Procédures légères

3 960 souris et hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Chaque animal patauge une heure dans une eau contenant des larves de schistosomes qui traversent sa peau, puis héberge le parasite jusqu'à ce qu'il ponde, avant d'être tué pour récupérer les œufs. Le porteur qualifie cette infestation d'indolore et affirme utiliser les animaux avant que l'accumulation des œufs, qui grossit le foie et la rate, ne provoque de souffrance. Il présente ce maintien permanent de cycles parasitaires comme la base "nécessaire et indispensable" à tous ses projets sur la schistosomose, et le juge impossible à reproduire in vitro faute d'hôte vertébré.

Objectifs

La Bilharziose ou schistosomose est la maladie parasitaire humaine la plus répandue dans le monde après le paludisme. Le cycle biologique de ce parasite se réalise dans de l’eau douce et nécessite deux hôtes : l’Homme, un rongeur ou une vache dans lequel le schistosome se reproduit et un escargot d’eau douce dans lequel le schistosome se multiplie. Les passages entre les hôtes se font grâce à des larves nageantes qui pénètrent par la peau. Dans les pays où la maladie est persistante et où de nombreuses personnes sont infestées, comme en Afrique, nos études permettent de développer des stratégies de contrôle de la maladie : par exemple, nous testons l’effet de substances sur le développement et la survie des parasites ; nous formons des enseignants à connaître cette maladie et à lutter contre elle pour qu’ils enseignent à leur tour à leurs élèves. Concernant les pays dans lesquels la maladie est récente, où peu de personnes sont infestées mais où la maladie peut se répandre, comme l’Europe, nos projets permettent d’analyser les effets du changement climatique sur la propagation de la maladie. Par exemple, nous recherchons quels sont les animaux qui peuvent transmettre la maladie, nous analysons le comportement des larves de parasites en fonction du pays de provenance, en fonction de l’animal qui est infesté (Homme ou rongeur), nous analysons grâce la biologie moléculaire s’il existe des parasites hybrides et étudions leur comportement.

Bénéfices attendus

Il existe de nombreux bénéfices qui peuvent découler de nos projets : des connaissances pour la recherche dite fondamentale afin de mieux comprendre la diversité de ces parasites et des bénéfices pour la recherche appliquée où nos résultats peuvent être utilisés dans la lutte contre cette maladie. La maintenance des cycles biologiques constituent la base nécessaire et indispensable à tous les projets scientifiques concernant la schistosomose. Ils permettent aux chercheurs d’avoir une base à partir de laquelle ils peuvent monter leurs propres projets.

Procédures

Chaque rongeur, vigile, est placé dans un bac transparent adapté, avec 0,5 cm de hauteur d’eau de forage à 25°C contenant les larves de parasites issues des mollusques ; il patauge pendant une heure sous surveillance (seules les pattes et la queue trempent dans l’eau) ; la pénétration des larves de parasite à travers la peau des rongeurs est indolore. Au bout d’une heure, le rongeur est replacé dans sa cage identifiée en fonction du parasite utilisé et la cage ramenée par un personnel habilité dans la salle d’hébergement correspondante des animaux (souris ou hamsters) infestés.

Impact sur les animaux

Pour leur infestation, les rongeurs sont transférés de leur cage vers un bac transparent contenant 0,5 cm de hauteur d’eau de forage à 25°C ainsi que les larves de parasites issues des mollusques ; le pataugeage dure 1 heure ; c’est le mode d’infestation naturel. La pénétration des larves de schistosome à travers la peau des rongeurs est indolore. Le développement des larves jusqu’au stade adulte ne peut provoquer de nuisances dans les tissus des rongeurs. Les parasites sont matures, et donc pondent des œufs, à partir de 2 mois chez la souris et de 3 mois chez le hamster. C’est l’accumulation des œufs du parasite au cours du temps qui est responsable de la pathologie liée à l’infestation par les schistosomes. Les symptômes visuels sont le grossissement du foie et de la rate dû à l’accumulation des œufs du parasite. Ces effets sont chroniques. Les animaux sont utilisés avant que le parasite n’induise de souffrance.

Devenir

Euthanasie des rongeurs pour récupération des œufs du parasite.

Remplacement

Impossible, on ne peut pas réaliser le cycle in vitro. En effet, le parasite a besoin d’un hôte vertébré et les rongeurs sont connus pour être des animaux réservoirs chez toutes les espèces de schistosomes.

Réduction

Pour chaque souche de schistosome nous utilisons le minimum d’individus nécessaires au maintien de l’ensemble de nos cycles biologiques. En effet, ceci nous permet de ne pas perdre les cycles biologiques de nos parasites pour lesquels il est difficile, voire impossible, de les récupérer sur le terrain.

Raffinement

Pour chaque cycle de schistosome entretenu, l’infestation se fait avec le nombre optimal de parasites permettant à la fois le bien-être de l’animal et le maintien du cycle du parasite. La pénétration des larves de parasite à travers la peau des rongeurs est indolore. Une surveillance quotidienne par les zootechniciens est effectuée. Afin de maintenir une socialisation, tout rongeur se retrouvant seul dans une cage est placé, après marquage non toxique sur la queue ou sur le pelage, dans une autre cage contenant des rongeurs infestés par la même souche de parasite. Les animaux bénéficient d’enrichissements de milieu tels que des tunnels en plastique ou en carton, des Aspen bricks (petits bouts de bois à ronger) et des carrés de coton pour la nidification. Ces différents enrichissements permettent qu’ils aient des activités ludiques et sociales.

Choix des espèces

Le choix pour les rongeurs s’est porté sur les souris (Mus musculus) qui présentent la meilleure compatibilité avec nos différentes espèces/souches (actuellement 3 espèces, Schistosoma mansoni, Schistosoma rodhaini et Schistosoma bovis avec un total de 12 souches) et les hamsters dorés (Mesocricetus auratus) pour les 3 souches de l’espèce Schistosoma haematobium avec lesquelles la souris n’est pas compatible. Animaux adultes. Les animaux sont infestés entre 6 et 16 semaines.

150 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Hébergés seuls pendant trente-huit jours, ils sont soumis à des régimes à base de protéines végétales, à des mesures de force et de composition corporelle, à un séjour en cage à métabolisme pour une partie d'entre eux, puis gavés ou injectés avant d'être tués pour analyser leurs muscles. Le porteur indique que l'isolement et la cage à métabolisme causent un stress léger et présente le rat comme le modèle préconisé par la FAO pour évaluer la qualité nutritionnelle d'un régime. Il affirme que le recours aux animaux est "absolument nécessaire" et que l'étude ne peut être menée chez l'humain, faute de production suffisante de graines germées.

