Procédures légères

40 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réintégrées au troupeau de la ferme expérimentale. Elles subissent huit prises de sang à la queue et un enregistrement de leurs comportements, dans un protocole qui restreint volontairement leur accès à l'eau pour reproduire des pratiques d'élevage courantes. Le porteur reconnaît qu'un des traitements induira une compétition accrue aux abreuvoirs et un risque de mammites, et cherche à savoir si les vaches les plus dominées manquent d'eau. Le projet, classé en recherche sur le bien-être animal, teste donc l'effet d'une privation d'eau sur les vaches qui la subissent.

Objectifs

L’absence de soif est un critère indispensable pour assurer le bien-être des vaches laitières en élevage. L’objectif de ce projet est de mesurer l’effet sur les vaches laitières de la restriction d’accès à l’eau correspondant à des pratiques d’élevage courantes dans un nombre significatif de fermes laitières. Ces pratiques sont soit liées à de la prévention, soit associées à l’usage du robot de traite. En effet, pour éviter des mammites, les vaches peuvent être attachées au cornadis lors du repas du matin. Il a été montré qu’augmenter la durée debout post-traite jusqu’à 90-120 minutes permet d’assurer que les canaux des trayons, qui constituent une voie d’entrée des pathogènes dans les quartiers de la mamelle, se referment entre la fin de la traite et le moment où les vaches se couchent sur une litière source de contaminations microbiennes. La restriction d’accès à l’eau après la traite est aussi mise en œuvre dans certaines exploitations laitières où les vaches sont traites par robot de traite avec un accès au pâturage. Dans certaines de ces exploitations, la suppression des points d’eau à l’extérieur permet de s’assurer que les vaches reviennent au robot se faire traire parce qu’elles recherchent l’accès à l’eau dans le bâtiment. Les mesures qui seront faites dans ce projet consisteront à caractériser les comportements d’abreuvement, alimentaire et social des animaux en prenant en compte la place de chaque vache dans l’échelle hiérarchique. En effet, les connaissances plus pointues ces dernières années concernant les hiérarchies sociales entre les vaches laitières nous obligent à remettre en question les pratiques d’abreuvement actuelles afin d’être certains que les vaches les plus subordonnées des troupeaux ont bien un accès suffisant à l’eau. Il a notamment été montré que, sur les compétitions à l’auge pour l’aliment, les vaches les plus dominées peuvent avoir un accès restreint aux auges du fait de vaches plus dominantes qui peuvent monopoliser la ressource. L’hypothèse de ce projet est donc qu’un accès modérément restreint à l’eau pour un groupe de vaches puisse avoir des effets délétères plus importants sur les vaches les plus dominées du groupe.

Bénéfices attendus

L’accès à l’eau des vaches dans les fermes commerciales françaises est hétérogène. En outre, la nouvelle définition du bien-être animal décrite par l’ANSES en 2018 insiste sur la prise en compte de l’animal à échelle individuelle. Les études décrivant le comportement d’abreuvement des animaux de manière individuelle et prenant en compte la place hiérarchique des animaux dans le troupeau sont trop peu nombreuses. Du fait de l’étude de l’animal moyen dans les troupeaux laitiers, nous manquons aujourd’hui encore cruellement d’informations quant aux animaux les plus subordonnés des troupeaux dans des contextes de compétition plus ou moins élevée. Cette étude va permettre 1) D’explorer le comportement social, alimentaire et d’abreuvement des animaux à l’échelle individuelle et de la catégorie sociale, 2) Mettre en lumière des dynamiques journalières, possiblement différentes selon ces catégories et le degré de compétition pour l’eau et ainsi 3) De pouvoir étayer les connaissances avec cette approche tridimensionnelle (étude des comportements sociaux, alimentaires et d’abreuvement) qui prendra aussi en compte un panel plus large de critères comme l’étude combinée des interactions négatives et positives (souvent étudiée de manière séparée), de la rumination, de l’ingestion, de l’activité physique journalière, etc. Ces travaux pourront enfin potentiellement mettre en avant un mal-être de certains animaux et/ou de se réinterroger sur certaines pratiques d’élevage. Ils pourront à terme contribuer à affiner les recommandations actuelles relatives à l’abreuvement des vaches laitières.

Procédures

Les vaches seront soumises à 8 prises de sang dans la veine de la queue, ainsi qu’à un enregistrement de leur comportements grâce à des caméras ou des capteurs embarqués. A la fin de la procédure, toutes les vaches seront réintégrées dans le troupeau des vaches laitières de la ferme expérimentale pour retrouver une vie de vache laitière similaire à celles que l’on peut trouver dans les troupeaux commerciaux.vé

Impact sur les animaux

Un des traitements induira une compétition plus importante qu’habituellement aux abreuvoirs, avec sans doute une compétition entre les animaux au moment de la réouverture des vannes des abreuvoirs. Cependant cette pratique reste dans la gamme des niveaux de restriction couramment observée en élevage, notamment pour ceux utilisant les restrictions d’abreuvement pour que les vaches reviennent se faire traire au robot de traite. Trois des 4 traitements pourront par ailleurs engendrer un léger risque de mammites supplémentaire si les vaches non bloquées en cornadis vont se coucher trop rapidement en sortie de traite. Ce risque sera néanmoins limité par le fait que la ration sera distribuée en sortie de salle de traite et que les vaches resteront naturellement debout le temps de leur repas.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront réintégrés dans le troupeau des vaches laitières de la ferme expérimentale pour retrouver une vie de vache laitière similaire à celles que l’on peut trouver dans les troupeaux commerciaux.

