés sur les animaux ne sont pas douloureux, tout au plus, il sont stressés quelques minutes du fait d'un environnement nouveau. Les trois tests expérimentaux durent entre 3 et 10 min chacun. Les deux TP sont des procédures expérimentales de classe légère.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être manipulés en réduisant au maximum les nuisances, car ils le seront selon les recommandations du Centre 3R anglais. Les nuisances les plus importantes seront tout au plus de gravité légère et comprennent une administration intra-péritonéale (nuisance équivalente à une piqûre d'aiguille).

Devenir

Les animaux seront réutilisés car ils auront été impliqués dans des procédures légères uniquement.

Remplacement

Pour ce projet, il n'existe pas de méthodes de substitution qui pourrait restituer fidèlement les comportements et réactions des animaux qui peuvent être complexes. Les gestes étant spécifiques de l'espèce rat ou souris, ils doivent être acquis chez l'espèce cible. Toutefois, des outils vidéos en provenance d'une source reconnue de tous (NC3R = Centre 3R anglais) et d'un intérêt indéniable seront utilisés en tout premier lieu, avant la pratique car ils présentent des méthodes modernes, de préhension/contention par exemple. La mise en place des TP sur animaux vivants est donc complétée par une approche préalable complémentaire basée sur les vidéos du centre NC3R. Les gestes ou approches à acquérir imposent que l'animal soit vivant pour évaluer les critères de réussite.

Réduction

Nous sommes attentifs à réduire au maximum le nombre d'animaux, à un rat et une souris par stagiaire, ce qui permet d'atteindre l'objectif pédagogique visé. Par ailleurs, les animaux impliqués dans le TP comportement, nécessairement naïfs, seront utilisés dans un second temps pour le TP gestes de base, permettant de mutualiser l'utilisation d'animaux entre les différentes procédures. Ils ne seront pas euthanasiés mais seront également impliqués quelques mois après la formation dans d'autres TP universitaires (qui feront l'objet de demandes d'autorisation de projet indépendantes de celle-ci).

Raffinement

Les animaux impliqués dans les procédures expérimentales de ce projet sont hébergés dans la zone d'hébergement pendant plusieurs semaines avant les TP, avec une enrichissement social et physique (acclimatation). Les procédures menées sont tout au plus de classe légère (administration intra-péritonéale de sérum physiologique). Les tests de comportement sont tout au plus un peu stressants pour les animaux. Dans ces conditions, aucune administration d'antalgique ne sera réalisée car elle n'est pas pertinente. Les autres gestes comme la préhension et la contention ne sont pas douloureux. Toutefois, une attention particulière sera portée à l'atteinte de potentiels points limites qui sont malgré tout très peu probables.

Choix des espèces

Les espèces qui seront utilisées dans ce projet correspondent aux espèces cibles, c'est à dire aux espèces du module complémentaire de la formation règlementaire en expérimentation animale. Ce sont les espèces dont les stagiaires auront besoin pour leurs futures activités de recherche. Les animaux seront des animaux matures de six semaines au moins. Nous utilisons ces stades car les animaux adultes correspondent aux animaux utilisés classiquement pour les tests de comportement prévus. Ce sont par ailleurs des stades où les animaux sont facilement manipulables pour les travaux pratiques (sachant que nous choisissons des souches d'animaux connus pour être calmes).

40 génisses vont être utilisées dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger, gardées en vie à l'issue, dix réutilisées et trente rendues à l'élevage. Elles reçoivent un traitement hormonal de synchronisation, un dispositif vaginal et un ou deux transferts d'embryons sous anesthésie épidurale, avec des prélèvements sanguins. Le projet compare deux protocoles de production d'embryons in vitro pour améliorer les taux de gestation des schémas de sélection bovine, dont le porteur reconnaît qu'ils servent des activités commerciales. Il conclut lui-même que l'effectif limité rend peu probable la mise en évidence d'une différence significative entre les lots.

