Procédures légères

68 lapins vont être utilisés puis proposés à l'adoption, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent des injections dans les deux genoux puis jusqu'à neuf séances d'IRM sous anesthésie répétée, pour évaluer la durée de présence d'un produit contre l'arthrose. Le porteur indique que la répétition des anesthésies constitue la principale nuisance et affirme une bonne tolérance du produit, testée au préalable. Il précise qu'aucun prélèvement terminal n'est prévu et que tous les animaux devraient être adoptés, sous réserve d'autorisation, l'étude servant le développement commercial d'un produit.

Objectifs

Ce projet de recherche et de développement a pour objectif d’évaluer au cours du temps la rémanence d’un produit administré au niveau de la région synoviale articulaire du genou chez le lapin par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM). La rémanence se définit par un maintien dans le temps des effets d’une action ou d’un phénomène. Dans le cadre de notre projet, l’objectif est d’évaluer le maintien dans le temps de produits à action prolongée injectés en intra articulaire dans le traitement de l’arthrose et cela grâce à une quantification du volume de produit présent dans l’articulation à des temps définis. D’après l’organisation mondiale de la santé, l’arthrose est l’une des dix maladies les plus invalidantes dans les pays développés. A l’échelle mondiale, environ 10% des hommes et environ 20% des femmes âgés de 60 ans en souffrent. Dans les prochaines décennies, le vieillissement de la population, couplé à des facteurs de risques tels que l’obésité, laisse suggérer que le nombre de personnes atteintes d’arthrose va continuer d’augmenter. Cette pathologie, d'étiologie plurifactorielle, est caractérisée par la présence de lésions du cartilage associée à des anomalies pathologiques diverses au niveau des articulations. Il n'existe pas, à l'heure actuelle, de traitement médicamenteux permettant de régénérer le cartilage, les produits sur le marché ne permettant que de soulager et retarder l’avancée de la maladie avant une éventuelle chirurgie (prothèse). Ainsi, l’étude de produit innovant, notamment à base d’Acide Hyaluronique (HA), permettant notamment de restaurer les propriétés viscoélastiques du liquide synovial, la capacité d’absorption des chocs et de lubrification de la région synovial est donc un enjeu majeur. Le devenir des animaux dépendra des procédures réalisées durant l’étude. Les animaux qui n’auront subi aucuns prélèvements terminaux (prélèvements d’organes ou prélèvements de sang trop important pour le rétablissement des animaux) et dont le certificat sanitaire le permet pourront être placés sous réserve de trouver des adoptants pouvant leur offrir une retraite dans le respect du bien-être animal.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera au développement et à la mise sur le marché de nouveaux produits contre l’arthrose, avec notamment une meilleure rémanence des produits.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés (induction en fixe puis relais en volatile) et intubés pour les injections intra articulaire (sous condition stérile) puis pour chaque session d’imagerie selon la durée totale de l’étude et le nombre de délai d’imagerie applicable. Un total de 10 interventions seront prévues au maximum (injection, puis 9 délais d'imagerie avec une première session 24h à 48h après, puis 7 jours de délai au minimum entre chaque session suivante d'imagerie).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sur les lapins seront essentiellement dus à la répétition des anesthésies réalisées premièrement par une injection intramusculaire puis l’animal sera maintenu sous anesthésie gazeuse par intubation. Cette procédure d’anesthésie sera régulière selon la durée totale de l’étude et le nombre d’IRM applicables, espacées de 24h minimum entre chaque temps par animal. Aucune nuisance ou effet indésirable de l’injection intra-articulaire n’est attendu étant donné que la tolérance du produit aura été testé au préalable et qu’il aura été démontré une bonne tolérance du/des produits injectés. Cependant, le transport jusqu'au lieu de réalisation des examens d’imagerie pourrait induire également un stress.

Devenir

Le devenir des animaux dépendra des procédures réalisées durant l’étude. Les animaux qui n’auront subi aucuns prélèvements terminaux (prélèvements d’organes ou prélèvements de sang trop important pour le rétablissement des animaux), dont le certificat sanitaire le permet et sous réverse d’une autorisation par les autorités réglementaires, pourront être placés chez des adoptants qui leur fourniront une retraite dans le respect du bien-être animal. Il est prévu à ce jour de faire adopter tous les animaux, aucun prélèvement terminaux n’étant prévus.

Remplacement

Afin de répondre aux objectifs de ce projet, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable le comportement de produits injectés dans un organisme entier vivant. Ce comportement dépend de très nombreux facteurs tels que la zone d’injection, les tissus environnants, l’activité de l’animal… L'articulation du genou étant une zone très spécifique (mouvements, isolement du reste de l'organisme, ...), les méthodes in vitro ou in silico ne permettent pas à ce jour à mimer de manière fiable le comportement d'un produit injecté dans cette zone sur le long terme.

Réduction

Une étude pilote permettant de valider la bonne visualisation et la bonne quantification par imagerie des produits injectés à 24h et 48h post injection sera réalisée sur 4 animaux. Si le produit candidat n’est pas visible ni quantifiable à ces temps courts post injection, la/les étude(s) principale(s) ne seront pas réalisées. La tolérance du produit a déjà été testée préalablement in vitro/in vivo. Ainsi, les 2 genoux seront injectés. L’injection dans les 2 genoux de chaque lapin permet d’administrer 2 traitements différents par animal, ce qui permet d’optimiser l’utilisation des animaux et ainsi réduire leur nombre nécessaire pour atteindre des données scientifiques robustes (nombre de lapins réduits à son strict nécessaire pour avoir 8 genoux par groupe soit 12 lapins). Avec 8 genoux comparables par groupe, une approche statistique est prévue : si un test paramétrique peut être utilisé, un test t de Student sera utilisé pour comparer 2 groupes et une Anova avec test de Dunett sera utilisé pour comparer un groupe versus un groupe contrôle ou test de Newman-Keuls pour comparer des groupes entre eux 2 à 2. Si un test non paramétrique doit être utilisé, un test de Wilcoxon sera utilisé pour comparer 2 groupes et un test de Kruskall-Wallis sera utilisé pour comparer n groupes versus un groupe contrôle et un test de Friedman pour comparer n groupes entre eux 2 à 2.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 4 jours minimum sera respectée. Toutefois, une période d’acclimatation de 7 jours sera privilégiés dès que cela sera possible. Les animaux seront hébergés en groupe tout au long du projet avec des enrichissements appropriés à leur besoin (balles, abris, bois à ronger, …). L’injection du produit stérile par voie intra articulaire ainsi que tous les actes techniques nécessitant une contention importante seront réalisés sous anesthésie induite en IM puis maintenue par voie volatile, afin d’éviter tout stress aux animaux. Les sites d’injection seront suivis à minima pendant 8 jours après administration intra articulaire. Tout au long de l’étude, un suivi clinique quotidien sera réalisé. Le poids des animaux et un suivi clinique avec grille de scoring seront réalisés minimum 1 fois par semaine. Tout signe clinique d’appel (voir §4, grille de scoring) sera remonté au vétérinaire, si l’animal présente des douleurs ou un inconfort, le vétérinaire pourra prescrire un antalgique (exemple : meloxicam à 0.4mg/kg). Enfin, tout examen clinique complet témoignant d’un état de santé considérablement dégradé de l’animal et sans possible rétablissement conduira à une euthanasie étique des animaux concernés. Le projet se déroulant sur deux établissements utilisateurs, des transports sont prévu entre les deux établissements. La température sera adaptée et suivie (environ 20°C, avec sonde de température) et les cages de transports seront suffisamment grandes pour assurer le bien-être des animaux pendant le trajet. De la nourriture et de l'eau pourront être mis à disposition à l'arrivée des animaux et une période de calme sera respectée à l'arrivée avant tout anesthésie afin de limiter au maximum le stress.