Remplacement

Il est impossible de remplacer les animaux vivant dans leur contexte d’élevage pour étudier les comportements d’abreuvement, d’ingestion et d’interactions sociales en dynamique dans le temps face à des pratiques de restriction d’abreuvement. Les mesures de comportements d’abreuvement, d’ingestion et d’interactions sociales dans ce contexte sont trop rares pour avoir recours à des modélisations. À ce jour, les seuls indicateurs de déshydratation physiologiques applicables sur des vaches laitières sont des teneurs sanguines (natrémie notamment), et leurs estimations nécessitent des prises de sang. L’enjeu de ce type d’expérimentation à terme est d’être en mesure de déterminer en ferme à partir de la seule description du dispositif d’abreuvement la probabilité que certains animaux puissent se trouver en situation de déshydratation. Ceci nécessitera de disposer de données sur des animaux vivants.

Réduction

Nous considérons que cette étude en carré latin 4X4 avec 40 individus est un bon compromis entre la puissance statistique requise et le nombre d’individus impliqués, d’autant plus qu’un certain nombre d’autres contraintes nous ont amenés à inclure ce nombre conséquent d’individus. La taille des groupes (10 individus) a d’abord été déterminée afin de disposer d’un groupe suffisant d’individus pour que des animaux puissent se trouver en situation de dominance au sein du groupe. Le fait de constituer préalablement des groupes homogènes en termes de hiérarchie sociale permettra par ailleurs de s’assurer de cela malgré une taille de groupe limitée par rapport à celle que l’on peut trouver en ferme classique. Pendant la semaine de caractérisation de l’échelle sociale des individus, les 40 vaches disposeront de 4 abreuvoirs connectés. D’après nos expériences passées, nous pouvons valider que disposer de 40 animaux et 4 abreuvoirs pendant une semaine va nous permettre de recenser un nombre suffisant d’interactions négatives aux abreuvoirs pour établir une hiérarchie sociale de départ robuste. Enfin, le dispositif de carré latin 4X4 nous assurera de disposer de répliqua de mesures sur 4 groupes d’individus, ce qui permettra d’envisager une certaine extrapolation de nos résultats à d’autres groupes. Ce schéma expérimental nous permet par ailleurs de prendre en compte l’effet du groupe et de la semaine expérimentale afin de mieux cerner la variabilité provenant des traitements. Les données seront analysées par analyse de variance en modèle mixte à l’aide du logiciel R en intégrant un effet aléatoire sur les individus. Nous inclurons dans le modèle l'effet des traitements, des semaines de mesures, des catégories sociales au sein des groupes d’individus sur le comportement d’abreuvement des animaux et les autres mesures grâce aux tests de Fischer propre à l’analyse de variance et à des tests de comparaison de moyennes post-hoc (Tukey).

Raffinement

Dans ce protocole, une majorité des mesures sera réalisée par des méthodes d’enregistrement sur les animaux ne nécessitant que peu de contention (capteurs sous forme de collier ou de boucle d’oreille, analyse vidéos, abreuvoirs connectés). Les prises de sang nécessaires à la caractérisation du niveau potentiel de déshydratation des animaux seront limitées au maximum en fin de semaine du carré latin à deux moments de la journée identifiés comme les plus à risque. Elles seront par ailleurs réalisées dans la veine de la queue pour limiter la contention des vaches. Par ailleurs, une grande partie des vaches du troupeau sont habituées à cette pratique et le personnel de la ferme expérimentale maîtrise les prises de sang de ce type, car il les pratique très régulièrement. Par ailleurs, la conduite d’élevage sera respectueuse du bien-être des animaux. Un suivi régulier du comportement et des paramètres indicateurs d’un mal-être des animaux sera mis en place pour détecter le plus rapidement possible tout signe de perturbations et traiter si besoin les animaux malades.

Choix des espèces

La problématique de l’étude, assez spécifique aux vaches laitières, nécessite de travailler avec cette espèce. Les vaches sont de race Prim’Holstein. Il s’agit de la race de vache laitière la plus répandue dans le monde, et les résultats de ce projet ont vocation à être diffusés au niveau international. La mise-bas et la fin de gestation affectant le comportement d’abreuvement des vaches laitières, les vaches choisies dans cette étude sont des vaches gestantes en milieu de lactation, plus représentatives du troupeau moyen laitier. Le recours des vaches en lactation est nécessaire du fait de leurs forts besoins en eau susceptibles de générer plus de compétition aux abreuvoirs que pour des vaches taries.

500 souris et 100 rats vont être utilisés, tués par prélèvement terminal sous anesthésie sans réveil, pour fournir sang, tissus et organes à des études in vitro. Le porteur classe ces procédures en gravité légère et affirme qu'elles n'induisent aucune douleur ni angoisse. Il présente ce prélèvement d'organes comme un moyen de réduire le nombre total d'animaux utilisés dans d'autres projets, une partie provenant d'animaux réaffectés après annulation d'étude. Le projet alimente une banque de matrices biologiques congelées mutualisée entre les équipes.

