Procédures légères

96 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections quotidiennes sous la peau pendant quinze jours, un test de tolérance au glucose après une période de jeûne, et deux prélèvements sanguins. Elles sont ensuite tuées et autopsiées pour analyser le testicule et d'autres organes. Le projet étudie l'effet de deux molécules régulant le glucose sur la fertilité masculine, le porteur indiquant qu'aucune méthode de remplacement ne permet d'intégrer les effets sur l'organisme entier.

Objectifs

Dans le monde nous estimons que 2 à 12% des hommes sont infertiles. Des facteurs génétiques mais aussi des changements de mode de vie (peu de sport, alimentation riche) peuvent conduire à une baisse de la fertilité à l'âge adulte. Ainsi, dans le cas d’un apport riche en glucides ou dans le cas de diabète sucré chez l’adulte, la qualité du sperme et de son patrimoine génétique sont altérés. Toutefois, après l'arrêt de la consommation de haute teneur en fructose, le nombre de spermatozoïdes retourne à une valeur normale. Dans cette étude, nous allons essayer de mieux comprendre comment le métabolisme glucidique peut affecter la fertilité masculine en utilisant deux classes de molécules (médicaments) utilisées pour réguler la voie des glucides. Nous utiliserons une molécule qui va favoriser l’entrée des glucides dans la cellule (molécule anti-diabetique) ; et la seconde molécule est une hormone produite par le foie . Cette hormone est actuellement étudié pour le traitement de maladies métaboliques (obésité, diabète), mais nous ne connaissons pas ses effets sur la reproduction. L’objectif du projet est d’identifier les effets de ces modulateurs des glucides sur la fonction testiculaire. Ainsi, au cours de cette étude, nous exposerons 2 groupes de souris mâles adultes (saines ou en surpoids suite à un régime riche en lipides) avec soit 1/ l'hormone et 2/ soit avec une molécule qui agit comme sensibilisateur aux glucides (anti-diabetique).

Bénéfices attendus

L’obésité peut conduire à l’apparition de pathologies telles que les maladies cardiovasculaires, ou l’infertilité. Ainsi, dans le cas d’un apport riche en fructose ou dans le cas de diabète sucré chez l’adulte, la qualité du sperme et de l’ADN des spermatozoïdes est détériorée. Les mécanismes d’actions des glucides sur le testicule ne sont pas clairement connus et posent des questions sur les nouveaux traitements thérapeutiques régulant le métabolisme glucidique et leur innocuité sur la fertilité masculine. Le fait que récemment, il a été mis en évidence des taux plasmatiques d'une hormone négativement corrélés aux taux sériques en testostérone chez les patients atteints d’obésité, suggère qu'elle peut agir directement ou indirectement sur plusieurs cellules du testicule et modifier leurs activités . Est ce que ces molécules agissent sur la fonction testiculaire et quels effets peuvent elles avoir ? Les données permettront de mieux comprendre l'importance 1/ du métabolisme glucidique et de sa dérégulation dans la fonction testiculaire et 2/ d'identifier les effets sur le testicule de ces médicaments.

Procédures

La moitié des males auront pendant 15 jours des injections journalières en sous-cutanée avec soit l’hormone, soit du sérum physiologique, l'autre moitié des males auront une administration dans l'eau de boisson. L'ensemble des males auront un test de tolérance au glucose qui nécessite une période à jeûn de 4 à 6h suivi d'une injection de glucose puis de mesures répétées du glucose dans une goutte de sang sur une période de 2h. Enfin les animaux auront 2 prises de sang au cours de l'expérimentation pour vérifier les effets des traitements sur le métabolisme du glucose et sur des marqueurs de la fonction testiculaire.

Impact sur les animaux

Les molécules utilisées ont déjà été etudiées aux concentrations que nous souhaitons utiliser. Elles sont en cours d'essais chez l'Homme. Elles ont montré avoir un effet benefique sur le métabolisme glucidique en cas d’hyperglycemie. Les tests decrivent une "innocuité et tolérance bonnes, similaires au placebo" . Les autres nuisances potentielles sont les injections sous-cutanée qui peuvent potentiellement conduire à une infection, mais les solutions seront preparées sous hotte stérile ainsi que l'apparition d'hematome lors des prises de sang.

Devenir

A la fin de l'experimentation, l'ensemble des males seront euthanasiés et autopsiés pour analyser les effets des molécules (analyse histologique et analyse fonctionnelle moléculaire du testicule, hypophyse, foie, tissu adipeux).

Remplacement

A l'heure actuelle, il n’y a aucune méthode de remplacement, puisque les essais in vitro ont été réalisés. L'analyse proposée, nécessite d'intégrer les effets sur l’organisme en entier (notamment en prenant en compte le métabolisme glucidique par le foie, le tissu adipeux et les muscles) sur la fonction testiculaire. Les effets des molécules ont déjà été caractérisés in vitro sur 2 lignées de cellules et aucun effet toxique (mortalité cellulaire) n’a été observé.