Choix des espèces

Le lapin est une espèce couramment utilisée comme modèle pour les pathologies de l’arthrose et du genou. En effet, la taille du genou facilite les analyses histologiques et d'imagerie par rapport à des espèce plus petites. De plus, il s'agit d'un animal couramment employé en expérimentation animale, permettant ainsi d'une part de gérer plus facilement son bien-être au cours de l'étude et d'autre part de travailler sur des lots homogènes (âge et sexe fixés). [McCoy AM. Animal Models of Osteoarthritis: Comparisons and Key Considerations. Veterinary Pathology. 2015; 52(5):803-818. doi:10.1177/0300985815588611] Des lapins adultes de 11 semaines minimum seront utilisés dans ce projet pour avoir des articulations et des cartilages matures sur des animaux n’étant plus en forte période de croissance osseuse.

80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent une dose unique de pesticides par gavage ou dans une pâte alimentaire, puis sont tués 24 heures après pour prélever sang et organes et y doser les pesticides. Le porteur indique que la dose retenue est la plus forte "n'induisant pas d'effet" et que le gavage peut perforer l'œsophage. Il reconnaît l'existence de modèles in silico mais affirme qu'aucun ne couvre les pesticides étudiés, l'objet immédiat étant de valider une méthode d'exposition par l'alimentation.

Objectifs

L’objectif de ce projet consiste dans un premier temps à valider une méthode d’exposition alimentaire chez le rat sans utiliser la méthode de gavage. Pour cela il va falloir tester une méthode d’exposition efficace permettant d’exposer un cocktail de pesticide à des concentrations souhaitées. Dans un second temps mettre au point une technique de détection des pesticides et de leurs métabolites dans les principaux organes de détoxification des rats (foie, rein, tissus adipeux) afin de vérifier la quantité de pesticides présente dans l’organisme. Réalisation des études histologiques sur les effets des pesticides chez les rats concernant les variation du poids corporel, les variations du poids des organes (rein, foie,…) et les variations de la consommation alimentaire . Enfin évaluer l’impact de l’exposition périnatale au cocktail de pesticides à faible dose sur les organes de détoxification chez le rat adulte.

Bénéfices attendus

Le projet pourra faire progresser les connaissances scientifiques en mettant en place une méthode d’exposition aussi efficace mais plus naturelle physiologiquement que le gavage. De plus, ce projet permettra de mettre au point, sur un petit groupe d'animaux, les techniques d’analyse et de détection des pesticides et de leurs métabolites notamment dans les principaux organes de détoxification chez le rat. Si les différentes étapes sont validées, nous pourrons évaluer les effets physiologiques de l'exposition à ce cocktail de pesticides

Procédures

Les animaux seront exposés à un ou deux pesticides par la méthode de gavage ou par l'ingestion d'une pâte. Ils recevront une unique dose soit par gavage (le geste dure quelques secondes maximum une minute sur animal vigile) soit par voie alimentaire (l'ingestion durera quelques secondes sur animal vigile). Les animaux seront mis à mort 24h après. Une fois l'animal déclaré mort, le sang et différents organes d'intérêt seront prélevés.

Impact sur les animaux

Les animaux recevront une unique dose de pesticides à la plus forte dose n’induisant pas d’effet. Ainsi, à cette dose, aucun effet notable des pesticides n'est attendu. La méthode de gavage peut entraîner des effets indésirables: la perforation de l'oesophage et une réaction de stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélever le sang et les organes afin d'effectuer les dosages des pesticides.

Remplacement

Pour évaluer l'imprégnation des organes à des substances chimiques comme les pesticides, il existe des modèles in silico. Toutefois, il n'existe pas de modèle pour les pesticides étudiés que ça soit par la méthode dite de gavage ou la méthode d'exposition par voie alimentaire.

Réduction

Dans le domaine de la toxicologie, 4 animaux minimum par groupe sont nécessaires pour évaluer l'imprégnation des organes à des substances chimiques. Dans ce projet, 5 animaux par groupe seront étudiés afin de s'assurer d'avoir 4 animaux à la fin de l'expérimentation pour pallier à l'éventuelle situation qu'un animal présenterait des effets pouvant avoir un impact sur les résultats finaux (animal exclu de l'étude). Une analyse statistique sera réalisé pour comparer les animaux exposés par voie alimentaire et ceux exposés par gavage.

Raffinement

Pour assurer le raffinement des animaux dans ce projet, ils seront quotidiennement observés selon des critères bien précis qui permettront de déterminer des points limites afin de prendre en charge une souffrance éventuelle des animaux. Les animaux seront hébergés plusieurs par cage avec la présence de dispositifs d'enrichissements pour limiter un éventuel stress (cylindres en carton et lanières de papier kraft). Un fond sonore sera également présent afin de couvrir d’éventuels bruits extérieurs, brefs et bruyants, sources de stress pour les animaux. L'objectif de ce projet est de mettre au point une nouvelle méthode d'exposition aux pesticides par le biais de l'alimentation afin de se soustraire de la méthode de gavage utilisée pour ce type d'exposition. Ainsi, ce projet permettra de valider cette méthode qui pourra être appliquée dans le futur pour des projets ayant pour objectif d'étudier les effets de ces pesticides sur l'organisme.

Choix des espèces

Le modèle rat est un modèle de référence dans le domaine de la toxicologie. En effet, il est un bon indicateur pour prédire les effets toxicologiques éventuellement observés chez l'Homme. Ainsi, ce modèle permet de définir les valeurs de référence à respecter pour éviter d'éventuels effets chez l'Homme. Les animaux étudiés seront des jeunes adultes (8 semaines d'âge) afin d'avoir des organes ayant un poids suffisant pour réaliser les dosages qui permettront d'évaluer l'imprégnation de l'organisme aux pesticides. En toxicologie, les valeurs de référence à respecter sont définies pour les adultes.

5 truies vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent deux injections hormonales de superovulation puis une insémination, avant d'être transportées à l'abattoir pour collecter leurs embryons, la lignée de porcs devant disparaître avec la fermeture de l'installation. Le porteur indique un stress et une douleur possibles liés aux injections et au transport en fin de gestation. Il présente la congélation d'embryons comme la seule méthode permettant de régénérer en une génération cette lignée développant des mélanomes, décrite comme une "ressource génétique" à sauvegarder.

