Procédures légères

90 souris mères porteuses vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent un transfert d'embryons par voie naturelle, sans chirurgie, pour valider une technique de revitalisation de lignées transgéniques, puis sont euthanasiées faute de pouvoir être réutilisées. Le porteur indique que le passage de la sonde peut irriter le vagin et que les petits nés seront gardés pour l'élevage. Il affirme ne pas pouvoir mettre au point cette technique sans recourir aux animaux, la réussite se mesurant au nombre de naissances.

Objectifs

L'objectif est d'avoir une méthode de révitalisation des lignées de souris transgéniques sans geste chirurgical.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est la validation d'une technique de réimplantation d'embryon sans geste chirurgical

Procédures

Un seul transfert par voie naturelle d'embryons de souris (durée quelques secondes).

Impact sur les animaux

Le passage de la sonde peut irriter le vagin. Les souris anesthésiées restent en observation jusqu’à leur complet réveil en bonne forme, dans leur cage placée sur une platine chauffante à 37°C. En fonction de l'évaluation de la douleur, du doliprane par voie orale peut être donné. L'évaluation de la douleur se fait notamment avec l'aide d'une grille de scoring.

Devenir

Les mères porteuses seront euthanasiés après la manip car elles ne peuvent plus être réutilisées pour une autre manip. Les petits générés pourront être gardés et utilisés en fonction des besoins de l'élevage ou d'autres procédures expérimentales.

Remplacement

Nous ne pouvons pas faire une mise au point d’une nouvelle technique de revitalisation sans l’utilisation d’animaux. Nous avons besoin de savoir si la technique marche et pour cela nous avons besoin de voir s'il y a des naissances.

Réduction

Réduire le nombre d'animaux au minimum pour atteindre la compétence du transfert d'embryon jusqu'à 80%

Raffinement

Raffiner en utilisant au mieux les animaux. Renforcement de l'enrichissement des cages contenant les mâles vasectomisés isolés. La durée d'isolement des mâles est réduite au maximum. Eviter tout stress des animaux pendant les manips (gestation...) Des points limites sont définis. Les animaux opérés lors du transfert d’embryon seront soumis à une attention particulière pour la gestion de la douleur avec réadministration d’antalgique si nécessaire après la chirurgie. Les cages hébergeant les femelles réimplantées sont enrichies avec une cabane, du sopalin. Deux femelles maximum sont mises par cage. Une surveillance quotidienne est réalisée. Le transfert se passe sous anesthésie avec une prise en charge analgésique appropriée à la procédure. Des points limites et spécifiques sont mis en place.

Choix des espèces

Nous revitalisons les lignées pour toute entrée de souris transgéniques. Les femelles C57Bl6 productrices de blastocyste sont des femelles sexuellement matures de 6 à 8 semaines. Les mâles C57Bl6 mis en accouplement avec les femellles C57Bl6 pour récupérer les embryons sont également sexuellement matures. Les femelles mères-porteuses sont des femelles adultes, àgées au minimum de 8 semaines tout comme les mâles vasectomisés.

276 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Une poche d'air est formée sous leur peau, des cristaux y sont injectés pour déclencher une inflammation, et un jeûne de vingt-quatre heures est imposé deux fois, avant un prélèvement de sang sans réveil, afin d'étudier l'effet du jeûne intermittent sur l'inflammation de la goutte. Le porteur indique n'attendre ni comportement douloureux ni effet nuisible du régime. Il juge difficile de reproduire un jeûne in vitro et renvoie à la vérification dans un "organisme entier".

Objectifs

Les poussées inflammatoires articulaires observées dans les maladies microcristallines sont responsables de douleur et d’handicap majeur. Leurs mécanismes exacts demeurent encore incompris. La réaction inflammatoire est une réaction complexe qui peut être modulée par des facteurs environnementaux tels que l’alimentation et le cycle circadien. Le jeûne intermittent (JI) est une stratégie alimentaire qui améliore la santé. Il diminue les altérations liées au vieillissement, le stress oxydatif et les marqueurs inflammatoires. Il diminue l’inflammation de la polyarthrite rhumatoïde mais l’effet anti-inflammatoire s’arrête lors de la reprise de l’alimentation. Les mécanismes impliqués dans cette baisse de l’inflammation ne sont pas bien connus. D’un point de vue cellulaire et moléculaire, le JI module le métabolisme cellulaire, la régulation épigénétique (ce qui module l’expression des gènes) et plusieurs acteurs clés impliqués dans l’autophagie (mécanisme de défense cellulaire permettant le recyclage des organites et des protéines défectueux). Il favorise le catabolisme (c'est-à-dire la dégradation) des acides gras et la production de corps cétoniques (produits de dégradation des lipides) qui ont des propriétés anti-inflammatoires. L’autophagie assure le bon fonctionnement et l’intégrité cellulaires. Elle régule le métabolisme cellulaire, la réaction inflammatoire et la réponse immunitaire. Son activation inhibe le plus souvent la réaction inflammatoire. A l’inverse, son inhibition aggrave la réaction inflammatoire en favorisant la différenciation des macrophages inflammatoires. Nos objectifs sont d’identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires associés à l’effet anti-inflammatoire du JI. Nous confirmerons l’implication de l’autophagie dans cet effet anti-inflammatoire, identifierons les modifications du métabolisme cellulaire et épigénétiques et les signatures métaboliques associées au JI et à l’effet anti-inflammatoire. L’objectif ultime est d’identifier la meilleure stratégie alimentaire permettant de limiter la réaction inflammatoire. Cette stratégie pourra alors être testée chez l’homme.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’acquérir des nouvelles connaissances sur l’inflammation microcristalline et des effets bénéfiques du JI. Il permettra d’avoir une vision élargie des modifications métabolomiques (ensemble des produits de dégradation des macromolécules comme les lipides, des protéines et du glucose) associées au JI sur 6 tissus différents chez un même individu. Il identifiera aussi les modifications épigénétiques régulées par le JI et associées à la réduction de l’inflammation et leur transmission potentielle aux descendants. Il identifiera des signatures métabolomiques liées au JI et à l’inflammation. Il permettra de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les maladies inflammatoires basées sur des stratégies alimentaires.

Procédures

Injection en sous cutané de 3 ml d'air sur animal anesthésié : 20 secondes pour l'injection, 1 poche/animal, la poche est gardée une semaine. Injection dans la poche de 1 ml de solution saline ou de cristaux: 20 secondes pour faire l'injection réalisée sous animal anesthésié, 1 seule injection réalisée sous antalgique (buprénorphine 50 µg/kg en sous-cutané). Jeûne intermittent : 24 heures de jeûne, 2 jours non consécutifs. Prélèvement sanguin et lavage de poche sous animal anesthésié (kétamine/xylazine 160 mg/kg et 6mg/kg) et après injection d'antalgique (buprénorphine 50 µg/kg par voie sous-cutanée), procédure sans réveil.

Impact sur les animaux

La création de poche sous la peau est réalisée sous anesthésie gazeuse, les souris ne montrent pas de comportement douloureux. Lors de l'injection des cristaux dans la poche, il se produit une réaction inflammatoire locale, non visible par l'inspection. Les souris sont mises à mort 6 heures plus tard, elles n'ont pas de comportement douloureux durant les 6 heures de stimulation. Le protocole de jeûne intermittent qui sera mis en place est utilisé dans la littérature et a montré des effets bénéfiques sur la longévité et les maladies métaboliques. Il n'est donc pas attendu d'effet nuisible avec ce régime.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure 4 pour prélèvement d'organe.

Remplacement

il est difficile de reproduire in vitro les conditions qui miment un jeûne car les cellules isolées ne résistent pas à une culture sans apport nutritif. Nous testerons les différentes concentrations de cristaux à utiliser in vitro pour réaliser une seule concentration in vivo. Nous testerons in vitro des cultures sans sérum et des cultures avec des milieux appauvris en acides aminés et en nutriment. Les expériences in vivo permettront de confirmer les résultats obtenus in vitro en intégrant les résultats au sein d’un organisme entier.

