Procédures légères

30 primates non-humains, ouistitis, babouins et singes écureuils, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous gardés vivants dans leurs groupes. Les femelles sont capturées deux à trois fois par semaine pour des prélèvements sanguins et des frottis vaginaux sous anesthésie, les babouins subissent une biopsie de l'utérus par raclage et douze petits singes une ablation de l'utérus. Le porteur étudie l'évolution de la menstruation chez les primates et reconnaît vouloir évaluer si l'usage de ces animaux comme modèles de l'endométriose est pertinent. Il affirme que ce phénomène ne s'étudie pas sur cellules en culture faute de banque de tissus adaptée.

Objectifs

Les objectifs du projet sont la caractérisation au niveau cellulaire, génétique et fonctionnel de l’évolution de la menstruation chez les primates. Ce projet répond à une question cruciale mais sous-étudiée liée à l’évolution de l’espèce humaine, ayant des conséquences sérieuses au niveau médical.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser les réseaux moléculaires mis en jeu lors du cycle hormonal et de la menstruation à l'état sain chez les primates, et d'évaluer leur conservation entre espèces. La caractérisation de cet état sain est une base indispensable à la compréhension des mécanismes pathologiques, et pour évaluer si l'utilisation actuelle de primates non-humains comme modèles de recherche pour les maladies telles que l'endométriose est pertinente.

Procédures

Babouins : Le suivi des cycles des 6 femelles babouins se fait par observation (non-invasive) pendant 3 mois. Le jour de la biopsie par raclage les animaux seront capturés dans leurs enclos respectives à l’aide des tunnels de capture et transférés dans des cages à fond amovible pour être anesthésiés avant de suivre la biopsie. La durée de la capture peut prendre 30 minutes. La durée de la biopsie, 1 heure. Ouistitis et Singes écureuils : Le suivi des cycles des 6 femelles ouistitis (12 maximum) et 6 femelles singes écureuils (12 maximum) se fait par dosage sanguin de la progestérone et suivi de l’indice caryopyknotique de l’épithélium vaginal. Les animaux doivent être capturés entre 2 et 3 fois par semaine(les prélèvements pourront être plus espacés lors du suivi du 2ème et 3ème cycle selon la concordance aux valeurs de références) pour faire un prélèvement sanguin à faible volume et un frottis vaginal. Les animaux seront capturés manuellement. L’ensemble des prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale. La durée normale de l’intervention est de 10 minutes (maximum 30 minutes). Les individus ne présentant pas de variations du cycle après 5 prélèvements seront exclus du projet et les inclusions seront arrêtées dès que 6 individus par espèce auront pu aller jusqu’au bout du protocole de recherche. Ces 6 ouistitis et 6 singes écureuils subiront une hystérectomie. Le temps d’anesthésie générale requis pour une hystérectomie chez une petite espèce comme le Singe écureuil ou le Ouistiti est de une heure maximum. (avec un temps de préparation de l’animal d’environ 30 minutes et environ 30 minutes d’acte chirurgical pur).

Impact sur les animaux

- Douleur légère inconfort possible après raclage utérin chez le babouin - Stress lors des captures - Anesthésies - Mise à jeûn avant les anesthésies - Hématomes possibles aux sites de prélèvements sanguins - Plusieurs complications post-chirurgicales peuvent survenir post hystérectomie avec des degrés de gravités différents (hématomes, infections urinaires, surinfections de la plaie chirurgicale (abcès), hémorragies internes ou encore éventration)

Devenir

Tous les femelles seront gardées en vie et dans leurs groupes sociaux d’origine après chacune des procédures.

Remplacement

La menstruation est un phénomène tissulaire complexe qui ne peut pas être étudié fonctionnellement sur des cellules en culture. L’étude du transcriptome et des régions de régulation de la transcription nécessite l’utilisation d’échantillons de tissus prélevés directement sur les animaux avec un suivi strict du cycle hormonal. Il n’existe pas de banque de tissu pour cet organe en ces conditions.

Réduction

Pour chaque espèce, 3 femelles seront prélevées dans la phase lutéale et 3 femelles en fin de cycle (menstruation ou phase équivalente pour les espèces non menstruantes). Ce nombre correspond au nombre minimum de réplications par espèce nécessaire à l'interprétation des résultats de l'étude. Pour les babouins nous utiliserons donc 6 individus. Pour les marmousets et singes écureuils, des femelles peuvent ne pas présenter de cycle hormonal, pour des raisons qui peuvent être liées à leur âge, à la structure de leur groupe social (dominance), ou à un arrêt des cycles avant la fin de la période identifiée de reproduction. Afin d’obtenir des prélèvements exploitables sur 6 individus, nous utiliserons 12 individus maximum par espèce. Les individus ne présentant pas de variations du cycle après 5 prélèvements seront exclus du projet, et les inclusions seront arrêtées dès que 6 individus auront pu aller jusqu’au bout du protocole de recherche. Nous utiliserons donc 30 animaux maximum au total.

Raffinement

Tous les prélèvements de tissu se feront sous anesthésie générale et couverture antalgique. Pour les babouins, la biopsie se fera par raclage en minimisant au maximum le stress pour l’animal et l’invasivité du prélèvement. Toutes nos animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires...), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises...). Ce programme est supervisé par notre responsable du bien-être animal et validé par la structure en charge du bien-être animal.

Choix des espèces

La menstruation est présente seulement chez certains primates. Nous avons sélectionné pour l’étude cinq primates non-humains et l’Homme. Chez les Cercopithecinae, un clade proche phylogénétiquement de l’Homme, nous trouvons des espèces avec menstruation (e.g. babouin olive, macaque rhésus). Dans la super-famille Ceboidae, incluant des espèces plus éloignées phylogénétiquement, nous trouvons des espèces sans menstruation comme le Singe écureuil et le Ouistiti commun. Cette configuration nous permettra de mettre en évidence les différences fonctionnelles qui sous-tendent l’apparition des menstruations chez les primates en tenant compte de la structure de l’arbre phylogénétique. L'étude nécessitant des échantillons de tissu utérin à la fin du cycle menstruel, tous les animaux utilisés sont des adultes en âge de procréer.

90 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 60 réutilisés et les autres tués pour prélèvement de tissus. Ils reçoivent des composés par voie orale ou intrapéritonéale puis passent des tests comportementaux nommés, champ ouvert pour la sédation, épreuve de la barre pour la catalepsie, et une mise à jeun destinée à provoquer des ulcères. Le porteur, société de prestation de service, met au point ces tests pour les intégrer à une offre commerciale d'évaluation des effets secondaires de médicaments. Il affirme que la douleur, définie comme une expérience à la fois sensorielle et émotionnelle, ne peut être étudiée que sur animal vigile.

Objectifs

La société est une société de prestation de service fondée par des scientifiques et spécialisée en pharmacologie in vivo de la douleur. La dimension sensori-discriminative de douleur a été largement étudiée sur une variété importante de modèles animaux et quasiment la totalité des antalgiques disponibles actuellement sur le marché ont été testés dans des modèles précliniques classiques chez le rongeur. Cependant, l’utilisation de ces antalgiques est souvent associée à de nombreux effets secondaires. De plus, une utilisation abusive s’est développée ces dernières années dans l’utilisation des opiacés mettant à jour une crise appelée « crise des opioïdes ». D’autres classes de molécules comme les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) présentent également des effets secondaires notamment, la formation d’ulcère qui est le principal effet indésirable. Les Gabapentinoides (Gabapentine, prégabaline) provoquent généralement une forte sédation, une somnolence et ont donc un impact sur la démarche et la coordination motrice. Un autre effet secondaire pouvant apparaitre après une prise d’un composé est la catalepsie. Celle-ci se caractérise par est un état comportemental de rigidité musculaire associé aux médicaments antipsychotiques aux agonistes des cannabinoïdes de type 1 (CB1) et à plusieurs autres classes de médicaments. L’objectif de ce projet est de mettre au point des tests permettant l’évaluation de ces effets secondaires cités :la formation d’ulcère, la sédation et la catalepsie. A terme ces procédures seront inclues dans un package regroupant plusieurs tests évaluant différents effets secondaires de plusieurs classes de composés pharmacologiques.

