Procédures légères

345 canards vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont soumis à des cycles de jeûne de 23 heures suivis de réalimentation, et une partie provient d'œufs incubés à température augmentée pour programmer l'engraissement du foie. Le porteur cherche à activer l'engraissement hépatique sans gavage, dans le but affiché d'optimiser la production de "foie gras" du canard mulard. Il présente ce modèle comme une amélioration du "bien-être animal" pour les seules phases expérimentales, la finalité restant la production.

Objectifs

Il a récemment été montré, qu’une hausse de température d’incubation des œufs de canard pouvait programmer le métabolisme du foie et ainsi provoquer un plus fort engraissement lors du gavage. L’objectif de ce projet est de mettre au point un modèle expérimental permettant d’activer les voies cellulaires de l’engraissement du foie sans gaver les animaux, afin d’étudier les mécanismes de cette programmation. Le modèle que nous proposons est basé sur l’activation du métabolisme hépatique lors de phases de jeûne et de réalimentation et permettrait d’accélérer les phases expérimentales. De nombreux points communs ont été mis en évidence entre le gavage et la réalimentation d’une durée d’une heure, après un jeûne de 23h. Toutefois, la quantité de lipides totaux dans le foie n’est pas modulée lorsque les mesures sont faites 4h après la réalimentation. Ce paramètre étant essentiel pour pouvoir mettre en parallèle la technique de gavage et le modèle expérimental, nous souhaitons maintenant optimiser le protocole pour obtenir un début d’engraissement hépatique mesurable (comparé à la fin de période de jeûne). Pour cela, nous souhaitons soumettre des canards âgés de 8 semaines à un jeûne de 23h, puis à différentes modalités de réalimentation (1h de réalimentation, 16h de réalimentation ou deux fois 1h de réalimentation séparées de 6h). Pour cette première partie du protocole, un total de 225 animaux sera utilisé. Dans un second temps, afin de mesurer l’impact de la programmation thermique embryonnaire sur le métabolisme lors de ce challenge alimentaire, deux groupes d’animaux seront soumis au meilleur protocole (ayant permis de mesurer une hausse du taux de lipides). Les œufs de canard seront incubés selon deux protocoles différents : un groupe avec une température d’incubation dite « contrôle » et un groupe dit « programmé » dont la température d’incubation sera augmentée de 1,7°C pendant 10 jours embryonnaires, 16h/24. Pour cette seconde partie dont l’objectif sera de mesurer des différences de réponses liées à la programmation thermique embryonnaire, 120 canards seront utilisés. La totalité de ce projet (optimisation du challenge alimentaire et programmation thermique) concernera donc un total de 345 animaux.

Bénéfices attendus

La filière « foie gras » se doit de chercher de nouvelles méthodes de production, notamment pour tenter de trouver des alternatives à la pratique du gavage, encore inexistantes chez le canard. Ce projet a pour objectif de mettre au point un protocole qui permettrait d’étudier le métabolisme du foie des canards et notamment l’impact de la programmation embryonnaire, sans avoir à gaver les animaux lors des phases expérimentales. La mise au point de ce protocole de jeûne/réalimentation nous permettrait de tester différentes techniques en vue d’optimiser le métabolisme hépatique des canards, que l’on pourrait ensuite appliquer dans des modèles classiques de production, mais également dans des nouvelles pratiques sans gavage. Notre équipe s’intéresse depuis quelques années à la programmation thermique embryonnaire, qui a déjà démontré son efficacité sur la production de foie gras par gavage, mais qui nécessite encore des optimisations. Ces optimisations pourront naitre d’une meilleure compréhension des mécanismes liés à la programmation. L’existence d’un protocole nous permettant d’étudier le métabolisme hépatique du canard sans avoir à gaver les animaux permettrait non seulement d’accélérer les études (les prélèvements étant plus flexibles et les mesures étant moins variables que lors du gavage), mais également de remplir l’objectif d’amélioration du bien-être animal, au moins pour les phases expérimentales. Si nous parvenons à obtenir une hausse de la quantité de lipides dans le foie lors de ces cycles de jeûne/réalimentation, nous pourrons alors tester de nombreuses conditions de programmations embryonnaires, et in fine les appliquer dans des modèles classiques de gavage mais également dans des modèles d’alternatives à venir.