Objectifs

Dans le cadre des activités de recherche et de développement de nouveaux candidats médicaments humains, un certain nombre d’études in vitro et ex vivo nécessite la mise à disposition de matrices biologiques d’origine animale (sang, tissus, organes…). Ces études préliminaires aux approches in vivo, sont essentielles pour comprendre les processus pathologiques, vérifier l’expression des cibles d’intérêt et contribuent à la sélection des meilleurs candidats médicaments. Ces études entrainent finalement une diminution du nombre d’animaux total utilisé dans les projets de recherche.

Bénéfices attendus

Les prélèvements réalisés servent à l’analyse de biomarqueurs ou la mise en culture cellulaire primaire dans le cadre d’études in vitro. Ils servent également à la calibration des méthodes de dosages analytiques réalisés sur les échantillons générés dans les études de toxicologie et pharmacocinétique. Enfin, ils peuvent servir pour caractériser les caractéristiques anatomo-pathologiques et hémato-biochimiques des souches murines utilisées en pharmacologie ou en toxicologie. En parallèle, une banque de matrices biologiques peut être congelée et mutualisée pour les équipes afin d’avoir à disposition des tissus lors de demandes ultérieures et limiter ainsi le nombre d’animaux utilisés ultérieurement.

Procédures

Un seul prélèvement sanguin terminal sur animal profondément endormi et avec analgésie si le prélèvement nécessite une ouverture cutanée - durée

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales sont entièrement réalisées sous anesthésie générale et sans réveil consécutif. Elles n’induisent aucune angoisse, douleur ou souffrance de l’animal.

Devenir

L’objectif des procédures expérimentales de ce projet est de réaliser des prélèvements terminaux sans reveil sur les rats et souris en vue d’études in vitro et d’analyses anatomo-pathologiques et hémato-biochimiques.

Remplacement

L’utilisation de matrices biologiques d’origine animale dans les études in vitro a pour but de remplacer en partie le recours à l’animal pour les premières phases de l’évaluation de l’efficacité ou de la toxicité d’un produit. Les études in vivo contribuant à la sélection des meilleurs candidats médicaments sont remplacées par ces études in vitro nécessitant moins d’animaux.

Réduction

Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont essentiellement des animaux devant faire l’objet de réaffectation de projet en cas d’annulation d’étude ou issus d’un premier projet autorisé. Cette approche permet par exemple de valoriser les animaux non inclus dans les études et contribue à la règle des 3R par la réduction in fine du nombre d’animaux.

Raffinement

Les procédures expérimentales sont entièrement sans réveil et n’induisent aucune angoisse, douleur ou souffrance de l’animal. Lorsqu’une ouverture cutanée est réalisée une analgésie est réalisée en complément de l’anesthésie.

Choix des espèces

Pour les études in vitro, l’espèce est choisie en fonction de la cible d’intérêt et des modèles toxicologiques et/ou pharmacologiques qui seront ensuite utilisés. Des animaux sevrés seront utilisés majoritairement (jeunes adultes et adultes). Cependant, pour des besoins spécifiques liés aux cibles, des animaux non-sevrés pourront être également utilisés.

200 équidés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réutilisés, gardés à l'élevage ou proposés à l'adoption après évaluation vétérinaire. Ils reçoivent des médicaments vétérinaires par voie orale ou par injection, parfois deux fois par jour pendant dix jours, puis sont observés et soumis à des prélèvements de sang, d'urine et de fèces pour établir des dossiers d'autorisation de mise sur le marché. Le porteur indique que peu d'effets indésirables sont attendus, tout au plus des signes cliniques de courte durée comme un abattement ou une gêne locomotrice. Il affirme qu'on "ne sait pas remplacer" les animaux pour obtenir des données de pharmacocinétique sur l'espèce cible.

Objectifs

Afin de commercialiser un nouveau médicament vétérinaire, un dépôt de dossier d’AMM est nécessaire. Celui-ci doit comporter des données techniques et scientifiques étayant la pharmacocinétique ou pharmacodynamique du médicament sur l’espèce cible.

Bénéfices attendus

Les bénéfices escomptés sont les gains sur la santé des chevaux et poneys qui recevront le candidat médicament testé une fois celui-ci mis sur le marché. Par exemple : lutte contre l’asthme chez des animaux en souffrant, à l’aide de la spécialité objet de l’essai en place.

Procédures

Les animaux reçoivent les médicaments testés par voie orale ou par injection (intramusculaire, intraveineuse, sous cutanée,…). Certains produits peuvent aussi être appliqués sur la peau ou tout autre partie de l’animal en fonction des cibles thérapeutiques. Les injections ont une durée de l’ordre de 30 secondes, alors que l’administration orale dure environ 10 minutes pour chaque animal : Pose de la sonde et administration du volume. L’administration des produits peut être prévue 1 seule fois, mais peut également être répétées afin de respecter les posologies prévues pour la spécialité. Par exemple 2 fois par jour sur 10 jours. Par la suite, les animaux sont observés : état général, examen clinique, examen neurologique, prise de température rectale,… L’observation d’un animal peut durer environ 10 minutes. Il peuvent aussi être prélevés (sang, urine, fèces,…) afin de quantifier la mise à disposition du produit dans le système circulant et son élimination. Les prélèvements de sang durent environ 30 secondes. Le prélèvement de fécès 1 minute. Pour les urines, un programme d’entrainement à uriner sur demande est mis en place avant l’étude afin d’obtenir la miction. Un cheval peut ainsi être prélevé sans utilisation de spécialités chimiques. L’expérience passée a permis d’obtenir la miction entre 30 secondes et 2 minutes après avoir demandé au cheval d’uriner. Les observations et prélèvements sont réalisées plusieurs fois le jour de l’administration jusqu’à 10 fois puis une fois par jour pour le reste de l’étude.