Objectifs

L’augmentation de la population mondiale va rendre difficilement supportable, d’un point de vue écologique, l’évolution constante de la consommation de protéines alimentaires de sources animales. Il est donc nécessaire de développer de nouveaux aliments à base d’ingrédients végétaux riches en protéines de bonne qualité alimentaire. Cependant, la consommation de ces produits végétaux est souvent limitée en raison de leur contenu en facteurs antinutritionnels (FAN) qui diminue la digestibilité protéique. Il devient alors nécessaire de développer de nouveaux procédés de transformation limitant le contenu en FAN pour la production d’aliments destinés à l’alimentation humaine. La germination au sens strict, est un processus biologique qui commence à l’imbibition d’une graine quiescente nondormante et s’achève au moment de la rupture du tégument et de l’émergence de l’embryon. Ainsi la germination correspond à la reprise des métabolismes et à la réorganisation des composants cellulaires avant la consommation des réserves protéiques de la graine au moment de la percée radiculaire et de la croissance de la jeune plantule. Ce processus biologique dépend des conditions d’imbibition (température, lumière, O2...), de l’environnement microbiologique et de la valeur intrinsèque à la graine (espèce, variété, âge, taux d’oxydation des protéines). Sur le plan nutritionnel, de nombreux travaux montrent que la germination améliore l’accessibilité aux protéines stockées dans la graine, augmente la teneur en micronutriments et améliore les capacités anti-oxydantes de la graine, mais aussi des farines qui en sont issues. De plus, le processus de germination diminue le contenu en FAN. L’objectif de ce projet sera d’évaluer l’impact de la germination sur la densité nutritionnelle et la qualité alimentaire de farines ou d’isolats protéiques produits à partir de graines de céréales, de légumineuses et d’oléagineux. Cette étude sera menée chez le rat en croissance. Les effets bénéfices sur le plan nutritionnel de farines ou d’isolats protéiques produits à partir de graines germées seront appréhendés par comparaison avec des farines ou des isolats protéiques issus de graines non germées et avec un régime témoin à base de protéines animales (caséine).

Bénéfices attendus

L’augmentation de la population mondiale va rendre difficilement supportable, d’un point de vue écologique, l’évolution constante de la consommation de protéines alimentaires de sources animales. Il est donc nécessaire de développer de nouveaux aliments à base d’ingrédients végétaux riches en protéines de bonne qualité alimentaire. Toutefois, la présence de facteurs antinutritionnels (FAN) dans les aliments végétaux ainsi qu’une réticulation importante des protéines végétales les rendent moins digestibles pour l’Homme. L’utilisation de la germination pourrait permettre de lever ce verrou. La germination est un processus de développement de la plante contenu dans sa graine qui débute par une étape de reprise de l’activité métabolique après une période de dormance, ces graines sont alors dites « germées ». Ce bioprocédé est à la fois respectueux de l’environnement mais également simple à mettre en place, et peu coûteux. Il diminue le contenu en FAN, augmente l’accessibilité et la teneur en protéines et en micronutriments (sodium, magnésium, fer, zinc) ainsi que les capacités anti-oxydantes des graines (polyphenols). Ce projet pourrait donc permettre de mettre en évidence qu’un bioprocédé de transformation, la germination, permettrait de lever le verrou lié à l’utilisation de végétaux comme source de protéines alimentaires. Ce bioprocédé de transformation est d’autant plus interessant qu’il respecte le concept de « Naturalité » inscrit dans la transition alimentaire à laquelle nous faisons face actuellement.

Procédures

Les rats seront hébergés en cage individuelle pour contrôler précisément leur consommation pendant toute la durée du protocole depuis leur arrivée à l’animalerie jusqu’à leur mise à mort soit 38 jours au total. Les animaux subiront diverses interventions au début et à la fin du protocole. Elles auront pour but de : -mesurer la composition corporelle sur animal vigile via une technique non invasive peu stressante réalisée 2 fois et d’une durée de 2 minutes à chaque fois. -mesurer la fonctionnalité musculaire de façon non invasive et sur animal vigile. Cette mesure fait intervenir 4 appareils. Ces mesures seront réalisées sur la base du « volontariat » car il est impossible d’obliger les animaux à réaliser les exercices. L’appareil 1 servira à mesurer la force et sera utilisé 2 fois pour une durée de manipulation de l’animal de 30 secondes à chaque fois. L’appareil 2 permettra d’évaluer l’équilibre et la coordination motrice et sera utilisé 2 fois. La durée dépendra de l’endurance et de la volonté du rat à réaliser l’exercice (5 minutes au maximum). L’appareil 3 permettra d’évaluer des paramètres statiques (surface des empreintes…) et dynamiques (vitesse…) de la locomotion. Il sera utilisé 2 fois et l’exercice durera moins de 7 secondes à chaque fois. Enfin, l’appareil 4 permettra d’appréhender l’activité ambulatoire totale et ne sera utilisé qu’à la fin du protocole. L’expérience dure 10 minutes et est non stressante. 150 rats concernés. -mesurer la rétention azotée (azote ingérée – azote excrétée) au niveau corps entier. Cette mesure nécessite la récupération de la totalité des fèces et de l’urine produits. Une partie des rats (80 rats) seront hébergés dans une cage métabolique conçue pour permettre cette récupération. La durée du passage sera réduite au maximum (4 jours au total) sans compromettre les résultats du projet. – mesure de la synthèse protéique dans les muscles squelettiques en fin de protocole. Après avoir été mis à jeun la veille, une partie des rats (80 animaux) subiront, le matin, une injection permettant de mesurer la synthèse protéique 50 minutes avant l’euthanasie. Les autres rats (70 animaux), après avoir été mis à jeun la veille, seront gavés avec un mélange permettant de mimer un repas. Ces rats subiront ensuite une injection permettant de mesurer la synthèse protéique 50 minutes avant l’euthanasie. Tous les rats seront ensuite mis à mort sous anesthésie générale gazeuse.

Impact sur les animaux

A leur arrivée, les animaux seront âgés de 4 mois. A la fin du protocole, ils seront mis à mort à l’âge de 9-10 semaines. Au cours de cette période de 5-6 semaines (dont 10 jours d’acclimatation) et en raison de l’avancée en âge, les rats auront pris du poids, de la masse grasse et de la masse maigre. Les différents régimes devraient moduler toutes ces modifications. L’hébergement des rats leur occasionnera un léger stress. En effet, les rats seront hébergés en cage individuelle afin de contrôler précisément leur consommation. De plus, 80 rats sur les 150 au total seront hébergés les 4 derniers jours du protocole dans une cage métabolique afin de récupérer l’ensemble des excréments. Durant le protocole, les animaliers observeront quotidiennement le comportement général de chaque rat, son apparence et contrôleront la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur un cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Si un animal présente 3 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum. Plusieurs mesures de composition corporelle et de fonctionnalité musculaire seront réalisées. Ces mesures seront effectuées sur animal vigile mais sont peu stressantes. Enfin, une mesure de synthèse protéique musculaire sera réalisée chez les rats. Cette mesure nécessite l’injection d’une molécule non toxique et n’induisant pas de douleur en soi diluée dans du sérum physiologique, par voie sous cutanée 50 minutes avant la mise à mort. Les injections seront réalisées sur le dos de l’animal. Pour limiter le stress et la douleur induits par l’injection, il ne sera jamais injecté plus de 10ml de la solution à un animal et il ne sera jamais injecté plus de 2ml de solution en un même point. La première injection sera effectuée entre les omoplates. 70 rats sur les 150 seront également gavés avant l’injection. Pour réduire le stress des animaux induit par la contention et le gavage, les gestes seront réalisés par des manipulateurs expérimentés.

Devenir

A la fin des 3 procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir réaliser les analyses sur les différents tissus prélevés qui permettront de répondre aux objectifs du projet.