Réduction

Des conditions sont mises en place afin de réduire le nombre d’animaux utilisés ainsi nous utilisons qu’une seule dose des médicaments qui est la dose efficace en se basant sur les données de la littérature et du developpeur. Nous optimisons également les analyses au niveau moléculaire, afin d'utiliser peu d'echantillon.Toutefois, pour faire face à la variabilité individuelle, nous avons besoin d'un nombre minimal d'animaux par groupe (12) pour avoir une analyse statistique fiable. Les tests statistiques seront menés pour tester les différences entre le groupe contrôle et le groupe traité de 12 animaux.

Raffinement

Afin de reduire au minimum les effets sur le bien-être animal, les animaux seront élevés dans les meilleures conditions d’élevage avec la présence d’un enrichissement (une cabane en carton pour se cacher et des morceaux de cartons "crinklets" pour faire leur nid), une surveillance accrue sera réalisée les jours suivants la prise de sang ou le test de tolerance au glucose. Si toutefois, un animal présentait un des points limites sur l'apparence, poids, ou le comportement, ou une combinaison de signes cliniques inquiétant, le vétérinaire référent ou un responsable bien-être local serait consulté et/ou les animaux euthanasiés. Dans le cadre des procedures, pour limiter la douleur, nous utiliserons un anesthesique pour les prises de sang et et un analgesique pour le test de tolerance au glucose et pour limiter la possibilité d'hematome nous effectuerons un point de compression. Pour limiter le stress, les animaux resteront au maximum dans leur cage d'hebergement habituelle.

Choix des espèces

Les souris sont des petits mammifères qui ont une vitesse de reproduction rapide (il ne faut que 30 jours pour produire un spermatozoïde à partir d’une cellule souche, contre 80 jours chez l’homme), et la durée de gestation est de 21 jours. De plus les marqueurs et paramètres du métabolisme glucidique ont été très bien caractérisés et facilement mesurables. Cette espèce est donc un très bon modèle pour étudier les effets des composés agissant sur le métabolisme sur la fonction testiculaire, chez les mammiferes. A l’heure actuelle, aucune donnée sur la reproduction n’est connue pour ces molécules. à partir de 6 semaines, les souris peuvent être considérées comme jeune adulte (fin de la puberté), et peuvent se reproduire. Nous utiliserons des animaux avec un âge supérieur à 6 semaines (8 semaines ).

90 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Ils subissent un gavage au glucose puis des séries de six prélèvements sanguins à la queue, une injection d'insuline suivie de six autres prélèvements, et un hébergement en cage individuelle que le porteur reconnaît comme un stress chronique chez ces animaux sociaux. À la fin, tous sont tués pour prélever sang, muscles, tissus adipeux, cœur et foie. Le projet vise à relier retard de croissance intra-utérin et obésité adulte via le système endocannabinoïde, le porteur affirmant l'impossibilité d'utiliser un autre modèle, l'étude longitudinale de la gestation à l'âge adulte n'étant selon lui pas réalisable chez l'humain.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'étudier chez des rats nés avec un retard de croissance, si des altérations précoces du système endocannabinoïde peuvent contribuer au développement ultérieur de l'obésité et de la résistance à l'insuline à l'âge adulte.

Bénéfices attendus

De nombreuses études, épidémiologiques, cliniques et expérimentales sur modèles animaux, ont à présent clairement établi que l’environnement nutritionnel pendant les périodes critiques du développement, les périodes fœtale (gestation) et néonatale, peut induire une programmation métabolique ayant des effets à long terme sur la physiologie de l’organisme favorisant la survenue de maladies métaboliques chroniques à l’âge adulte, comme l’obésité, le diabète, l’athérosclérose ou le cancer. Le retard de croissance intra-utérin (RCIU) est un problème de santé publique qui concerne près de 10% des naissances en France. Le RCIU découle le plus souvent d’altérations de la fonction placentaire réduisant les apports en nutriments au fœtus. Avec la prématurité, le RCIU constitue la première cause de morbi-mortalité néo-natale mais également un facteur de risque de survenue de maladies métaboliques chroniques à l’âge adulte. Cette « programmation métabolique fœtale » affecte le fonctionnement de multiples organes et circuits métaboliques et implique des mécanismes complexes qui ne sont pas complètement compris. Bien que le rôle du système endocannabinoïde dans la régulation de l’homéostasie glucidique et lipidique et du tissu adipeux soit bien connu chez l’adulte, l’impact de la programmation métabolique fœtale, en particulier du RCIU, sur le fonctionnement de ce système n’a, à ce jour, jamais été étudié. Ce projet d’étude est donc particulièrement pertinent et permettrait de définir de nouvelles pistes d’intervention nutritionnelle périnatale pour prévenir les conséquences à long terme d’un RCIU, en ciblant le système endocannabinoïde.