Objectifs

Actuellement, les biotechnologies de l’embryon sont largement utilisées par les entreprises de sélection bovines afin d’accroitre le progrès génétique par la réduction de l’intervalle entre générations et l’augmentation de l’intensité de sélection. La production in vitro d’embryons après ponction ovocytaire, couplée au génotypage, est théoriquement l’approche la plus efficace. Toutefois, les conditions de production in vitro sont sub-optimales et altèrent globalement la compétence au développement des embryons: alors que le taux de gestation atteint les 60% pour des embryons produits in vivo, la réimplantation d’embryons génotypés produits in vitro et congelés ne conduit à une gestation que dans moins de 35% des cas. Ces résultats engendrent d’importantes pertes économiques et de progrès génétique qui rendent nécessaire une optimisation des conditions de production in vitro. Au cours d’un précédent projet de recherche, un nouveau protocole de production d’embryons in vitro a été développé. Ce nouveau protocole a donné des résultats prometteurs en utilisant des critères d’évaluation in vitro (taux de développement, qualité morphologique, comptage cellulaires, survie à la congélation) et doivent désormais être validés par mesure des taux de gestation après transfert dans des femelles receveuses. En effet, l’évaluation in vitro de la qualité des embryons constitue encore un vaste sujet d’études car aucun critère in vitro ne semble aujourd’hui prédire de manière fiable le potentiel de développement in vivo après transfert dans des femelles receveuses. Avant d’être transféré aux professionnels et épprouvé à plus large échelle, le nouveau protocole de production doit donc être testé en conditions expérimentales, sur un nombre réduit de receveuses bien caractérisées. Le projet présenté dans ce document vise donc à obtenir des données préliminaires en transférant des embryons produits in vitro selon 2 protocoles différents (témoin et le protocole optimisé) dans 40 femelles receveuses préalablement synchronisées (2 lots de 20 receveuses).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'obtenir des données préliminaires sur les taux de gestation permis par le protocole optimisé et donc rassurer les professionnels sur son efficacité avant de l'intégrer à leurs activités commerciales et ainsi de le tester à plus large échelle. In fine, l'amélioration des taux de gestation conduira à une meilleure efficacité des schémas de sélection, notamment par la diminution du nombre d'animaux donneurs et receveurs nécessaires à la procréation des futurs taureaux d'insémination (impacts économique, environnemental, social).

Procédures

Les génisses expérimentales seront soumis à 1 ou 2 transferts d'embryons après anesthésie épidurale et traitement hormonal de synchronisation des chaleurs (incluant 1 injection intra-musculaire et la pose/retrait d'un dispositif vaginal) ainsi qu'à des prélèvements sanguins (2 à 4 en fonction du nombre de transferts d'embryons réalisés).

Impact sur les animaux

Peu de nuisances sont attendues sur les animaux de ce projet. La procédure expérimentale 1 est une pratique courament utilisée par les professionnels chez les bovins et qui ne semble pas impacter la santé et le bien-être des animaux. La procédure expérimentale 2 concerne peu de prise de sang (2 à 4 prises de sang

Devenir

Tous les animaux expérimentaux resteront en vie après chacune des procédures expérimentales. Les génisses gestantes à l'issue des transferts d'embryons seront vendues dans des élevages commerciaux comme femelle laitière prête à vêler. Les génisses vides après 2 transferts seront éventuellement recyclées pour un autre projet de recherche ou de formation mais pourront également être mises à la reproduction hors expérimentation.

Remplacement

Compte-tenu de l’objectif même de l’étude, le modèle animal ne peut être substitué par un modèle d’étude ex vivo. De plus, les techniques utilisées dans ce projet sont des pratiques couramment réalisées en élevages qui ne sont susceptibles d'engendrer qu'une douleur légère et très ponctuelle chez les génisses.

Réduction

Au total, 40 femelles seront utilisées dans ce projet. Compte-tenu de ces effectifs limités, il est peu probable que le dispositif puisse mettre en évidence une différence significative de taux de gestation entre les lots. Cette première étape de validation permettra essentiellement d’obtenir des données préliminaires avant d’envisager une validation à plus large échelle, en conditions de terrain.

Raffinement

les génisses utilisées dans ce projet seront placées sous surveillance quotidienne (activité, comportement) et hébergées dans une stabulation répondant aux normes de bien-être animal chez cette espèce (accès aisé à l'auge et aux points d'abreuvements, présence de tapis caoutchouc derrière pour le confort des aplombs, accès à des brosses latérales et dorsales...). De plus, une anesthésie épidurale sera réalisée préalablement au transfert d'embryons.

Choix des espèces

Compte-tenu de l’objectif même de l’étude, aucune autre espèce animale ne peut être choisie. La race Prim’Holstein choisie est la 1ère race laitière française en effectif, et est particulièrement concernée par les biotechnologies de l’embryon. Les animaux utilisés dans ce projet seront des génisses, toutes pubères. Le modèle génisse a l’avantage, par rapport à un modèle vache, de ne pas présenter de biais expérimentaux liés à l’historique des femelles (conditions de mise bas, interactions avec la production laitière….). Sur le terrain, les transferts sont également majoritairement réalisés sur des génisses car les taux de réussite sont supérieurs à ceux obtenus sur vaches.