Remplacement

L’utilisation d’animaux, dans ce projet est absolument nécessaire et ne peut être remplacer par l’utilisation de systèmes de culture cellulaire ne permettant pas de mesurer simultanément la digestibilité des différentes sources de protéines, l’évolution de la fonctionnalité musculaire, de la performance et de la mobilité, le métabolisme protéique musculaire et le statut inflammatoire circulant. En l’état, ce projet ne peut pas non plus être mené directement chez l’Homme. En effet, actuellement, la production de graines germées reste très limitée en France à cause des contraintes sanitaires extrêmement strictes afin de limiter les contaminations bactériennes. En effet, les graines peuvent contenir des micro-organismes pathogènes qui sont principalement des bactéries Escherichia coli pathogènes, et Salmonella. Aussi, depuis 2013, la réglementation européenne à renforcer la traçabilité et les garanties sanitaires des graines germées (règlement d’exécution (UE) no 208/2013) et les opérateurs produisant ces graines doivent donc désormais mettre en place des mesures additionnelles de gestion de sécurité des denrées alimentaires. Ainsi, à cause de ces contraintes sanitaires lourdes, peu de produits issus de graines germées sont présents sur le marché national. Les farines et isolats protéiques issus des graines germées ou non qui seront testées dans ce projet ne pourront être produits qu’en quantité trop limitée pour envisager l’utilisation de ces farines pour réaliser des produits de panification ou des biscuits qui pourraient être utilisés pour une étude humaine. Mais par contre, ce projet pourrait promouvoir auprès des entreprises agro-alimentaires la production ainsi que l’utilisation de graines germées pour la confection de différents produits de panification et de pâtisserie par exemple. Il est à noter qu’avant de réaliser les régimes fournis ensuite aux animaux les farines ou isolats protéiques seront analysés d’un point de vue nutritionnel et microbiologique garantissant leur innocuité.

Réduction

Les résultats d’études antérieures menées sur des rats nourris avec des farines produites à partir de céréales non germées ont permis de réduire le nombre d’animaux utilisés à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Le nombre total de rats nécessaires à la réalisation de ce projet est 150.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Les rats seront hébergés individuellement dans des cages adaptées à leur poids. Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque rat, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur un cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Si un animal présente 3 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum.

Choix des espèces

Les animaux utilisés sont des rats Wistar âgés de 4 semaines car ces animaux présentent un métabolisme très proche de celui de l'Homme tout particulièrement au niveau de notre métabolisme cible, le métabolisme protéique. C’est pourquoi le choix de cette espèce est préconisée par l’Organisation des Nations Unies pour l’alimentation et l’agriculture (Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO) pour évaluer l’efficacité nutritionnelle d’un régime. Ce modèle est bien connu du laboratoire et de nombreuses études menées au sein de l’équipe de recherche l’ont utilisé. L’étude vise à évaluer l’efficacité alimentaire et de caractériser l’effet d’un régime à base de protéines végétales issues de graines germées ou non sur le métabolisme protéique musculaire chez le rat en croissance. Les animaux seront âgés de 4 semaines et seront de poids homogène (environ 300g) au début du protocole. Ils seront âgés de 9-10 semaine à la fin de l’étude en tenant compte des 10 jours d’acclimatation.

28 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des femelles gestantes reçoivent dans leur eau de boisson un composé qui abaisse leur taux d'hormone thyroïdienne, puis les animaux sont tués pour prélever leurs intestins et mettre en culture leurs cellules gliales. Le porteur indique que le traitement pourrait perturber l'alimentation et provoquer de l'agressivité, et qualifie l'effectif de réduit au strict minimum. L'objectif déclaré est d'étudier, avec une équipe chilienne, l'effet d'une carence thyroïdienne maternelle sur l'inflammation intestinale de la descendance.

Objectifs

Les hormones thyroïdiennes maternelles sont essentielles au développement et à la différenciation cellulaire du fœtus. Des carences en hormones thyroidiennes maternelles affectent de manière irréversible le développement du système nerveux central, des poumons, de l'intestin, des muscles squelettiques, des os, de la réponse immunitaire et de la réponse physiologique au stress chez la descendance. L'hypothyroxinémie gestationnelle (HTX) est une forme d’hypothyroïdie dans laquelle la concentration sanguine de T3 (l’hormone thyroïdienne active) est normale alors que celle de T4 (précurseur de T3) est diminuée. Cette anomalie en T4 peut être la conséquence d’un régime alimentaire pauvre en iode ou d’une hypertension. Des modèles d’HTX maternelle chez la souris et le rat montrent l’existence de troubles digestifs chez la descendance associé à une inflammation intestinale. On sait que les cellules gliales entériques du système nerveux entérique jouent un rôle central dans la physiologie intestinale et dans les mécanismes inflammatoires au niveau intestinal. Cependant, on ignore l’impact d’une HTX maternelle sur les cellules gliales entériques. L’objectif du projet sera d’étudier l’impact d’une HTX maternelle sur le statut inflammatoire des cellules gliales entériques et leur réponse à différents agents inflammatoires, et cela sur la descendance à l’adolescence et au stade adulte.

Bénéfices attendus

L’hypothyroxinémie maternelle constitue un facteur de risque de développer des maladies inflammatoires intestinales plus tard au cours de la vie. Le système nerveux entérique, et en particulier les cellules gliales entériques, sont des acteurs majeurs dans les processus inflammatoires de l’intestin. Cependant, les conséquences de l’hypothyroxinémie sur le statut inflammatoire des cellules gliales entériques sont encore largement inconnues. Dans ce contexte, l’étude dans un modèle rongeur de l’impact d’une hypothyroxinémie maternelle sur les cellules gliales entériques présente un réel intérêt pour la compréhension des mécanismes impliqués, mais également dans la perspective d’un traitement thérapeutique des atteintes inflammatoires de l’intestin associés à une hypothyroxinémie. Cette étude sera réalisée et financée en collaboration avec une équipe du Chili.

Procédures

Les animaux ne seront pas soumis à des interventions invasives. La seule intervention est l’addition de 0,02% de 2-mercapto-1- methylimidazole (MMI) dans l’eau de boisson des mères gestantes entre le stade gestationnel 10 et 14 jours après accouplement.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues seraient faibles. Les animaux pourraient ne pas supporter le traitement et avoir une alimentation modifiée entrainant une absence de prise de nourriture. Les animaux pourraient avoir un comportement altéré induisant une agressivité. Tous ces signes seront observés quotidiennement au cours du traitement.

Devenir

Mise à mort des animaux pour collecter les intestins des animaux afin de récupérer les cellules et les mettre en culture.

Remplacement

Le modèle de culture de cellules gliales nécessite l’utilisation d’intestins d’animaux. Pour notre étude des conséquences de l’hypothyroxinémie sur le statut inflammatoire des cellules gliales entériques, nous ne pouvons pas remplacer l’utilisation de rongeurs.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au strict minimum. Nous avons décidé de réaliser une étude préliminaire avec au total 8 souris gestantes (4 contrôles et 4 traitées) afin de définir le meilleur stade pour mettre en culture les cellules gliales. A l’issue de ces tests, 10 souris gestantes contrôles et 10 traitées sont prévues. La culture de cellules gliales se fait en collectant les ganglions à la suite de différents traitements et les intestins de souris sont petits. Pour avoir suffisamment de « matériel » pour effectuer la culture, nous avons besoin de 10 souris gestantes/condition. Nous estimons que nous aurons 6-7 souriceaux max/femelle gestante.

Raffinement

Le bien être animal sera pris en compte tout au long de l’expérimentation. Nous recevrons les femelles gestantes 4 jours avant le début du traitement. Les animaux seront hébergés dans des cages avec de la litière et des enrichissements tels que des frisottis pour se faire des nids. Une observation quotidienne sera effectuée tout au long du traitement (de 10 à 14 jours après l’accouplement). A la naissance, les petits seront hébergés avec leur mère et ce jusqu’au sevrage à 21 jours après la naissance. Les signes cliniques seront observés et les animaux seront exclus de l’étude s’ils présentent 2 ou 3 signes cliniques notables ou 1 seul des signes cliniques sévères.