Procédures

Les canards ne seront soumis à aucune intervention autre que la mise à jeun. Ils seront pesés et prélevés après leur euthanasie. La phase de préparation au gavage correspond à l’enchainement de 28 cycles identiques de jeûne/réalimentation, sans que cela n’entraine de stress particulier ou de perte de poids significative. Nous supposons donc que cette procédure n’entrainera pas de nuisances particulières. La faim provoquée par le jeûne imposé ne devrait pas entrainer une hausse significative de l’agressivité entre individus. Lors de la réalimentation, les aliments seront mis à disposition en quantité suffisante pour que tous les animaux puissent y avoir accès. Les embryons seront soumis à une hausse de température d’incubation de 1,7°C, parallèlement à une hausse de l’humidité relative afin d’éviter la déshydratation des œufs (65%), durant 10 jours embryonnaires (E11-E21) et de façon discontinue (16h/24h). Ces conditions permettent généralement de limiter les nuisances pour les embryons et de maintenir une éclosabilité identique aux embryons incubés en conditions normales.

Impact sur les animaux

Il ne devrait pas y avoir d’effet indésirable notable car la phase de préparation au gavage utilisée couramment en élevage, et consistant à rationner les animaux à une seule heure d’alimentation par jour afin de les habituer à consommer une grande quantité d’aliments, correspond à l’enchainement d’une trentaine (28) de cycles de jeûne/réalimentation sur une durée de 4 semaines. Cette pratique n’entraine pas de problème de comportement, ni de baisse de poids des animaux. Nous pouvons donc supposer que l’étude de ces cycles de jeûne/réalimentation ne produira pas de stress excessif ou de baisse de poids significatifs. De même il a été montré que la hausse de température d’incubation des oeufs, lorsqu’elle est pratiquée de manière modérée (inférieure à 2°C), de façon discontinue (16h/24h) et pendant les phases les moins précoces de l’embryogenèse permettait de limiter les impacts négatifs sur la survie des embryons. Dans cette étude nous utiliserons une hausse de température de 1,7°C maximum pendant 10 jours embryonnaires (du 11eme au 21eme jour) et de façon discontinue (16h/24), dans l’objectif de maintenir l’éclosabilité au même niveau que le groupe ne subissant pas de hausse de température.

Devenir

La totalité des animaux sera euthanasiée en fin de procédure, les prélèvements prévus ne pouvant se faire sur animaux vivants.

Remplacement

Le remplacement total des animaux dans le cadre des études de métabolisme hépatique dans la filière « foie gras » n’est à ce jour pas possible. Les mesures physiologiques de variation de poids et de composition du foie ne peuvent se faire qu’in vivo.

Réduction

Ce projet en lui-même représente une méthode permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés pour l’étude des mécanismes de la stéatose hépatique (engraissement du foie). En effet, le protocole de jeûne/réalimentation permettrait de stimuler des voies analogues à celles stimulées lors du gavage, mais la variabilité de réponse étant beaucoup moins importante le nombre d’animaux nécessaires en serait réduit d’autant (passant de 38 animaux par groupe pour notre précédente étude avec gavage à 15 animaux par groupe pour celle-ci, donc une réduction d’environ 60% des effectifs lors des phases expérimentales).

Raffinement

Les animaux seront installés dans des loges de 18m² (à raison de 45 animaux maximum par loge, assurant ainsi 0,4m² par animal), avec un accès extérieur de 6m² lorsque les conditions environnementales le permettent (donc hors claustration imposée en cas de crise de grippe aviaire). Jusqu’à l’âge de 3/4 semaines, selon la taille de leur pattes, les canetons sont installés sur de la litière pour éviter qu’ils ne se blessent sur les caillebotis. Les animaux auront accès à un seau d’eau, où ils pourront plonger leur tête et projeter de l’eau sur leur corps. Différents enrichissements seront mis en place de façon périodique avec mise à disposition successive de chainettes métalliques de jeu, de flotteurs suspendus par une corde, de tas de copeaux de bois, afin de stimuler leur curiosité et le jeu en vue de réduire les comportements agressifs. Au cours de l’élevage et pendant la période de jeûne, une observation biquotidienne des animaux sera réalisée, afin de s’assurer du bon état de chaque animal. Toute observation de boiterie, blessure, prostration ou refus de se réalimenter (point limite strict spécifique du projet) entrainera un consignation sur la feuille d’élevage et l’évolution de l’état de l’animal sera suivi à chaque passage de l’éleveur. Celui-ci jugera de la conduite à tenir. Si son état se dégrade, il sera retiré de l’expérimentation, isolé pour être surveillé plus attentivement et soigné si nécessaire. Si son état ne s’améliore pas, il sera euthanasié sous la directive du vétérinaire.