Réduction

pour réduire au minimum le nombre de souris, nous réaliserons le maximum de tests in vitro afin de déterminer les temps optimaux de privation de nutriments. Nous utiliserons, lorsque c’est possible, le même groupe témoin (régime normal) pour chaque expérience de jeûne. Les expériences in vivo seront adaptées au fur et à mesure afin de limiter le nombre d’expérience et de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés. Ces adaptations et ces tests in vitro permettront de mener une seule expérience in vivo pour répondre à une question précise. Si les résultats obtenus lors des premières expériences ne confirment pas l'hypothèse initiale, les expériences suivantes qui découlaient de l'hypothèse initiale soit ne seront pas réalisées soit seront adaptées aux résultats obtenus.

Raffinement

les souris seront, à la réception dans l’animalerie, réparties de façon aléatoire par groupes de 10 dans un environnement enrichi (jeux, abris, substrats, cachette, blocs de bois). Une période d’acclimatation de 7 jours sera respectée avant toute intervention sur les animaux. Les animaux sont élévés dans un environnement calme et surveillés de façon quotidienne. En cas de lésions générées par des combats de dominance, l'animal recevra des soins locaux (désinfection, pommade hydratante) associés à des analgésiques. Si les lésions sont importantes, l'animal sera isolé, mis dans un environnement calme et des soins locaux et des analgésiques poursuivis. Si l'animal montre des signes de souffrance (stéréotypie, repli, baisse des activités, perte de poids, vocalisation), il sera isolé dans un environnement enrichi, recevra un traitement analgésique. Son alimentation sera mise à disposition directement dans la cage. En l'absence d'amélioration, l'animal sera mis à mort. Il sera réintégré dans la cage après récupération d'un comportement normal et guérison des lésions. Tout animal qui s'alimente moins ou qui perd du poids en dehors du jeûne sera exclu de l’étude pour ne pas induire de biais expérimental. En l’absence de reprise de poids après isolement et soins, l’animal sera mis à mort. Dans le modèle de poche à air, utilisé dans le laboratoire depuis plusieurs années, les procédures de création de poche et injection de cristaux sont très bien tolérées par les animaux. Nous n'avons pas observé antérieurement de modification des comportement des animaux ni de lésion des poches. Après les injections de cristaux, si l'animal présente des signes de souffrance, un traitement analgésique sera administré

Choix des espèces

La réaction inflammatoire est complexe et dépend de nombreuses interactions cellulaires qui ne peuvent pas être évaluées uniquement par des tests in vitro. De même le jeûne intermittent a des répercussions dans l'organisme entier qui ne peuvent pas être appréhendées in vitro. Les expériences in vivo permettront de confirmer les résultats obtenus in vitro en intégrant les résultats au sein d’un organisme entier. C’est une étape de vérification indispensable avant l’évaluation chez l’homme. L'utilisation des souris est basée sur : 1/ La maîtrise du modèle de poche à air chez la souris par le laboratoire. 2/ Le modèle animal utilisé est reconnu sur le plan international. 3/ Le modèle utilisé est représentatif de la maladie humaine. 4/ Des découvertes majeures dans la goutte (inflammation déclenchée par les cristaux d’urate) ont été réalisées avec ce modèle. 5/ Des protocoles bien établis sur le jeûne intermittent dans cette espèce montrant des effets bénéfiques Les souris mâles seront utilisées à l’âge adulte entre 2 et 4 mois. Il s’agit de souris adultes pas trop âgées permettant 1/ d’éviter la modulation de la réaction inflammatoire liée au vieillissement et 2/ d’avoir des souris avec un système immunitaire et inflammatoire compétent. Les 4 souris femelles utilisées pour la génération des descendances seront âgées de 2 à 6 mois pour garder les mêmes caractéristiques que les mâles.

1200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue sans réveil, dans des procédures classées de gravité légère mais menées sous anesthésie terminale. Selon le test, l'extrémité de la queue est sectionnée, une sonde est posée sur la carotide ou un dispositif induit une thrombose sur la veine cave, pour évaluer l'effet de substances sur la coagulation dans le développement de médicaments. Le porteur n'attend pas d'effets toxiques majeurs, les composés ayant déjà été caractérisés à ce stade. Il indique que les tests in vitro ou informatiques ne peuvent "entièrement suppléer" le modèle animal, faute d'un environnement biologique intact.

Objectifs

En dépit des efforts menés pour prévenir et traiter la thrombose, la thrombose artérielle notamment reste une cause majeure de mortalité dans la population adulte des pays développés puisqu’aucune des thérapies proposées à ce jour ne donne entière satisfaction en termes d’efficacité et/ou de sécurité. En effet, les substances utilisées actuellement présentent d’importantes restrictions thérapeutiques en raison de leurs effets secondaires tels que le saignement prolongé en lien avec une altération de la coagulation sanguine. Par ailleurs, si certains cancers, comme la leucémie, peuvent causer une thrombocytopénie qui se caractérise une baisse du nombre de plaquettes (essentielles à une bonne coagulation sanguine), les traitements de certains cancers peuvent aussi d’affecter la moelle osseuse et de mener à une baisse du nombre de plaquettes (agents chimio-thérapeutiques, médicaments biologiques, radiothérapie). Les hémorragies ainsi causées, cérébrales notamment, constituent un problème médical majeur qui justifie la poursuite des recherches vers des thérapies anti-thrombotiques et anti-cancéreux efficaces et plus sûres. Les tests décrits dans ce projet ciblent l'évaluation des effets des substances sur la circulation sanguine, et en particulier sur la coagulation du sang, dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles permettent d'écarter les molécules qui auraient des effets néfastes sur la santé humaine (troubles de la coagulation, saignement, thromboses), ou de garder des molécules qui pourraient faire preuve d'efficacité soit dans le cas de pathologies en lien avec la coagulation sanguine (thrombose artérielle ou veineuse) soit dans le cadre des traitements des cancers.

Bénéfices attendus

Les modèles décrits dans ce projet sont nécessaires à la découverte et à la mise sur le marché de nouveaux médicaments efficaces pour traiter les problèmes de coagulation sanguine, de manière sûre, ou pallier à certains effets secondaires d'autres médicaments sur la circulation sanguine. Ces modèles permettent d'écarter les molécules qui auraient des effets néfastes sur la santé humaine (troubles de la coagulation, saignement, thromboses), ou de garder des molécules qui pourraient faire preuve d'efficacité soit dans le cas de dans le cas de pathologies en lien avec la coagulation sanguine (thrombose artérielle ou veineuse) soit dans le cadre des traitements des cancers.

Procédures

Dans les modèles de ce projet, les animaux sont anesthésiés jusqu'à la fin de la procédure. Pour le test d’évaluation du temps de saignement (durée maximum de 30 minutes), les animaux sont anesthésiés et l’extrémité de la queue (2 mm) est coupée avant d’être plongée dans du sérum physiologique à température ambiante. Pour le test d’évaluation de la thrombose artérielle, les animaux sont anesthésiés puis une sonde de débit sanguin est positionnée autour d’une artère carotide pour la mesure en continue du débit sanguin. Un patch (dispositif induisant localement une thrombose) est positionné sur la carotide. Pour le test d’évaluation de la thrombose veineuse, les animaux sont anesthésiés puis un patch (dispositif induisant localement une thrombose) est positionné sur la veine cave au niveau abdominal. Pour le test d’évaluation de la thrombose dans le modèle du shunt artérioveineux, les animaux sont anesthésiés puis un cathéter est introduit d’un côté dans une artère carotide et de l’autre dans une veine jugulaire (de façon à établir une circulation extra-corporelle. Tous ces tests (sous anesthésie) n'excèdent généralement pas 2 heures et les animaux sont immédiatement euthanasiés (sans réveil préalable). Pour les besoins de l'étude, peuvent être réalisés en fin de test (animal anesthésié), selon les bonnes pratiques vétérinaires. La durée de la procédure de prélèvement est de quelques secondes. Les administrations par bolus rapide (par voie orale, intraveineuse, sous6cutanée, intra-péritonéale, intramusculaire) ou par perfusion lente (intraveineuse) sont effectuées selon les bonnes pratiques vétérinaires. La durée de la procédure d’administration par bolus est de quelques secondes. Celle d’une administration par perfusion intraveineuse peut durer de quelques minutes à plusieurs heures en fonction des spécificités du candidat traitement. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours, en fonction des spécificités du candidat traitement. La fréquence des administrations (exemple : journalière, hebdomadaire) est variable et également adaptée à la spécificité de la substance testée.

Impact sur les animaux

Des effets toxiques majeurs ne sont pas attendus. A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée aux substances évaluées dans ces tests.