Choix des espèces

La souris a été choisie pour ce projet car l’induction d’une hypothyroxinémie chez une mère gestante est bien caractérisée dans cette espèce. En effet , des résultats préliminaires ont déjà été obtenus chez la souris par nos collaborateurs du Chili. Les souris gestantes seront réceptionnées au stade gestationnel 6 jours après accouplement et recevront 0,02% de 2-mercapto-1-methylimidazole (MMI) dissout dans l’eau de boisson entre le stade gestationnel 10 et 14 après accouplement. En parallèle, les animaux témoins recevront de l’eau de boisson classique. Les mères seront gardées jusqu’au sevrage des souriceaux, qui seront gardés eux-mêmes jusqu’à l’âge 30 ou 55 jours, correspondant respectivement à un stade adolescent ou adulte.

10 000 civelles d'anguille européenne, espèce en danger critique d'extinction, vont être capturées puis relâchées dans leur milieu, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque individu est anesthésié puis reçoit sous la peau une petite quantité d'élastomère servant de marque, avant un réveil et une remise à l'eau près du lieu de capture. Le porteur indique que le marquage peut causer un stress et une gêne postopératoire de courte durée. L'objectif déclaré est de suivre le comportement migratoire des civelles pour évaluer une passe à poissons, dans une visée de conservation de l'espèce.

Objectifs

Le site du grau de la Fourcade aux Saintes-Maries-de-la-Mer ne permet pas à ce jour une migration naturelle des civelles vers la lagune du Vaccarès. L'accès à la lagune est en effet conditionnée par la gestion des martelières du grau de la Fourcade et la majorité des civelles sont actuellement capturées au sein d'une passe-piège à anguilles juxtaposée au grau. Le suivi de cette passe-piège mené depuis 2004 permet ainsi d'étudier l'évolution des arrivées de civelles et d'améliorer leur colonisation dans la lagune du Vaccarès. Le site du grau de la Fourcade sera néamoins équipé courant 2024 d'une passe à poisson couplée d'une passe à anguilles dont le but est d'améliorer la colonisation naturelle des civelles vers la lagune du Vaccarès. Le projet vise à étudier le comportement migratoire des civelles sur ce site afin de favoriser une gestion des martelières plus efficace et déterminer à terme si la passe à anguille nouvellement installée permet le franchissement des civelles vers la lagune du Vaccarès. Ces connaissances sont indispensables pour protéger cette espèce en "Danger critique d'extinction".

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'apprécier l'efficacité de la future passe à anguille et ainsi nuancer les éventuelles variations de capture à la passe-piège. De plus, une meilleure connaissance du comportement de migration des civelles permettra de déterminer l'importance de la colonisation naturelle selon les conditions environnementales rencontrées et préconniser une gestion des martelières compatible avec la colonisation des civelles dans le Vaccarès.

Procédures

Sédation/anesthésie profonde (5-10 minutes), introduction d'une petite quantité d'élastomère sous la peau de l'animal à l'aide d'une seringue sous anesthésie générale (30 secondes), suivi d'un réveil et de la remise en contact avec les congénères dans un bac de stabulation (environ 2h en observation).

Impact sur les animaux

L'anesthésie, la biométrie peuvent occasioner un stress de courte durée pour les animaux au moment de leur manipulation. Le marquage par V.I.E peut induire un stress et une douleur/gêne post-opératoire de courte durée.

Devenir

Tous les individus capturés sont relâchés dans le milieu naturel, à proximité de leur lieu de capture. A chaque session de marquage, un lot témoin de 50 individus sera maintenu en couve à proximité du lieu de capture afin d'attester du bon état des individus marqués. Ces individus seront également relâchés à la fin de chaque session.

Remplacement

L'étude vise à étudier le comportement d'individus sauvages dans leur milieu naturel. Les connaissances scientifiques actuelles ne permettent pas la reproduction en captivité de l'Anguille européenne et il n'est donc pas possible de trouver de subsitut.

Réduction

Le marquage a été limité à cinq campagnes de deux sessions. Cette approche permet de limiter l'impact sur le milieu (836 000 individus capturés en moyenne à la passe-piège entre 2004 et 2021), tout en assurant un nombre d'individus suffisant pour que les résultats soient exploitables sur le plan scientifique.

Raffinement

Avant et après le marquage, de l'enrichissement est proposé aux animaux pour limiter leur stress durant leur stabulation (habitats artificiels pour se cacher, recouvrement des bacs pour un maintien dans l'obscurité, oxygénation des bacs).

Choix des espèces

Le grau de la Fourcade représente un des sites majeur du recrutement en civelles de la façade méditerranéenne française. L'anguille, classée en danger critique d'extinction, bénéficie d'un plan de gestion national, décliné à l'échelle du bassin méditerranéen par le PLAGEPOMI. Le suivi de la reconquête effective des axes de migration sur ce site à enjeu représente un fort interêt pour cette espèce. Les anguilles seront marquées au stade civelle, individus arrivant de la mer et amorçant leur phase de colonisation vers la lagune du Vaccarès. Tous les individus appartiennent à la même espèce : Anguilla anguilla.

Pour repérer à leur odeur les chevaux porteurs de larves de mouches gastérophiles, parasites de l'estomac, 100 équidés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis tous gardés en vie pour être réutilisés. Trois fois dans l'année, chaque cheval subit un prélèvement de matières fécales dans le rectum et une gastroscopie sous sédation, la sonde passant de la narine à l'estomac après 24 heures de jeûne. Une fois par an, après un vermifuge, il reste 96 heures isolé de son groupe dans un box sans paille, sur des tapis de mousse, avec une sortie quotidienne en paddock, pendant que l'équipe compte les larves qu'il expulse. Le porteur range l'ensemble parmi des "actes d'élevage couramment utilisés" et promet des "solutions innovantes à la filière équine".

Objectifs

Par manque de diagnostic spécifique et efficace, le contrôle des endoparasites des chevaux se fait en utilisant des antiparasitaires de synthèse en routine et sans évaluation préalable. Cette utilisation non raisonnée des vermifuges sélectionne des isolats parasitaires résistants. De plus, les résidus de ces traitements sont relargués dans l’environnement et constituent une source importante de pollution. Une réduction de leur usage est donc souhaitable mais il n'existe pas de solutions alternatives de contrôle pour la gestion de ces mouches. Ces mouches sont responsables d'ulcères de l'estomac des chevaux. Pour mieux raisonner les usages, nous proposons d’associer le statut physiologique et parasitaire de l’hôte à la signature odorante des équidés. Les composés odorants isolés permettront d’identifier les animaux ayant un besoin de traitement ou de mettre en place des stratégies de piégeage des mouches dans les prairies.

Bénéfices attendus

Les connaissances qui seront acquises à la fin de ce projet seront très originales et apporteront des solutions innovantes à la filière équine en santé animale. L’innovation de notre projet et notre ambition sont d’établir les bases pour un diagnostic du parasitisme grâce aux odeurs émises par les équidés parasités. Nos résultats combleront également l’ignorance sur des sujets comme les interactions de la faune gastrointestinale des équidés et proposeront des mesures concrètes pour évaluer le parasitisme. Jusqu’à présent, le problème émergent des gastérophiles restait invisible grâce à leur traitement opportuniste en même temps que le traitement des nématodes gastrointestinaux. Ainsi, nous n’avions à disposition aucun moyen diagnostique du problème. Le suivi du changement des odeurs lorsqu’un animal est parasité aidera aussi à définir de nouveaux seuils de parasitisme acceptables pour le bien-être animal. Cette nouvelle approche de gestion du parasitisme se veut adaptée à l’état physiologique de l’animal et à ses besoins de traitement. Ceci nous permettra de limiter l’utilisation de molécules chimiques. Dans le cadre du concept One Health, notre équipe proposera des nouvelles molécules naturelles, issues de la chimiosensation des parasites (habilité de détecter des molécules présentes dans l’environnement et pour la plupart impliquées dans des fonctions vitales pour l’organisme), qui viendront appuyer les efforts pour le développement de moyens de lutte plus respectueux de l’environnement et du bien-être animal. Ces stratégies alternatives de lutte ne sont pas incompatibles avec les traitements actuels et aideront à diminuer progressivement les traitements pharmacologiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à des gastroscopies sous sédation (intervention de 20 min) et des prélèvements de matière fécale intra-rectale. Chaque acte sera effectuée 3 fois dans l'année pour chaque animal.