Objectifs

L’objectif du projet est de conserver une lignée de porcs développant des mélanomes (cancer de la peau) en congelant des embryons. En effet, cette lignée ne pourra plus être maintenue sur pieds après la fermeture de l’installation expérimentale porcine dans laquelle les animaux sont actuellement hébergés. Cette lignée pigmentée développe spontanément des mélanomes cutanés autour de la naissance. Les mélanomes sont des tumeurs malignes qui se développent à partir d’un type de cellules de la peau et qui correspondent à la forme la plus agressive des cancers cutanés chez l’humain. Dans ce modèle animal, les tumeurs régressent à partir du 2ème ou 3ème mois avec une dépigmentation variable et progressive. A partir de 3 mois, les tumeurs ont régressé, et la croissance des animaux va se poursuivre, en bonne santé et ils pourront se reproduire normalement. La régression tumorale, suivie souvent par la dépigmentation de la robe et des yeux, indique le rôle de la réaction immunitaire contre les cellules mélanocytaires, à l’origine de la pigmentation de la peau mais aussi des mélanomes. Le système immunitaire de cette lignée est donc très performant dans le combat contre le cancer cutané et les métastases. Des études génétiques, cliniques et histologiques ont montré que ces mélanomes présentent des caractéristiques très similaires aux mélanomes humains faisant de ces animaux un modèle translationnel d’intérêt pour la médecine humaine. Ainsi cette lignée est un modèle original très intéressant pour la recherche contre le cancer. Afin de sauvegarder cette ressource génétique originale pour des travaux qui pourraient être entrepris à l’avenir, l’utilisation de la technique de production d’embryons à partir de truies donneuses et leur conservation par la technique de congélation rapide a été retenue. Cette lignée de porcs est une lignée peu prolifique avec une taille variable des portées. Un traitement hormonal sera administré aux truies donneuses avant l’insémination artificielle afin de produire un maximum d’embryons.

Bénéfices attendus

L’installation expérimentale qui héberge ce modèle biomédical porcin va fermer définitivement. La sauvegarde de cette lignée est fondamentale car c’est une ressource génétique originale qui permet de comprendre les mécanismes impliqués lors de la régression spontanée des mélanomes par le système immunitaire. Ainsi, cette régression complète des mélanomes permet aux animaux de continuer à vivre en bonne santé. En médecine humaine, les immunothérapies ne sauvent que 20% des personnes traitées pour des cancers de la peau, et induisent des effets secondaires sévères. Ce modèle animal reste donc d’un intérêt majeur pour élucider les mécanismes immunitaires permettant la régression complète des mélanomes. Sauvegarder les embryons de cette lignée est en effet nécessaire pour conserver le patrimoine génétique et permettre de futurs projets scientifiques. La congélation d’embryons présente plusieurs avantages par rapport à la conservation de sperme. En effet, chez le porc la congélation de semence n’est pas une procédure aussi efficace que chez les autres espèces. Le taux de succès de l’insémination artificielle à partir de semence congelée est inférieur à 50%. De plus, la qualité de la semence des reproducteurs de cette lignée n’est pas très bonne ce qui diminue encore le succès de l’insémination. L’inconvénient majeur de la conservation de semence uniquement est que cette semence devra être utilisée pour inséminer des truies d’une autre race porcine. Ainsi, les caractéristiques génétiques de cette lignée ne seront retrouvées qu’après plusieurs générations de croisements consanguins (au moins 3 générations, soit 3 ans). La congélation rapide d’embryons et leur réimplantation chez des truies receveuses permettra d’obtenir des porcelets portant 100% des caractéristiques génétiques attendues. C’est la seule méthode qui permettra de produire à nouveau des porcs développant des mélanomes en une génération et avec le maximum de diversité génétique.

Procédures

Dans ce projet, après synchronisation du cycle ovarien par la ration alimentaire du matin sur 18 jours, cinq truies vigiles seront traitées avec deux injections de superovulation (à jour 1 et jour 4 de la procédure) puis inséminées à jour 5.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables peuvent être le stress et la douleur liées aux injections. Le fournisseur des médicaments indique que comme avec toutes les spécialités contenant des protéines, des réactions de type allergiques peuvent se produire. Un traitement serait instauré rapidement dans ce cas. En termes de bien-être, et spécifiquement de risque d’avortement, le transport est considéré comme à risque en fin de gestation mais pas avant l’implantation des embryons. Un stress des truies lié au transport est aussi possible.

Devenir

En fin de procédure tous les animaux seront euthanasiés à cause de la fermeture de l’installation expérimentale qui les héberge et les embryons seront collectés pour conservation.

Remplacement

L’obtention et la conservation d’embryons réalisées dans ce projet est une alternative à la conservation sur pieds dans une installation expérimentale. Après ce projet, l’installation expérimentale sera fermée. Il n’y a pas de méthode alternative de remplacement pour produire des embryons en nombre suffisant pour pouvoir régénérer la lignée dans le futur après décongélation et réimplantation dans une truie porteuse.

Réduction

L’utilisation de la procédure de superovulation permet de maximiser le nombre d’embryons par truie. Chez la truie de production, plus de 30 embryons sont collectés par donneuse. La fertilité (taux de gestation après transfert) oscillant entre 40 et 70%, ce dispositif permet de produire une portée par truie prélevée. Ces données ne sont pas connues dans la lignée de porc utilisée qui fait des portées de 5-6 porcelets en moyenne. La congélation rapide d’embryons permettra d’obtenir en une génération des porcs avec toutes les caractéristiques génétiques recherchées. Cette méthode permettra aussi surtout d’utiliser moins d’animaux par la suite pour retrouver la lignée par rapport à la congélation de sperme. Nous utiliserons les 5 truies qui restent dans l’élevage avant euthanasie pour cause de fermeture de l’installation.

Raffinement

Les truies ont été entraînées à la présence des soigneurs et interagissent régulièrement aux simples contacts ou caresses. Ces interactions de nature positive favorisent la relation par une absence de peur et une forte confiance en l’humain, caractéristiques du bien-être animal. Les soigneurs, qui connaissent très bien leurs animaux, sont très réactifs si un animal montre des signes de gêne quelconque. Les animaux sont élevés dans des loges aux surfaces réglementaires, sur sciure et avec des enrichissements comme des chaînes, des cordages, et autres jouets en plastique ou caoutchouc à mâchouiller qui sont renouvelés régulièrement. Les cinq truies utilisées dans ce projet n’ont pas eu de complication ni lors du développement des mélanomes ni lors des précédentes gestations et mise-bas. Les injections seront réalisées par des agents formés et habitués à réaliser ce type de manipulation. Au jour 11 de la procédure, le transport à l’abattoir d’une durée de 1.5-2h sera effectué par un transporteur agréé. De la paille sera déposée sur le sol de de la bétaillère pour stimuler le fouissage des animaux et limiter leur stress pendant le transport.

Choix des espèces

L’objectif du projet étant la conservation d’une lignée de porcs, le projet concerne spécifiquement l’espèce porcine. Les animaux utilisés sont adultes, donc en âge d’ovuler.

24 chevaux de course vont être utilisés puis gardés à l'écurie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent des fouilles rectales, des prises de sang et deux tests d'effort sur piste, pour mesurer l'effet d'une ration plus riche en fibres sur leur microbiote intestinal et leur performance sportive. Le porteur indique une gêne passagère lors de la fouille et une douleur brève à la ponction jugulaire, et prévoit une sédation possible si le stress devient dangereux. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer le cheval pour ces mesures, l'objet de l'étude restant la performance des chevaux de course eux-mêmes.