Devenir

Mises à part les administrations substances évaluées qui peuvent être effectuées avant le test lui-même, les procédures, qui sont toutes réalisées chez l'animal anesthésié, ne permettent pas un retour à l'état conscient (perte importante de volémie sanguine ou chirurgie).

Remplacement

En amont des tests in vivo, des tests in silico ou in vitro peuvent être envisagés. Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires (permettant ainsi un tri des substances à étudier, et donc réduisant de fait le nombre d'animaux utilisés), ils ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer les pathologies dans un environnement biologique et immunologique intact comme cela est possible chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement par rapport à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison). Les tests statistiques paramétriques (e.g. : Student, Kuruskal, ANOVA...) utilisés seront définis en fonction du design expérimental de chaque étude (nombre de groupes testés). Lorsque celà est possible, des prélèvements sanguins intermédiaires (autre que terminal) peuvent être envisagés sur un même animal, permettant ainsi de générer des données sur la cinétique d'action de la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.

Raffinement

Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de stopper précocement la douleur, la souffrance ou l'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et fréquemment manipulés par des techniciens formés et attentifs. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. A l'exception des traitements lorsqu'ils sont effectués sur animal éveillé, les animaux sont anesthésiés et analgésiés tout au long de la procédure. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes.

Choix des espèces

L’impact de substances pharmacologiques sur la coagulation sanguine chez le rat est prédictif de leur efficacité en clinique. Les procédures utilisées dans ce projet ont été caractérisées de façon extensive dans la littérature scientifique et sont mises en oeuvre à grande échelle au sein des laboratoires de pharmacologie. Principalement rongeurs sevrés, âge variant entre 3 semaines et 6 mois, conformément aux données historiques.

250 otaries à fourrure australes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis relâchées dans leur milieu naturel. Des femelles sauvages sont capturées au filet, anesthésiées, équipées de balises et soumises à des prélèvements de sang, de lait, de poil et de vibrisse, ainsi qu'à des séparations mère-petit, pour étudier l'effet des changements climatiques sur leur écologie. Le porteur décrit un stress de capture, une désorientation au réveil et une gêne possible pour les petits, tout en indiquant qu'aucune perte de lien mère-petit n'a été observée. Il indique qu'il n'est pas possible de remplacer ces espèces sauvages étudiées dans leur habitat.

Objectifs

Ce projet vise à 1) comprendre les effets des changements environnementaux sur l’écologie en mer, le succès reproducteur, et la santé des deux seules espèces d’otaries à fourrure du territoire français, les otaries à fourrure Antarctiques (Arctocephalus gazella – océan austral) et subAntarctiques (Arctocephalus tropicalis – océan indien), et 2) prédire les futurs impacts de scenarios climatiques pressentis sur les individus et les populations. Les océans absorbent 93 pourcents de la chaleur produite en excès par les activités humaines, et connaissent donc des changements importants qui affectent le fonctionnement et la santé des écosystèmes. Les océans polaires sont impactés 2 à 3 fois plus et plus vite que la moyenne mondiale. Il est donc essentiel d’étudier l’impact de ces changements climatiques sur ces écosystèmes et sur les animaux qui y vivent. Les prédateurs supérieurs tout en haut de la chaine alimentaire, tels les otaries à fourrure, sont des espèces considérées comme des sentinelles des changements qui s’opèrent dans leur environnement et des espèces clés de voute pour le maintien des écosystèmes. Elles permettent de comprendre les mécanismes en jeu dans les perturbations observées du fonctionnement de ces écosystèmes. Cependant, les otaries à fourrure sont des espèces particulièrement vulnérables aux conditions environnementales suboptimales, en particulier les femelles pendant la saison de reproduction et les jeunes pendant leur première année de vie (dont la survie dépend directement de la quantité d’énergie que la mère a pu leur fournir pendant l’allaitement) avec une capacité limitée d’adaptation à ces changements climatiques. Ce sont en outre des espèces qui ont été historiquement chassées jusqu’à quasi extinction, et dont la récupération après l’arrêt de la chasse semble ralentir. Par conséquent, ce projet vise à étudier l’écologie en mer des otaries en fonction des conditions climatiques annuelles et leur impact sur leur capacité à survivre et se reproduire avec succès dans une optique de conservation, et s’inscrit dans le contexte de (et complémente les données) d’un observatoire à long terme de l’institut polaire français IPEV sur les changements des populations et des paramètres démographiques de ces espèces (fin non programmée). Ces deux espèces d’otaries évoluent de plus dans des milieux océaniques différents, et nous offrent donc des informations complémentaires sur des écosystèmes marins adjacents.

Bénéfices attendus

Ce projet permet en premier lieu l’amélioration de nos connaissances de la biologie, de l’écologie (par exemple, les mouvements et les capacités de recherche alimentaire pendant les mois d’hiver sont soit inconnus pour les otaries de Kerguelen, soit méconnus pour les otaries d’Amsterdam), de la santé (émergence de nouveaux pathogènes), et des capacités d’adaptations des espèces d’otaries à fourrure australes aux changements qui s’opèrent dans leur environnement. Ces deux espèces d’otaries évoluent dans des océans qui sont affectés différemment et à différentes vitesses par les activités anthropiques et le réchauffement climatique, et elles nous permettent donc d’en comprendre les impacts dans 2 écosystèmes marins différents mais adjacents et interconnectés. Ces informations nous permettent de comprendre les mécanismes en jeux par lesquels les individus et les populations d’otaries sont impactés, et d’en prédire l’évolution en fonction de scenarios climatiques futurs. Ces connaissances nous permettent de comprendre les impacts de ces changements climatiques sur le fonctionnement des écosystèmes marins, dont les otaries sont les sentinelles, dans un but de conservation efficace et robuste de l’environnement, des espèces et de la biodiversité.

Procédures

1. Deux captures et contentions des mères jusqu’à anesthésie, séparées de 7-15 jours en été et 7-8 mois en hiver (10 minutes), 2. Deux anesthésies des mères, séparées de 7-15 jours en été et 7-8 mois en hiver (30-45 min + 5-10 min pour un réveil complet) pour pose ou récupération de balise et pour prélèvements de tissus, 3. Une pose de balise et 1 récupération de balise sur l’animal anesthésié – l’animal porte la balise sur la tête ou le dos de 7-15 jours en été et sur une nageoire 7-8 mois en hiver, 4. Un prélèvement d’1 vibrisse sur l’animal anesthésié, 5. Un prélèvement de poil sur l’animal anesthésié, 6. Un frottis nasal sur l’animal anesthésié, 7. Deux prélèvements de 5ml de lait en l’espace de 7-15 jours en été et 7-8 mois en hiver sur l’animal anesthésié, 8. Deux prélèvements de sang en l’espace de 7-15 jours en été et 7-8 mois en hiver sur l’animal anesthésié, 9. Deux séparations mère-petit espacées de 7-15 jours en été et 7-8 mois en hiver (1h au maximum).

Impact sur les animaux

Les animaux capturés subissent un stress lors de la capture (la taille et la robustesse des otaries à fourrure rend la probabilité de blessures lors de captures au filet extrêmement faible pour l’animal, en 20 ans d’expérience sur 7 espèces d’otaridés différentes et environ 400 captures, il n’y a jamais eu de blessures au-delà d’égratignures sporadiques). Une fois équipées de balises de tête, les femelles qui partent en mer peuvent subir une très légère augmentation de la force de trainée lors de leurs déplacements dans l’eau puisque les balises posées sur la tête changent leur hydrodynamisme naturel. La balise de tête n’étant laissée sur l’animal qu’une courte période de temps, il a été démontré que cela n’a que très peu d’impact sur les femelles à court, moyen et long termes. Les animaux équipés peuvent aussi subir une diminution très localisée de l’isolation thermique pileuse à l’endroit où la balise est collée sur la tête. La perte notable d’hydrodynamisme ou d’isolation thermique n’a pas été démontrée pour la balise posée sur le tag d’identification (beaucoup plus petit, et dont la localisation à la base de la nageoire n’est pas aussi importante en terme d’hydrodynamisme, et ne touche pas le poil ou la peau). La capture des femelles peut engendrer un stress passager de séparation ainsi qu’une perte passagère d’apport calorique pour les petits lors de la capture des mères pour pose de balise et prélèvement de tissu. Cependant, la perte de liens mère-petit n’a jamais été observée chez aucune espèce d’otaries après capture, manipulation et anesthésie, et les réunions se font très rapidement une fois les animaux relâchés. Au sortir de l’anesthésie, les mères peuvent montrer une légère désorientation et/ou ataxie momentanée (de très courte durée, la récupération chez les otaridés étant très rapide 5-10 min après la fin du gaz anesthésiant).