Impact sur les animaux

Les actes prévus par ce projet sont des actes d’élevage couramment utilisés (coproscopies, vermifugations, gastroscopies, tonte). Les effets indésirables pour les animaux pourraient venir des gastroscopies qui nous obligent de maintenir à jeun les chevaux pendant 24 heures. Les animaux sont ensuite sédatés pour pouvoir passer la sonde du gastroscope de la narine jusqu’à leur estomac. Avec la sédation nous essayons de minimiser les effets désagréables de l’endoscopie mais dans aucun cas ce protocole n’engendre un danger pour la santé de l’animal. Un autre effet désagréable pour les animaux est le maintien pendant 96h dans des boxes lors du comptage des larves de gastérophiles excrétées suite à la vermifugation. Des tapis en mousse sont fournies aux chevaux pour minimiser leur inconfort. L’inconfort peut venir de l’isolement de l’individu de son groupe et le manque de paillage au sol. Cette procédure ne se produit qu’une fois par an pour chaque cheval impliqué mais elle est nécessaire pour avoir le nombre exact de larves présentes dans l’estomac de chaque animal avant la vermifugation et établir ainsi la charge parasitaire qui caractérise chaque individu. L’animal a du foin ad libitum et il est sorti dans un paddock sablé tous les jours durant le protocole. Il voit plusieurs fois par jours les animaliers et les expérimentateurs qui surveillent de près son comportement.

Devenir

Les interventions réalisées dans ce projet correspondent à des actes d'élevage couramment utilisés, qui ne remettent pas en cause le bien-être ou la santé de l'animal.

Remplacement

Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle alternatif de maintien du cycle d’infestation des gastérophiles in vitro. De plus, nos activités consiste à évaluer la charge parasitaire des animaux en lien avec différentts modes de lutte, ce qui n’est pas possible sans animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum nécessaire pour mettre en évidence les effets recherchés. En revanche, chaque période de vermifugation recquiert des chevaux différents.

Raffinement

Suite à la vermifugation les animaux seront maintenus dans des boxes tapissés avec des tapis en mousse pour réduire leur inconfort dû à l’absence de paillage. Des visites régulières (toutes les heures durant la journée et une fois dans la nuit) seront effectuée par les animaliers pour surveiller le comportement des animaux et détecter d’éventuels signes de stress accru. La gastroscopies sont réalisées après sédation par deux vétérinaires spécialistes en médecine équine, référents pour le troupeau de l'établissement utilisateur.

Choix des espèces

Les gastérophiles sont des parasites inféodés aux chevaux. Notre projet porte sur toutes les classes d'âge rencontrées en élevage.

1100 blaireaux vont être capturés au piège, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclarée légère, 935 étant relâchés après vaccination et environ 165 tués. Sous anesthésie ou contention, ils subissent des prélèvements de sang, une injection de vaccin, une tonte et la pose d'un transpondeur, les blaireaux testés positifs à la tuberculose bovine étant mis à mort par obligation réglementaire. Le porteur signale un stress de capture et de rares lésions, dents, griffes ou fracture de la mâchoire chez moins d'un blaireau sur mille. Il présente la vaccination comme complémentaire de l'abattage pour réduire l'infection, la finalité étant de protéger les élevages bovins, le remplacement ne pouvant selon lui s'appliquer.

Objectifs

Le projet s’inscrit dans le cadre de l’étude de moyens de lutte contre la tuberculose bovine en France dans le compartiment sauvage. Depuis plusieurs années en France continentale, des infections à Mycobacterium bovis ont été identifiées autour de foyers bovins de tuberculose chez plusieurs espèces sauvages (Blaireau, Cerf, Sanglier, Chevreuil, Renard). A ce jour, la lutte contre la tuberculose dans le compartiment sauvage repose sur différentes actions dont notamment : - L’identification des zones d’infection par dépistage régulier sur les blaireaux. - La diminution des densités de blaireaux par piégeage puis abattage en zones infectées en priorisant les zones à proximité des élevages foyers. - La gestion des déchets de chasse, la maitrise des populations de sangliers, l’amélioration de la biosécurité en élevage pour limiter les interaction bovins - faune sauvage. Concernant le Blaireau, la mise en place de mesures de lutte s’inscrit dans un contexte particulier lié à l’inscription de cette espèce à l’annexe III de la Convention de Berne. Ainsi, tout prélèvement doit être réglementé de manière à maintenir l’existence de ces populations hors de danger de conservation. L’objectif général du projet est l’étude d’une méthode complémentaire à l’abattage des blaireaux pour diminuer leur taux d’infection par la tuberculose bovine dans les zones avec de l’infection dans les populations d’animaux domestiques et sauvages, comme préconisé dans l’avis de 2019 de l’Anses, l’Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail. Les objectifs particuliers du projet sont de : - Tester la faisabilité opérationnelle de mise en œuvre d’une vaccination par voie injectable des blaireaux dans une zone infectée de tuberculose bovine, en utilisant un vaccin commercialisé pour les humains qui a montré son efficacité et son innocuité sur le Blaireau. - Mesurer l’effet de cette vaccination sur les taux d’infection des blaireaux et des bovins après déploiement dans cette zone pendant 4 ans. La finalité opérationnelle du projet est de développer des procédures pour le déploiement d’une vaccination des blaireaux par voie injectable dans d’autres zones d’infection et à terme de proposer une méthode alternative à l’abattage non discriminé de blaireaux. Le projet vise aussi à tester des procédures permettant une mise en œuvre la plus simple possible de cette vaccination pour permettre son déploiement sur tout ou partie des zones infectées en France.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet en termes de recherche et de lutte contre la tuberculose bovine sont de contribuer à montrer que l’usage de la vaccination injectable est faisable d’un point de vue opérationnel, et permet de diminuer les taux d’infection des populations de blaireaux de zones très infectées et cela, dans le contexte français de densités moyennes de blaireaux (assez proche de la situation d’Irlande du Nord). La perspective liée à ce projet est de pouvoir proposer un abattage ciblé des animaux infectés, couplé à une vaccination permettant de réduire le risque d’infection des populations de blaireaux dans les zones avec un taux d’infection de tuberculose bovine élevé dans les élevages bovins et les populations de blaireaux, et ceci dans le but de contribuer à diminuer ce taux d’infection dans les élevages bovins. A terme, lorsque ce taux d’infection aura diminué, la vaccination pourrait même se substituer totalement à l’abattage comme c’est le cas actuellement en République d’Irlande, où chaque année, un vaste programme de vaccination est déployé sur une zone d’environ 20 000 km2. A titre de comparaison, le protocole similaire appliqué en Irlande du Nord a permis de montrer, entre 2015 et 2018, une diminution de la proportion de blaireaux positifs parmi les animaux capturés pour la première fois, passant de 18 pour cent en 2015 à 2 pour cent en 2018. Ce projet a été réalisé sur une surface équivalente à celle de notre projet, les densités de blaireaux sont considérées comme proches par les spécialistes de l’espèce et le taux initial d’infection des populations de blaireaux est proche de celui de notre zone d’étude. Un bénéfice individuel pour les blaireaux est également attendu puisque la diminution du taux d’infection de la tuberculose bovine dans les populations de blaireaux va diminuer le nombre d’animaux risquant d’exprimer la maladie. En outre, si cette méthode s’avère efficace sur la baisse du taux d’infection, le nombre de blaireaux abattus sera réduit, permettant une mesure plus éthique de lutte contre la tuberculose bovine chez cette espèce. De plus, d’un point de vue scientifique, notre projet, via la mutualisation des prélèvements réalisés, contribuera à consolider les connaissances relatives à l’étude de la réponse immunitaire post-infection chez le blaireau et à la validation d’autres tests diagnostiques.