Choix des espèces

De nombreuses différences entre espèces ont été relevées quant à la capacité à produire du foie gras, et aujourd’hui le canard mulard est utilisé pour plus de 90% de la production. Notre étude visant à comprendre les mécanismes de la programmation thermique embryonnaire sur le métabolisme du foie dans l’objectif d’optimiser les méthodes de production actuelles, le canard mulard est donc l’espèce de choix. Les animaux seront utilisés depuis le début de l’embryogenèse (arrivée rapide des œufs après le jour de ponte) et jusqu’à la huitième semaine de vie post-éclosion. La programmation embryonnaire nécessite l’application de notre stimulus thermique pendant la période d’incubation. Et nous avons choisi de mettre en place notre stimulus alimentaire (jeûne/réalimentation) à la huitième semaine de vie post-éclosion, car elle correspond habituellement à l’âge auquel les animaux sont mis en préparation au gavage et commencent donc à subir ces cycles de jeûnes/réalimentation, sans impacts néfastes pour leur santé.

480 poulets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent trois prélèvements sanguins et, pour la moitié, un vaccin surdosé pouvant perturber leur digestion, avant d'être tués pour prélever le tube digestif. Le porteur cherche des biomarqueurs de santé digestive chez le poulet de chair, dans une visée d'élevage et de production. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne permet d'atteindre cet objectif chez cette espèce.

Objectifs

Le maintien de l’homéostasie intestinale - équilibre entre l'hôte, le microbiote intestinal et les composés alimentaires présents dans le tube digestif - est essentiel pour assurer la santé et le bien-être du poulet. Cependant, plusieurs facteurs inhérents à la qualité des aliments, à la gestion des oiseaux et à l'environnement peuvent affecter cette homéostasie et engendrer potentiellement de multiples perturbations avec des conséquences négatives sur la santé, le bien-être et des rejets dans l'environnement.

Bénéfices attendus

Ce programme contribuera à proposer : - des biomarqueurs de santé les moins invasifs possibles pouvant être utilisés pour quantifier la robustesse du poulet et proposer des stratégies de prévention. -un socle de connaissances sur la l’homéostasie digestive des volailles peu étudiée de façon globale. - un ou plusieurs outils de suivi en élevage ne nécessitant pas de procédure invasive pour les animaux.

Procédures

A J8, J21 et J35, les animaux subiront une prise de sang au sinus occipital , cette intervention prend 5 secondes.

Impact sur les animaux

Le prélèvement au niveau du sinus occipital peut engendrer du stress lié à la contention de l’animal et un hématome. Cette procédure est assurée par des personnes expertes qui maitrisent parfaitement la technique réduisant le risque de stress et d’hématome pour l’animal. De plus, le régime alternatif intégrant des matières premières plus locales et alternatives au soja (importé) sont susceptibles d’entrainer dans certains cas des désordres digestifs. Ces désordres sont malheureusement fréquents sur le terrain ; ils affecteraient près de 50% des lots. Pour la moitié des animaux, un challenge vaccinal (anticoccidien surdosé) sera appliqué pouvant induire une perturbation temporaire de la santé digestive des animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en respectant la règlementation en vigueur (annexe 4 del’arrêté du 1/02/13) afin de réaliser les prélèvements des différentes parties du tube digestif, les organes annexes et digesta.

Remplacement

Les connaissances sur la physiologie digestive et sur les possibles liens entre matrices invasives (tissu, contenu digestif), peu invasive (sang) et non invasive (fientes) sont encore très éparses et ne permettent d'envisager une expérimentation in silico. L’utilisation de l’animal ne peut être remplacée par un modèle d’étude in vitro ou in silico.

Réduction

Les animaux seront élevés en groupe et au sol dans un bâtiment d’élevage standard. Il a été estimé qu’un nombre de 20 poulets par condition était nécessaire pour identifier une différence significative entre les groupes en termes de santé digestive et biologiquement pertinente au regard de la bibliographie . Considérant une mortalité de 5% (3 animaux par traitement), il est nécessaire de considérer 63 animaux par traitement (20 animaux * 3 dates + 3 mortalités possibles).