Devenir

Tous les animaux sont immédiatement relâchés dans leur milieu naturel (sur le lieu de capture) dès que les manipulations sont terminées

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les espèces cibles du projet puisqu’il s’agit d’une étude sur les impacts des changements environnementaux sur la biologie et l’écologie des otaries à fourrure sauvages et de leurs populations dans leur habitat naturel.

Réduction

Le nombre maximal d’individus échantillonné par année est un compromis entre le besoin de représentativité des données collectées, étant donnée la variabilité individuelle au sein des populations d’otaries à fourrure sauvage (analyse de puissance statistique sur données précédentes), et la faisabilité des procédures sur le terrain (milieu sauvage austral). De plus, pour réduire l’impact de cette variabilité individuelle (liée au sexe, à l’âge, au stade de cycle de vie et à la saison) et donc l’incertitude dans les modèles statistiques, nous avons choisi de ne travailler que sur des femelles en âge de se reproduire. Dans la mesure du possible, le nombre d’animaux utilisés dans cette étude sera réduit en équipant les mêmes femelles de la balise de nageoire en hiver pendant la procédure de récupération de la balise de tête/dos en été (évite de capturer et anesthésier un animal supplémentaire pour l’équiper d’une balise d’hiver). Le concepteur du projet s’engage à réaliser un suivi de près en terme de faisabilité et de bien-être animal pour maximiser cette réduction d’effectif potentiel. Notre étude repose également sur des mesures en mer répétées dans le temps sur le même individu (mesures prises à intervalles réguliers par les balises enregistreuses), ce qui permet d’utiliser des modèles mixtes, robustes, qui prennent en compte à la fois les effets aléatoires (individus), et fixes (population), et permet de réduire le nombre d’individus utilisés dans la population afin d’obtenir une puissance statistique suffisante. Pour étudier les impacts des changements environnementaux dans les dernières décennies, cette étude réutilisera également les données collectées par le passé au sein de l’équipe sur ces mêmes espèces, ce qui permettra d’augmenter le nombre d’échantillons (et donc le pouvoir analytique des analyses statistiques) via la valorisation de ces études précédentes pour suivi des changements temporels.

Raffinement

Les otaries peuvent être choisies visuellement, et seuls des femelles adultes, en bonne condition corporelle, qui ne sont pas activement en train d’allaiter (pour limiter la gêne aux petits), et de préférence en bordure de colonie (pour limiter la perturbation générale) seront considérés pour capture. La capture, par filet, sera faite le plus rapidement possible par des manipulateurs expérimentés. L’animal capturé sera immédiatement transporté à l'écart vers la station de travail installée dans un endroit suffisamment éloigné pour garantir la sécurité des animaux et des manipulateurs (quelques dizaines de mètres de la colonie, en fonction de la topographie). Il y sera anesthésié le plus rapidement possible, alors qu’il est toujours dans le filet pour diminuer le stress physique et émotionnel de l’animal et garantir sa sécurité et celle des manipulateurs (la pré-anesthésie n’est pas recommandée chez les mammifères plongeurs). Le stress de la manipulation pendant l’induction de l’anesthésie sera limité par une diminution maximale des stimuli auditifs (bruits, paroles etc) et visuels (mouvements brusques). La perception visuelle de l’animal sera diminuée par la présence du filet, qui sera remplacé par un chiffon occultant une fois le filet retiré. La prise de sang et de la vibrisse se fera après avoir appliqué un analgésique local (lidocaïne) pour limiter la douleur. Une fois les procédures effectuées, l’anesthésie gazeuse sera stoppée (30-40 min). L’animal sera transporté (sur une planche) encore anesthésié, dans un endroit proche de la colonie mais assez éloigné de ses congénères pour ne pas les perturber, et ne sera relâché que lorsqu’il sera assez alerte pour éviter les interactions sociales (5-10 min après la fin de l’anesthésie). Il sera libre de retourner à la colonie par lui-même et sera visuellement suivi pendant 30 min pour s’assurer de la bonne récupération, réunion avec son petit, et réinsertion dans la colonie. La récupération de la balise se fait en laissant le socle de colle sur lequel la balise est collée aux poils (rapidement perdu pendant sa mue en février/mars), puisque cela engendre moins de pertes thermiques que de couper le poil. En cas très improbable de blessures ou d’accidents involontaires, toutes les activités seront stoppées immédiatement, et l’animal soigné (désinfectant, colle chirurgicale, etc..) puis relâché en conséquence.

Choix des espèces

A. gazella et A. tropicalis sont des espèces clés pour le maintien des écosystèmes, et sont considérées comme des sentinelles des changements que subit l’écosystème dans lequel elles vivent. Ces otaries vivent dans des milieux marins qui subissent des changements climatiques à différentes échelles (sud de l’océan indien pour A.tropicalis et océan austral pour A. gazella) et nous informent donc sur leur écosystème respectif. De plus, les otaries sont particulièrement vulnérables aux variations environnementales pendant les stades de vie critiques c’est-à-dire les femelles pendant la saison de reproduction et les jeunes pendant leur première année de vie, aux conditions environnementales suboptimales. Elles ont de plus une aire de répartition limitée en été, ont une capacité de plongée limitée, et ont un mode de vie très couteux en énergie, ce qui limite leur capacité d’adaptation aux changements environnementaux dans leur habitat. Ce sont également des espèces qui ont été historiquement chassées jusqu’à quasi extinction, et dont la récupération après l’arrêt de la chasse semble ralentir. Toutes ces caractéristiques en font deux espèces essentielles dans l’étude de impacts des changements environnementaux sur les écosystèmes subpolaires. Tous les animaux utilisés dans cette étude sont des adultes en âge de reproduction (c’est-à-dire plus de 3 ans) avec un petit confirmé. Ce choix est motivé par un effort de minimisation de la variabilité dans les données collectées en ne choisissant qu’une seule tranche d’âge et statut reproducteur au sein des populations. Le poids minimum choisi est de 28 kg, en l’état actuel des balises utilisées, de façon à ce que le poids et surtout la surface des balises sur le corps des otaries n’entrainent qu’une force négligeable de frottement lors de la nage.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles servent à entraîner de nouveaux personnels aux gestes de contention, d'injection intraveineuse et de prélèvement sanguin, ainsi qu'à caler des séquences d'imagerie, avant d'être tuées en fin de semestre pour un apprentissage de l'anatomie. Le projet ne vise pas à produire des connaissances mais à former des manipulateurs et valider des protocoles. Le porteur affirme que la mise en situation réelle reste nécessaire malgré l'existence de simulateurs et de fantômes.

Objectifs

Notre laboratoire a pour activité principale l’imagerie du petit animal qui peut être réalisée après injection de produits radioactifs. Il accueille régulièrement de nouveaux arrivants que nous devons former à notre activité afin que leurs gestes soient maitrisés. Cette maitrise est indispensable pour le bien-être animal mais également à la prévention de tout accident lié à la manipulation de radioactivité. La mise en place de nouvelles séquences d’imagerie peut également requérir des tests à réaliser chez l’animal, ce projet nous permettra de les réaliser. Les objectifs de ce projet sont donc multiples : 1- Permettre aux nouveaux arrivants de maitriser les techniques de manipulation et contention des animaux. 2- Permettre la formation à l’administration de composés en particulier par voie intraveineuse (la maitrise de cette technique étant indispensable pour obtenir une imagerie pertinente scientifiquement, ce qui constitue le cœur de notre activité). 3- Permettre la formation aux prélèvements sanguins qui peuvent être réalisés au cours de nos travaux. 4- Former au déroulé de l’imagerie in vivo (scanner, imagerie nucléaire (après injection d’un traceur radioactif) et IRM) mais surtout mettre en place de nouvelles procédures d’imagerie (en particulier de nouvelles séquence d’IRM).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de former les nouveaux arrivants en particulier au geste délicat de l’injection intraveineuse à la veine de la queue qui doit impérativement être maitrisé pour une bonne pertinence des imageries réalisées dans nos projets. Ce projet permettra également en amont de nouvelles études de valider nos protocoles d’imagerie. Nous pourrons ainsi diminuer le nombre d’animaux résidus utilisés dans nos projets (moins d’animaux supplémentaires à prévoir pour palier à une maîtrise approximative des gestes techniques).