Procédures

Les rats subiront diverses interventions au début, au milieu et/ou à la fin du protocole. Elles auront pour but de 1) mesurer la composition corporelle sur animal vigile via une technique non invasive peu stressante réalisée une fois/animal, 2) mesurer la tolérance au glucose. Les animaux subiront un gavage avec une solution de glucose puis 6 prélèvements de sang de 300μl chacun seront réalisés au niveau de la queue. Ces prises de sang interviendront à T0 (juste avant le gavage) puis 15, 30, 60, 90 et 120 minutes après. Ce test sera réalisé 1 fois/animal, et 3) mesurer la sensibilité à l'insuline. Les animaux subiront une injectionintrapéritonéale d'insuline (dose finale de 0.75mU/g de poids) puis 6 prélèvements de sang de 300μl chacun seront réalisés au niveau de la queue. Ces prises de sang interviendront à T0 (juste avant le gavage) puis 15, 30, 45, 60 et 120 minutes après. Ce test sera réalisé 1 fois/animal.

Impact sur les animaux

Aucun effet indésirable particulier n’est attendu en lien avec les différents régimes et les différentes mesures réalisées. Afin de mesurer précisément leur consommation alimentaire pendant toute la durée du protocole expérimental, les rats seront hébergés en cage individuelle. Cet hébergement individuel affectera le bien-être de ces animaux sociaux en induisant un stress chronique que nous cherchons à réduire en favorisant les contacts acoustiques, olfactifs et optiques avec leurs congénères et en fournissant un enrichissement adapté dans la cage. L’enrichissement de l’environnement sera mis en place avec différents items tels que tunnels en pvc, des maisonnettes en plastique translucide rouge, boule en inox, papier pour se faire un « lit ».

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir réaliser les analyses qui permettront de répondre aux objectifs du projet. Ainsi, juste avant la mise à mort des rats, sera prélevé la totalité du sang puis juste après la mise à mort, seront prélevés les muscles les tissus adipeux sous cutané et rétro-abdominal, le coeur, le foie et le muscle gastrocnemien.

Remplacement

Pour ce projet, nous avons décidé d’utiliser des rats sprague-dawley. Nous avons choisi ce modèle en raison de l’impossibilité d’utiliser un autre modèle pour répondre clairement à nos objectifs, à savoir étudier les altérations du système endocannabinoïde induites au cours de la période de gestation par un retard de croissance intra-utérin (RCIU, modèle de prématurité) et une fois adulte. Il est possible d’étudier le système endocannabinoïde via des prélèvements sanguins et des biopsies tissulaires chez l’homme adulte. Cependant, le prélèvement de nombreuses biopsies musculaires et adipeuses chez le nouveau-né prématuré rend cette alternative très difficile à mettre en œuvre. De plus le design longitudinal de cette étude couvrant une période de vie allant de la gestation jusqu’à l’âge adulte n’est pas réalisable chez l’homme. Des modèles cellulaires d’adipocyte ou de muscle squelettique, peuvent être utilisés pour tester des conditions physiopathologiques modifiant le système endocannabinoïde. Cependant, la diversité cellulaire des tissus adipeux et musculaires et leurs interactions sont également très complexes et difficiles à reproduire in vitro. Enfin, il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro, ou in silico, permettant de reproduire les échanges placentaires entre la mère et le fétus contrôlant le développement fœtale et la gestation, d’autant plus que les mécanismes et les conditions responsables du RCIU sont encore mal compris.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans en compromettre les objectifs. Il a été déterminé par un calcul d’échantillonnage. Le nombre de rats nécessaires à l’étude est calculé pour une différence attendue de 15% des teneurs circulantes en endocannabinoides entre les rat contrôles et les rats nés avec un RCIU. Des études ultérieures réalisées chez des rongeurs adultes ont montré que ce paramètre peut varier entre 10 et 50 % en fonction du degré d'obésité. L’effectif est calculé pour un risque de 1ère espèce alpha de 5% et un risque de 2ème espèce béta de 5%. Ainsi, le nombre de rats nécessaires par groupe est de 8. Toutefois, afin d’anticiper une mortalité éventuelle liée au RCIU, nous avons choisi de débuter l’étude avec des groupes de 10 rats. Le nombre total de rats nécessaires à la réalisation de ce projet est donc de 40 rats males et 40 rats femelles: 10 rats contrôle et 10 rats RCIU au sevrage (pour chaque sexe), 10 rats controles et 10 rats RCIU âgés de 7 mois (pour chaque sexe). Pour obtenir ceux-ci 10 femelles rattes seront utilisées (nombre minimu recommandé par Janvier Labs pour obtenir le nombre de rats nécessaire). soit un total de 90 animaux.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Les rats seront hébergés individuellement dans des cages T4. Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque rat, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Si un animal présente 3 points limites notables (tels que manque de toilettage, hypoactivité, agressivité, maigreur...) ou 1 point sévère (tels que mutilation, perte de poids supérieure à 20% en quelques jours), il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum.