Objectifs

D’une part, une première étude a mis en évidence une relation entre la capacité du microbiote du gros intestin du cheval à dégrader les fibres alimentaires (capacité fibrolytique) et la performance sportive chez le trotteur. D’autre part, il est fréquent dans les centres d’entraînement de chevaux de courses que les chevaux soient nourris avec un régime riche en céréales et en amidon qui, en quantité trop importante, peut être nuisible à l’activité fibrolytique du microbiote et donc à la santé de l’individu. L’alimentation peut donc être un levier pour le bien-être et la performance chez le cheval de course. La présente étude portera sur l’impact d’une modification de l’alimentation sur le microbiote du gros intestin, le métabolisme énergétique et la performance chez le jeune trotteur athlète. L’objectif de la présente étude est, après avoir confirmé la relation entre la capacité fibrolytique du microbiote du cheval et la performance sportive chez le trotteur, d’évaluer l’impact d’une modification du microbiote par l’alimentation sur le métabolisme énergétique et la performance chez le cheval athlète de haut niveau.

Bénéfices attendus

Une première étude menée par l’établissement utilisateur a démontré que les individus dont le microbiote était plus efficace à dégrader les fibres alimentaires avaient de meilleures performances à l’effort. Il est fréquent dans des centres d’entraînement de chevaux de courses que les animaux reçoivent un régime alimentaire riche en céréales (et donc riches en amidon). Cette quantité de céréales, lorsqu’elle est importante, peut être néfaste pour la santé digestive de l’animal et peut conduire à différentes maladies digestives à travers la diminution significative de la capacité de dégradation des fibres alimentaires par le microbiote. Dans cette étude, la modification de l’alimentation visera à réduire la quantité d’amidon apportée par la ration alimentaire en apportant un aliment riche en fibres, bénéfiques pour la santé digestive et potentiellement pour la performance sportive aux vues des résultats de l’étude précédente. Cette étude peut donc ouvrir de nouvelles perspectives de conduites alimentaires dans l’objectif de préserver l’intégrité digestive des chevaux de course en mettant en évidence l’importance des fibres alimentaires pour la performance sportive.

Procédures

Au cours du projet, les chevaux seront soumis à deux prélèvements de fèces et deux séries de trois prélèvement de sang séparaés de six semaines. Ces prélèvements s'effectuent sur animal vigile et ne durent que quelques minutes. Les chevaux réaliseront aussi deux tests d'effort sur piste séparés de six semaines. Ces tests dureront 30 à 45 minutes et leur intensité sera comparable à celle de leurs entrainements habituels.

Impact sur les animaux

Aucune nuisance ou effets indésirables majeurs ne sont attendus sur les animaux au cours de ce projet. La fouille rectale peut entrainer une gêne passagère qui cessera au moment du retrait du bras du manipulateur, et une douleur légère et passagère peut être éprouvée au moment de la ponction dans la veine jugulaire, mais celle-ci ne devrait pas durer plus de quelques minutes. Le test d’effort réalisé entraînera une forme de stress et un état de fatigue mais ne dépassera pas les intensités des entraînements réalisés quotidiennement.

Devenir

Il n'est pas attendu de dommage pour les animaux impliqués dans ce projet, ils pourront donc être réutilisés sans effet cumulatif. Les chevaux athlètes appartiennent à l'écurie de course où se déroulera le projet, ils y resteront à l'issu de celui-ci.

Remplacement

L’étude du microbiote du gros intestin équin nécessite le prélèvement de fèces qui permettent d’obtenir un échantillon microbien représentatif de celui présent dans le gros intestin du cheval. Le microbiote digestif étant complexe et spécifique à chaque espèce, il n'est pas possible de remplacer l'utilisation du cheval par un autre modèle ou par une étude in vitro. Il en va de même pour les tests d'effort qui reflètent les capacités physique et métabolique du cheval et pour lesquelles aucune alternative n'existe afin de mimer l'impact d'un test d'effort sur cette espèce. Aucun autre modèle ne permet de remplacer l'utilisation du cheval pour répondre aux objectifs de ce projet. Les tests d’effort et prises de sang reflètent les capacités physiques et métaboliques individuelles et aucune alternative autre qu’in-vivo n’existe afin de mimer l’impact d’un test d’effort.

Réduction

Un total de 24 animaux seront inclus dans ce projet, réparti en 2 groupes de 12 animaux. Ce nombre a été établi à l'aide de la fonction power.t.test du logiciel R et à partir des résultats obtenus lors d'un premier essai mesurant les mêmes paramètres sur un échantillon d'animaux conduit dans les mêmes conditions. La vitesse moyenne sur le dernier palier du test d’effort (paramètre clé de la performance) était de 42,7±1,14 km/h, la dégradation de la matière sèche in vitro était de 18,7±2,8 % et la concentration en acétate sanguin 5 min après le test d’effort était de 1,86±0,47 mmol/L de sang. Pour une puissance du test fixée à 80 % et une erreur de première espèce de 5 %, un nombre de 10 chevaux par lot, soit 20 chevaux pour l’étude est nécessaire pour mettre en avant des différences significatives sur les paramètres ci-dessus. Par sécurité 24 chevaux âgés de 2 ans, stationnés sur le même site d’entraînement, ayant la même conduite et ayant un niveau d’entraînement similaire seront inclus dans l’étude. La marge d’animaux sélectionnés (2 par lot) se justifie au travers du fait que certains animaux pourront être retirés de l’étude dans le cas d’une blessure entraînant l’arrêt de l’entraînement de l’animal au cours de l’étude. Dans le cas d’une maladie ou d’une blessure, et selon la médication utilisée, un animal pourra être exclu de l’étude du fait de l’impact du traitement sur le microbiote du gros intestin. En outre, l'activité fibrolytique du microbiote de chaque individu sera étudiée de manière in-vitro ce qui réduit significativement le nombre de prélèvements par fouille rectale par animal. Les résultats obtenus seront analysés avec la procédure Mixed de SAS avec le cheval en aléatoire et le régime et la période comme paramètres ainsi que la vitesse pour les tests d'effort.

Raffinement

Chaque animal aura été préalablement emmené dans la barre de fouille et manipulé à l’intérieur par le personnel de l’écurie afin de limiter le stress lors du prélèvement. La procédure pourra être répétée si des chevaux semblent stressés lors de la première habituation. Les chevaux étant des animaux grégaires, ils seront déplacés par lot de deux par le personnel de l’écurie lors des habituations et lors des prélèvements à la barre de fouille afin de limiter le stress pouvant être induit par la séparation d’avec les congénères. Si le stress provoqué devient trop dangereux pour l’animal et le manipulateur, une sédation pourra être réalisée par le vétérinaire. Une phase d’observation sera effectuée durant 30 minutes après la fouille rectale afin de vérifier le bon état de santé du cheval. Dans le cas où une sédation est réalisée, le cheval restera en observation avec un panier de mise à jeun dans un box à proximité de la stalle jusqu’à la disparition des effets de la sédation. De plus, du gel sera utilisé pour faciliter le passage. Les tests d'effort seront réalisés par le personnel de l'écurie auquel les chevaux sont habitués. Ainsi pour les chevaux les tests d'effort seront vécus comme un entrainement classique, et l'état de forme des chevaux sera suivi les jours suivants le test d’effort. Dans le cas où un animal se blesserait lors du test, il sera immédiatement arrêté et les soins nécessaires seront pratiqués. Le test d’effort pourra également être arrêté si la personne conduisant le test d’effort juge cela nécessaire.