Bénéfices attendus

Ces différents tests seront à terme inclus dans un package « adverses effects » dans le but de le proposer dans notre offre de services. L’entreprise pourra ainsi offrir à ses clients la possibilité de développer de nouveaux candidats médicaments avec au préalable une évaluation des effets secondaires potentiels.

Procédures

Les animaux seront maintenus en contention et soumis à des admnistrations per os ou à des injections intrapéritonéales des composés antalgiques mentionnés. Ces interventions ne prennent que quelques minutes. Chaque animal reçoit 1 admnistration.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux par test sont les suivants : - Open Field : diminution de l’activité spontanée et locomotrice, sédation - Catalepsie : posture anormale sur la barre, difficulté à se remettre correctement sur la barre, sédation - Ulcères : apparition d’ulcères

Devenir

Une partie des animaux sera réutilisée et l'autre partie mise à mort pour prélèvement de tissus.

Remplacement

L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.

Réduction

Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Afin de s’inscrire dans une démarche de réduction une partie des animaux provient de procédures antérieures. En fonction du design de chaque étude une analyse statistique sera réalisée.

Raffinement

Les tests comportent une valeur de cut-off à ne pas dépasser pour ne pas induire de souffrance (pour les ulcères un temps de mise à jeun est a respecter par exemple). Un soin particulier est apporté à la réduction de la souffrance et du stress des animaux au strict nécessaire et à l’amélioration de leur bien-être (enrichissement et paramètres environnementaux contrôlés tout au long de l’étude, habituation une semaine à la salle de stabulation et 24h aux salles de tests). Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumé en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Au vu du domaine d’expertise de l'entreprise (spécialisation dans l’étude de la douleur), les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. La maitrise des gestes techniques est contrôlée régulièrement. Les animaux sont surveillés chaque jour, et un suivi spécifique est réalisé. De plus, pour réduire et limiter le stress des animaux, ils sont mis à mort sous anethésie pour le prélèvement de tissus.

Choix des espèces

La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein de l'entreprise. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; b) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Pour la procédure 1 les animaux utilisés pèseront entre 200 et 250g le jour des tests, ce seront donc des adolescents (42 jours). Le choix ici se base sur un test que nous effectuons déjà dans l‘entreprise : le test d’Irwin puisqu’ à terme ces deux procédures seront intégrées à l’Irwin dans un package plus large pour évaluer les effets secondaires de molécules pharmacologiques. Pour la procédure 2 les rats utilisés, seront des rats issus de précédentes études et donc seront plus âgés. Leur âge précis ne peut être défini.

7 030 rats vont être utilisés pour maintenir des lignées génétiquement modifiées reproduisant la trisomie 21, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ces animaux naissent porteurs de phénotypes que le porteur qualifie lui-même de dommageables, lésions cutanées, diabète, insuffisance rénale, tumeurs mammaires, détresses respiratoires ou épilepsie, suivis toute leur vie. Les reproducteurs trop âgés sont tués faute de pouvoir être adoptés, les autres sont transférés vers d'autres projets expérimentaux. Le porteur affirme qu'aucune alternative n'existe pour étudier le cerveau et conclut que ces modèles restent précieux malgré les atteintes qu'il décrit.

Objectifs

Le syndrome de Down (SD) ou Trisomie 21 touche 1 naissance sur 700 et représente la forme la plus fréquente de retard mental. Par ailleurs, les personnes atteintes du SD développent de nombreuses comorbidités parmi lesquelles la maladie d’Alzheimer (MA). Ainsi, plusieurs modèles de rat ont été créés afin de pouvoir étudier les mécanismes physiopathologiques du SD et de la MA dans un contexte de SD. Ces modèles sont porteurs de duplication de régions homologues au chromosome 21 humain ou de gènes spécifiques, qui semblent jouer un rôle important dans le développement du SD. Les premières caractérisations de ces modèles ont ainsi mis en évidence que certains d’entre eux présentaient des phénotypes dommageables. Malgré cela, ces modèles restent très précieux. En effet, leur caractérisation pourrait nous apporter des éléments clés pour une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques du SD ou de la MA dans un contexte de SD. Par ailleurs, l’étude de ces modèles combinée à la caractérisation des autres modèles que nous avons (ne présentant pas de phénotype dommageable) pourrait nous permettre de déterminer quel région/gène est impliqué dans tel ou tel déficit. Enfin, ces modèles pourraient constituer des modèles de choix pour tester de potentiels nouveaux traitements. L’objectif de ce projet est donc de nous permettre de maintenir ces modèles à phénotypes dommageables afin d’étudier le SD et la MA dans un contexte de SD.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de permettre le maintien de modèles de rats présentant des phénotypes dommageables. Il s’agit de modèle de rats du SD et de la MA combinés. Leur maintien nous permettra de les caractériser dans le but de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques du SD et de la MA dans un contexte de SD. Par ailleurs, les mécanismes impliqués dans le développement de la MA dans le SD pourraient également s’appliquer aux personnes de la population générale affectée par la MA. A long termes, cela pourrait permettre d’identifier des cibles thérapeutiques pour ces deux pathologies. Au-delà de leur caractérisation, ces modèles peuvent également nous permettre de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques, avec une application potentielle à l’Homme.

Procédures

Dans le cadre de ce projet qui vise au maintien de modèles rat à phénotypes dommageables la seule intervention prévue est la mise en place d’un traitement en cas d’apparition d’une pathologie. Ce traitement devra être adapté au cas par cas en fonction des observations faites chez l’animal. Nous pouvons ainsi avoir recours à différents types de traitements : antiseptique, crème cicatrisante, antibiotiques en crème, à mettre en eau de boisson ou injectable, insuline et anti-inflammatoires à mettre en eau de boisson ou injectable. Suivant la pathologie observée, le traitement pourra être réalisé 1 à 2 fois par jour et prendra en moyenne 2-3 minutes par rat. Il sera ainsi réalisé quotidiennement jusqu’à guérison de l’animal.

Impact sur les animaux

De manière générale, l’apparition de phénotypes dommageables va induire un mal-être chez l’animal. Ainsi, les lésions cutanées liées à une sensibilité aux infections et les conjonctivites vont induire des démangeaisons, l’apparitions de rougeurs ou un gonflement, voire de la douleur dans les cas de lésions cutanées les plus sévères. Dans le cas du diabète, l’animal aura une consommation excessive d’eau et présentera une perte de poids à un stade avancé. De la même façon, les animaux qui développent une insuffisance rénale présenteront une perte de poids. Concernant les tumeurs mammaires, suivant leur localisation, elles peuvent induire une gêne pour l’animal notamment lors de ces déplacements. Les hématuries, correspondant à la présence de sang dans les urines, peuvent induire une gêne, voire une douleur chez l'animal. Enfin, les détresses respiratoires et cardiaques, ainsi que l’épilepsie, induisent des signes de mal-être et de douleur chez l’animal. Par ailleurs, la manipulation quotidienne de l’animal pour l’application/injection de son traitement, à raison de 1 à 2 fois par jour, peut induire un stress très bref chez l’animal.

Devenir

Les animaux ayant servi pour la reproduction qui sont trop âgés ou qui ne donnent plus de portées et qui ne peuvent pas rentrer dans un projet seront mis à mort. En effet, s’agissant d’organismes génétiquement modifiés, ils ne peuvent pas être adoptés. Les animaux produit dans le cadre de projets expérimentaux seront transférés vers le projet concerné.

Remplacement

Il n’existe à l’heure actuelle aucune alternative à l’utilisation des animaux pour les études concernant le cerveau. La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires des pathologies génétiques et neurodégénératives, ainsi que les essais de traitement de ces pathologies, requièrent l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité. Il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo.

Réduction

Dans le cadre de ce projet, nous avons estimés à 7030 le nombre d’animaux à phénotypes dommageables qui seront produit au cours des 5 prochaines années. Cela inclus les animaux nécessaires à la maintenance des lignées, les 2 sexes pouvant être utilisés, ainsi que les animaux qui seront utilisés dans le cadre d’études comportementales/cellulaires/moléculaires. Dans le cadre de ces études, afin d’utiliser l’ensemble des animaux produits et de prendre en compte une éventuelle variabilité sexuelle nous utiliserons des mâles et des femelles. Ce nombre a ainsi été déterminé sur la base de nos connaissances et du recul que nous avons sur les lignées qui permettent de générer ces modèles. Par ailleurs, dans le cadre des projets expérimentaux, nous avons pris en compte le nombre minimal d’animaux nécessaire pour avoir des résultats scientifiquement interprétables du fait d’une variabilité inter-individuelle attendue.