Choix des espèces

Notre projet vise à documenter les altérations précoces du système endocannabinoides induite par le retard de croissance intra-utérin (RCIU) en réponse à un régime hypoprotéique (modèle mimant la prématurité du nouveau né), et leurs conséquences à long terme sur le développement de l'obésité et de l'insulinorésistance une fois adulte. ces mesures seront réalisées au sevrage des rats (j+22 postnatal) et à 7 mois (rats adultes). Ce type d'expérimentation nutritionnelle ne peut pas être menée chez la femme enceinte. Notre étude nécessite le prélèvement de différents tissu et plasma qui sont difficiles à obtenir en particulier chez des nouveaux-né prématurés et requièrent également un suivi jusqu'à l'age adulte qui n'est pas envisagebale chez l'homme. Notre projet vise à documenter les altérations précoces du système endocannabinoides induite par le RCIU et leurs conséquences à long terme sur le développement de l'obésité et de l'insulinorésistance une fois adulte. Aussi, pour répondre à cette problématique, les rats seront utilisés au sevrage (j+22/23 postnatal) ou à l'âge de 7 mois (adulte).

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. On leur injecte dans l'oreille une bactérie provoquant une inflammation locale, suivie d'imagerie sous anesthésie, un point limite étant fixé à 20 % de perte de poids. Le projet teste des molécules contre l'acné humaine. Le porteur qualifie ce modèle d'indispensable et affirme n'y recourir qu'en dernier recours, après des criblages in vitro qui ne remplacent pas complètement la peau vivante selon lui.

Objectifs

L'acné touche en France environ 15 millions de personnes : majoritairement des adolescents, mais aussi près de 20 % des femmes adultes. L’acné est une maladie de la peau caractérisée par l’éruption de boutons rouges, de points noirs et de kystes. Elle touche le plus souvent le visage et le thorax, mais aussi le dos, le torse voire le cuir chevelu. L’acné est une pathologie chronique du follicule pilosébacé, évoluant de façon fluctuante dans le temps et dont la physiopathologie implique 3 étapes : (1) hypersécrétion sébacée, (2) formation des lésions rétentionnelles (3) formation des lésions inflammatoires. L'acné est un vrai enjeu de santé publique : c'est la maladie de la peau qui a les répercussions psychologiques les plus importantes chez les patients. Parce qu'elle modifie l'image corporelle des individus à des moments clés de la vie (l'adolescence, la femme jeune) et parce qu'elle atteint le visage, elle interfère alors dans la relation avec les autres. Les personnes touchées sont en proie au mal-être et ont tendance à se replier sur elles-mêmes. Il est donc important d’avoir un modèle préclinique prédictif de l'acné et afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques (non cosmétiques), il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle.

Bénéfices attendus

L'acné est une maladie de la peau qui a des répercussions psychologiques très importantes chez les patients car elle modifie l'image corporelle des individus à des moments clés de la vie (l'adolescence, la femme jeune) et parce qu'elle atteint le visage, elle interfère alors dans la relation avec les autres. Les personnes touchées sont en proie au mal-être et ont tendance à se replier sur elles-mêmes. Les bénéfices de ce projet, si une molécule se révélait efficace, serait de mettre sur le marché cette molécule permettant aux patients atteints d'acné de guérir de l'acné et de son inflammation, réduisant ainsi les conséquences physiques et les répercussions psychologiques impactées par cette maladie de peau.

Procédures

Injection en intradermique au niveau de la face externe de l'oreille à l'aide d'une aiguille (durée d'intervention

Impact sur les animaux

L'injection de la souche bactérienne P. acnes dans les oreilles est très bien tolérée par les animaux, elle induit uniquement une inflammation locale et très transitoire chez l'animal. Il est possible que les molécules testées par voie topique peuvent assécher localement de façon excessive la peau des oreilles. Si tel était le cas, les fréquences de traitement seraient espacées.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort après les procédures 1 et 2 car ils ne pourront pas être réutilisés du fait du prélèvement des tissus chez ces derniers.

Remplacement

Nous n'utiliserons le modèle animal d'inflammation provoquée par l'acné qu'en dernier recours après des tests préalables de criblage et d'efficacité in vitro. Il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas vraiment de modèle in vitro d'inflammation provoquée par l'acné pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau (voie dermique / topique) - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme).

Réduction

Le nombre de souris nécessaires a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour pouvoir interpréter et valider les résultats d'expérience. L'utilisation de l'imagerie de Tomographie en Cohérence Optique (OCT) permettra aussi d'augmenter le raffinement (finesse de l'analyse, suivi longitudinal,...) et entraîne une réduction du nombre d'animaux utilisés grace au suivi longitudinal du même animal. Cette approche permet donc de réduire le nombre d’animaux de 50 % au moins comparé à une technique telle que l'histologie qui aurait nécessité le sacrifice des animaux à différents temps.

Raffinement

Evaluation des points finaux quotidiennement (poids, état d'hydratation, comportement de l'animal, état des lésions induites...), enrichissement du milieu dans les cages (igloo, buchettes, cotons pour nidification). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien-Être Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : - Défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation ; - Perte de poids supérieure à 20 % du poids normal maintenue sur 72h ; - Hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger ; - Difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire ; - Plaie nécrosée, purulente ou exsudative - Complication sur le site d’application de la molécule topique. Si l'un de ces points limites est atteint, les animaux seront euthanasiés immédiatement.