Raffinement

Le comportement des animaux sera suivi quotidiennement afin de détecter tout risque de souffrance ou de mal-être. Toute manifestation de symptômes comportementaux persistants définis par un point limite (animal prostré plus de 24 h et ayant cessé de s’alimenter et de s’abreuver) entrainera le retrait de l’animal de l’expérimentation. Le milieu sera enrichi avec des enrichissements permettant aux animaux de grimper et de se cacher.

Choix des espèces

Le projet est un programme de recherche finalisée visant à identifier des biomarqueurs de la santé digestive chez le poulet de chair afin de proposer des méthodes d’évaluation peu ou non invasives. Il n’existe pas de modèle mathématique ni de test in vitro permettant d’atteindre cet objectif. L’objectif premier de ce projet est d'identifier des biomarqueurs peu ou non invasives de santé digestive spécifiquement chez le poulet qui sera le modèle d’étude.

750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une injection dans le muscle ou une instillation dans la trachée de vecteurs synthétiques, puis jusqu'à quatre prélèvements sanguins. Le porteur cherche à optimiser ces vecteurs pour la thérapie génique et la vaccination, en s'appuyant sur l'exemple des vaccins à ARN contre le Covid. Il indique que la classe de vecteurs à base de polymères ne fonctionne pas en culture cellulaire, ce qui rend selon lui l'évaluation in vivo "nécessaire".

Objectifs

A l’heure actuelle, beaucoup de maladies géniques (dysfonctionnement d’un ou plusieurs gènes) n’ont pas de traitement curatif. Cependant, la thérapie génique (qui consiste à délivrer dans la cellule « malade » un gène « sain »au moyen d’un « vecteur » pour pallier son dysfonctionnement) semble être une approche permettant de réparer la cellule elle-même. Ainsi, la possibilité de faire exprimer par une personne malade une protéine d’intérêt vaccinale ou thérapeutique représente un espoir important pour traiter ou prévenir des maladies héréditaires ou acquises. De plus, une démonstration récente vient d’être apportée par les vaccins contre le COVID19, prouvant qu'il est possible d’utiliser cette méthode de traitement. Dans ce contexte, nous cherchons à améliorer le ciblage de la thérapie à l’aide de vecteurs synthétiques. En effet, les acides nucléiques ne traversant pas spontanément les membranes biologiques, l’objectif de notre projet est d’inventer et d’optimiser de nouvelles classes de vecteurs synthétiques pour faciliter l’entrée des « gènes sains » dans les cellules « malades ». Néanmoins, tout ceci est rendu possible uniquement par l’évaluation chez l’animal de la réponse biologique comme les réponses immunitaires ou cellulaires observables à la suite du traitement appliqué. En effet, il n’est pas possible d’évaluer l’efficacité de la vaccination in vitro, car il est impossible de récapituler le système immunitaire dans un tube à essai. C’est pourquoi, nous voulons injecter nos vecteurs synthétiques chez la souris adulte pour observer la réponse globale de l’animal. L’analyse des résultats, des différents prélèvements des sites d’injections, du sang, ou de différents d’organes permettra d’ajuster la composition des vecteurs que nous développons et de trouver le meilleur vecteur pour les thérapies futures.

Bénéfices attendus

Dans ce projet de recherche, nous poursuivrons la synthèse de deux classes de vecteurs synthétiques, dont l’une est constituée de lipides et l’autre de polymères, afin d’en augmenter considérablement la capacité de transfection. La première classe constituée de lipides est efficace pour transporter in vitro des acides nucléiques dans des cellules et peut donc faire l’objet d’optimisation in vitro avant d’être évaluée chez l’animal. En revanche, la classe constituée de polymères ne permet pas in vitro une transfection cellulaire, obligeant le triage et la caractérisation de ce type de vecteur uniquement chez l’animal. C’est d’ailleurs de cette manière que cette nouvelle classe de vecteur a été identifiée et est actuellement en phase de développement clinique chez l’Homme.

Procédures

Selon la procédure, les animaux recevront une injection intramusculaire ou une instillation intra-trachéale des vecteurs synthétiques. Ces 2 procédures (de moins de 5 minutes) seront réalisées sous anesthésie générale. Ensuite, pour les protocoles courts, les procédures sont arrêtées après 48 heures et les différents prélèvements sont effectués. Pour les protocoles longs, après l’administration des vecteurs, des prélèvements sanguins sur animal vigile ou anesthésiés seront réalisés à différents temps tout au long de l’étude (4 prélèvements sanguins par animal), et les procédures seront arrêtées 56 jours après initiation du protocole.