Impact sur les animaux

Pas ou peu d’effets indésirables sont attendus. Les spécialités sont testées au préalable pour leur sécurité (Safety). Dans certains cas, des signes cliniques de courte durée pourraient apparaitre tel que : un abattement après traitement, une gêne locomotrice, une perte de vigilance de l’animal, une élévation de la température corporelle, une modification du rythme cardiaque ou de la fréquence respiratoire. Toutefois, toute manifestation post traitement (signe clinique, comportement…) est soigneusement enregistrée et fera l’objet d’une évaluation.

Devenir

A l’issu d’un test, les animaux seront soit proposé à l’adoption, soit réutilisés pour le même projet ou un projet différent. Une évaluation vétérinaire est toujours associée à cette décision

Remplacement

Les études de pharmacocinétique et pharmacodynamique sont réalisées sur l’espèce cible. On ne sait pas remplacer les animaux pour obtenir de telles données

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est calculé en fonction des exigences scientifiques des études. Les études ne font pas l’objet d’une approche statistique, un faible nombre d’animaux est requis lors de phases exploratoires. Les observations sont réalisées plusieurs fois le jour de l’administration jusqu’à 10 fois (à chaque prélèvement) puis une fois par jour pour le reste de l’étude.

Raffinement

Les protocoles envisagés sont classés en léger. Le stress sera limité par l’hébergement en groupe des animaux. Une récompense alimentaire est prévue après chaque geste technique et lors de mouvements d’animaux. Aucune sédation n’est envisagée pour les protocoles pour raisons suivantes : - La gêne et la souffrance occasionnées sont très faibles et ponctuelles, - L’administration d’une sédation chimique modifierait les résultats de l’étude.

Choix des espèces

Les études de pharmacocinétique ou pharmacodynamique nécessitent l’expérimentation sur l’espèce cible afin de répondre aux exigences du dossier d’AMM. Jeunes animaux sevrés ou hébergés avec leur mère, et/ou animaux adultes selon les études. Le choix est fait en fonction de la gamme d’âge d’indication prévue pour le médicament et sera justifié dans le protocole soumis au Comité d’Ethique.

38 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la plupart tuées à l'issue et trois réutilisées pour un autre usage. Elles reçoivent une injection intranasale de composés métalliques, parfois précédée d'une injection de mannitol sous anesthésie, avant que leur cerveau soit prélevé pour de l'imagerie par rayons X en trois dimensions. Le porteur indique que les animaux sont euthanasiés dans un délai de trente minutes à vingt-quatre heures pour ce prélèvement. Il affirme avoir "besoin de cerveaux" et n'avoir "pas d'autre alternative" que le recours aux rongeurs, sans détailler de méthode de remplacement.

Objectifs

Le but de ce projet est de réaliser de l'imagerie-x en 3 dimensions sur des cerveaux de souris. Il s'agit de s'approcher de l'histologie, en utilisant l'imagerie x en 3D afin d'obtenir des informations dans l'espace, plutôt qu'en 2 dimensions. Pour cela, il convient d'administrer des composés par voie intranasale avant euthanasie, prélèvement et imagerie des cerveaux.

Bénéfices attendus

Nous espérons obtenir des images de type "histologie" en 3-dimensions, permettant l'identification de l'organisation spatiale des astrocytes et des neurones dans les cerveaux.

Procédures

1 injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse (pour certains (entre 12 et 26 souris selon les résultats), mannitol en IV, 100 µL, 12 mmol)+ injection intranasale de composés 2x5µL (pour tous les animaux) à 1 mg/mL de métal. Durée de l'expérience avant euthanasie: de 30 minutes à 24h maximum.

Impact sur les animaux

Le mannitol est un composé permettant l'ouverture transitoire de la barrière hématoencéphalique. Il est à administrer à petite dose et à débit modéré. Les expérimentateurs sont familiers avec son utilisation. L'administration des autres composés se limite à de faibles volumes. Afin de limiter le stress des animaux, les souris seront anesthésiées lors des différentes administrations et des analgégiques seront disponibles en cas de besoin.

Devenir

Euthanasie pour prélèvement sous anesthésie gazeuse, pour tous les animaux.

Remplacement

Nous avons besoin de cerveaux pour cette expérience et n'avons pas d'autre alternative que l'utilisation de rongeurs.

Réduction

Les nombres indiqués dans ce projet sont maximaux (38). L'accès au faisceau de rayons-x étant limité et fractionné, nous allons travaillé par petit nombre d'animaux. Il est hautement probable que nous réduisions le nombre total d'animaux utilisés. Les analyses au fur et à mesure des expériences nous permettrons cette réduction. Il n'est pas nécessaire de prévoir des analyses statistiques : des analyses d'images sont effectuées (analyse de contraste).