Choix des espèces

La souris s'est rapidement imposée au cours du temps comme un modèle fondamental dans la recherche biomédicale. Il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives à l'évaluation de l'inflammation provoquée par l'acné dans ces espèces. De plus, elle présente certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Les animaux seront utilisés entre 6 et 10 semaines, nous permettant ainsi d’avoir un point de comparaison par rapport aux résultats issus de la littérature relative à ce modèle.

49 équidés, des juments, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réutilisés. Chaque jument subit des ponctions d'ovocytes par voie transvaginale échoguidée sous sédation et anesthésie, à raison de douze femelles par an. Le projet vise à comparer des milieux de culture commerciaux pour augmenter le taux d'embryons transférables et, selon le porteur, répondre à une demande croissante des éleveurs tout en optimisant les coûts de production. Il affirme être obligé d'utiliser cette espèce pour améliorer les rendements de la filière équine.

Objectifs

L'objectif de cette étude est donc de tester et comparer des milieux commerciaux prêts à l'emploi de développement embryonnaire in vitro. Le but étant d'augmenter le taux d'embryons transférables après la période de culture in vitro qui n'est actuellement pas plus de 30% dans les laboratoires utilisant des milieux "faits maison". Ainsi nous pourrons répondre à une demande de plus en plus importante de la part des éleveurs français tout en essayant d'optimiser un maximum les coûts de production.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont : - d'augmenter le pourcentage d'embryons transférables après la phase de développement embryonnaire in vitro - et ainsi diminuer les séances de ponction pour une jument mise à la reproduction avec cette technique

Procédures

12 femelles/an seront soumises à un prélèvement d'ovocytes par ponction transvaginale échoguidée entre les mois de mars et de juillet, période de cyclycité des juments. Les prélèvements se font sur animal debout analgésié et anesthésié. La durée de la procédure est de 30 à 45 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Très peu d'effets indésirables rapportés dans la littérature. Moins de 3% des juments présentent de la fièvre les jours suivant la ponction. La fièvre peut être traitée par un anti-inflammatoire non stéroidien. 0,8% des juments présente des saignements dans la cavité abdominale qui peuvent être traités par de l'acide tranexamique (action anti hémorragique). D'après une étude récente, il n'y a pas de complications après ponctions folliculaires chez la jument lorsque l'acte est réalisé dans des conditions d'hygiène irréprochable. L'étude a été menée sur 66 juments et les ponctions étaient réalisées par des vétérinaires non expérimentés dans la ponction folliculaire.

Devenir

Chaque jument prélevée sera ensuite placée dans un paddock en sable (à proximité de ses congénères) et surveillée jusqu'à l'absence d'effet visible de la sédation (locomotion normale, réactivité face au test de clignement à la menace). Elle pourra ensuite rejoindre le troupeau.

Remplacement

Notre objectif est de développer et améliorer une technique de production in vitro d'embryons équins par ICSI. Le développement de cette technique peut se faire en partie avec des ovocytes collectés sur des juments abattues dans des abattoirs commerciaux. Toutefois, les résultats obtenus avec des ovocytes collectés dans les abattoirs ou in vivo par ponction folliculaire sont parfois différents. Notre objectif étant de produire des embryons à partir de femelles en carrière sportive ou de femelles subfertiles, nous devons mettre au point et améliorer nos techniques sur des ovocytes collectés in vivo par ponction, sans abattage des animaux. Les embryons équins seront transférés dans des juments receveuses car il n’existe pas actuellement de système in vitro permettant le développement embryonnaire au-delà de 8 jours.

Réduction

Le lot est constitué sur le nombre minimal d'animaux nécessaires pour l'obtention d'embryons. Douze femelles seront utilisées par an pour les séances de ponctions. On peut espérer obtenir un embryon transférable, à la fin de la période de développement in vitro, par séance de ponction au début du projet. Avec l'expérience ce nombre devrait augmenter.

Raffinement

L'étude sera menée en minimisant le nombre de procédures par animal. Afin de réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse, les animaux seront manipulés dans le calme, en présence du personnel qu'ils connaissent et dans leur environnement habituel. Les femelles soumises aux ponctions recevront un traitement à base de sédatifs, d'analgésiques, d'anti-inflammatoires et d'antibiotiques. Ce traitement sera précisé dans la description des procédures. Les animaux seront surveillés tout au long des procédures et après les procédures afin d'écarter tout problème avant leur remise en troupeau.

Choix des espèces

Notre objectif étant d'améliorer les rendements de production et développement in vitro d'embryons équins grâce à l'ICSI afin de répondre aux attentes de la filière équine française , nous sommes obligés d'utiliser cette espèce pour notre projet. Nous utiliserons des femelles adultes, pubères et cycliques pour collecter les ovocytes de bonne qualité, aptes à être fécondés. Nous utiliserons des femelles jeunes (moins de 10 ans), cycliques pour assumer le développement embryonnaire et la gestation jusqu'au stade 25 jours. A 25 jours l'activité cardiaque peut être visualisée lors d'un examen gynécologique. Cette activité est gage de bon développement embryonnaire et viabilité de l'embryon au départ.