Choix des espèces

L'étude porte sur la performance des chevaux athlètes, il est donc nécessaire de travailler sur des chevaux pour répondre aux objectifs du projet. Les animaux inclus dans cette étude seront tous âgés de deux ans afin de ne pas avoir un effet de l’âge sur les paramètres mesurés. De plus, les animaux inclus dans cette étude seront dans leur phase de pré-entraînement c’est-à-dire qu’ils n’auront pas encore participé à des courses. Ceci permettra d’établir de manière précoce si une relation existe entre le microbiote du gros intestin et la performance. En outre, un effet de l’entraînement sur le microbiote du gros intestin a pu être observé chez le cheval, chez l’humain et la souris. Ce choix de stade de développement permettra de réduire cet effet pour l’étude. Enfin, le jeune trotteur est la population cible de l'étude, il est donc logique de travailler avec de jeunes animaux.

480 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les rates reçoivent une supplémentation nutritionnelle pendant la gestation, une injection d'eau marquée, un prélèvement de lait sous anesthésie et des prélèvements de sang, leurs petits des prélèvements d'urine, un test de tolérance au glucose et un prélèvement de sang, avant une mise à mort par ponction cardiaque pour prélever la glande mammaire. Le porteur teste des acides aminés censés augmenter la production de lait maternel, une éventuelle étude chez la femme renvoyée au conditionnel. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne rend compte de la mise en place de la lactation.

Objectifs

L’Organisation Mondiale de la Santé recommande l’allaitement exclusif jusqu’à 6 mois. Le taux d’allaitement exclusif, en France, de l’ordre de 65% à la naissance, chute à 35% dès la fin du premier mois. La raison invoquée est évidemment le retour des mères au travail ; toutefois, la perception d’une production insuffisante de lait maternel est souvent citée mais repose soit sur une impression subjective, soit sur une mesure indirecte et imprécise de la production de lait, qui consiste à peser les enfants, avant et après tétée. Nous avons mis au point une méthode plus précise, basée sur la méthode d’enrichissement isotopique. Cette méthode requiert l’administration à la mère d’une dose d’eau marquée au deutérium, isotope stable de l’hydrogène, puis de suivre la diffusion de ce traceur chez le petit allaité. L’eau du lait maternel étant la seule source d’eau ingérée par le petit, on peut en déduire le flux de lait entre la mère et le petit. Nous avons utilisé cette méthode pour quantifier la production de lait maternel chez un modèle de petite taille (rongeur, rat), largement utilisé pour la recherche périnatale du fait de son cycle court de reproduction. Dans l’idée de tester des stratégies pour améliorer la lactation par des interventions nutritionnelles chez des femmes allaitantes, nous allons utiliser cette méthode pour explorer, sur un modèle animal rongeur, des molécules « galactologues » susceptibles d’améliorer la production de lait maternel. Ces molécules seront testées pendant la gestation, qui est la période de croissance in utero du fœtus et aussi la période de préparation de la glande mammaire à la lactation. C’est une période de vie qui mérite d’être mieux étudiée avec un objectif d’améliorer la lactation. Les molécules galactologues qui nous intéressent sont deux acides aminés, arginine et citrulline, qui participent au contrôle de la lactation. L’arginine, est un acide aminé semi-essentiel, seul précurseur endogène de l’oxyde nitrique (NO). L’arginine supplémentée pendant la gestation et la lactation augmente le flux de lait de 20% chez la rate allaitant une portée de 12 ratons sous régime normo-protéique alors que l’effet est nul lorsque l’arginine est supplémentée pendant la lactation seule. La citrulline est un acide aminé non essentiel qui échappe à l'absorption hépatique, n'est pas incorporée dans les protéines, et est absorbée par les reins où elle est transformée en arginine.

Bénéfices attendus

La supplémentation du régime alimentaire de la mère sera testée pendant la gestation de façon à étudier cette période de vie. La période de gestation, en particulier le dernier trimestre chez la femme, est d’abord la phase de croissance in utero du fœtus, mais elle correspond également à la période où les glandes mammaires se préparent à la lactation, avec l’initiation de leurs mécanismes physiologiques. Nous avons donc décidé de la considérer pour étudier ses effets potentiels sur la lactation. Les bénéfices attendus sont une meilleure initiation de la lactation, dès les premiers jours après la naissance, et au final, une meilleure production de lait maternel, tout au long de la lactation. Le meilleur indicateur en termes de bénéfice serait, à terme, une amélioration du taux d’allaitement. Si les résultats de cette supplémentation s’avéraient positifs sur ce modèle de rate, nous pourrions aller vers une étude clinique chez la femme pendant la grossesse. Si les bénéfices en termes de lactation sont positifs chez la rate, rien ne prouve qu’il en serait de même chez la femme et seule une étude clinique permettrait de le prouver. Supplémenter le régime maternel avec un acide aminé, uniquement en fin de gestation, serait envisageable puisque les doses en arginine et citrulline sont celles déjà testées chez l’homme adulte, sans que des effets indésirables n’aient été observés. La prise en considération de la vulnérablité accrue de la femme en période de grossesse serait évidemment à considérer.

Procédures

Les rates seront soumises à une manipulation nutritionnelle durant la gestation (15 jours), à une injection d’eau deutérée en intra-veineuse pendant la lactation (10 min/femelle), à 1 prélèvement manuel de lait (30 minutes), et à des prélèvements de sang (2 min/animal). Leur descendance sera soumise à des prélèvements d’urine pendant la lactation (2 min/petit) et à un test de tolérance orale au glucose (120 minutes) et des prélèvements de sang à la veine caudale à 150 jours de vie (2 min/animal).

Impact sur les animaux

Pour les animaux, l’évaluation de la douleur sera faite à l’aide d’observations physiologiques (poids), comportementales (consommation de nourriture, fuite ou défense de l’animal à la manipulation, activité) et en fonction de l’apparence de l’animal (poil, posture). Aucune souffrance (ou très faible) n'est attendue lors des manipulations prévues. Les animaux seront observés tous les jours y compris le Week-end. De la douleur et/ou du stress peuvent être ressentis par l’animal, pendant l’injection d’eau deutérée (mère), et les prélèvements de sang (mères et ratons). Du stress peut être ressenti par l’animal pendant le prélèvement de lait (mère), et le prélèvement d’urine et le gavage du glucose lors du test de tolérance orale (ratons).