Raffinement

Des mesures de raffinement sont prises afin de réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse notamment en mettant en place une anesthésie préinjection par méthode gazeuse (par isoflurane: simple, rapide, reproductible). Les animaux sont également placés par groupe avant l'expérience, avec nourriture et eau à disposition ainsi que des enrichissements dans les cages (cotons, tunels etc). Dans ce protocole, nous commençons par les temps les plus courts. Dans le cas où des animaux présenteraient des points limites, nous serions dans l'obligation d'adapter la procédure, soit en réduisant le volume injecté par narine (pour un meme volume final administré), soit en modifiant la formulation du composé. De plus, des analgésiques sont disponibles au laboratoire comme la buprénorphine, en cas de besoin.

Choix des espèces

Nous avons déjà démarré l'étude sur des souris et désirons poursuivre les investigations sur ce modèle. Au stade de jeunes adultes (7 semaines). Il n'est pas nécessaire d'utiliser des juvéniles ni des animaux plus âgés.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent deux implantations de pastilles sous la peau par une canule et trois prélèvements sanguins, pour tester si l'activation de l'autophagie par la rapamycine améliore une dystrophie musculaire d'origine génétique. Le porteur indique que les souris seront euthanasiées à la fin pour prélever leurs organes, et que l'insertion des pastilles peut provoquer une douleur ainsi qu'une sécheresse oculaire pendant les anesthésies. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet d'étudier cette maladie, décrivant les cultures cellulaires comme incapables de reproduire une pathologie qui se développe trop lentement.

Objectifs

L'objectif de ce projet s’inscrit dans l’évaluation d’approches thérapeutiques pour des maladies génétiques rares, les dystrophies musculaires, pour lesquelles il n’existe, à l’heure actuelle, aucun traitement. Les dystrophies musculaires sont des maladies dégénératives du muscle qui conduisent à une perte progressive des fonctions motrices telle que la marche. La dystrophie musculaire étudiée dans ce projet est la dystrophie musculaire tibiale (TMD) qui est due à une mutation dans le gène de la titine. Bien que les mécanismes pathogéniques moléculaires de cette maladie ne soient pas entièrement compris, un certain nombre d’éléments suggèrent qu’une activation du mécanisme de nettoyage cellulaire appelé autophagie pourraient être bénéfique pour améliorer le phénotype. Notre étude vise à déterminer l’effet d’une activation de l’autophagie sur le phénotype de souris modèle de la TMD afin de comprendre si une modulation de l’autophagie pourrait consister en une approche thérapeutique pour les patients TMD.

Bénéfices attendus

Dans ce projet, nous proposons de définir si l’activation de l’autophagie a un effet bénéfique sur la pathologie TMD. La molécule utilisée, la rapamycine (Sirolimus, Rapamune®) est une molécule ayant déjà l’autorisation d’utilisation chez l’homme. Il sera donc possible à la fin du projet de préparer un essai clinique chez les patients TMD pour valider son usage dans cette pathologie qui n’a pas de traitement à ce jour.

Procédures

Les interventions sur les animaux comprennent l'insertion des pastilles par une canule deux fois au cours du protocole et les prélèvements sanguins trois fois au cours du protocole.

Impact sur les animaux

Les nuisances (douleur ou stress) attendues sur les animaux sont liées à la nature des actes réalisés: douleur liée à l’insertion des pastilles par la canule deux fois au cours du protocole et aux prélèvements sanguins. Il y a une possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser le prélèvement des organes.

Remplacement

Aucun modèle alternatif à des modèles animaux ne nous permet d’étudier les symptômes typiques des dystrophies musculaires pour répondre aux questions posées. Théoriquement, les méthodes alternatives à l’expérimentation animale peuvent être de différentes natures : méthodes in silico ou in vitro. Les approches in silico utilisées en alternative à l’expérimentation animale à ce jour permettent uniquement des modélisations physico-chimiques comme la relation entre structure et activité biologique d’une molécule ou des modélisations toxico-cinétiques d’élimination de molécules. Des modèles in silico qui pourraient permettre de modéliser numériquement les expériences proposées dans ce projet à partir d’un ensemble de données n’existent donc pas à ce jour. Les méthodes in vitro les plus utilisées aujourd’hui comme alternative en expérimentation animale sont basées sur l’utilisation de cultures cellulaires. Elles présentent l’avantage d’offrir la possibilité d’utiliser des cellules humaines avec les considérations éthiques correspondantes bien sûr. Il est possible de réaliser des cultures cellulaires ou des organoïdes pour les organes considérés avec, même une certaine complexité, comme en co-culture avec certaines cellules additionnelles. Cependant, il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro de la pathologie étudiée dans ce projet d’autant que les symptômes se développe lentement sur une période qui dépasse la durée possible de maintenance de cellules en culture.

Réduction

Ce projet se limite aux expériences considérées comme absolument indispensables et prévoit l'exploitation maximale des données obtenues. Vu l’âge des animaux et la durée du protocole, nous réaliserons un maximum de prélèvements après la mort des animaux, plus que ce qui serait nécessaire pour la réponse à la question de ce projet. Ces prélèvements seront conservés et seront donc disponibles pour répondre à des questions qui pourraient émerger des résultats obtenus ou d’autres sources comme la littérature. Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le critère choisi est une réduction du niveau des fibres musculaires ayant subi au moins un cycle de dégénérescence. Le test statistique utilisé donne N=10 par groupe.