192 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis replacés à l'issue sans être tués. Ils sont élevés en verger de pommiers pour tester l'association arboriculture-élevage, avec prélèvements de poil, prises de sang à l'oreille et observations de comportement. Le projet cherche à mesurer les bénéfices réciproques entre lapins et pommiers, le porteur évoquant l'amélioration du bien-être des animaux non-humains et le désherbage. Il affirme qu'il n'est pas possible de répondre aux ambitions du projet sans recourir aux animaux, la modélisation manquant de données à ce stade.

Objectifs

Il s'agit projet transdisciplinaire qui ambitionne de démontrer la faisabilité et la plus-value de l’association arboriculture-élevage « lapins en verger de pommiers » en agriculture biologique. L’hypothèse générale est que l’association entre arbres et animaux pourrait induire des bénéfices réciproques pour les différentes composantes du système (désherbage, fertilité des sols, bien-être des animaux, etc.), mais également un impact négatif de l'association lapins-pommiers : dégâts de lapin sur les pommiers, attraction de prédateurs ou maladies pour les lapins. L'objectif est de concevoir un système d'élevage de lapins au verger. Les animaux vont donc tester des conditions d'hébergement et avoir un suivi de leur comportement, bien-être, santé, croissance. Un groupe de lapins sera élevé en bâtiment pour avoir un élément de comparaison et mieux apprécier les effets de l'accès à l'extérieur.

Bénéfices attendus

Le projet doit permettre de déterminer les conditions d'hébergement au verger optimales pour les lapins et les pommiers : respect et amélioration du bien-être animal, expression des comportements, vie en groupe, valorisation et entretien de l'herbe, fertilisation des arbres, protection des lapins par le couvert du verger.

Procédures

Les animaux vont être exposés à la vie en extérieur avec une moindre maîtrise des conditions d'ambiance (aléats climatiques, température). Ils vont tester différents types de logements de façon à déterminer les hébergements optimaux. Ils vont subir un petit prélèvement de poil (carré de 5 cm de côté) au niveau du dos à l'aide d'une tondeuse pour doser le cortisol (hormone du stress). Ils subiront une prise de sang à la veine de l'oreille pour réaliser des analyses sanguines pour évaluer leur santé. Des observations de comportement seront réalisées : observations à distance ou réalisation de séquences vidéos.

Impact sur les animaux

Les prélèvements de poil seront sans incidence (pas de douleur, pas de stress) pour les animaux. Le prélèvement sanguin fait à la veine de l'oreille est peu douloureux et de faible volume (maximum 1 ml). Une compression de la veine sera réalisée pour arrêter le saignement et éviter la formation d'un petit hématome. La vie à l'extérieur peut exposer les lapins à des maladies et des aléats climatiques.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie car leur bien-être sera préservé tout au long du projet. Ils seront replacés après l'essai.

Remplacement

Le projet a pour ambition de tester la compatibilité et le caractère éventuellement cumulatif des vertus de deux élevages alternatifs : l’agriculture biologique et l’intégration culture-élevage. L’agroforesterie et en particulier l’association arboriculture-élevage est très prometteuse en termes de bénéfices réciproques, mais très peu étudiée en zone tempérée. L’association entre l'arboriculture fruitière et l'élevage de lapins est novatrice. Le projet porte donc sur l’évolution des systèmes de production d’aliment nécessaire à la transition écologique. Vu le caractère en rupture du projet et l’absence d’information scientifique sur ce sujet, il n’est pas possible de répondre aux ambitions du projet sans le recours aux animaux. La modélisation n’est pas possible à ce stade par manque de données permettant la construction des modèles.

Réduction

Le projet est structuré avec 3 phases de prototypage impliquant un petit nombre d'animaux (une vingtaine) de façon à optimiser le schéma expérimental de l'essai final et de raffiner les conditions de vie des lapins. Les tests statistiques varient en fonction de la variable étudiée. Pour l'essai final, nous utiliserons plusieurs lots d'animaux de façon à avoir suffisament d'unités statistiques pour réaliser les comparaisons entre les differentes conditions de vie (avec et sans arbres ou élevage en cage).