Devenir

Si aucun évènement n’a justifié la mise à mort prématurée des animaux, ils seront mis à mort aux temps de prélèvements de tissus préalablement établis dans les procédures expérimentales. Pour la procédure 1, les rates sont suivies jusqu’à l’involution (J21), temps auquel elles sont mises à mort, notamment pour un prélèvement de glande mammaire. Les ratons à J21 sont séparés en 2 : les ratons non sevrés (8 sur 12 par portée) sont mis à mort à ce même temps, pour un prélèvement de sang intracardiaque, les ratons sevrés (4 sur 12 par portée) sont suivis jusqu’à 150 jours, temps auquel ils sont mis à mort. Pour la procédure 2, les mères sont suivies jusqu’à J18 (date de fin de mesure du flux de lait par méthode d’enrichissement à l’eau deutérée), temps auquel elles sont mises à mort, notamment pour un prélèvement de glande mammaire. Tous les ratons (toute la portée) sont également mis à mort à ce temps car aucun suivi n’a été prévu à long terme: Un prélèvement de sang intracardiaque sera alors effectué sur ces animaux. Tout animal sera exclu du protocole et mis à mort si un comportement anormal de l’animal (prostration, poil hérissé, refus d’alimentation, courbe de prise de poids anormale) est observé.

Remplacement

Il s’agit d’une étude in vivo visant à évaluer des stratégies nutritionnelles sur la production de lait maternel. Il n’existe donc pas de modèle in vitro permettant le remplacement de l’étude animale. Tous les animaux utilisés pour ce projet proviennent d’élevages reconnus et sont nés en captivité. Il n’existe pas encore de méthode alternative (modélisations, modèles in vitro) permettant de rendre compte de la complexité des mécanismes physiologiques dans la mise en place de la lactation, pendant la phase de gestation.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au minimum. Il prend en compte la nécessité d’avoir au moins 6 mères différentes par groupe expérimental pour des raisons de calcul statistique et de garder 2 ratons mâles et 2 ratons femelles par mère pour tenir compte d’un effet sexe et d’un effet « portée ». Si un galactologue ne montre pas d’effet significatif sur la production de lait ou la croissance de la portée par rapport au contrôle dans le protocole 1, la procédure 2 ne sera pas réalisée pour ce galactologue.

Raffinement

Des mesures sont mises en place lors des différents prélèvements de sang, avec une analgésie locale de lidocaïne 2% qui sera appliqué 15 min avant l’incision. Pendant le prélèvement de lait, les femelles seront gardées sous anesthésie avec induction en boite (mélange isoflurane 4 à 5%/L d’oxygène), puis maintien au masque (mélange isoflurane 2.5 à 3%/L d’oxygène). Les rattes sont placées sur un tapis chauffant pendant pendant toute la durée du prélèvement jusqu’à leur réveil. Les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel agréé et seront pesés 3 fois par semaine ce qui permettra de surveiller une éventuelle perte de poids et de vérifier leur état général. Les rats sont hébergés dans des portoirs ventilés avec différents enrichissements de milieu (frisottis, tunnels, morceau de bois) afin de réduire leur stress. Les points limites de cette procédure qui conduiront à la mise à mort de l’animal seront les suivants : Pour les mères : - anomalies détectées lors de l’observation générale de l’animal : posture (dos vouté, ventre rétracté) ou masque (yeux plissés, museau gonflé) suggérant une douleur sévère ; Pour les petits : - incapacité à téter ; absence prolongée d’interaction avec la mère et l’environnement ou de réponse aux stimulations ; dégradation de l’état du poil ; perte de poids 2 jours consécutifs Pour les mères et les petits : - anomalies détectées à l’examen clinique : baisse significative du poids corporel (plus de 20% persistant pendant 72 heures) ou arrêt de la croissance pour les petits ; déshydratation sévère ; signes de défaillance des organes (détresse respiratoire, dilatation du ventre…).

Choix des espèces

L'avantage du modèle rat sur le modèle porcin utilisé dans certaines références bibliographiques est la petite taille des animaux (permettant d'augmenter les effectifs et donc de diminuer la variance des mesures) et la rapidité de croissance et de reproduction, permettant de réaliser des protocoles expérimentaux en beaucoup moins de temps. Les mères seront commandées gestantes auprès du fournisseur (J1). Les rates seront utilisées pendant la gestation et la lactation puisque la gestation est la période au cours de laquelle la supplémentation du régime alimentaire sera testée et la lactation est la période de mesure du flux de lait. La descendance sera utilisée pendant l’ensemble de la période de lactation. Afin de déterminer l’impact des galactologues sur le métabolisme de la descendance à long terme, 2 mâles et 2 femelles par mère seront sevrés et suivis jusqu’à l’âge adulte (5 mois maximum)

1 344 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent par gavage une bactérie commensale de l'intestin, puis des prélèvements de fèces, avant une mise à mort pour prélever leurs tissus intestinaux, aucun ne pouvant être réutilisé en raison du risque de contamination. Le porteur étudie comment cette bactérie s'attache à l'intestin et stimule l'immunité, en vue d'une plateforme de vaccins et d'un probiotique, des applications renvoyées au long terme. Il affirme que la culture in vitro ne reproduit pas les interactions d'un organisme complexe et retient le modèle murin.

Objectifs

La Bactérie Filamenteuse Segmentée (SFB, segmented filamentous bacteria) est une bactérie commensale commune de l'intestin. Contrairement à la plupart des autres commensaux, qui résident généralement dans la lumière intestinale, SFB se fixe intimement aux cellules de l’intestin d'une manière spécifique de l'espèce. En raison de cet attachement, SFB stimule puissamment le système immunitaire de l'hôte. Comme l'attachement à l’intestin est une étape clé de son potentiel de stimulation immunitaire, nous visons à mieux comprendre cette partie du cycle de vie en analysant les détails structurels et moléculaires de SFB lorsqu'il est cultivé dans un hôte où il peut se fixer et dans un hôte où il lui est impossible de s'attacher. Il y a deux objectifs principaux à ce projet : 1. Mise en évidence des caractéristiques structurelles de SFB dans des conditions d'attachement et de non-attachement. Les différences structurelles fourniront des informations importantes sur la manière dont SFB peut interagir avec son hôte. 2. Comprendre comment la motilité et la reconnaissance de ses composants par le système immunitaire inné peuvent impacter le potentiel immunostimulateur de SFB.

Bénéfices attendus

La compréhension de l’attachement de SFB à son hôte aura des conséquences translationnelles directes. En effet, ces connaissances nous permettrons de modifier la spécificité d’hôte et d’utiliser SFB de souris chez l’homme pour concevoir une nouvelle plate-forme d'administration de vaccins. Ce projet nous permettra également de mieux comprendre l'impact de la colonisation du SFB sur d'autres commensaux et pathogènes intestinaux. En effet, nous pensons que SFB a co-évolué avec son hôte afin d’obtenir de l'énergie en échange d'une résistance à la colonisation : SFB façonne la composition du microbiote et en même temps renforce la barrière intestinale et les défenses immunitaires. Ces connaissances constituent la base d'une application translationnelle de SFB pour à la fois améliorer la santé intestinale à l'avenir en tant que probiotique et comme outil de vaccination. Il est important de savoir comment des facteurs bactériens et des facteurs de l'hôte sont impliqués dans le puissant potentiel immunostimulant de SFB. Ces données nous amènerons à comprendre comment SFB est capable de modifier l'environnement immunitaire homéostatique chez l'hôte pour à la fois le protéger mais aussi exacerber des phénotypes pathogéniques. Ce n'est qu'avec une meilleure idée des détails moléculaires de ces mécanismes que des études thérapeutiques pourrons être conçues pour stimuler ou entraver les effets immunologiques de SFB sur l'hôte.