Raffinement

Nous avons choisi d’administrer la molécule à l’aide de pastilles sous cutanées qui permettent la délivrance de la molécule pendant une période de 60 jours. Cette méthode permet un contrôle de la quantité de produit administré en assurant une distribution continue et une stabilité du produit et donc une meilleure reproductibilité. Cette méthode permet de limiter drastiquement la manipulation des animaux avec 2 implantations sur 4 mois au lieu de manipulations quotidiennes, évitant par la même du stress aux animaux.

Choix des espèces

Pour ce projet, nous utiliserons l’espèce souris car le modèle existant de la pathologie étudiée est sur cette espèce Les animaux seront utilisés au stade adulte à un âge permettant l’observation d’une atteinte histologique bien installée à la fin du protocole pour des souris non traitées avec la molécule.

68 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, sans être tués à l'issue, le porteur prévoyant de les faire adopter faute de prélèvement terminal. Chaque animal reçoit une injection dans les deux genoux puis jusqu'à dix anesthésies successives pour des séances d'IRM, les deux genoux servant à tester deux produits par lapin. Le porteur indique n'attendre aucun effet indésirable de l'injection et rattache les nuisances à la répétition des anesthésies. Il affirme qu'aucune méthode ne modélise le comportement d'un produit injecté dans un "organisme entier vivant" et décrit un projet de développement de produits contre l'arthrose.

Objectifs

Ce projet de recherche et de développement a pour objectif d’évaluer au cours du temps la rémanence d’un produit administré au niveau de la région synoviale articulaire du genou chez le lapin par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM). La rémanence se définit par un maintien dans le temps des effets d’une action ou d’un phénomène. Dans le cadre de notre projet, l’objectif est d’évaluer le maintien dans le temps de produits à action prolongée injectés en intra articulaire dans le traitement de l’arthrose et cela grâce à une quantification du volume de produit présent dans l’articulation à des temps définis. D’après l’organisation mondiale de la santé, l’arthrose est l’une des dix maladies les plus invalidantes dans les pays développés. A l’échelle mondiale, environ 10% des hommes et environ 20% des femmes âgés de 60 ans en souffrent. Dans les prochaines décennies, le vieillissement de la population, couplé à des facteurs de risques tels que l’obésité, laisse suggérer que le nombre de personnes atteintes d’arthrose va continuer d’augmenter. Cette pathologie, d'étiologie plurifactorielle, est caractérisée par la présence de lésions du cartilage associée à des anomalies pathologiques diverses au niveau des articulations. Il n'existe pas, à l'heure actuelle, de traitement médicamenteux permettant de régénérer le cartilage, les produits sur le marché ne permettant que de soulager et retarder l’avancée de la maladie avant une éventuelle chirurgie (prothèse). Ainsi, l’étude de produit innovant, notamment à base d’Acide Hyaluronique (HA), permettant notamment de restaurer les propriétés viscoélastiques du liquide synovial, la capacité d’absorption des chocs et de lubrification de la région synovial est donc un enjeu majeur. Le devenir des animaux dépendra des procédures réalisées durant l’étude. Les animaux qui n’auront subi aucuns prélèvements terminaux (prélèvements d’organes ou prélèvements de sang trop important pour le rétablissement des animaux), dont le certificat sanitaire le permet et sous réverse d’une autorisation par les autorités réglementaires, pourront être placés chez des adoptants qui leur fourniront une retraite dans le respect du bien-être animal.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera au développement et à la mise sur le marché de nouveaux produits contre l’arthrose, avec notamment une meilleure rémanence des produits.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés (induction en fixe puis relais en volatile) et intubés pour les injections intra articulaire (sous condition stérile) puis pour chaque session d’imagerie selon la durée totale de l’étude et le nombre de délai d’imagerie applicable. Un total de 10 interventions seront prévues au maximum (injection, puis 9 délais d'imagerie avec une première session 24h à 48h après, puis 7 jours de délai au minimum entre chaque session suivante d'imagerie).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sur les lapins seront essentiellement dus à la répétition des anesthésies réalisées premièrement par une injection intramusculaire puis l’animal sera maintenu sous anesthésie gazeuse par intubation. Cette procédure d’anesthésie sera régulière selon la durée totale de l’étude et le nombre d’IRM applicables, espacées de 24h minimum entre chaque temps par animal. Aucune nuisance ou effet indésirable de l’injection intra-articulaire n’est attendu étant donné que la tolérance du produit aura été testé au préalable et qu’il aura été démontré une bonne tolérance du/des produits injectés.

Devenir

Le devenir des animaux dépendra des procédures réalisées durant l’étude. Les animaux qui n’auront subi aucuns prélèvements terminaux (prélèvements d’organes ou prélèvements de sang trop important pour le rétablissement des animaux), dont le certificat sanitaire le permet et sous réverse d’une autorisation par les autorités réglementaires, pourront être placés chez des adoptants qui leur fourniront une retraite dans le respect du bien-être animal. Il est prévu à ce jour de faire adopter tous les animaux, aucun prélèvement terminaux n’étant prévus.