Raffinement

Le projet est structuré avec 3 phases de prototypage de façon à raffiner les conditions d'hébergement avant de déployer l'essai final. Seuls les animaux en parfaite santé seront engagés dans l'essai en extérieur. Les animaux plus faibles ou malades pendant les essais seront hébergés dans une infirmerie chauffée, le temps d'être soignés et guéris selon les problèmes relevés. Le sevrage sera réalisé entre à 6 semaines afin d'améliorer la santé digestive des animaux. Les fratries seront préservées pour éviter des stress de séparation. Lors du transport (5h de voyage), les animaux auront du foin à disposition pour ingérer des fibres longues et éviter un impact négatif du stress de transport sur le transit intestinal (ex: arrêt de transit). Chaque groupe sera placé dans l'hébergement extérieur après quelques heures de repos : abreuvement, nourissage, vérification que les animaux s'alimentent et éliminent. Chaque hébergement sera doté d'une épaisse litière en paille pour permettre aux animaux d'être confortables et isolés de la fraîcheur. L'accès à l'enclos sera libre, les animaux pouvant entrer et sortir à leur guise dans l'enclos de 25 m2. Des relevés de température seront réalisés quotidiennement pour vérifier que les animaux ont suffisament chaud. En cas d'accident climatique extrême (alerte rouge ou vague de froid intense), les animaux seront rentrés dans un bâtiment. La santé des lapereaux sera controlée quotidiennement. Chaque semaine, les animaux seront pesés et auront un examen clinique complet ainsi qu'un controle du niveau de parasitisme (examen des crottes au microscope). Les animaux seront protégés des prédateurs par une double clôture électrique qui entoure la zone de l'essai. Toutes les manipulations des animaux seront faites avec calme et bienveillance. Les animaux seront sociabilisés à l'homme. Lors de la prise de sang à l'oreille, une petite compression sera réalisée sur le lieu de la ponction pour arrêter le saignement et éviter la formation d'un hématome. Lors des traitements des arbres, les animaux seront déplacés sur une autre parcelle.

Choix des espèces

L’hypothèse générale est que l'accès à l'extérieur peut apporter une amélioration du bien-être des lapins et être utile pour la culture des arbres (désherbage, fertilisation). Pour tester cette hypothèse le choix du lapin présente des avantages techniques et éthiques. Herbivore de petite taille (entre 1 et 5 kg), le lapin est capable de tolérer des niveaux élevés de cuivre (utilisé en traitement phytosanitaire en arboriculture biologique) par rapport aux ovins tout en étant capable d’apporter la même aide au déherbage et à la fertilisation. Le projet concerne l'élevage des lapins du sevrage à l'âge de la commercialisation (soit 10-12 semaines) Nous utiliserons 192 lapereaux de 42 jours (sevrage) mâles et femelles élevés au champ.

3 640 souris, dont des femelles gestantes et leurs souriceaux, vont être utilisées, toutes tuées par dislocation cervicale à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les nouveau-nés sont colonisés par une bactérie E. coli puis gavés quotidiennement pendant trois à six semaines avec une suspension bactérienne, pour tester des souches probiotiques contre des bactéries résistantes aux antibiotiques. Le porteur indique que le gavage provoque un stress mais qu'il n'entraîne qu'extrêmement rarement une réponse délétère, et prévoit un surplus de souriceaux dont seuls les mieux colonisés sont conservés. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune expérience in vitro ne peut reproduire la colonisation intestinale in vivo.

Objectifs

Escherichia coli est une bactérie qui colonise le tube digestif de l’Homme et des animaux à sang chaud, dès les premières heures qui suivent la naissance. Un sous-groupe d’E. coli est responsable de maladies telles que les méningites néonatales, les septicémies et les infections urinaires. Le traitement de ces infections passe par l’administration d’antibiotiques. Cependant, dans un contexte de multiplication de résistance bactérienne aux antibiotiques, la recherche d’autres voies de lutte contre ces agents infectieux est nécessaire. Parmi plusieurs stratégies, l’usages de bactéries issues d’un autre sous-groupes de E. coli possèdant des propriétés bénéfiques, notamment la capacité de combattre les souches potentiellement pathogènes, est décrit.

Bénéfices attendus

Le projet vise à amorcer le développement d'une stratégie de lutte contre les bactéries pathogènes multirésistantes aux antibiotiques trouvant leur réservoir dans le tube digestif des mammifères sans utiliser d'antibiotique.

Procédures

- Récolte de fèces sur animaux vigiles - Gavage oral qutodiein pendant 3 à 6 semaines avec 100 uL d'une suspension bactérienne (non visqueuse, non irritante) ou du PBS Administration antibiotique dans l'eau de boisson. Contamination par contact des nouveau-nés par la souche d'intérêt.

Impact sur les animaux

La procédure expérimentale, basée sur un gavage oral des souris avec une suspension bactérienne, implique une nuisance (stress) pour l'animal. Cependant, le gavage oral des souris par des E. coli commensales et pathogènes n’occasionne qu’extrêmement rarement une réponse délétère pour l’animal. Lors de l'expérimentation pilote, aucun individu n'a présenté de signe imputable à la colonisation bactérienne initiale ni aux gavages quotidiens. Le prélèvement de féces sur animaux vigiles n'induit pas de douleur. Cependant un léger stress peut être provoqué par la préhension de l'animal avant le prélèvement, il sera limité par l'habituation et dure 1 à 2 minutes le temps du prélèvement.

Devenir

L'ensemble des animaux est euthanasié par dislocation cervicale à l'issu de la procédure expérimentale.