Raffinement

Du fait de leurs phénotypes dommageables, ces animaux font l’objet d’une attention particulière afin de pouvoir détecter le plus précocement possible tous problèmes pouvant altérer leur bien-être. Les animaux seront ainsi suivis quotidiennement tout au long de leur vie. Les animaux présentant des signes de mal être ou de douleur (plaies, hérissement du poil, attitude voûtée, perte de poids) seront présentés au vétérinaire puis, si un traitement est envisageable, il sera mis en place (antiseptiques, antibiotiques, analgésiques). A noter que le traitement utilisé devra être adapté au cas par cas en fonction des symptômes rencontrés. Si aucun traitement n’est envisageable, l’animal sera mis à mort. Les points limites seront déterminés en fonction des observations quotidiennes faites chez l’animal tout au long de sa vie (changement de comportement (prostration, agressivité, akinésie), perte de poids continue, résistance aux antibiotiques, taille de la tumeur). Si ces points limites sont atteints, l’animal sera mis à mort. De plus, les animaux seront évalués pour des signes de douleur suivant l’échelle de l’expression faciale (Sotocinal et al. 2011, The Rat Grimace Scale : a partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions). Le point limite est atteint quand l’animal présente une expression faciale indiquant une douleur sévère dans 3 des items de douleur considérés, dans ce cas l’animal sera mis à mort. Par ailleurs, tout au long de leur vie, les animaux seront hébergés par deux, le rat étant une espèce très sociable, et disposeront d’un bâton à ronger en guise d’enrichissement.

Choix des espèces

La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires des pathologies génétiques et neurodégénératives requière l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité. Le rat est physiologiquement et génétiquement plus proche de l’Homme que ne l’est la souris. A ce jour, l’anatomie, la physiologie et la génétique du rat sont bien connues. Par ailleurs, l’évolution de l’ingénierie génétique permet maintenant de réaliser facilement des modifications génétiques chez le rat. De plus, les régions homologues au chromosome 21 humain sont retrouvées sur 2 chromosomes chez le rat contre 3 chez la souris. L’obtention d’un modèle de trisomie complète est donc plus simple à obtenir chez le rat. Par ailleurs, les meilleures capacités d’apprentissage et d’adaptation du rat comparées à la souris en font un meilleur modèle pour l’étude des déficiences cognitives associées au SD et à la MA. Pour les accouplements, les animaux sont utilisés jusqu’à 1 an selon leur fertilité afin d’optimiser le taux de natalité et le nombre d’animaux utilisés. Lorsque des animaux sont gardés en vieillissement pour des projets, ils peuvent avoir jusqu’à 18 mois afin d’étudier la MA dont certains phénotypes pourraient apparaitre que chez les vieux animaux.

22 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal subit quatre anesthésies générales d'environ trois heures avec ponction percutanée et injection dans l'artère du foie d'une chimiothérapie à l'oxaliplatine placée dans un nouveau véhicule. Le porteur indique des effets attendus proches du syndrome post-embolisation observé chez l'humain, nausées, douleurs abdominales et fièvre, et un possible hématome au point de ponction. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit ces conditions et justifie le porc par une anatomie vasculaire proche de celle de l'humain, les animaux étant tués en fin d'étude pour des analyses histologiques.

Objectifs

L'objectif de l'étude est de tester la faisabilité et l'éfficacité de l'administration intra hépatique par voie artérielle d'une chimiothérapie incluse dans un nouveau mode d’injection (véhicule) qui doit limiter la distrubtion aux autres organes de cette chimiothérpie. L'étude évaluera également la sécurité et les propriétés pharmacocinétiques de cette solution en évaluant la toxicité, l'effet sur le parenchyme hépatique et la concentration plasmatique de la chimiothérapie délivrée par ce véhicule. Ces résultats permettront de valider la nouvelle plateforme d'administration de médicaments avant de prendre la décision sur sa pertinence pour des essais cliniques supplémentaires.

Bénéfices attendus

L'objectif du projet est de valider la sécurité et de définir le meilleur schéma d'administration pour le traitement intra-artériel du cancer du foie à l'aide d'un nouveau véhicule de l'oxaliplatine. Après cette étude, nous aurons défini un moment optimal d'administration qui permettra à la fois une concentration soutenue du médicament entre deux administrations et une recanalisation/perméabilité des artères hépatiques cibles lors de la prochaine séance de traitement. Outre la concentration du médicament dans les tissus, nous évaluerons l'effet hépatique et la toxicité des injections répétées.

Procédures

Les animaux de cette étude subiront 4 anesthésies générales d'environ 3h avec ponction percutanée et injection intra hépatique d'une émulsion Pickering.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux seront ceux que l'on retrouve habituellement après une TACE chez l'homme, aussi appelé syndrome post-embolisation. Cela comprend des nausées, des douleurs abdominales et de la fièvre. La ponction artérielle pourrait être responsable d'un hématome de l'aine. La toxicité liée à l'oxaliplatine est minime mais comprend des diarrhées et des nausées. Ce type d'administration intra-artérielle est déjà utilisé chez l'homme et les effets secondaires gastriques sont inférieurs à 5%.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure car des analyses histologiques sur différents tissus doivent être réalisés.

Remplacement

La mise au point, l’évaluation et l’optimisation des traitements anticancéreux nécessitent l’utilisation d’un modèle préclinique in vivo reproduisant les conditions pratiques cliniques pour évaluer la réponse au traitement : conditions d’anesthésie, anatomie et physiologie, matériel utilisé, biologie... Il n’existe pas à ce jour de modèle alternatif in vitro ou in silico permettant de reproduire ces conditions pour étudier les réponses physiologiques à notre traitement. En effet il n'est pas possible d'évaluer, en dehors d'un modèle in-vivo, l'impact de la procédure d'administration intra-artérielle hépatique d'un véhicule porteur de chimiothérapie ni la toxicité de celle ci sur les organes non ciblés (cerveaun poumon rein....).

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude, deux animaux seront utilisés à la phase préliminaire pour déterminer la faisabilité et la répétabilité de la plateforme d'administration

Raffinement

Période d’acclimatation d’une semaine minimum entre l’arrivée à l’animalerie du laboratoire et l’inclusion dans le protocole de recherche. Hébergement en groupe de deux pour favoriser le contact régulier entre congénères. Environnement adapté à chaque phase de l’expérimentation pour réduire l’angoisse des animaux (accompagnement et anxiolyse durant le transfert depuis l’animalerie jusqu’en salle d’intervention). L'environnement est enrichi (activité de fouissement encouragée, medecine ball, jeux dans le couloir, pesée sousforme de jeux avec récompense, planche à gratter, distributeur d’aliment). Contrôle quotidien par un animalier. Lors de ce contrôle, des observations basées sur l’apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales attendues aux stimuli externes (peu enclins aux manipulations, tentative de fuite) seront réalisées afin de repérer tout animal malade ou blessé et de prendre les mesures appropriées. Ponctions vasculaires percutanées échoguidées artérielles et veineuses, pour mise en place des cathéters de surviellance hémodynamique continue afin de limiter la souffrance, les risques de saignement et infectieux.

Choix des espèces

Le porc présente une anatomie vasculaire et une physiologie proche de celle de l’homme ce qui facilite la réalisation de la navigation endovasculaire ainsi que les canulations artérielle et veineuse nécessaires pour la surveillance per opératoire. Cette convergence permet une adaptation optimale et rapide de l’espèce aux expérimentations et limitera au minimum le nombre d’animaux tests (échec techniques). La navigation endovasculaire intra hépatique ainsi que le matériel utilisé n’est pas compatible avec l'anatomie du petit animal. De plus notre projet est une étude d'innocuité de l'émulsion avant son application chez l’humain. De ce fait, ce projet doit être réalisé sur une espèce animale présentant des caractéristiques anatomiques et physiologiques communes à l’humain. Les animaux utilisés seront des mâles adultes (45-50 kg)car leur envergure est compatible avec les objectifs de navigation endovasculaire intra-hépatique.