Procédures

les animaux subiront les actes suivant (au maximum 1 acte par semaine): * Préhension / contention : le transfert des souris d’une cage à l’autre ainsi que les techniques de contention de base. Durée : quelques minutes * Administration d’un produit neutre (eau ou sérum physiologique) par différentes voies : intraveineuse, orale, intrapéritonéale et sous-cutanée sous anesthésie lorsque cela est possible. Durée : quelques minutes * prélèvement sanguin sous anesthésie isoflurane. Cette technique ne sera pas répétée plus de 3 fois à une semaine d’intervalle sur chaque animal. Durée : quelques minutes * Test d’imagerie in vivo avec ou sans injection sous anesthésie isoflurane. L’imagerie se déroulera au maximum sur 1h30.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés dans ce projet ne devraient pas être soumis à une quelconque douleur supérieure à celle de la piqure d’une aiguille. L’encadrement strict des manipulations (pas plus d’une manipulation par semaine, pas plus de 3 piqures au même site) ainsi que la supervision par un personnel maitrisant les techniques permettra de s’assurer du bien-être des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de semestre au maximum afin de former à l’anatomie des souris, réaliser des prélèvements d’organes et les suivis sanitaires de notre EU.

Remplacement

Si la plupart des gestes peuvent être expliqués sur « simulateurs » et la plupart des techniques d’imagerie testées sur phantoms (tubes en plastique remplis d’eau), la mise en situation réelle est nécessaire pour valider la maitrise des gestes.

Réduction

La réutilisation des animaux pour plusieurs manipulations permet de réduire le nombre d’animaux total utilisés. L’effectif des animaux utilisés sera réduit à son maximum en fonction du programme d’études du semestre afin de s’adapter aux besoins du laboratoire. Le maximum de n=24 souris par semestre pourra donc être réduit si une souche de souris n’est pas prévue d’être utilisée ou si le nombre de personnes à former est réduit. De plus les animaux utilisés dans ce projet permettront de réduire le nombre d’animaux total utilisés pour nos autres études. En effet, la validation des techniques d’imagerie en amont de nos études ainsi que l’entrainement aux différentes techniques comme l’injection intraveineuse permet de mieux maitriser les risques et ainsi 1) d’éviter de multiplier les études identiques qui pourraient échouer du fait d’un problème de manque de maitrise technique et 2) réduire les animaux en surplus qui pourraient être inclus à nos études du fait d’une maitrise technique insuffisante.

Raffinement

L’imagerie est une méthode non invasive permettant de réduire la douleur à son minimum. En effet les animaux seront placés sous anesthésie sur un lit chauffant et aucune douleur n’est attendue. De plus, la majorité des autres procédures (injection intraveineuse / prélèvements) est réalisée sous anesthésie sur plaque chauffante réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Une attention particulière sera également portée à la phase de réveil post-anesthésie. Enfin, un délai d’une semaine est imposé entre chaque acte réalisé sur l’animal afin d’éviter tout effet cumulatif des procédures et préserver le bien-être animal.

Choix des espèces

Les souris sont les animaux les plus utilisés dans nos domaines de recherche (oncologie, cardiologie et pneumologie). Les rongeurs sont un modèle de choix en imagerie car leurs grandes fonctions physiologiques sont comparables à l’Homme (fonction rénale, hépatique). Les animaux seront commandés à l’âge de 5-6 semaines et seront utilisés jusqu’à l’âge de 7-8 mois (ou lorsque leur taille ne leur permettra plus de les placer dans les lits d’imagerie). L’âge des animaux a été choisi pour que la taille des animaux corresponde à celle utilisée dans nos autres projets et que cette dernière soit compatible avec nos lits d’imagerie (qui ne peuvent accueillir des souris trop grosses) sur toute la période d’hébergement soit 6 mois environ.

80 poissons cichlidés Astatoreochromis vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque poisson est anesthésié et reçoit une injection intrapéritonéale de marqueur, puis est conservé un temps variable avant d'être tué par surdose d'anesthésique pour prélever ses mâchoires. Le projet mesure la durée du cycle de remplacement des dents pharyngiennes de cette espèce. Le porteur indique que des approches numériques existent mais restent limitées aux mammifères, et affirme devoir poursuivre des études in vivo pour développer un modèle adapté.

Objectifs

Le but du projet est de déterminer la durée du cyle de remplacement des dents pharyngiennes chez le cichlidé Astatoreochromis afin de mieux comprendre la plasticité dentaire et élaborer des modèles de plasticité dentaire. En moins de 200 000 ans, une grande variété de morphologies dentaires s’est mise en place chez les espèces cichlidés des grands lacs africains à la suite de radiations adaptatives parallèles. L’Astatoreochromis alluaudi est une espèce de cichlidé du lac Victoria et des cours d’eau environnant ; malachophage non obligatoire il possède un profil alimentaire varié. Sa mâchoire pharyngienne inférieure est particulièrement plastique et change en fonction de son alimentation. En particulier, une modification du régime alimentaire provoque des changements morphologiques au niveau des dents pharyngiennes. Cette espèce est la seule à avoir fait l'objet de plusieurs études expérimentales qui ont permis de documenter ce phénomène. De ce fait, l'Astatoreochromis alluaudi est une espèce absolument unique pour la réalisation de ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet aura des implications importantes pour notre compréhension du rôle du développement dans la dynamique des radiations évolutives post-crises. Il permettra également de mieux exploiter les fossiles d'espèces qui ont vécu au moment de la transition Permien-Trias qui représente un des épisodes majeurs d'extinction massive d'espèces et de mettre en évidence certains des mécanismes sous-jacent aux phénomènes d'extinctions massives tel que nous vivons actuellement.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés individuellement par balnéation et recevront une unique injection intrapéritonéale. L'intervention durera une dizaine de minutes en incluant l'anesthésie, l'injection et le reveil. Les animaux seront ensuite conservés pour des durées variables puis mis à mort par surdose d'anesthésique en balnéation afin de prélever leurs machoires pour analyse.

Impact sur les animaux

Faibles. Le projet implique de réaliser, en début de protocole, des injections péritonéales qui peuvent présenter dans de rares cas des séquelles. Une vigilance particulière sera donc apportée lors de la récupération des animaux après ces injections. Pour le reste du projet, les animaux sont conservés en groupe sociaux et nourris suivant un régime alimentaire équivalent à celui qu'ils adoptent dans le milieu naturel.

Devenir

L'analyse de la forme des dents nécessite de prélever les mâchoires des animaux et de réaliser des coupes qui seront analysées au microscope. Ceci nécessite donc la mise à mort de l'ensemble des animaux utilisés dans le projet.

Remplacement

Des approches in silico existent pour l'étude de la topologie dentaire malheureusement elles ne sont adaptées qu'aux mammifères. Nous souhaitons développer des modèles numériques équivalent mais qui soient adaptés aux espèces que nous étudions. Pour développer ces modèles, il est nécessaire de poursuivre des études in vivo pour fournir les données nécessaires à leur élaboration. Une fois établis, ces modèles pourront être utiliser pour étudier la topologie dentaire d'autres espèces de vertébrés.

Réduction

L’organisation du projet en 3 procédures distinctes permet de réduire le nombre d’animaux utilisés sur l’ensemble du projet. La première procédure permet de définir avec précision la dose de calcéine nécessaire à un marquage efficace. La seconde procédure permet d'évaluer la durée du cycle de remplacement dentaire avec un pas de temps important (2 semaines). Elle permet de fournir une durée approximative du cycle qui sera utilisée dans la troisième procédure pour évaluer avec une meilleure précision la durée du cycle (précision à 2 jours). Cette organisation permet de limiter le nombre d'animaux utilisés à 80 (20 pour la première procédure et 30 chaque pour les deux suivantes). Un approche statisitique sera utilisée pour mettre en évidence d'éventuelles différences de longueur de cycle entre les dents positionnées au centre et celles positionnées en périphérie de la machoire.