Remplacement

Afin de répondre aux objectifs de ce projet, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable le comportement de produits injectés dans un organisme entier vivant. Ce comportement dépend de très nombreux facteurs tels que la zone d’injection, les tissus environnants, l’activité de l’animal… Afin de répondre aux objectifs de ce projet, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable le comportement de produits injectés dans un organisme entier vivant. Ce comportement dépend de très nombreux facteurs tels que la zone d’injection, les tissus environnants, l’activité de l’animal… L'articulation du genou étant une zone très spécifique (mouvements, isolement du reste de l'organisme, ...), les méthodes in vitro ou in silico ne permettent pas à ce jour à mimer de manière fiable le comportement d'un produit injecté dans cette zone sur le long terme.

Réduction

Une étude pilote permettant de valider la bonne visualisation et la bonne quantification par imagerie des produits injectés à 24h et 48h post injection sera réalisée sur 4 animaux. Si le produit candidat n’est pas visible ni quantifiable à ces temps courts post injection, la/les étude(s) principale(s) ne seront pas réalisées. La tolérance du produit a déjà été testée préalablement in vitro/in vivo. Ainsi, les 2 genoux seront injectés. L’injection dans les 2 genoux de chaque lapin permet d’administrer 2 traitements différents par animal, ce qui permet d’optimiser l’utilisation des animaux et ainsi réduire leur nombre nécessaire pour atteindre des données scientifiques robustes (nombre de lapins réduits à son strict nécessaire pour avoir 8 genoux par groupe soit 12 lapins). Avec 8 genoux comparables par groupe, une approche statistique est prévue : si un test paramétrique peut être utilisé, un test t de Student sera utilisé pour comparer 2 groupes et une Anova avec test de Dunett sera utilisé pour comparer un groupe versus un groupe contrôle ou test de Newman-Keuls pour comparer des groupes entre eux 2 à 2. Si un test non paramétrique doit être utilisé, un test de Wilcoxon sera utilisé pour comparer 2 groupes et un test de Kruskall-Wallis sera utilisé pour comparer n groupes versus un groupe contrôle et un test de Friedman pour comparer n groupes entre eux 2 à 2.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 4 jours minimum sera respectée. Toutefois, une période d’acclimatation de 7 jours sera privilégiés dès que cela sera possible. Les animaux seront hébergés en groupe tout au long du projet avec des enrichissements appropriés à leur besoin (balles, abris, bois à ronger, …). L’injection du produit stérile par voie intra articulaire ainsi que tous les actes techniques nécessitant une contention importante seront réalisés sous anesthésie afin d’éviter tout stress aux animaux. Les sites d’injection seront suivis à minima pendant 8 jours après administration intra articulaire. Tout au long de l’étude, un suivi clinique quotidien sera réalisé. Le poids des animaux et un suivi clinique seront réalisés minimum 1 fois par semaine. Tout signe clinique d’appel sera remonté au vétérinaire, si l’animal présente des douleurs ou un inconfort, le vétérinaire pourra prescrire un antalgique. Enfin, tout examen clinique complet témoignant d’un état de santé considérablement dégradé de l’animal et sans possible rétablissement conduira à une euthanasie étique des animaux concernés. Le projet se déroulant sur deux établissements utilisateurs, des transports sont prévu entre les deux établissements. La température sera adaptée et suivie et les cages de transports seront suffisamment grandes pour assurer le bien-être des animaux pendant le trajet. De la nourriture et de l'eau pourront être mis à disposition à l'arrivée des animaux et une période de calme sera respectée à l'arrivée avant tout anesthésie afin de limiter au maximum le stress.

Choix des espèces

Le lapin est une espèce couramment utilisée comme modèle pour les pathologies de l’arthrose et du genou. En effet, l’anatomie du genou du lapin est proche de celle de l’homme et sa taille facilite les analyses histologiques et d'imagerie par rapport à des plus petites espèces. De plus, il s'agit d'un animal couramment employé en expérimentation animale, permettant ainsi d'une part de gérer plus facilement son bien-être au cours de l'étude et d'autre part de travailler sur des lots homogènes (âge et sexe fixés). Des lapins adultes de 11 semaines minimum seront utilisés dans ce projet pour avoir des articulations et des cartilages matures sur des animaux n’étant plus en forte période de croissance osseuse.

1 500 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent une alimentation enrichie en adénine qui provoque une insuffisance rénale et une forte baisse de poids, puis des composés par gavage ou injection et des prélèvements de sang et d'urine, avant d'être autopsiés pour prélever les os. Le porteur indique que l'insuffisance rénale peut entraîner une rigidité abdominale et une inflammation, surveillées par des grilles cliniques. Il affirme qu'aucune méthode ne reproduit le remodelage osseux d'un organisme entier et juge l'évaluation chez l'animal "indispensable" avant l'usage des composés chez des patients.