Procédures

Le nombre de captures par individu sur la durée du projet n’est pas prévisible car un même individu peut se faire recapturer plusieurs fois au cours d’une même année. Les animaux recapturés durant une même année, seront relâchés immédiatement. Les blaireaux capturés feront l’objet, selon l’année de primo-capture, de maximum 0 à 2 pesées, 0 à 2 anesthésies (30 min par anesthésie) et 0 à 2 contentions (environ 5 min) sur la durée des 4 ans. Entre 2 anesthésies, 2 contentions, ou 1 anesthésie et 1 contention, il y aura minimum 8 mois d’intervalle. Pendant l'anesthésie, selon l’année de capture, les blaireaux feront l’objet des prélèvements de sang et d’une injection intramusculaire du vaccin (1ère dose et/ou rappel) et seront marqués par tonte localisée et pose d'un transpondeur sous cutané (à la première capture). La contention sur animal vigile sera pratiquée uniquement en année 2 et 3 pour prélever une goutte de sang, réaliser une injection intramusculaire du vaccin (1ère dose ou rappel), un marquage par tonte et la pose d’un transpondeur en sous cutané (à la première capture). Les prélèvements de sang permettront de déterminer si l'animal est négatif ou positif ou à la tuberculose bovine.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances induites par les protocoles envisagés sont liées 1/ à la capture : stress lors de la capture ; rares lésions observées lors de la capture (lésions mineures au niveau cutané, lésions dentaires ou des griffes chez 16 blaireaux pour mille, fracture de la mâchoire observée chez moins de 1 blaireau pour mille - données issues des captures réalisées en Irlande du Nord lors de campagnes de vaccination), 2/à l’anesthésie : possible très légère douleur lors de l’injection intra-musculaire de l’anesthésique, engourdissement passager lors du réveil de l'anesthésie, 3/ à la vaccination : légère inflammation au site de l'injection du vaccin.

Devenir

Sur les 1100 animaux inclus dans le projet, nous estimons que 85% de blaireaux seront testés négatifs à la tuberculose, soit 935 individus qui seront vaccinés, marqués et relâchés sur leur lieu de capture. Nous estimons que 15% de blaireaux seront testés positifs à la tuberculose bovine, soit environ 165. Ces individus testés positifs devront être mis à mort pour répondre à l'exigence réglementaire de lutte contre la tuberculose bovine.

Remplacement

L'objectif du projet étant d'atteindre un niveau d’immunité de la population de blaireaux localement suffisant pour limiter la circulation de l’infection et limiter le recours à l’abattage, tel qu’actuellement mis en œuvre pour lutter contre la tuberculose bovine dans les zones infectées, le principe de remplacement ne peut pas être appliqué.

Réduction

Selon le retour d’expérience des îles britanniques, un niveau de protection par vaccination de 60 pour cent de la population de blaireaux est jugé suffisant pour diminuer les taux d’infection dans la population. Les animaux vaccinés étant marqués, il sera possible grâce aux méthodes statistiques de capture-marquage-recapture d’estimer la taille de la population de notre zone d’étude. En année 2 ou 3, l’effort de piégeage pourra ainsi être ajusté à la hausse ou à la baisse en fonction des résultats obtenus pour atteindre ces 60 pour cent. Partant d'une population estimée à 600 blaireaux sur le terrain en année 1 du projet, et tenant compte d'une augmentation de la population et d'un besoin de vacciner 60 pour cent des blaireaux, nous estimons que 1100 blaireaux seront inclus sur la durée des 4 années du projet. Dans le projet, des essais de prélèvements seront faits sur un nombre limité de 10 animaux (5 jeunes et 5 adultes); ce nombre étant jugé suffisant pour valider la technique avant de l'aplliquer à la population de blaireaux.

Raffinement

Une vigilance particulière sera portée à l’étape de pose des pièges afin d’éviter tout incident lors de la capture : pose des collets pas trop proche d’une gueule de terrier (dans laquelle l’animal risquerait de se réfugier et d’être inatteignable) et en prenant en compte des éléments du paysage possiblement à risque (présence de tronc d’arbre par exemple, autour duquel l’animal risquerait d’enrouler le câble du collet). Toutes les équipes seront composées de piégeurs agréés ayant déjà une expérience de capture de la faune sauvage en milieu naturel. Afin de limiter le temps de capture, les cages-pièges et collets tendus seront relevés au lever du soleil tous les matins, le blaireau ayant une activité nocturne. Afin de limiter le stress et la douleur lors de certaines interventions, les animaux seront anesthésiés. Durant l’anesthésie, les blaireaux seront placés sur une couverture. En cas de conditions météorologiques impactantes, un contrôle de la température rectale sera réalisé et des mesures seront prises pour réchauffer ou refroidir l’animal si besoin. Pour le réveil, l’animal sera placé au calme à proximité de son terrier si la respiration est normale et s‘il présente les premiers réflexes de réveil. Le réveil sera suivi à distance jusqu’à ce que l’animal soit considéré en sécurité. Lors d’intervention sur animaux vigiles : - Pour les blaireaux capturés en cage, une grille passant à travers la cage sera placée afin de pousser délicatement l’animal au fond, facilitant l’intervention au travers des parois de la cage. - Lors de capture au collet, un opérateur s’approchera doucement de l’animal. Si celui-ci n’a pas la position fréquente de repli de la tête vers le sol, l’opérateur détournera son attention en attirant son regard à l’aide d’un bâton, pendant que l’opérateur 2 interviendra sur l’animal. Dans certains cas, l’animal sera immobilisé au niveau du cou par l’opérateur 1, à l’aide d’un lasso dédié à la manipulation des carnivores, pendant que l’opérateur 2 réalisera les gestes techniques.

Choix des espèces

Le Blaireau d’Europe est l’une des espèces sauvages pouvant être hôte de liaison de la tuberculose bovine au sein d’un complexe multi-hôtes où le réservoir principal est généralement constitué par les bovins. Les blaireaux partagent une partie de leur habitat avec les bovins (au niveau des pâtures) et, lorsqu’ils sont infectés, peuvent excréter Mycobacterium bovis, agent de la tuberculose bovine, dans cet environnement partagé, pouvant ainsi transmettre en retour la tuberculose bovine aux bovins. Dans certaines régions le taux d’infection estimé est très élevé chez les blaireaux piégés (pouvant aller jusqu’à 25 pour cent dans certaines communes). Les autres espèces sauvages sensibles à la tuberculose en France présentent des taux d’infection inférieurs et/ou n’ont pas le même rôle dans le maintien ou la transmission de la maladie. De plus, les mesures d’abattage liées à la gestion de la tuberculose bovine dans les zones infectées actuellement mises en œuvre concernent uniquement le blaireau. Le projet visant à développer une mesure complémentaire, voire alternative à l’abattage des blaireaux, aucune autre espèce ne peut être choisie. L’objectif est de vacciner les blaireaux au stade adulte et les jeunes à partir de 1 kg (1 à 2 mois environ pour avoir des animaux avec un système immunitaire suffisamment développé), afin d’atteindre une couverture vaccinale de 60 pour cent.