Raffinement

La dose minimale nécessaire au marquage des dents va être déterminée dans la première partie du protocole et sera utilisé dans le reste de l'étude. L'injection intra-péritonéale en début de protocole sera réalisés sous anesthésie et les poissons seront placés dans des bacs de réveil et surveillé lors de leur sortie d'anesthésie. Par ailleurs, les Astatoreochromis sont maintenus en groupes sociaux dans des bacs qui leur permettent d'exprimer leurs comportements naturels. Afin de favoriser le bien-être des animaux, les aquariums disposent d'un substrat (sable) qui permettent aux animaux d'exprimer leur comportement fouisseur. De même, afin de limiter les possibilités d'agression par les individus dominants de nombreuses cachettes (gouttières renversées, pots en terre) sont mises à disposition des animaux. Ils disposent d'une alimentation variée proche de celle de leur milieu naturel. Les animaux sont observés quotidiennement et les animaux malades ou stressés sont isolés et placés dans un environnement différent. Après l'injection péritonéale, les animaux seront placés dans des bacs d'observation durant 24h pour détecter tout signe d'inflammation au site de l'injection. Les signes de déséquilibres homéostatiques seront observés après l'injection(hydropisie, écailles hérissées), ainsi que les signes pouvant indiquer une atteinte de la vessie natatoire (flottabilité positive ou négative). Les animaux présentant des signes d'inflammation ou d'atteinte à la vessie natatoire seront mis à mort par une surdose d'anesthésique en balnéation (Tricaine 0,2 % tamponnée à pH 7).

Choix des espèces

En moins de 200 000 ans, une grande variété de morphologies dentaires s’est mise en place chez les espèces cichlidés des grands lacs africains à la suite de radiations adaptatives parallèles. L’Astatoreochromis alluaudi est une espèce de cichlidé du lac Victoria et des cours d’eau environnant ; malachophage non obligatoire il possède un profil alimentaire varié. Sa mâchoire pharyngienne inférieure est particulièrement plastique et change en fonction de son alimentation. En particulier, une modification du régime alimentaire provoque des changements morphologiques au niveau des dents pharyngiennes. Cette espèce est la seule à avoir fait l'objet de plusieurs études expérimentales qui ont permis de documenter ce phénomène. De ce fait, l'Astatoreochromis alluaudi est une espèce absolument unique pour la réalisation de ce projet. Les animaux utilisés seront des juvéniles de moins d'un an.

600 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. On leur injecte dans un œil, puis dans l'autre une semaine plus tard, une solution salée concentrée qui fait monter la pression intraoculaire pendant près de quatre heures, pour tester des molécules candidates contre le glaucome. Le porteur mesure la pression au tonomètre et pose un cathéter dans l'artère de l'oreille pour des prises de sang, et affirme que la hausse de pression 'ne devrait pas' provoquer de douleur. Il décrit l'œil du lapin comme le 'modèle de référence' et conclut qu'aucune méthode in vitro ne peut le remplacer.

Objectifs

L'objectif du projet est de tester chez le lapin les effets de nos molécules sur une hypertension intraoculaire transitoire provoquée par une injection dans l'oeil d'une solution saline hypertonique.

Bénéfices attendus

La cause principale du glaucome (diminution irréversible du champ visuel, 2ème cause de cécité) est une augmentation de la pression intraoculaire à l’origine de la destruction des cellules du nerf optique. Les traitements existants (bêta-bloquants, analogues des prostaglandines…) ont une efficacité limitée et peuvent présenter des effets indésirables. Ainsi, le bénéfice attendu de ce projet est le développement d’une nouvelle classe thérapeutique pour traiter le glaucome qui touche plus de 800 000 personnes en France.

Procédures

Les lapins vont recevoir sous anesthésie locale une injection d'une solution saline concentrée dans un seul oeil qui va être à l'origine d'une augmentation de la pression dans le globe oculaire. Cette augmentation de pression intraoculaire va durer moins de 4 heures. Plusieurs mesures de la pression intraoculaire à l'aide d'un tonomètre vétérinaire vont être effectuées : 5 avant l'injection et 6 durant les 4 heures suivant l'injection. Ces mesures sont non invasives et indolores. Le lapin recevra avant l'injection intraoculaire une administration (par gavage, par application locale sous forme de collyre, par injection intrapéritonéale) des molécules à tester. Après une semaine de récupération, une autre session pourra être réalisée en utilisant le 2ème oeil. Des prélèvements sanguins pourront être effectués à des fins de pharmacocinétique. Un cathéter sera mis en place au niveau de l'artère centrale de l'oreille. Sur une durée de 24 heures maximum, pas plus de 8 prélèvements de 1 mL seront effectués.

Impact sur les animaux

Deux effets indésirables principaux sont attendus sur les animaux : -Le stress lié à la contention et à la réalisation des mesures de pression intraoculaire (geste non invasif et non douloureux) : pour limiter cet effet, les animaux auront une période d’habituation à la préhension, manipulation des yeux et des mesures de pression -L’augmentation de la pression intraoculaire : selon la technique utilisée, l’augmentation de la pression devrait être modérée (aux alentours de 40 mmHg) et ne devrait pas générer de douleur. Cependant, nous avons mis en place un protocole de suivi et d’identification de points limites permettant de mettre en place un traitement en cas d’apparition de douleurs ou d'anomalies oculaires.

Devenir

Après que chaque œil a fait l’objet d’une injection intraoculaire de solution saline hypertonique, les animaux sont mis à mort. En effet la procédure ne peut pas être répétée plusieurs fois sur un même œil. De plus au sein du laboratoire ces lapins ne peuvent être réutilisés pour d’autres procédures.

Remplacement

L'oeil du lapin par sa physiologie et sa taille proche de celle de l'oeil humain est le modèle de référence pour étudier les propriétés de nouvelles molécules sur la pression intraoculaire. Cette taille de l'oeil permet une injection intravitréenne reproductible et facilite également la mesure de la pression intraoculaire à l'aide de tonomètres vétérinaires. De plus il n’existe pas actuellement de méthode alternative.

Réduction

L'amplitude et variabilité des réponses obtenues sur le(s) paramètre(s) d'intérêt selon des résultats précédemment publiés indiquent un effectif compris entre 5 et 8 lapins par groupe expérimental comme étant raisonnable et suffisant pour effectuer une analyse statistique pertinente des données. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, l'expérimentation sera réalisée sur un oeil puis sur l'autre oeil du même lapin à une semaine d'intervalle.

Raffinement

Les animaux sont hébergés individuellement à leur arrivée jusqu’au jour de l'expérimentation. Pour le bien-être des animaux et limiter le stress inhérent à cette espèce, nous veillons à mettre à disposition dans les cages d’hébergement une balle en plastique, une buchette à ronger et une hutte en polycarbonate rouge dans laquelle le lapin peut venir se réfugier s’il ressent le besoin de s’isoler. Du foin est mis à disposition de manière journalière ce qui permet de créer un contact régulier avec le lapin et de le familiariser avec l'expérimentateur. Sans traitement particulier, les animaux ne doivent pas présenter de signes de douleur à ce stade expérimental. Toutefois, le personnel zootechnicien est sensibilisé pour communiquer directement à l’expérimentateur tout comportement « suspect » d’un animal anxieux, soit observé durant la période d’acclimatation (un animal qui tape systématiquement fortement du pied lors d’une entrée dans la pièce ou lorsque l’on s’approche près de sa cage), soit le jour même de l’expérimentation au moment de sa manipulation pour la sortie (comportement excessif de fuite, vocalisation…). Une semaine avant l'injection intravitréenne, des mesures journalières de pression intraoculaire à l'aide d'un tonomètre seront effectuées afin de familiariser l'animal avec le dispositif et l'expérimentateur. Les mesures de la pression intraoculaire sont effectuées à l'aide d'un tonomètre "à rebond" qui n'engendre aucune souffrance chez l'animal. Chaque mesure de la pression intraoculaire sera associée à une récompense (friandise "mini treats" goût fruité, Plexx, Hollande). La souffrance liée à l'injection intravitréenne d'une solution saline hypertonique va être limitée par l'administration sous forme de gouttes d'un anesthésique local chez un lapin au préalable sédaté.