Procédures

Lors de la première procédure, les animaux subiront une inoculation de SFB par gavage (introduction d’une suspension bactérienne concentrée dans l'estomac à l'aide d'une sonde gastrique) au jour 0, ce qui prend environ 1 minute. Au début et au fin de l’expérience (8, 14 ou 21 jours) des prélèvements de fèces seront réalisés sur animaux vigiles, ce qui prend environ 5 minutes. Lors de la deuxième procédure, les mères souris subiront une inoculation de SFB par gavage et sur leur ventre avec une solution bactérienne concentrée au jour 0 (2 semaines après la naissance de ses petits). Des fèces seront prélevés sur les souris mères vigiles à J0 (semaine 2 des nouveau-nés) de la procédure et une ou deux semaines après en fonction du point final. Un prélèvement de fèces prend environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

La colonisation par les SFB est sans complication chez l’animal. Le seul risque est lié au gavage qui peut provoquer l’introduction de liquide dans les poumons de l'animal. Pour s'assurer du bien-être des animaux, ils seront surveillés pendant 10 minutes après la procédure.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car le risque de contamination par transferts répétés de souris est trop important. A l’issue de la première procédure expérimentale, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir récupérer les SFB intestinaux pour analyse. A l’issue de la deuxième procédure expérimentale les animaux seront mis à mort afin de pouvoir récupérer les tissus intestinaux pour analyse.

Remplacement

SFB est une espèce commensale spécifique qui se cultive très difficilement, ce qui limite l’utilisation de système in vitro. Notre laboratoire a réussi à mettre au point un protocole de culture in vitro pour les SFB. Cependant cette technique est difficile et limitée dans le temps, et ne nous permet pas de modéliser fidèlement les interactions microbiennes pouvant avoir lieu dans un organisme complexe tel que l’Homme. Afin de pouvoir atteindre nos différents objectifs, nous devons donc utiliser des organismes tels que le rongeur pour reproduire le plus fidèlement possible les interactions multiples observés chez l’Homme. Par ailleurs, pour comprendre l’interaction complexe entre l'hôte et les SFB, des modèles de souris in vivo génétiquement modifiés sont nécessaires pour l’étude tissulaire du système immunitaire. L'utilisation de rats est nécessaire pour pouvoir étudier SFB dans des conditions in vivo où il s'attache et ne s'attache pas afin de décrypter les facteurs impliqués dans l'attachement Lors de nos différentes procédures expérimentales nous utiliserons un modèle animal qui nous permettra d’observer et d’étudier les différentes réactions immunitaires induites par les SFB dans un organisme ayant un système immunitaire mature et pouvant être contrôlé. Ce modèle animal nous permettra également d’étudier et de caractériser les interactions physiques et moléculaires des SFB avec leur hôte, notamment au niveau de l’épithélium intestinal. Ce modèle nous permettra également d’étudier la réponse immunitaire induite par les SFB chez des hôtes ayant des caractéristiques immunitaires et tissulaires différentes. Cela nous permettra d’étudier plus précisément les différents mécanismes immunitaires mis en jeu lors d’une colonisation bactérienne.

Réduction

Afin de respecter le principe de réduction dans la conception de nos expérimentations, limité au maximum le nombre de procédure expérimentale tout en permettant d’atteindre nos objectifs, chaque procédure expérimentale nous permettra d’atteindre un des objectifs spécifiques précédemment cités. Nous nous sommes assurés de la non redondance de nos expérimentations afin d’exclure toute répétition d’étude antérieures. Ainsi nous garantissons lors de notre projet l’obtention de résultats originaux. Nous nous attachons à partager et réutiliser les tissus et prélèvements pour des analyses multiples. Afin de garantir l’obtention de résultat concluant tout en utilisant le moins d’animaux possible, chaque expérimentation a fait l’objet d’une réflexion approfondie en amont. Nous avons fait appel à un biostatisticien afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaire tout en nous permettant d’atteindre nos objectifs scientifiques. Nous utiliserons lors de nos procédures expérimentales des animaux ayant des caractéristiques similaires nous permettant de diminuer la variabilité entre individu. Nos protocoles expérimentaux sont parfaitement au point pour limiter au maximum la variabilité technique.

Raffinement

Dans un principe de raffinement, et afin de limiter l’impact de la vie en captivité, les souris et les rats seront hébergées dans des cages correctement alimentées en nourriture et en eau pour garantir leurs besoins physiologiques. Pour garantir les besoins comportementaux de base des souris, les cages seront enrichies avec des cylindres de coton, des bâtons à ronger et un tunnel. Les souris et les rats seront hébergées en groupe. Si cela est justifié par le comportement agressif ou pour permettre la récupération d’une souris après une manipulation technique, une souris pourra être isolée pour une durée ne dépassant pas 3 semaines. Un complément alimentaire pourra être rajouté pour accélérer la récupération de la souris. Nous avons également favorisé aux maximum les procédures non invasives, et limité à l’essentiel les procédures invasives. Les procédures invasives décrites ci-dessous seront réalisées par des personnels compétents et limité au maximum dans le temps. Dans ce projet, nous ne nous attendons pas à avoir d’altération du bien-être des animaux. Toutefois, le bien-être des animaux sera évalué avec une grille de score et si à un moment quelconque de l'expérience, nous observons que l'animal a un score clinique de 2 ou plus, l'animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Nous avons choisi de réaliser nos expérimentations sur des modèles murins. Ces modèles présentent plusieurs avantages. D’un point de vue technique l’utilisation d’un modèle murin nous permet d’utiliser des infrastructures déjà existantes et respectant la législation en termes d’expérimentation animale. La reproduction et la maturation rapide du modèle murin nous permettra de rapidement obtenir des individus pour nos expérimentations. De plus, le modèle murin nous permet de bénéficier d’un nombre important de modèle génétiquement modifié et humanisé nous permettant de mener à bien nos investigations scientifiques. D’un point de vue anatomique le modèle murin présente de grandes similitudes avec l’Homme. Ces similitudes nous permettrons de modéliser le plus fidèlement les mécanismes observer chez l’Homme et fond du modèle murins un modèle idéal pour l’étude des interactions hôte-microbiote. L'utilisation de rats est nécessaire dans un contexte très limité pour pouvoir traiter l'adhérence spécifique à l'espèce de SFB, ce qui n'est pas possible en utilisant un autre système modèle. Pour la première et deuxième procédure, des souris et des rats mâles et femelles âgées de 8 à 12 semaines, seront utilisés. Pour cette étude nous avons choisi de travailler avec des souris et des rats adultes dont le système immunitaire est pleinement développé. De plus, les procédures de manipulation telles que le gavage sont plus faciles à réaliser chez les souris et les rats adultes. Pour la troisième procédure, nous visons à déterminer l'activation immunitaire induite par SFB chez les jeunes souris avant et après le sevrage. Pour cela, nous avons conçu notre procédure pour minimiser la détresse des animaux. Nous ne ferons donc un gavage à la mère que la deuxième semaine après la mise bas et répandrons également la bactérie sur le ventre de la mère souris pour faciliter la transmission aux petits. Nous avons choisi de ne pas nourrir de force les jeunes souris (dans leur deuxième semaine d'âge) mais plutôt de les nourrir d'une petite quantité de solution bactérienne sans aucune procédure invasive pour maximiser le succès de la colonisation et de la reproductibilité.