Objectifs

En France, 10 % des adultes présentent une maladie rénale chronique (MRC). Le nombre de personnes atteintes est ainsi estimé à près de 3 millions. La MRC induit des troubles du métabolisme des minéraux conduisant à des lésions osseuses (ostéodystrophie) et des calcifications vasculaires qui aggravent le pronostic fonctionnel et vital du patient. 45 à 80% des patients atteints de MRC développent des lésions osseuses plus ou moins sévères. Dans le but d'améliorer la qualité de vie des patients et de réduire leur morbidité, l'évaluation de composés susceptibles de réduire les lésions osseuses devient indispensable, et c’est dans ce contexte que s’inscrit ce projet. La présente demande a pour but d'évaluer les effets de l’administration d’un composé d’intérêt chez le rat atteint d’ostéodystrophie. Le composé étudié est susceptible de réduire des lésions osseuses. Des études pilotes seront réalisées pour chaque lot de composé d’intérêt étudié. Dans ce contexte, il est prévu de réaliser le suivi de ce composé ainsi que de tout marqueur physiologique et/ou physiopathologique identifié au niveau systémique, urinaire, fécal. De même, l’analyse de certains organes préalablement déterminés sera réalisée afin de confronter ces observations avec les résultats des observations, mesures, dosages spécifiques qui seront effectués dans l’étude. La durée maximale des protocoles sera de 70 jours, et des animaux seront sacrifiés à différents temps intermédiaires ou en cas d’atteinte de points limites.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - Court terme : chaque protocole, permettra à son échelle d’informer sur l’efficacité du composé évalué et sur le degré de réduction des lésions osseuses. De plus les informations recueillies à chaque étape mettront en évidence une potentielle toxicité osseuse de la molécule étudiée - Long terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications des conditions physiologiques osseuses chez les animaux après application du composé. De plus, ce projet doit permettre d’établir des plans de prévention, prophylaxie (ensemble des mesures à prendre pour prévenir les maladies), et diagnostic robustes indispensables à la prise en charge et à l’amélioration de la qualité de vie des patients atteints d’insuffisance rénale développant une ostéodystrophie

Procédures

L’administration orale du composé se fera par gavage sur animaux vigiles (moins de 5min par gavage). Les fréquences d’administration dépendent de la prophylaxie des lots de composé testés. Les injections du composé en parentérale (sous cutanée ou intramusculaire ou intrapéritonéale : dans le cadrant caudal droit de l'abdomen ventral) seront réalisés sur animaux vigiles ou anesthésiés (moins de 5 min par injection). Les fréquences d’administration dépendent de la prophylaxie des lots de composé testés. Les prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles ou anesthésiés (moins de 5 min par prélèvement). Un traitement analgésique sera systématiquement appliqué aux animaux. Si des prélèvements à l’aorte abdominale sont effectués, ils ne se feront qu’en point final sous anesthésie avant sacrifice de l’animal. Les urines pourront être prélevées en cours de protocole sur animaux vigiles, en pressant sur la vessie des animaux (moins de 5 min par prélèvement) ou en point final, sur animaux euthanasiés. Elles peuvent être également collectées suite au placement des animaux en cage métabolique pendant un maximum de 24h où l'urine libérée par l’animal pendant ce laps de temps sera collectée.

Impact sur les animaux

Du fait du faible attrait des animaux pour la nourriture enrichie en adénine, une forte baisse de poids est observée les premiers jours de la prise alimentaire sans pour autant être délétère pour l’animal. La prise de poids redevient physiologique après 2 semaines maximum d’alimentation spécifique (supplémentée en adénine). L’insuffisance rénale induite par l’apport d’adénine peut induire une rigidité abdominale signe d’inflammation des organes abdominaux comme les reins et/ou une anurie. Une possible réaction inflammatoire pourra également apparaître au cours du temps en cas de toxicité osseuse (due à l’administration du traitement thérapeutique). Pour prévenir ces cas de figure, les animaux sont suivis de près et des grilles d’évaluation clinique ainsi que les conduites à tenir en cas de l’observation de ces signes ont été prévus.

Devenir

A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront humainement euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les pièces osseuses, seront prélevés. Les prélèvements sanguins et urinaires seront utilisés pour évaluer les modifications éventuellement des biomarqueurs du remodelage osseux, du métabolisme phosphocalcique, de l’insuffisance rénale et de la présence de cristaux calciques. Les organes seront également utilisés pour doser le composé et/ou réaliser des analyses histopathologiques et d’imagerie

Remplacement

De manière systématique, les composés que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais l’évaluation chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des agents thérapeutiques testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, le tissu osseux est un tissu en perpétuel remodelage avec une activité de résorption et de formation osseuse. Cet équilibre repose sur des mécanismes de régulations systémiques et locaux grâce à une communication étroite entre les différentes cellules osseuses afin de maintenir l’homéostasie du tissu. Ce mécanisme complexe ne peut être mimé par un modèle simple de culture in vitro. Il n'existe donc pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer la réduction de lésions osseuses. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité probable des réponses aux principes actifs et en accord avec l’article R.214-105 du Code rural et de la pêche maritime, 10 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance), sur nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif sera revu à la baisse dans le cas où le traitement évalué est connu, et après analyse des résultats d’études précliniques préliminaires d’efficacité, afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre. Pour chacune des procédures, des tests statistiques seront réalisés

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un anesthésique lors des prélèvements sanguins à la jugulaire et des traitements antalgiques dès l’apparition de premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux ou trois fois par semaine. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera euthanasié

Choix des espèces

Le rat a été choisi pour ce projet car cette espèce mammifère présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires notamment en termes de remodelage osseux, proches de celles observables chez l'homme. Le rat, étant fréquemment utilisé à des fins de recherche, l’étude des effets de composés chez cet animal de laboratoire, permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, la taille de cet animal permet d’obtenir un volume suffisant de liquides biologiques parfaitement analysables. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents composés seront utilisés.