9 144 souris de huit lignées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une injection d'un virus AAV sous la rétine sous anesthésie, des anesthésies répétées pour des examens de la vision (électrorétinogramme, tomographie optique) et des tests comportementaux nommés, optocinétique et exploration d'une boîte claire ou obscure, pour valider une thérapie génique de surexpression du gène CRX. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animal ne reproduit la rétine, tissu complexe, et conclut à la "nécessité" de recourir à la souris. Les retombées annoncées pour les patients atteints de rétinopathies restent renvoyées à un stade ultérieur, l'objectif immédiat étant de tester l'efficacité et la sécurité du traitement chez la souris.

Objectifs

La perte progressive des photorécepteurs (PR), les cellules sensibles à la lumière de notre œil, sont des causes fréquentes de déficience visuelle avec une prévalence de 1/4 000. Certaines de ces pathologies sont liées à des facteurs de transcription spécifiques aux photorécepteurs, comme le cone-rod homeobox (CRX). Les facteurs de transcriptions sont primordiaux pour le développement des photorécepteurs, leur différentiation en cônes ou en bâtonnets, leur maintien et leur fonctionnement. Ils permettent l’expression d’autres gènes, et sont donc en amont de nombreuses voies. Une mutation, un défaut, dans ce genre de gène induit donc de nombreux changements qui peuvent conduire notamment à la mort des photorécepteurs. Par ce projet, nous souhaitons valider notre traitement thérapeutique pour soigner les patients atteints de ces mutations sur Crx, mais aussi sur d’autres gènes important pour la rétine. Les modèles de souris mimant ces pathologies, et présentant différentes mutations dans Crx ont déjà permis de comprendre le fonctionnement de ce gène et d’approfondir nos connaissances sur les rôles tenus par ce facteur de transcription. Il nous est désormais possible d’exploiter nos nouvelles connaissances pour proposer des solutions thérapeutiques aux pathologies liées à Crx. Nous proposons de surexprimer Crx au moyen d’un Adeno-Associated Virus (AAV). L'efficacité et la sécurité des thérapies géniques, au moyen d'injections d’AAV, ont été prouvées avec des succès précliniques démontrant leur efficacité clinique. Chez un de nos modèles de souris Crx aveugle, nous avons précédemment montré que notre traitement permettait de restaurer partiellement les photorécepteurs et ainsi d’établir une basse vision. Nous devons maintenant tester cette thérapie sur d’autres modèles présentant d’autres mutations dans Crx pour valider notre thérapie sur plusieurs pathologies. Nous souhaitons améliorer l’efficacité de notre AAV, pour répondre plus efficacement à ces différentes pathologies. Nous souhaitons également pouvoir proposer notre traitement à d’autres patients, atteints de dégénérescence rétinienne non liée à Crx. Pour cela, nous utiliserons encore une fois des souris qui mimeront des pathologies telle que la rétinite pigmentaire (RP), et qui nous permettront de valider l’effet protecteur de Crx pour d’autres pathologies.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, peu de thérapies sont proposées aux patients atteints de rétinopathies, ou dégénérescence visuelle. La plupart permettent uniquement de ralentir les symptômes, mais ne ralentissent pas la mort des cellules et encore moins des photorécepteurs, nos cellules sensibles à la lumière. Ils doivent donc vivre avec leur perte de vision sans solutions efficace. Il existe actuellement quelques traitements de thérapie génique, qui sont eux plus efficaces, mais ils ne sont proposés qu’en fonction de la mutation génétique du patient induisant la maladie. Hors il existe des dizaines de gènes, ayant eux-mêmes des dizaines de mutations possibles, qui peuvent entrainer une même maladie. Ces traitements sont donc à usage très limités. Nous réalisons ce projet afin de développer une thérapie génique efficace aussi bien pour des rétinopathies liées à un facteur de transcription spécifique, CRX, que ce soit une mutation dominante ou non, qui n’ont pour l’instant pas de traitement disponible, que pour des rétinopathies liées à d’autres gènes, et entrainant la perte des photorécepteurs. Ce serait donc un traitement plus général, applicable au plus grand nombre. Nous espérons par ce projet démontrer l’efficacité de notre traitement sur plusieurs modèles de souris. Ces différents modèles présentent soit une mutation dans le gène Crx, soit une mutation sur d’autres gènes connus. Dans tous les cas, ces souris miment les pertes de visions humaines. Si notre produit s’avère efficace sur ces animaux, nous auront alors la preuve de notre concept. Nous pourrons donc produire notre traitement à plus grande échelle, afin de le proposer en essai clinique pour les patients. Nous espérons ainsi pouvoir proposer un réel traitement thérapeutique qui permettra aux patients de voir aussi longtemps que possible.

Procédures

Nous utiliserons 8 lignées de souris ayant des pathologies différentes, qui permettront de mesurer l’impact que pourrait avoir notre traitement thérapeutique et le nombre de patient que cela pourrait aider par la suite. Toutes les souris recevront une injection sous rétinienne d’AAV sous anesthésie générale (1 à 2 min par œil). La bonne réalisation de l’injection sera validée par observation sous macroscope. Certaines souris seront euthanasiées à différents temps après les injections, pour collecter les rétines, sans suivre d’autres expérimentations. Une partie des animaux seront de nouveau anesthésiés à 35, 60, 90, 155, 270 et/ou 360 jours, pour réaliser un ERG (mesure non invasive de la réponse électrique de la rétine à un stimulus lumineux) et un OCT (visualisation non invasive de la rétine en coupe chez la souris) sur les deux yeux (environ 20/30 minutes pour les deux tests). Ces examens sont non invasifs et nous permettent de mesurer la fonction visuelle de la souris. Une autre partie des souris passeront un test d’optocinétique à 65, 95, 155, 275 et/ou 365 jours (3 x 20minutes espacés d’1 heure minimum). Ce test permet de quantifier les reflexes oculaires de la souris et se fait donc sur animal vigil. Elles pourront également réaliser un test comportemental appelé clair/obscur (5 minutes), ou la souris est filmée en train d’explorer une boite soit noire soit éclairée, afin de visualiser son comportement face à la lumière, les souris étant des animaux nocturnes. Ces tests nous permettent de mesurer la vision réelle de la souris. A chaque temps, à la fin de ces tests, des souris seront euthanasiées pour analyser les rétines en coupe histologiques, ou quantifier la production d’ARN ou de protéines.

Impact sur les animaux

Plusieurs modèles de souris seront utilisés dans cette étude. Les techniques qui seront effectuées pour évaluer l’efficacité de notre thérapie génique sont peu invasives et couramment utilisées en recherche ophtalmologique (électrorétinogramme, tomographie par cohérence optique, tests d’optocinétique). Les phénotypes des animaux utilisés sont restreints à la rétine. La vision est un des sens les moins utilisé par la souris, qui est plutôt un animal nocturne. Le caractère non dommageable des lignées murines utilisées pour ce projet a d’ailleurs été établi précédemment par la Structure chargée du Bien-Être Animal (SBEA). Les souris élevée dans le noir jusqu’à leur 28 ème jour (chez les rd10, afin de préserver la rétine du stress dû à la lumière, qui induit la dégénérescence rétinienne dans ce modèle) ne développent pas de stress particulier. Les anesthésies répétées peuvent être dommageables pour les souris, mais elles sont espacées de 14 jours minimum, et les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil et quotidiennement. Une grille d’évaluation nous permet d’ailleurs de suivre le bien-être de l’animal tout au long de sa vie, par différentes observations. Si un animal présente des signes de douleurs, il sera pris en charge. L’injection sous rétinienne se réalise également chez l’homme, et n’engendre pas de douleurs. Le décollement rétinien dû à la procédure se résorbe en 48h. Par précaution, nous prévoyons d’utiliser un analgésique local et un anti-inflammatoire. Une opacification de la cornée peut être observée malgré l’ajout systématique de gel ophtalmique. Si une cataracte apparait néanmoins, elle se résorbe normalement d’elle-même rapidement. Si les animaux présentent des saignements anormaux dans l’œil lors de l’injection ou avant leur réveil, ils seront euthanasiés. A la fin des procédures, les animaux sont euthanasiés, ce qui permet d’étudier la rétine à un niveau cellulaire et moléculaire, pour valider l’efficacité de notre traitement.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure, afin de récupérer les rétines et réaliser des marquages immunologiques sur les coupes histologiques, ou analyser les effets de notre traitement au niveau transcriptomique et protéique.