216 animaux aquatiques (xénopes, poissons-zèbres, carpes koï) vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une partie tuée à l'issue, d'autres adoptés ou réutilisés d'une session à l'autre. Les xénopes femelles reçoivent une injection d'hormone puis un massage abdominal pour prélever des ovocytes, les poissons-zèbres un prélèvement de gamètes et une biopsie de la nageoire, le tout lors de travaux pratiques de formation. Le porteur présente ces séances comme une obligation réglementaire et emploie surtout des animaux "de réforme". Il affirme que le remplacement des animaux vivants est "impossible" pour la pratique, tout en l'évoquant pour la théorie.

Objectifs

Les formations concepteurs sont encadrées par l’arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques. Cet arrêté défini le programme de base et ce dernier doit comporter une partie : Procédure faiblement invasive : théorie et pratique. Cet aspect pratique, à but éducatif, doit donc permettre aux stagiaires futurs concepteurs ou applicateurs de procedures expérimentales de se familiariser avec les manipulations élémentaires sur les principales espèces aquatiques utilisées à des fins scientifiques. A l'issue de cette séance, les expérimentateurs maitriseront les aspects élémentaires de zootechnie et seront en mesure de réaliser des anesthésies et des mises à mort dans le respect de la réglementation en vigueur.

Bénéfices attendus

A l'issue de la formation les stagiaires seront réglementairement formés, auront acquis les connaissances et techniques leur permettant de garantir le maintien du bien-être animal dans le cadre de leurs travaux de recherche scientifique. La prise en charge de la douleur, l'identification précoce des signes cliniques des animaux, seront autant d'éléments permettant d'améliorer la condition des animaux détenu en captivité.

Procédures

Les xénopes femelles seront soumises à une injection, sous contention d’une minute, d'hormone gonadotropine par session de travaux pratiques, le lendemain un prélèvement d’ovocyte par massage abdominal sera réalisé pour une durée de 2 minutes maximum. Les poissons-zèbres seront soumis à un seul prélèvement de gamètes par individu (sperme et ovocytes) de manière non- invasive, et une biopsie d'une faible portion de la nageoire caudale, l’ensemble de la manipulation n’excédera pas 10 min par individu, réalisé sous anesthésie. Les carpes koï seront soumises à une anesthésie n’excédant pas 10min.

Impact sur les animaux

La majeure partie des manipulations sera réalisée sous anesthésie par balnéation (tricaïne ou benzocaïne) limitant les sources d’inconfort pour les animaux. Le seul effet indésirable potentiel pourra it apparaître suite à la biopsie de la nageoire caudale. Bien qu'il s'agisse d'un organe capable de régénération, il présente des nocicepteurs, c'est pourquoi un analgésique sera administré en post-prélèvement. Les animaux seront manipulés à l’aide d’une épuisette, pouvant présenter une légère source de stress lors des transferts de bac à bac.

Devenir

Poisson-zèbre et carpe koï : En fin de procédure les animaux seront mis-à-mort ou adopté si leur état de santé le permet. Xénopes : Les animaux seront maintenus en vie pour être réutilisée d'une année à l'autre, les procédures etant faiblement invasives.

Remplacement

Dans le cadre de la réglementation, lors de séances de Travaux Pratiques le remplacement des animaux par un modèle alternatif est impossible. Toutefois, lors des enseignements théoriques, le recours aux méthodes alternatives (IPS, organoïdes, organes sur puces, impression 3D de tissus, utilisation d’embryons) est largement évoqué et encouragé dès que cela est possible.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés est calculé au plus juste (pour chaque session, 1 à 2 animaux par espèce et par binôme/trinôme de stagiaires, ainsi qu’un nombre restreint d’animaux pour les démonstrations par les encadrants) et la quantité est toujours adaptée au nombre de stagiaires. Nous utiliserons dans la mesure du possible des animaux adultes issus de l'élevage standard, animaux dit de réforme : anciens reproducteurs ou individus ne présentant pas les standards commerciaux (carpes-koï), dont le devenir est la mise à mort dans le but de ne pas produire d'animaux destinés exclusivement à la réalisation de ces travaux pratiques. Nous nous efforcerons de réutiliser une partie des animaux d'une session à l'autre lors des sessions de TP rapprochées, les xénopes femelles seront réutilisées sur plusieurs sessions sur plusieurs années.

Raffinement

Un minimum de 3 formateurs expérimentés sera présent en permanence lors des séances de manière à encadrer au plus près les stagiaires lors des manipulations, un maximum de 12 stagiaires (soit 1 formateur pour 4 apprenants) par session sera respecté, permettant un suivi des animaux au plus près et un encadrement strict des gestes techniques. Une attention toute particulière est portée pour la diminution des contraintes exercées aux animaux, la majeure partie des manipulations sera réalisée sous anesthésie, l'application d'un analgésique sera systématique afin de miniser toute douleur potentielle. Des points limites prédictifs stricts et adaptés au projet de formation sont mis en place et appliqués dès leur seuil atteint.

Choix des espèces

Poisson-zèbre et xénope sont les principales espèces utilisées à des fins scientifiques. Leurs facilités d'élevage, la vaste documentation disponible et la large communauté scientifique en font des modèles de choix. Les connaissances zootechniques disponibles et les caractéristiques biologiques (induction de ponte, nombres d'œufs, température, etc.) de ces 2 espèces permettent de présenter l'ensemble des manipulations élémentaires réalisées lors des procédures expérimentales mises en œuvre dans les projets de recherche. Les poissons étant un groupe paraphylétique composé d'une immense diversité d’espèces, il est important de pouvoir effectuer les manipulations sur un modèle différent. Cette formation est ouverte à une large communauté scientifique, travaillant sur un éventail d’animaux très varié. La carpe koï, poisson téléostéen d’eau froide, présente des caractéristiques complémentaires au poisson- zèbre tropical, notamment du fait de sa taille et de son écologie, elle permettra de mettre en évidence des aspects spécifiques à prendre en considération notamment lors des anesthésies. Xenopes et poissons-zèbres : les animaux utilisés seront uniquement des adultes sexuellement matures. L'ensemble des manipulations et observations doivent être réalisées sur des animaux adultes afin d'apporter aux stagiaires les meilleurs éléments de formations pour leur procédures futures, d'autre part l'induction de pontes par injection d'hormone ne peut s'effectuer que sur des femelles xénopes adultes. Carpe koï : les animaux seront des juvéniles, de l’ordre de 10 à 15 cm non-encore sexuellement différenciés