Une plateforme prélève à la demande sur des singes du sang, de la moelle osseuse, du liquide céphalo-rachidien, du sperme, du lait ou les humeurs de l'œil, pour les fournir à des laboratoires extérieurs. 800 macaques à longue queue, 150 ouistitis, 40 macaques rhésus et 10 singes vervets, soit 1 000 primates, vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, puis gardés en hébergement ou réutilisés dans d'autres projets. Chaque prélèvement commence par une capture : le singe est dirigé dans un tunnel jusqu'à un sabot de contention, deux actes que le porteur reconnaît comme "stressants". Pour le lait, les petits sont séparés de leur mère jusqu'à six heures, avec une peluche à laquelle s'agripper s'ils sont seuls, et pour le sperme, le mâle est isolé de son groupe jusqu'à 24 heures. Le porteur désigne ses demandeurs comme des "client chercheurs" et affirme que ces prélèvements suivent "parfaitement la règle des 3R".

Objectifs

L’accès à des échantillons biologiques de primates non humains (PNH) est un élément clé dans le développement préclinique. Ils permettent de valider in vitro différentes hypothèses scientifiques et de tester l’efficacité ou la toxicité de candidats médicaments. Autrement dit, utiliser des échantillons de PNH 1) permet de réduire l’utilisation d’animaux de laboratoire en les remplaçant par l’utilisation in vitro de cellules (plusieurs produits testés avec les cellules d’un seul animal) ; 2) rend le développement d’un médicament plus fiable, grâce à une sélection objective de l’espèce animale la plus proche de l’homme. Les prélèvements sont réalisés sur des animaux anesthésiés en suivant les recommandations correspondant aux bonnes pratiques chez l’Homme. De plus, un hébergement spacieux en groupe sociaux et un enrichissement du milieu adapté sont fournis à ces animaux. Anesthésie, analgésie, hébergement en groupe sociaux et enrichissement participent ainsi au principe de raffinement. La réalisation de prélèvements biologiques suit donc parfaitement la règle des 3R, tant dans son concept que dans sa réalisation. Pour les besoins de la recherche scientifique , l'objectif de ce projet est de proposer et fournir à la communauté scientifique la fourniture d’échantillons biologiques (sang et dérivés sanguins, cellules, tissus, fluides…). Le besoin en prélèvements biologiques/cellules de PNH est dépendant de projets extérieurs à la plateforme

Bénéfices attendus

D’un point de vue scientifique, les prélèvements de sang, moelle osseuse, liquide céphalo-rachidien, urine, humeur aqueuse, humeur vitrée, sperme, biopsies cutanées, biopsies musculaires, lait et liquide bronco-alvéolaire peuvent avoir de nombreuses utilisations. On peut notamment citer parmi les utilisations faites par les utilisateurs de ces prélèvements : (i) des recherches sur les cellules primaires pour développer de nouvelles molécules de biothérapie en oncologie ou contre les maladies inflammatoires ; (ii) des pré études de sécurité pour mettre en place avec les doses adaptées les futures études de toxicologie sur les primates non humains ; (iii) des comparaisons avec le sang humain afin d’étudier la compatibilité des résultats obtenus sur les primates non humains lors de leur application chez l’Homme (iv) des études de bioanalyses pour le développement de médicaments ; (v) des recherches pour découvrir de nouvelles molécules pour inhiber l’immunité innée pour le traitement des maladies à médiation immunitaire.

Procédures

Les interventions réalisées sur les animaux dans ce projets diffèrent peu d'interventions de don du sang ou de prélèvements diagnostics menés chez l'humain. De plus, contrairement à ce qui est fait chez l'Homme, ces procédures sont ici réalisées sur animaux anesthésiés et analgésiés. Pour les prélèvements de sang, un prélèvement vigil pourra être effectué dans le seul cas où l'anesthésique affecteraits les analyses ou les expériences menées par le chercheur. L'ensemble de interventions sont des prélèvement biologiques : prise de sang, prélèvement de LCR, moelle osseuse, urine, lait, sperme et humeurs oculaires, biopsies de peau ou musculaire, lavage broncho-alvéolaire. Le nombre des interventions dépend des demande des utilisateurs mais sont toujours réalisées en respectant les procédures définissant des intervalles de prélèvements et de volume maximaux afin de préserver la bonne santé et le bien être de l'animal.

Impact sur les animaux

La réalisation des prélèvements biologiques nécessite au minimum la capture et la contention des animaux. Ces deux actes sont stressants car réalisés de manière contrainte. La capture consiste à diriger les animaux vers un tunnel de capture installé dans chaque animalerie. Une fois dans le tunnel de capture, les animaux peuvent être triés et dirigés vers le sabot de contention au bout du tunnel équipé d’un fond de contention. Le fond de contention permet de manière sécurisée (i) d’attraper le bras de l’animal afin de pouvoir le tenir et le sortir en vigil du tunnel à l’aide de gants de contention, ou (ii) d’accèder à sa cuisse afin de pouvoir effectuer une injection intra-musculaire du produit anesthésiant. A noter que l’habituation des animaux ainsi que le renforcement positif permet de réduire la durée et l’intensité du stress de capture. Ces méthodes de raffinement sont appliquées le plus souvent possible. Les effets post-prélèvements peuvent également représenter une nuisance en termes de récupération physiologique et/ou physique des animaux. Il s’agira au maximum des effets secondaires liés à l’anesthésie (somnolence, nausée). Toutes les nuisances sont considérées comme légères. De plus, des mesures de raffinement sont mises en place propres à chaque type de prélèvements. A noter que -pour le prélèvement de lait, les petits sont séparés de leur mère pour une durée de 6h maximum engendrant un stress de séparation. Cette séparation sera la plus courte possible et n’entraine pas d’effet à long terme sur le petit. Des mesures particulières sont mises en place afin de limiter le stress immédiat des petits due à cette séparation comme la présence d’une peluche pour s’agripper si le petit est seul ou la mise en groupe des petits s’ils sont plusieurs. - pour le prélèvement de sperme, le mâle est séparé de son groupe la veille pour obtenir le meilleur prélèvement possible. Cette séparation engendre un stress chez l’animal. Afin de réduire au maximum ce stress, le temps de séparation est limité à 24h maximum et le mâle est relâché dans son groupe dès que possible. Le contact visuel avec le groupe est maintenu si possible.

Devenir

Les procédures de prélèvements biologiques étant des procédures très légères, les animaux sont gardés en hébergement standard ou pourront être réutilisé pour d'autres projets scientifiques.

Remplacement

Dans la mesure où les produits de synthèses ne permettent pas encore de reproduire toutes les réactions des différentes cellules visées dans ce projet, l’utilisation d’animaux en tant que donneurs non terminaux reste indispensable. Les prélèvements biologiques réalisés sur animaux vivants proposés dans ce projet permettent justement de remplacer l’utilisation d’animaux vivants « entiers » par des produits biologiques issus de ces animaux permettant ainsi d’éviter l’injection de composants en tests à ces animaux et de multiplier les essais réalisés sur les produits biologiques testés sans multiplier le nombre d’animaux utilisés.

Réduction

L’utilisation de produits biologiques à la place d’animaux entiers permet en soi de réduire le nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques puisqu’un même animal peut être réutilisé pour le prélèvement de plusieurs produits biologiques, dans la limite des volumes et de la fréquence maximale permettant à l’animal de retrouver son état de santé et de bien-être général entre chaque prélèvement. Concernant les prélèvements biologiques eux-mêmes, ceux-ci sont réalisés après une demande spécifique validée d’un demandeur (en général client chercheurs). Les animaux ne sont pas prélevés systématiquement s’il n’y a pas de demande pour la fourniture de produits biologiques qui ne seraient pas utilisés. Dans la mesure du possible, toutes les demandes sont couplées afin de limiter le nombre d’interventions pour un même groupe d’animaux hébergés ensemble et réduire le stress lié à la capture dans une même animalerie. Ainsi tout est fait pour prélever un minimum d’animaux pour satisfaire les demandes des chercheurs.