Choix des espèces

Les modèles in vitro modélisant la chambre oculaire et la physiopathologie des hypertensions oculaires ne permettent pas de tester les efficacités des molécules thérapeutiques. L'oeil du lapin par sa physiologie et sa taille proche de celle de l'oeil humain est le modèle de référence pour étudier les propriétés de molécules sur la pression intraoculaire. Cette taille de l'oeil permet une injection intravitréenne reproductible et facilite également la mesure de la pression intraoculaire à l'aide de tonomètres vétérinaires. L'expérimentation sera réalisée sur des lapins adultes. Le glaucome est une pathologie apparaissant avec l'âge, il n'y a aucune raison de travailler sur des individus en cours de développement.

70 poulets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, dix tués à l'issue pour distribuer leurs tissus et soixante gardés vivants comme reproducteurs. Dès le lendemain de leur naissance, une puce télémétrique leur est implantée sous anesthésie, à différents emplacements testés, pour mesurer leur température à distance et la comparer à la mesure rectale. Le porteur signale que l'implant peut provoquer une inflammation locale, des infections et des coups de bec entre animaux sur la zone d'implantation. Il présente la mesure à distance comme plus 'éthique' que la voie rectale, et affirme qu'aucune méthode hors animal vivant ne permet ce suivi.

Objectifs

Dans les études physiopathologiques chez les animaux, le premier signe clinique mesurable est la température. Afin de bien connaitre ce paramètre en fonction de l'espèce animale, il est nécessaire de collecter des données zootechniques sur des sujets sains pendant une longue période. Chez la volaille, les données sont manquantes. Le premier objectif du projet sera de définir la meilleure zone d’implantation d’une puce télémétrique chez le poulet, parmi plusieurs zones préselectionnées. Ces mêmes puces sont déjà utilisées chez les rongeurs et ce système s’est avéré efficace pour suivre la température corporelle. Le second objectif sera d’obtenir un nombre conséquent de mesures qui valideront l’utilisation de ce système en expérimentation. En expérimentation, cela permettra d’augmenter le nombre de données chez les volailles, en ajoutant la température, paramètre peu exploiter aujourd’hui.

Bénéfices attendus

Il est attendu du projet qu’une zone d’implantation de puce télémétrique soit sélectionnée ce qui permettrait de disposer d'un moyen d'obtenir des mesures fiables de la température corporelle des poules au cours du temps. L’injection induira une légére douleur locale et la puce ne causerait pas de gêne importante à l’animal. Ainsi, il est attendu que les animaux soient moins importunés par cette méthode (mesure de température à distance) comparativement aux mesures rectales, ce qui serait plus éthique.

Procédures

L’anesthésie de l’animal et la pose d’une puce télémétrique sera effectuée une fois et durera environ 5 minutes. Après cela, seule une mesure de la température avec le matérial adéquat sera effectuée. La mesure rectale de température est la référence et la zone d'implantation retenue sera dépendante de la pré-expérimentation (en sous-cutanée ailaire, en intra-péritonéal (dans la cavité thoraco-abdominale) et en intramusculaire au niveau du bréchet. L’animal pourra être maintenu en place s’il bouge trop pour que la mesure puisse être effectué, mais n’aura pas besoin d’être soumis à une contention.

Impact sur les animaux

Il est possible que les animaux ressentent une gêne au niveau de la zone d’implantation de la puce télémétrique (légère inflammation) et se « piquent » entre eux (c’est-à-dire se donnent des coups de becs), par exemple s’ils remarquent la zone d’implantation de la puce sur un autre animal dans les 24-48h. Une infection au niveau du site d’implatation pourrait éventuellement être observée.

Devenir

Les 10 poussins de l'étude pilotes seront euthanasiés et les tissus distribués et optimisés par la communauté scientifique. Les 60 autres poussins de l'étude seront gardés en vie et introduit au sain de l'élevage pour faire de futurs reproducteurs.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les animaux car la mesure de température d’une autre manière qu’in vivo est impossible. Nous avons besoin d’animaux vivants pour évaluer s’il est possible de mesurer la température au cours du temps. Ces puces ont été utlisées avec succès sur modèle rongeur.

Réduction

Une étude pilote est réalisée sur 10 animaux pour choisir le meilleur emplacement de la puce télémétrique et limiter le nombre de possibilités de localisation pour la seconde partie du projet. Pour cette seconde partie, le nombre d’animaux utilisés (60 animaux) pour obtenir un nombre de mâles et femelles est basé sur l’expérience des animaliers et la littérature. Pas d’analyses statistiques sur l’étude pilote, car l’un des objectifs est de valider le positionnement de la puce chez le poussin. Cependant, les données obtenues sur cette étude pilote pourront rentrer dans la banque de données télémétriques obtenues dans la seconde étude. Il pourrait être envisagé, sur la seconde étude, en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des utilisateurs, de faire une étude statistique simple basée sur un test non paramétrique pour déterminer un éventuel effet sexe.

Raffinement

Pour l’étude pilote, comme il n’y a pas de restriction concernant leur statut sanitaire, les poussins seront hébergés au sol sur paille dans des conditions environnementales contrôlées, et disposeront d’un enrichissement social et comportemental (petites rondelles en inox suspendues ce qui permet aux animaux de piquer, de se percher). Pour la seconde étude en élevage à statut sanitaire EOPS (Exempt d’organismes pathogènes spécifiés), les animaux seront hébergés hors-sol en cage dans des conditions environnementales contrôlées, chauffées, avec un accès à un perchoir, un nid, de la paille broyée.

Choix des espèces

Trop peu de données zootechniques sur la température chez les volailles saines comme malades sont recensées alors que pourtant, la température est un paramètre important en expérimentation animale dans le cadre des modèles infectieux. Utiliser ces puces télémétriques en expérimentation animale permettrait à la fois d’identifier les animaux et d’obtenir des données pertinentes pour les études, tout en raffinant nos pratiques. Les puces seront implantées 1 jour après la naissance. En expérimentation animale pour l’étude des maladies infectieuses aviaires, il est fréquent que les protocoles commencent à la naissance (1 jour) et ne dépassent pas 35 jours d’âge. Ce choix a été effectué pour se rapprocher le plus possible des conditions expérimentales.

20 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis gardées vivantes pour de futures expériences. Ces souris porteuses d'une mutation sont placées dans des cages métaboliques pendant vingt-quatre heures pour recueillir leur urine, puis maintenues dans des tubes de contention sous une lampe chauffante pour mesurer leur pression artérielle, une méthode présentée comme non invasive. Le projet cherche à savoir si la mutation d'une protéine des vaisseaux perturbe le rein, dans l'optique de la néphropathie diabétique. Le porteur affirme que des organoïdes ne permettraient pas d'observer les effets de la mutation en conditions physiologiques.

Objectifs

Les cellules endothéliales tapissent les vaisseaux sanguins. Elles sont essentielles pour permettre le maintien et la formation des vaisseaux sanguins. Pour cela elles doivent être jointives entre elles grâce à une protéine : la VE cadhérine. Les cellules endothéliales sont par conséquent indispensables pour le bon fonctionnement des organes richement vascularisées comme le rein. De nombreuses études ont démontré que la dysfonction endothéliale était un marqueur pronostique validé pour la survenue des pathologies comme les néphropathies Les néphropathies sont des affections rénales qui touchent plusieurs millions de personnes dans le monde. Elles peuvent être causées par des troubles fonctionnels tels que le diabète, l’hypertension ou à des défauts de la filtration. Notre équipe a démontré qu’une mutation dans une protéine d’adhésion des cellules endothéliales pourrait être une cible potentielle pour la néphropathie diabétique. Comment cette mutation peut jouer un rôle dans ces pathologies ? Nous voulons déterminer si cette mutation affecte les effets physiologiques du rein.Nous allons donc déterminer si la composition de l’urine et si la pression artérielle sont anormales chez les souris mutées, signe de la néphropathie diabétique.

Bénéfices attendus

Suite à ce projet, nous pourrons valider ou non si la proteine d'intérêt exprimée par les cellules endothéliales pourrait être une nouvelle cible thérapeutique pour traiter les néphropathies.

Procédures

20 souris seront mises dans les cages métaboliques, collecte de l’urine au bout de 24h pour étudier le fonctionnement rénal. Expérience répétée 3 fois. Ces 20 souris seront utilisées pour la mesure de la pression artérielle. Ces 20 souris placées dans des tubes de contention pendant la mesure de la pression sous une lampe chauffante. Méthode non invasive. Expérience répétée 1 fois par jour à la même heure pendant 15 jours (week-end inclus) 30 minutes par souris.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux pourraient être essentiellement lié au stress que pourrait générer l’acclimatation des animaux aux cages métaboliques ou aux tubes de contention pour la mesure de la pression artérielle.