Remplacement

Aucune expérimentation alternative ne peut remplacer l'aspect in vivo de ce projet. Des expérimentations in vitro de diminution du nombre et de la croissance de notre bactérie cible ont été effectués au laboratoire en réponse à notre souche probiotique. Différentes doses et combinaisons (mutants, souches expérimentales) ont pu être testées permettant de sélectionner la souche probiotique la plus efficace et pertinente in vitro. Cependant, l'objectif du projet étant de démontrer l'efficacité de la souche probiotique Nissle à réduire le portage intestinal d'une souche multirésistance, les systèmes in vitro (tube à essai) ne nous permet pas d'appréhender cette question. Seule une approche in vivo nous permettra de prendre en compte la complexité de l'organisme et l'effet de l'administration quotidienne par gavage de la souche probiotique sur le portage de la souche multirésistante dans l'intestin.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires est calculé au plus juste en tenant compte des éléments suivants : - Une expérimentation pilote a permis de montrer que des résultats positifs pouvaient être observés chez certains animaux (n= 4 animaux par groupe dans cette expérience obtenus à partir de différentes femelles gestantes) pour deux souches probiotiques sélectionnées après 28 jours de gavage. Les résultats obtenus ont permis de sélectionner une souche probiotique pertinente à tester sur un plus grand nombre d'animaux pour conclure sur son efficacité. - Notre expérience montre que les femelles Swiss font des portées comprenant en moyenne 12 souriceaux. Afin de garantir 10 mâles et 10 femelles colonisés par groupe, 7 femelles gestantes sont nécessaires, avec un attendu de 84 souriceaux. Le surplus de souriceaux permettra de ne conserver que les animaux dont la colonisation est suffisament élevé (au moins 10^8 log(CFU/g de fèces)) et stable entre les 2 points initiaux de mesure, ainsi que de compenser un sexe-ratio différent de 1 (données imprévisibles). L'expérimentation pilote a permis de montrer que pour constituer notre effectif final de 64 souris, 7 mères gestantes étaient nécessaires. 91 individus seront nécessaires par expérimentation (7 femelles gestantes + 84 souriceaux). Nous serons amenés à reproduire ce protocole pour valider nos données (répétition) et utiliser différents probioiques (nombre estimé à 6) contre différents variants de E. coli pathogènes (nombre estimé à 10). Ainsi, nous pensons sur la période de 5 ans utiliser 3640 souris (dont 280 femelles gestantes). - Les résultats obtenus sont comparés avec le logiciel Prism GraphPad 8, en utiliant le test du Chi-2 (comapraison des moyennes de charges bactériennes dans les fèces en CFU/g de fèces) ou le test exact de Fischer (comparaison des proportions de souris toujours excrétrices de bactéries pathogènse par rapport au nombre total de souris).

Raffinement

Le suivi expérimental repose sur des techniques non-invasives. Le prélèvement de fèces sur animaux vigiles n'induit pas de douleur mais une habituation à la contention par l'expérimentateur sera réalisée avant les prélèvements. La contention des animaux lors des gavages oraux et des récoltes de selles s'effectue par du personnel qualifié et expérimenté dans la manipulation des souris. Les gavages sont réalisés avec des sondes souples. La solution de gavage est de volume limité (100 uL maximum par administration). Celle-ci n'est ni visqueuse, ni irritante. Compte-tenu de la fréquence des gavages, ceux-ci sont réalisés uniquement par du personnel qualifié, en veillant à ne pas placer la sonde trop profondément dans l'oesophage, et l'administration se fait lentement. Durant cette phase, les souris sont évaluées individuellement à l'aide de critères cliniques et pesées 2 fois par semaine, opérations effectuées par des personnels formés et habitués à la manipulation de souris notamment dans le cadre de ce modèle expérimental. Nous serons attentifs à d'éventuels signes de souffrance et mettrons en place une grille d'évaluation. La grille d'évaluation comprendra les points suivants: - qualité du poil (lisse/hérissé; propre/sale), - perte de poids éventuelle (supérieure ou pas à 15%), prostration: l'animal sera mis sur la main de l'expérimentateur (mesure de la vivacité: curieux (redresse la tête, sens en alerte) / prostré (mise en boule, recroquevillé), mesure de la mobilité: mouvement exploratoire se déplaçant sur la main / pas de mouvement), qualité et aspect des selles (normales, molles, présence de diarrhées ou sang). Si un point limite est atteint alors la procédure s'arrêtera et l'animal sera euthanasié. Les animaux seront hébergés en présence d'un enrichissement (même quantité de coton dans toutes les cages) en présence d'une petite maison en plastique rouge transparente pour leur permettre de se faire un nid tout en nous permettant de les observer sans les déranger.

Choix des espèces

La souris est le mammifère le plus facilement manipulable pour l’étude de l’établissement de la colonisation intestinale. Aucune expérimentation alternative ne peut remplacer l'aspect in vivo de ce projet. L'administration de bactéries à effet probiotique s'effectue par gavage quotidien. Une administration par voie orale d'une culture fraîche à cette fréquence offre toutes les chances d'une efficacité rapide. L'expérimentation pilote a permis de montrer que des résultats positifs pouvaient être observés chez certains gavage. Femelles reproductrices et souriceaux agés de moins de 2 jours pour la colonisation via l'environnement de la souche pathogène (absence de contact). Souriceaux âgés de J21 à J70 pour le suivi de la colonisation dans les selles et gavages avec le probiotique