Remplacement

Le projet visant la validation d’une stratégie thérapeutique pour le traitement de maladies rétiniennes, une validation de ces approches in vivo est un prérequis des agences réglementaires avant la mise en place d’essais cliniques. Il est également fondamental de travailler sur des modèles animaux présentant des pathologies comparables à celles développées chez l’Homme. La nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie également par le fait que la rétine est un tissu complexe composé de nombreux types de neurones dont les interactions sont cruciales pour générer un signal visuel correct. Dans ce contexte il est essentiel de travailler in vivo car les processus de mort cellulaire, de neuroprotection, ou de réparation sont totalement dépendants de l’environnement cellulaire. Pour ces différentes raisons, des méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Notre étude se déroule sur 5 ans, et comprend l’analyse de plusieurs lignées. Ces différentes lignées sont importantes pour vérifier que notre stratégie thérapeutique va cibler le plus grand nombre de patients ainsi que pour comprendre le mécanisme d’action. Nous indiquons ici un nombre d’animaux surestimé pour réaliser toutes les expérimentations que nous pensons nécessaire, mais cela sera ajustable. Le nombre de modèles à étudier pourra être revu à la baisse en fonction des résultats obtenus sur les autres modèles. Finalement, si nous nous apercevons que le traitement n’est plus efficace à partir d’un certain temps, les temps restant supérieurs ne seront pas réalisés. Notre étude commencera toujours par établir la dose d’AAV à injecter à chaque modèle sur les temps courts. Nous comparerons ensuite l’efficacité de nos deux AAV, pour ne réaliser les procédures chez ce modèle qu’avec l’AAV à la dose efficace. Si les anesthésies répétées s’avèrent trop néfastes pour les animaux (difficultés au réveil, difficultés de récupérations…) nous réduirons le nombre de tests nécessitant une anesthésie. Les animaux étudiés aux temps les plus lointains pourront donc être moins suivis que prévu. Si un nombre d’individus correctement injecté pour obtenir les résultats statistiques souhaités est atteint avant d’avoir utilisé tous les animaux prévus, nous pourrons utiliser les animaux pour les autres expériences ou stopper la reproduction. Le but est d’obtenir 12-18 yeux, en fonction des expérimentations, pour chaque vecteur, à la fin de la procédure. Le taux de réussite d’injections pouvant varier entre 50% et 75%, nous prévoyons donc plus d’animaux que nécessaire. Nous ne garderons que les animaux correctement injectés dans au moins un œil, ceux-ci pouvant être analysés séparément dans la plupart des expériences. Les autres seront sacrifiés à la fin de l’injection, encore sous anesthésie.

Raffinement

Durant l’injection sous-rétinienne, une anesthésie locale sera effectuée en plus de l’anesthésie générale. Une goutte de gel oculaire hydratant sera déposée sur l’œil des animaux pour préserver la cornée. Les animaux seront ensuite surveillés jusqu’au réveil. Afin de prévenir une éventuelle douleur, les animaux recevront un anti-inflammatoire suite à l’opération. Ils seront observés quotidiennement pour surveiller l’apparition éventuelle d’infection oculaire. Une grille d’évaluation de la douleur est utilisée pour apprécier l’état des animaux. Si des signes de douleur ou de gêne se manifestent, ou en cas de perte d'appétit ou de prostration, les animaux seront soignés autant que possible, mais pourront être euthanasiés si leur état se dégrade trop. Les animaux qui entreront dans notre protocole seront suivis à divers temps de manière non invasive et indolore, grâce à nos équipements. Dans le but de réduire le plus possible la douleur, souffrance ou angoisse, nous imposons : - des conditions d’élevage conformes à la directive 2010/63/UE et à la STE123 (animaux en groupe autant que possible, nidification et abris, croquettes et eau à volonté, change hebdomadaire). - des méthodes d’anesthésie adaptées à l’âge de l’animal. - des méthodes d’évaluation de la douleur par une observation et un suivi quotidiens.

Choix des espèces

La thérapie génique que nous souhaitons développer nécessite d’être validée in vivo avant d’être testée chez l’homme. Afin d’être le plus proche des pathologies humaines que nous souhaitons traiter, et ainsi évaluer les bénéfices/risques de notre approche thérapeutique, nous prévoyons d’utiliser des souris comme modèle d’étude. L’existence de lignées de souris atteintes naturellement ou non de dégénérescence rétinienne en fait un excellent organisme modèle pour notre projet. Nos modèles sont bien établis en recherche ophtalmologique. Chaque modèle est différent, et les temps choisis pour les injections correspondent aux contraintes imposées par la dégénérescence rétinienne. Nous observerons ensuite les effets de notre traitement entre 3 semaines et 1 an après injection.

3 204 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des souris receveuses sont irradiées pour détruire leur moelle osseuse, greffées avec des cellules mutées, puis suivies jusqu'à deux ans par prises de sang répétées, avec des injections induisant une inflammation chronique. Le porteur indique que l'irradiation peut entraîner infections opportunistes, anémie, apathie et perte de poids dans les deux semaines suivant la greffe. Il conclut qu'il est "indispensable" de développer un modèle murin, la leucémie ne pouvant selon lui être étudiée in vitro.

Objectifs

Les leucémies sont des cancers du sang c’est-à-dire qui affectent la production normale des cellules sanguines. Les cellules du sang sont renouvelées quotidiennement à partir de cellules souches qui se trouvent dans la meolle osseuse : les cellules souches hématopoïétiques. Ces cellules sont douées d’auto-renouvèlement et sont donc responsables de la production des toutes les cellules du sang (les globules rouges, les globules blancs et les plaquettes) tout au long de la vie. Il est donc tout à fait crucial de préserver leurs fonctions. Quand ces fonctions sont altérées, par exemple par exemple par des stress environnementaux (radiations) induisant des changements dans l’expression de certains gènes, cela conduit au développement de leucémies. La leucémie myélomonocytaire chronique est une leucémie caractérisée par l’accumulation de monocytes, un type des globules blancs circulants dans le sang. Cette maladie touche le sujet âgé. Elle est peu fréquente mais grave, avec une survie inférieure à 3 ans. L’âge avancé des patients ne permet pas d’utiliser la greffe de moelle osseuse et il n’existe actuellement aucun traitement curateur. De nouvelles approches thérapeutiques sont donc nécessaires. Il n'est pas possible de modéliser les fonctions des cellules souches hématopoïétiques, base du cancer, in vitro. De même, le processus de développement d’une leucémie requiert l’environnement de la moelle osseuse impossible à reproduire dans une boite de pétri. Il est donc indispensable de développer des modèles murins mimant le plus fidèlement possible le développement de la maladie pour tester des molécules d’intérêt thérapeutique et en découvrir de nouvelles. Notre projet a pour but de : 1/ Développer des modèles de leucémie myélomonocytaire chronique chez la souris ressemblant au plus près à la maladie humaine et qui s’adapteraient à une étude clinique. Comprendre les mécanismes d’aggravation de la maladie. (2) Etudier le rôle d’une inflammation chronique sur le développement de la leucémie. Au cours de la vie nous subissons de nombreuses infections bactériennes ou virales qui mettent en jeu le système immunitaire et la production de monocytes dans le sang et créent une inflammation chronique. (3) Etudier les mécanismes impliqués dans le développement de la maladie et analyser les mécanismes de la naissance du cancer pour découvrir de nouvelles pistes thérapeutiques. (4) Tester un composant chimique sur le développement et la guérison de la maladie.

Bénéfices attendus

Il n'existe pas de traitement curatif spécifique de cette leucémie qui reste donc une maladie très sévère, induisant la mort des patients dans les 30 mois après le diagnostic. Il n’existe pas non plus de bons modèles de souris mimant cette pathologie humaine. En développant de tels modèles, notre projet permettra de tester de nouveaux traitements spécifiquement adaptées à cette leucémie incurable et sera à terme très bénéfique pour les patients. Au niveau plus fondamental, notre projet permettra de comprendre comment la maladie survient, quel est le rôle de l’inflammation chronique qui survient avec l’âge sur son développement ou son accélération.