Devenir

Les souris participant à la pression artérielle ou l’analyse de l’urine via les cages métaboliques seront gardées vivantes après l’expérience pour de futures expériences

Remplacement

L’utilisation de ce modèle est requis pour voir les effets de la mutation in vivo au niveau fonctionnel et phénotypique des organes L’utilisation d’organoïdes ne nous permettrait pas de voir les effets de la mutation en condition physiologique et pathologique.

Réduction

Les groupes ont été calculés pour faire les validations statistiques nécessaires pour répondre à l'objectif scientfique du projet.

Raffinement

Pour l’étude du fonctionnement rénal, les souris seront placées dans des cages métaboliques pendant 24h. Les cages métaboliques sont des cages conçus pour récupérer le fèces et l’urine de la souris sans interférer dans la vie de l’animal notamment dans l’accès à l’eau et la nourriture. Pour réduire leur stress, les souris seront entrainées pendant une semaine à être placées dans ces cages une fois par jour pendant 30 minutes. L’expérience sera répétée trois fois avec un intervalle de trois jours pour laisser les souris récupérer. Pour la prise de la pression artérielle, les souris seront également entrainées à être placées dans les tubes de contention sous une lampe chauffante avec la mise en place du brassard pour la prise de mesure pendant une semaine chaque jour pendant 40 minutes. L’expérience sera répétée une fois par jour pendant 15 jours pour diminuer la variabilité entre les mesures sur une même souris. La prise de la mesure durera 30 minutes par souris. Toutes les souris impliquées dans les procédures classées légères, seront surveillées avant, pendant et après les expériences. Les signes de douleurs seront évalués par une grille de score.

Choix des espèces

Nous avons choisi un modèle murin porteur de la mutation sur la protéine d'intérêt pour nous permettre d’étudier les impacts de cette mutation sur le fonctionnement du rein et sur la pression artérielle. les souris seront âgées de 8-12 semaines car c’est à cet âge-là que des dysfonctionnements du rein ont été observés. Les souris utilisées pour ces procédures seront des souris âgées de 8-12 semaines car c’est à cet âge-là que des modifications rénales ont été observées par nos collaborateurs.

1 650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. On leur provoque une uvéite ou une inflammation sous la rétine par injections et photocoagulation au laser sous anesthésie, avec un suivi par imagerie de l'œil, pour étudier deux récepteurs immunitaires dans la DMLA et l'uvéite. Le porteur qualifie l'atteinte visuelle de légère au motif que la vision ne serait pas 'indispensable à la souris pour se déplacer'. Il affirme que ces mécanismes d'inflammation ne peuvent être étudiés que dans un 'organisme entier'.

Objectifs

La dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) est une maladie de la rétine provoquée par une dégénérescence progressive de la macula, partie centrale de la rétine. Il existe deux formes de DMLA : atrophique et exsudative. Les traitements existants permettent seulement de ralentir l’évolution de la formation et la croissance de nouveaux vaisseaux et donc uniquement la forme humide de la pathologie alors qu’aucun traitement n’est disponible pour la forme sèche de la DMLA. Les uvéites sont des maladies inflammatoires oculaires d’étiologie diverse, principalement auto-immune, pouvant être très invalidantes voire cécitantes, généralement traitées par des corticoïdes responsables de nombreux effets secondaires au long cours. Les causes précises de ces maladies ne sont pas connues et les mécanismes peu compris. Cependant, dans ces 2 pathologies, un processus inflammatoire est présent, caractérisé par l’infiltration et l’accumulation de cellules inflammatoires participant de manière importante à la dégénérescence de la rétine. Notre projet vise à étudier le rôle de 2 récepteurs surexprimés sur les macrophages activés qui infiltrent la rétine au cours de ces pathologies oculaires : les « paired Ig-like receptors » PIR-A et PIR-B.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d'évaluer le rôle des récepteurs PIR-A et PIR-B comme potentiels cibles thérapeutiques chez l’Homme dans le traitement de l’inflammation liée à l’infiltration et l’accumulation de cellules inflammatoires participant de manière importante à la dégénérescence de la rétine.

Procédures

Les animaux utilisés dans ce projet seront soumis aux interventions suivantes afin modéliser une uvéite expérimentale ou une inflammation sous-rétinienne. Toutes les injections (1 injection par animal) sont rapides (moins d’une minute). La photocoagulation laser dure moins de 5 minutes par animal sous anesthésie générale. Les nuisances attendues sont celles de l’introduction d’une aiguille pour les injections (qui sont réalisées sous anesthésie, il n’y a donc pas de douleur attendue). Le suivi de l’évolution de l’inflammation est réalisé sous anesthésie générale par des actes non invasifs (donc pas de douleur ou de détresse) : imagerie rétinienne (fond d’œil – 5 min - quotidiennement 5 fois par semaine pendant 3 semaines, soit 15 examens au maximum) et OCT (tomographie en cohérence optique – 5 min - 1 fois par semaine pendant 3 semaines, soit un maximum de 3 examens par animal). Tous les prélèvements se feront suite à l’euthanasie de l’animal par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Il n’y a pas de procédure chirurgicale engagée dans ce projet. La totalité des procédures sont de gravité légère. Les modèles expérimentaux n’entraînent seulement qu’un phénotype léger : nuisance visuelle mais vision non indispensable à la souris pour se déplacer. Aucune douleur perceptible n’est à prévoir. Les nuisances attendues sont celles de l’introduction d’une aiguille pour les injections (qui sont réalisées sous anesthésie).

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et que cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

Les études in vitro sur les animaux invertébrés ne permettent pas l’études des signes cliniques de la pathologie de l’œil en particulier ; la souris est donc une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude. Dans nos études nous nous intéressons aux mécanismes d’inflammation sous-rétinienne qui impliquent l’interaction de nombreux types cellulaires qui ne peut être étudié qu’au sein d’un organisme entier et ne peut pas être reproduit en utilisant des cultures de cellules isolées provenant de différents tissus.

Réduction

Les souris PIRA et PIRB KO seront étudiées en comparaison avec des souris sauvages dans des modèles d’inflammation sous-rétinienne. Nous devons induire plusieurs expériences (5 expériences/groupe expérimental) en raison de la grande variabilité dans le développement de la pathologie entre les souris d'un même lot (sévérité de l’inflammation plus ou moins importante). Nous avons limité au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables au regard de nos précédentes expériences d’autres projets de recherche (variabilité inter- animal/ inter - expériences). Le nombre de 10 animaux défini par groupe est le minimum requis pour l'application de tests statistiques de significativité fiables et l'obtention de résultats interprétables et fiables.

Raffinement

Les animaux auront une période d'acclimatation de 5 jours avant expérimentation et seront hébergés en groupe de 5 dans des cages ventilées avec enrichissement, alimentation et abreuvement à volonté. Si nécessaire et en cas d'agressivité des mâles, les animaux seront séparés. Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la règlementation. Pour éviter toute souffrance ou détresse animale, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale lorsque nécessaire. Nous avons fixé des points limites appropriés au-delà desquels des mesures sont prises pour minimiser ou arrêter le processus faisant souffrir ou stresser l’animal. Tout signe d’inconfort, de détresse, ou de comportement anormal fera l’objet d’une surveillance accrue et d’un isolement en cas de besoin. Les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale lors de chaque manipulation, un gel ophtalmologique sera appliqué sur les yeux des animaux pour éviter l’assèchement de la cornée durant les anesthésies.

Choix des espèces

Les souris sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour la l’inflammation liée à l‘accumulation de cellules immunitaires dans l’espace sous-rétinien. La souris est un animal petit, facilement manipulable, qui se reproduit bien. En outre, l’étude des mécanismes physiopathologiques conduisant à la dégénérescence rétinienne sur la souris a été validée par de nombreuses publications, et ce modèle offre l’avantage de multiples options pour les analyses. De plus, notre projet nécessite l'utilisation de souris car c'est l'espèce dans laquelle a été développée les modèles PIRA et PIRB. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines minimum à leur entrée dans la procédure expérimentale, âge à partir duquel le système immunitaire et vasculaire de la souris est mature et donc à partir duquel l’animal est susceptible de développer la maladie.