Raffinement

La plupart des prélèvements est réalisée sur des animaux anesthésiés en suivant les recommandations de prélèvement correspondant aux bonnes pratiques chez l’Homme. Dans les rares cas où l’anesthésie n’est pas réalisée (pour les prélèvements sanguins uniquement : demande spécifique de l'utilisateur : interraction de l’anesthésique avec leur recherche), il est jugé que le dommage engendré par la réalisation du prélèvement en vigil ne diffère pas de celui engendré par l’anesthésie (douleur de la piqure d’une aiguille + stress d’un prélèvement vigil vs douleur de la piqure d’une aiguille + réveil, respectivement). De plus, tous les animaux disposent d’un hébergement répondant à la règlementation en vigueur, avec accès extérieur (volume supplémentaire par rapport à la réglementation) le cas échéant et en groupes sociaux. Les animaleries intérieures et extérieures sont équipées d’enrichissements du milieu adaptés à chaque espèce (au minimum perchoirs, reposoirs, barrières visuelles, matériaux variés, jouets, litière). En ce qui concerne les méthodes de prélèvements des produits biologiques, des mesures de raffinement spécifique (dont analgésie si nécessaire) sont mises en place pour chaque procédure.

Choix des espèces

De nombreuses thématiques de recherche sont menées sur les PNH et peuvent nécessiter l’utilisation de produits biologiques (ici sang et dérivés, LCR, moelle osseuse, urine, humeurs oculaires, biopsies de peau ou musculaire, lait, liquide broncho-alvéolaire, sperme) soit pour des études préliminaires soit comme témoin négatif en comparaison aux produits récoltés lors de l’expérimentation. Les espèces PNH choisies sont celles utilisées le plus couramment en recherche biomédicale et pour lesquelles la communauté scientifique dispose du plus de données bibliographiques et de connaissances (Macaques cynomolgus, rhésus, singes verts et ouistitis). L’espèce prélevée est choisie sur demande du chercheur. Animaux de tous âges en fonction des demandes des utilisateurs. Les volumes prélevables sont ajustés en fonction de l’âge et du poids de l’animal.

5120 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées dans les cinq jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent deux injections hormonales de superovulation, une partie subissant en plus une amputation de la dernière phalange pour génotypage, avant d'être tuées pour prélever leurs embryons à divers stades. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable en dehors des gestes eux-mêmes et tue tout animal montrant des signes de douleur. Il présente le recours à la souris comme "indispensable", aucun système cellulaire ne reproduisant selon lui l'activation du génome au tout début du développement embryonnaire.

Objectifs

L'expression de gènes contrôlés par l'ARN polymérase II requiert la formation d'un complexe multiprotéique (PIC) sur les promoteurs. Cet assemblage est favorisé par l'action d'autres complexes protéiques qui modifient la structure de la chromatine et facilitent le recrutement du PIC. L'expression active des gènes s'arrête au cours de la formation des gamètes, des ovocytes en particulier, et ne reprend qu'après le démarrage du développement embryonnaire, bien après la fécondation. La nature des complexes protéiques qui permettent le redémarrage de la transcription dans l'embryon (activation du génome zygotique ou ZGA) n'est pas connue. Nos objectifs sont i) d'analyser la présence des protéines composant les différents complexes protéiques associés à la transcription au moment de la ZGA et ii) de tester l'importance de différents gènes codant pour certaines de ces protéines.

Bénéfices attendus

Les connaissances que nous avons des mécanismes d'expression des gènes reposent historiquement sur des modèles cellulaires comme les cellules cancéreuses et des organismes unicellulaires comme les levures. Ces modèles ne sont pas représentatifs de la diversité cellulaire qui existe chez les animaux ni des transitions qui existent au cours du développement et de la différenciation. Notre projet permettra de caractériser une étape essentielle du développement embryonnaire des mammifères.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à deux injections intrapéritonéales rapides (moins de 5 secondes par injection) à 48 heures d'intervalle. Pour une partie des animaux seulement, la partie distale d'une phalange sera rognée pour identification et génotypage (moins de 5 secondes).

Impact sur les animaux

La superovulation nécessite une série de deux injections intrapéritonéales et une partie des animaux seront identifiés et génotypés par rognage de phalange. Aucun effet indésirable en dehors de l'acte n'est attendu chez les animaux.

Devenir

Toutes les femelles superovulées seront euthanasiées dans un délai maximum de 5 jours après la première injection dans le but de récupérer les embryons à différents stades de développement.

Remplacement

A l'heure actuelle, il n'existe pas de système cellulaire qui permette de récapituler le stade de l'activation du génome zygotique qui correspond au démarrage de la transcription du génome embryonnaire; l'emploi d'un modèle animal est donc indispensable. Il n'est pas possible de remplacer le modèle murin par un autre modèle animal parce que, bien que le développement de tous les animaux passe par une étape d'activation du génome zygotique, il y a des différences fonctionnelles fondamentales entre ce qui se passe chez les mammifères (développement plus lent) et chez les autres animaux (développement plus rapide).

Réduction

Le nombre d'animaux déterminé tient compte de l'efficacité de la procédure de superovulation (variabilité du nombre d'embryons obtenus par femelle, du nombre de femelles pour lesquelles la stimulation hormonale n'a pas été efficace et du nombre de femelles non fécondées) et du nombre minimal d'embryons à collecter pour pouvoir réaliser nos analyses et pour pouvoir conclure. En particulier, une partie des animaux sera utilisée pour produire des embryons en vue d'optimiser des techniques ce qui permettra de réduire le nombre d'embryons (et donc de femelles) pour l'analyse de l'importance de 7 gènes candidats.

Raffinement

La procédure de rognage des phalanges n'est pas susceptible de générer une gêne majeure pour l'animal vers 10 jours: en cas de saignement, un point de compression sera effectué. La procédure de superovulation est rapide et limitée à 2 injections intrapéritonéales à 48 heures d'intervalle. Les points d'injection seront alternés et suivis jusqu'à l'euthanasie. De plus les femelles sont euthanasiées au plus tard 5 jours après la première injection. Ces procédures sont rapides et ne nécessitent pas de dérogation aux conditions règlementaires d'élevage, d'enrichissement et d'interaction sociale. En cas de signes de douleur (inflammation, prostration, poil hérissé ou dos vouté), les animaux concernés seront immédiatement euthanasiés.

Choix des espèces

La superovulation étant efficace sur des femelles jeunes, nous n'utiliserons que des femelles entre 3 et 5 semaines d'âge ce qui correspond à la période optimale de réponse à la stimulation hormonale. Le choix du modèle murin repose sur la possibilité qu'offre ce modèle pour générer des mutants et sur le fait que c'est un modèle mammifère proche de l'homme. L'activation du génome zygotique (ZGA) chez les mammifères est différente de celle qui se passe chez d'autres modèles vertébrés ou non vertébrés. En effet, le développement mammifère est plus lent et la ZGA est initiée juste avant la 1ère division, environ 12 heures après la fécondation, alors que chez le poisson zèbre, le xénope ou la drosophile, la ZGA est plus rapide mais intervient après plusieurs divisions cellulaires. De plus, les acteurs et les mécanismes moléculaires de la ZGA ne sont pas conservés entre les mammifères et les autres modèles.