Procédures

Pour étudier le développement de cette leucémie, nous utiliserons la transplantation de moelle osseuse. Les transplantations sont réalisées par injection par voie veineuse, sous anesthésie, de cellules de moelle osseuse de souris donneuses, portant des mutations dans des gènes, dans des souris receveuses préalablement irradiées. L’irradiation a pour but de tuer toutes les cellules de la moelle osseuse et de libérer ainsi de la place pour les cellules transplantées qui vont venir s’y greffer. La prise de greffe est analysée un mois après la transplantation par la présence de cellules donneuses dans le sang des animaux, par une prise de sang à la veine faciale, effectuée sous anesthésie. Nous suivrons ensuite le développement de la maladie au cours du temps, jusqu’à 2 ans, par prise de sang régulières (toutes les deux semaines ou toutes les semaines si la maladie s’aggrave) et analyse des différentes cellules sanguines. Toutes les souris receveuses seront soumises à ces injections et prélèvements sanguins. Pour induire une inflammation chronique, des injections intra-péritonéales seront réalisées 2 fois par semaine pendant un mois. Une anesthésie locale avec de la lidocaïne sera utilisée pour ces injections.

Impact sur les animaux

Malgré la greffe de d’un nombre important de cellules de moelle qui permet aux cellules du sang de se reformer rapidement après l’irradiation, il se peut que dans les 2 semaines suivant la transplantation, les animaux souffrent : 1/ d’infections opportunistes, les cellules de l’intestin pouvant être aussi étant affectées par l’irradiation. 2/ d’une mauvaise prise de greffe et des difficultés à récupérer un taux normale de cellules dans le sang qui pourrait engendrer une diminution des globules rouges (anémie), fatigue, apathie, perte de poids, et perte de l’alimentation et dégradation de l’état général.

Devenir

Les animaux sont les animaux receveurs de cellules de moelle osseuse lors des transplantations dans nos procédures. Ils seront mis à mort et leurs organes prélevés pour étudier le phénotype et les mécansimes de la maladie.

Remplacement

Il n’est pas possible in vitro d’étudier les fonctions des cellules souches hématopoïétiques qui se trouvent dans la moelle osseuse, les mécanismes de production des cellules du sang et le développement de leucémies in vitro. Le développement de ces maladies requiert l’environnement de la moelle osseuse impossible à reproduire in vitro. Enfin, la prolifération in vitro de cellules cancéreuses est limitée et ne reflète pas ce qui se passe dans un individu. Il est donc indispensable de développer des modèles de souris mimant le plus fidèlement possible le développement de la maladie leucémique pour tester et sélectionner de nouvelles thérapies.

Réduction

La maladie évolue avec l’âge donnant des variations importantes d’un animal à l’autre. Pour avoir un pouvoir statistique suffisant nous pourrions être obligés d’étendre l’élevage pour avoir un nombre suffisant d’animaux du même âge au temps de l’expérience. Pour pallier cela (réduction), nous utiliserons la transplantation qui consiste en une greffe de moelle osseuse provenant d’une même souris donneuse à plusieurs souris receveuses qui développeront alors chacune une maladie identique. Nous pouvons utiliser moins d’animaux pour tester rapidement plusieurs conditions avec un pouvoir statistique important. Cette approche permet aussi de réduire considérablement les élevages et d’avoir des groupes de souris greffées à traiter du même âge. Nous pouvons greffer 10 souris à partir d’une souris donneuse. Ces modèles de leucémie sont nouveaux, le rythme de développement de la maladie n’est donc pas encore connu. En conséquence, nous avons calculé le nombre de souris nécessaires par groupe de greffe en nous fondant sur les données du laboratoire et de la littérature pour des pathologies similaires.

Raffinement

Immédiatement après irradiation, une observation des animaux sera réalisée 2 à 3 fois par semaine, afin de s’assurer que l’animal ne présente pas de complications directement liées à l’irradiation. Afin de favoriser le bien-être des animaux, l’hébergement se fera en groupe pour favoriser la socialisation des animaux et la nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Un enrichissement structural du milieu (coton de nidification, cabanes) sera mis en place dans chaque cage. Les procédures seront réalisées par un personnel expérimenté et sous anesthésie pour tous les gestes techniques. Les animaux seront observés quotidiennement par le personnel de l’animalerie et lors de chaque intervention des expérimentateurs (injection, pesées). Des points limites généraux sont établis. Les animaux bénéficieront d’un environnement enrichi en tout temps. Du DietGel Energy sera ajouté dans les cages après transplantation ou en cas de diminution de la prise alimentaire.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour étudier l’hématopoïèse et les cancers du sang car elle possède un système hématopoïétique et immunitaire proche de celui de l’Homme. Les souches des animaux sont bien caractérisées ce qui permet d’effectuer des greffes de moelle osseuse en évitant les problèmes liés au rejet de greffe. Enfin, il s’agit d’espèces faciles à élever qui permettent l’obtention relativement rapide de résultats du fait de leur temps de génération réduit. Nous utiliserons des souris de 8-14 semaines car elles sont considérées comme adultes. En effet, dans le cadre de notre étude, nous avons besoin que les animaux aient atteints l’âge adulte pour être dotées d’un système immunitaire fonctionnel.

900 animaux non-humains, dont des souris, rats, cobayes, hamsters, chats et chiens, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent des administrations répétées de formulations vétérinaires par voies variées et de multiples prélèvements de sang, jusqu'à dix chez les chiens et chats sur 48 heures. Le porteur indique que les rongeurs sont tués en fin d'étude tandis que les 250 chiens et 250 chats sont réutilisés puis proposés à l'adoption. Il qualifie ces études de "stricte nécessité" réglementaire, ne pouvant selon lui être remplacées pour la mise sur le marché des produits.

Objectifs

Lors de la mise au point de nouvelles formulations à usage vétérinaire, le screening de substances actives ou le choix des ingrédients de la formulation est basé entre autres sur leur propriétés pharmacocinétiques. La connaissance des principes actifs et/ou ingrédients (bibliographie, historique des études etc...), l’usage de méthodes alternatives in silico et in vitro ainsi que de la modélisation pharmacocinétique permet une première sélection mais la complexité d’une formulation (mélange d’excipients, pH, volume injecté, etc.) nécessite une ou plusieurs évaluations préliminaires avant le choix définitif de la formulation (sélection ou optimisation de formulations) et de son utilisation (posologie, voie d’administration). En amont des essais sur espèces cibles, il est possible de réaliser des études sur des rongeurs. Si les résultats sont concluants, le produit pourra être testé sur la ou les espèces cibles.

Bénéfices attendus

Ce projet contribue au développement et à la mise à disposition de produits pharmaceutiques sûrs et efficaces auprès des vétérinaires et des propriétaires d’animaux de compagnie en accord avec les exigences réglementaires pour la mise sur le marché de ces produits. Dans le cadre du développement de nouveaux produits ou amélioration de produits existants sur le marché, les bénéfices envisagés de cette procédure seront la meilleure connaissance et compréhension du fonctionnement de ces produits (dose, voie d’administration, adjuvants/excipients, innocuité, efficacité, mécanisme d’action) ainsi que la réalisation des études réglementaires permettant la mise sur le marché de ces produits.

Procédures

●Prélèvements de Sang : - chiens chats : 2 minutes par prélèvement, maximum 10 prélèvements sur 48h et dépendant du volume et du temps de récupération sur une période d’une semaine. - Rongeurs : 1 minute par prélèvement . Souris, rats : maximum 1% du volume circulant total sur 24h et maximum 15% du volume circulant total sur une période de 28 jours. - Hamsters, cobayes : maximum 5 prélèvements par 48 h et dépendant du volume et du temps de récupération sur une période d’une semaine. ●Prélèvements avec écouvillons : nasal, salive, larmes. Chiens et Chats : 1 minute par prélèvement. Rongeurs : 1 minute par prélèvement sur animal anesthésié. ●Prélèvements non invasifs : poils : sans restriction de nombre. Des administrations de produits pour toutes les voies : -1 traitement par voie (durée environ 5 minutes chez les carnivores et 1 minute chez les rongeurs. Les voies d’administration peuvent être orale (ou per os), gingivale, parentérale (entre autres sous-cutanée, intradermique, intrapéritonéale, intramusculaire, ou intraveineuse), nasale, topique (par exemple spot-on, pour-on, collier, patch), auriculaire.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir une douleur transitoire aux sites d’injection lors de l’administration du produit testé, d’anesthésique ou de médication, liée à l’introduction d’une aiguille. Suite à l’administration du produit testé, les animaux pourront présenter des signes cliniques locaux et/ou généraux, qualifiés d’effets indésirables transitoires comme une réaction cutanée locale (prurit, œdème, tuméfaction, nodule, douleur à la palpation), des réactions systémiques transitoires (perte de poids, réduction de consommation alimentaire). Ces nuisances pourront être répétées car plusieurs administrations pourront être réalisées selon la posologie envisagée. Le suivi de la température par voie rectale pourra causer de l’inconfort temporaire. Enfin, lors du suivi régulier des animaux, les nuisances envisagées seront fonction du type de prélèvements réalisés telles qu’une légère gêne (ex : écouvillon oral), ou douleur transitoire liée à l’introduction de l’aiguille (ex : prise de sang), le cas échéant.

Devenir

Pour les rongeurs, les animaux sont euthanasiés à la fin de l’étude. Pour les carnivores, l’ensemble des animaux sont ré-utilisés puis proposés à l’adoption.

Remplacement

Cette procédure a un caractère de stricte nécessité : elle ne peut pas, pour le moment, être remplacée par des méthodes alternatives car elle répond à l’obligation réglementaire ou scientifique d’être conduite sur l’espèce de destination du produit ou sur un modèle de rongeurs le cas échéant lors d’études préliminaires.

Réduction

Le nombre d’animaux envisagés dans cette procédure à été défini à son minimum : - soit en conformité avec la réglementation et la pharmacopée - soit étayé à l’aide d’un raisonnement scientifique et/ou d’une analyse statistique et/ou d’une recherche bibliographique permettant l’atteinte de l’objectif du projet. Il est également évalué en fonction du développement des projets sur les 5 ans à venir et des animaux déjà utilisés sur ceux-ci. Les études peuvent être réalisées selon différents designs : - design croisé (cross-over) : tous les animaux reçoivent successivement tous les traitements (test et référence) dans un ordre aléatoire. L’essai croisé utilise le sujet comme son propre témoin ; - design en parallèle : chaque groupe d’animaux reçoit un seul type de traitement. L’essai en parallèle utilise généralement un groupe témoin versus un ou des groupes traités car les groupes sont indépendants entre eux ; - design par étapes : quand le nombre de sujets est important, l’étude peut être réalisée en deux étapes avec un nombre inférieur de sujets. Si la première étape (plus de 50% des sujets totaux) ne permet pas de répondre à la question, la seconde étape est réalisée avec le nombre de sujets pour compléter le nombre total. Entre chaque période de traitement, une période d’attente sera définie pour permettre aux animaux de récupérer et/ou permettre l’élimination du produit administré précédemment (principe actif et métabolites) ou de son effet pharmacologique. Des tests statistiques seront adaptés à chaque design d'étude.

Raffinement

Les mesures de raffinement utilisées sont : - Une période d’acclimatation adaptée aux conditions de l’étude - Habituation des chats aux prélèvements de sang sur animaux vigiles. - socialisation des carnivores domestiques à l’aide d’une période de jeu dans une pièce dédiée. - Enrichissement des box afin d’améliorer le confort des animaux (musique, jouets adaptés...). - renforcement positif (récompenses ou caresses) - Selon le produit et l’étude, possibilité d’utiliser un sédatif/anesthésique pour soit l’administration, soit les prélèvements, soit les 2, selon les caractéristiques du produit et l’instruction d’utilisation en vigueur. - Une surveillance sera mise en place jusqu’au réveil complet de l’animal - Médication : selon le produit, l’objectif de l’étude et l’impact scientifique, l’utilisation d’anti-douleur sera étudiée au cas par cas et selon les caractéristiques du produit. - Adaptation du type de nourriture afin de faciliter l’alimentation des animaux (pâtée). - Observation quotidienne des animaux et examen/suivi clinique effectué aussi souvent que cela sera jugé nécessaire avec une fréquence qui pourra être augmentée en cas de besoin (en particulier pour le suivi d’innocuité). - Mise en place de points limites adaptés et précisément définis qui pourront être réévalués en fonction des observations recueillies. - En cas d’obligation d'héberger les animaux individuellement, des mesures complémentaires seront mises en place: une présence augmentée du personnel, possibilité pour les animaux de voir, sentir et entendre leurs congénères, augmentation du nombre de jouets dans l’hébergement, un suivi renforcé par les vétérinaires avec une attention particulière sur le comportement des animaux.

Choix des espèces

De façon réglementaire, les études de pharmacocinétique doivent être menées sur la ou les espèces de destination. Il est possible d’utiliser les rongeurs dans les études préliminaires de sélection de nouvelles molécules, formulations, voies d’administration ou posologie si pertinentes et avant les études sur espèces de destination. Les études sont réalisées chez des animaux sevrés, représentatifs de l’espèce de destination et de son statut physiologique, ceci comprenant entre autres l’âge ou la maturité sexuelle. Ces choix sont faits selon l’utilisation future du produit.

2 016 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent un régime gras jusqu'à douze semaines, des tests métaboliques avec prélèvements de sang caudal toutes les quinze minutes pendant deux heures, un jeûne intermittent et des injections sous-cutanées de cellules cancéreuses avec suivi tumoral. Le porteur indique que le régime gras dégrade leur statut métabolique et que les greffes induisent des tumeurs sous-cutanées, mammaires ou prostatiques. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthodes alternatives" à ces expériences de preuve de concept in vivo.

Objectifs

L’inflammation, processus naturel permettant déliminer des pathogènes tels que bactéries, virus et parasites, peut dans certaines conditions s'installer à long terme. On parle alors d’inflammation chronique. Cette inflammation excessive semble avoir un rôle causal dans de nombreuses affections, tels que l'arthrite, l'obésité/diabète, le sporiasis ou encore le cancer. L'activation de l'immunité innée, responsables de la production de cytokines pro-inflammatoires notemment les interférons de type I participe à l'installation et la persistance de l'inflammation chronique. Nous souhaitons ici comprendre le lien entre inflammation chronique due à l'accumulation d'acides nucléiques cytosoliques et les déréglements métaboliques chez l'obèse ainsi que leur effet sur la tumorigènèse. Les résultats obtenus au sein du laboratoire d’accueil suggèrent que l'activation de l’immunité innée et l'inflammation chronique dans les cellules cancéreuses favorise la prolifèration tumorale. De façon intéressante, l’analyse de l’impact de facteurs environnementaux sur l’apparition des cancers met en évidence un lien étroit entre l’adiposité et l’incidence du cancer. Vu le caractère fortement inflammatoire du tissu adipeux, il est tentant d’émettre l’hypothèse que le tissu adipeux promeut la tumorigénèse au cours de l'obésité.

Bénéfices attendus

Les résultats de notre projet permettra de mieux comprendre le lien entre inflammation et co-morbidités au cours de l'obésité. Ces résultats ouvriront la voie à de nouvelles appoches thérapeutiques pour limiter l'inflammation chronique dans un contexte d'obésité. En effet ce projet permettra également de déterminer l'intérêt de l'utilisation d'un inhibiteur de la voie de reconnaissance des acides nucléiques (cGAS/STING) dans le traitement du cancer en particulier chez le patient obèse.

Procédures

Les animaux recevront 5 types différents d'interventions: 1- intervention diététique pendant 12 semaines maximum: régime normal ou gras 60% 2- tests métaboliques avec injection intrapéritonéale d'insuline ou de glucose selon le test puis prélévement de sang caudal (une goutte toutes les 15 minutes pendant 2 heures) sur animaux vigiles. 3- jeûn intermittent 24h jeun/ 24h nourri pendant 20 jours maximum. 4- injection en sous-cutanée de cellulales cancéreuses (injection 5 minutes puis suivi tumoral environ 3 semaines) sous anesthésie (isoflurane). 5- injection de cellules cancéreuses (injection 15 minutes puis suivi tumoral environ 3 semaines) en orthotopique (sein ou prostate) sous isoflurane. 5- administration d'un inhibiteur de notre voie d'intêret pendant 4 semaines (sous-cutanée ou intrapéritonéal) pendant 4 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux soumis à un régime gras vont prendre du poids rapidement et voir leur statut métabolique ( sensibilité à l'insuline, tolérance au glocuse) se dégrader. L'injection de cellules cancéreuses chez les animaux va induire le dévelopement d'une tumeur sous cutanée ou mammaire/prostatique selon le type d'injection.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés au CO2 ou par discolacation des cervicales afin de prélevements les organes et /ou la tumeur des animaux.

Remplacement

Il s’agit ici de l’effet in vivo du régime gras sur l’inflammation et son impact sur le développement tumoral ainsi que l'effet d'un nouvel inhibiteur de l'inflammation : Il n'existe pas de méthodes alternatives à ces expériences de preuve de concept in vivo. Cependant des tests in vitro sur des lignées adipocytaires sont menés afin de mieux comprendre l'activation de notre voie d'interet.

Réduction

Le chercheur en charge du projet a déjà mis en place des études similaires dans le passé et s'appuie sur les données des précedentes études pour établir le nombre d'animaux nécessaire dans les cohortes afin d'observer une différence significative si elle existe.

Raffinement

Le changement de litière, la pesée des animaux pourront être amener à etre plus fréquents si besoin.

Choix des espèces

La souris immunocompétente de type C57BL/6 J ou N constitue un modèle expérimental de référence pour ce type d'expérience sur le métabolisme et les greffes de cellules tumorales murines. La C57BL/6N présente des caractéristiques proches de la C57BL/6J. La C57BL/6N n’est pas porteuse de la mutation du gène Nnt contrairement à la C57BL/6J. Cette différence induit une légère différence de phénotype face au régime gras et au développement de l’insulinorésistance. Nos lignées mutantes sont majoritairement sous fond 6J, cependant 2 d’entre elles sont 6N, nous sommes dans l’optique de les backcrosser pour les passer en J. Nos résultats préliminaires ont donné des résultats positifs chez les souris STING sous fond B6J que cela soit en termes de métabolisme ou de tumorigénèse. Souris adultes de 8 à 12 semaines afin d’avoir des animaux adultes (d’âge mûr), pour une utilisation dans un protocole classique de métabolisme et de croissance tumorale.

132 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent un régime riche en fibres par gavage trois à cinq fois par semaine, une implantation de tumeur sous la peau ou une injection intraveineuse de cellules cancéreuses, et sont privées d'eau et de nourriture jusqu'à quatre heures lors des mesures de dihydrogène expiré. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable et présente l'implantation de tumeurs comme n'induisant pas de souffrance. Il indique que le rôle du microbiote ne peut être étudié qu'in vivo et qu'il n'existe "pas d'alternative à ce jour".

Objectifs

Nous avons montré qu’un régime riche en fibre (High Fiber Diet - HFD) permet de moduler positivement la composition de la flore intestinale, ainsi que ses fonctions, impactant sur le métabolisme et l'immunité de l’hôte. Ceci conduit à l’activation de cellules immunitaires particulières au niveau intestinal. Dans un modèle de mélanome chez la souris, nous montrons qu’un pré-conditionnement à l’aide d’un régime HFD permet de prévenir la pousse tumorale, grâce aux mêmes cellules immunitaires que celles retrouvées dans l'intestin. Ainsi, nos données suggèrent qu’un régime riche en fibre, en modulant le microbiote intestinal et ses métabolites, dont le dihydrogène, active l’immunité locale et systémique de l’hôte, permettant une immunosurveillance accrue des cancers. De plus, nous avons montré qu’un régime HFD conduit à la production de dihydrogène (H2), connu pour ses propriétés immunostimulantes. Afin d’étudier le rôle du H2 dans l’effet immunostimulant et antitumoral du régime HFD, nous proposons de comparer les effets d’un régime HFD avec ceux induits par l’administration d’H2 (hydrogénothérapie). Cette démonstration renforcera nos observations et permettra le transfert rapide du régime HFD en clinique humaine, ainsi que dans la population générale.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de répondre à deux questions : (i) La quantité d’H2 produit par consommation d’inuline alimentaire peut-elle suffire à induire, par inhalation, une inhibition de la croissance tumorale ? Pour répondre à cette question, nous déterminerons tout d’abord la quantité d’H2 produite chez des souris nourries avec un régime HFD. Cette dose d’H2 déterminée sera ensuite administrée à des souris porteuses de tumeurs afin que nous étudiions la croissance tumorale et la réponse immunitaire anti-cancer. (ii) L’H2 produit par la consommation de fibres participe-t-il à l’induction de l’immunité anti-cancer ? Pour répondre à cette question, l’immunité basale des animaux sera analysée après 2 semaines de traitement. En démontrant l’effet anti-cancer d’une dose modérée d’H2 et son implication potentielle dans l’effet anti-tumoral du régime HFD, nous aurons des données préliminaires solides pour demander des financements de recherche préclinique (sur le mécanisme d’action de prébiotiques) et pour engager rapidement des essais cliniques. Enfin, ce projet doit permettre de développer de nouvelles technologies applicables dans des études précliniques sur des rongeurs de laboratoire et qui pourront être transférées en clinique (dispositifs de mesure de H2 exhalé et/ou dispositif d’administration de H2).

Procédures

Une partie des animaux sera nourrie avec un régime HFD, administré par gavage oral 3 ou 5 fois par semaine durant 1 mois (1 minute / gavage). Les animaux sont hébergés dans l'enceinte de mesure d'H2 pendant au maximum 4h consécutives, durant lesquelles ils seront surveillés par l'expérimentateur. Les fèces des animaux seront collectés après 2 semaines de préconditionnement (< 1 minute / souris). Une partie des animaux recevra une implantation tumorale par injection sous-cutanée (1 minute / souris), ou une injection de cellules cancéreuses par voie intra-veineuse, sous anesthésie (5 minutes / souris). Les prélèvements sanguins (2 minutes / souris) seront réalisés uniquement en fin d'expérience, sous anesthésie volatile, et sans réveil. Lorsque les animaux (ou un des animaux) atteindront un des points limites, ils subiront une anesthésie volatile terminale puis un prélèvement sanguin.

Impact sur les animaux

Nous n'attendons pas d'effet indésirable dans ce projet. Le traitement des animaux sera apporté par des gestes expérimentaux de classe légère (gavage ou inhalation). L'implantation de tumeurs en elle-même n'induit pas de souffrance des animaux. Les prélèvements sanguins seront systématiquement réalisés sous anesthésie générale. En revanche, durant la mesure d'H2 exhalé et l'hydrogénothérapie, les animaux n'auront pas accès à l'abreuvement et à l'alimentation, pour une durée relativement courte (maximum 4 heures).

Devenir

Les animaux en fin d'expérimentation seront euthanasiés après avoir atteint les points limites, pour des prélèvements d'organes et de tissus.

Remplacement

Le rôle du microbiote intestinal ne peut être étudié qu'in vivo. En effet, les interactions hôte/microbes et notament système immunitaire de l'hôte/microbes et les réponses anti-tumoralesinduites nécessitent une étude dans un organisme vivant. Il n'existe donc pas d'alternative à ce jour.

Réduction

Afin de tenir compte de la variabilité inter individuelle dans la réponse aux différents traitements, des groupes de 6 animaux seront constitués. Ainsi, malgré la variabilité, ce nombre d'animaux par groupe apportera une fiabilité au niveau statistique. De plus, plusieurs conditions expérimentales seront testées en parallèle, afin de mutualiser les groupes contrôles, et donc de réduire le nombre d'animaux contrôles utilisés. La dernière expérience ne sera réalisée que si les précédentes donnent des résultats satisfaisants.

Raffinement

Afin d'assurer le bien-être des animaux, les souris seront hébergées par cage de 6, avec environnement enrichi. Le régime alimentaire sera administré par gavage, et l'hydrogénothérapie par inhalation. L'injection sous-cutanée ou intra-veineuse de cellules cancéreuses n'induit qu'une légère souffrance des animaux. Toutefois, les animaux seront quotidiennement surveillés à la suite des implantations tumorales. Les injections et prélèvements sont réalisées sous légères anesthésies générales.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus pertinent pour mener ce genre d'étude. La manipulation de leur flore est acquise. De plus, les modèles tumoraux ainsi que les outils pour étudier les réponses immunes induites sont parfaitement développées pour ce modèle animal. Tous nos résultats précédents obtenus dans le cadre de cette thématique l'ont été avec ce même modèle murin. Les souris seront utilisées à partir de 6 semaines d'âge (livrées à 5 semaines + 1 semaine d'acclimatation). A ce stade, les souris sont sevrées et le système immunitaire est pleinenement mature et permet donc son étude.