Impact sur les animaux

Les vecteurs synthétiques testés possèdent des caractéristiques très précises et un degré de pureté élevé. des études préliminaires de toxicologie et de biodistribution réglementaires ont déjà démontré la parfaite innocuité et absence de mortalité de ces nouvelles classes de vecteurs synthétiques pour le transport intracellulaire de gènes thérapeutiques. Afin de mener à bien nos études nous utilisons des gènes modèles pour la caractérisation de l'efficacité du transport intracellulaire in vivo pour l'expression de protéine d'intérêt thérapeutique ou vaccinale. Ces gènes permettent par des tests simples de déterminer l'efficacité des vecteurs. L’administration des vecteurs testés (injection intramusculaire ou instillation intra trachéale) est susceptible d’entrainer un stress chez l’animal, une douleur ou une gêne à la mobilité à la suite de l’injection. De la même manière, l’instillation intratrachéale est susceptible d’entrainer une douleur. Ces deux gestes ne seront réalisés qu’une seule fois au début du protocole expérimental, et les souris ne recevront que l’une ou l’autre des méthodes d’administration. Enfin dans le cadre des protocoles longs, des prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile, ou anesthésié. Ces gestes et notamment les prélèvements sur animal vigile peuvent être source de stress chez l’animal, l’anesthésie gazeuse peut également causer des nuisances aux animaux. La réalisation de prélèvements sanguins est également susceptible de causer un saignement. Lors des protocoles long les animaux seront soumis à 4 prélèvements sanguins suffisamment espacés dans le temps afin de limiter les effets indésirables sur les animaux.

Devenir

Afin de pouvoir réaliser les analyses nécessaires à la caractérisation des vecteurs synthétiques évalués dans ce projet de recherche, le prélèvement de tissus et d’organes vitaux est nécessaire à l’issue des expérimentations. Pour cela, les animaux seront mis à mort à l’issue des deux procédures.

Remplacement

Nous remplacerons dans la mesure du possible l'expérience sur les animaux. Pour la classe de vecteurs constitués de lipides, une présélection sera réalisée in vitro pour ne tester in vivo que les vecteurs ayant démontré la meilleure efficacité de transfection. La meilleure efficacité de transfection correspond aux conditions où le plus de protéine codée par l’ADN/ARN messager issu du vecteur est exprimée dans le tissu dans lequel a été injecté le vecteur. Toutefois, dans le cadre des protocoles dédiés à la vaccination, seule l’approche in vivo sera considérée pour évaluer l’efficacité des vecteurs, étant entendu qu’il n'existe pas de système immunitaire dit "en tube à essais". De plus, les vecteurs utilisés dans notre étude sont de nature polymérique et ne sont pas capables de délivrer des ARN ou ADN dans des cellules en culture. L’évaluation in vivo chez l’animal est donc nécessaire. C’est d’ailleurs par cette approche que cette nouvelle classe de vecteur a été récemment validée et est actuellement en phase de développement clinique chez l’Homme.

Réduction

Nous réduirons le nombre d'animaux utilisés en effectuant un premier screening in vitro dans le cadre de nos recherches de vecteurs dédiés aux protocoles de traitement de maladies rares. Après cette première sélection, l'usage d'un modèle in vivo sera indispensable afin d'évaluer le comportement des vecteurs synthétiques après administration. En effet, l’influence de l’environnement (organe, sang) in vivo tant par sa mécanique que par sa composition peut entrainer des modifications de comportement que l'on ne peut évaluer in vitro. Par ailleurs, l’évaluation des vecteurs sera effectuée dans la même souche de souris, du même âge et même sexe des souris utilisées précédemment afin de pouvoir comparer les résultats entre eux et de ne pas renouveler des contrôles déjà effectués.

Raffinement

Comme les études in vivo sont nécessaires à la validation de nos vecteurs, le raffinement des méthodes est pris en compte dans l’établissement des différents protocoles d’étude. Au cours de chaque procédure expérimentale, la prise en charge des animaux comprend des mesures visant à réduire la douleur. Une anesthésie sera toujours réalisée, ainsi qu'une analgésie dans les cas nécessaires. Après les injections ou les prélèvements, les animaux seront examinés afin de vérifier leur bien-être, puis une visite quotidienne (weekend inclus) aura ensuite lieu pour vérification de leur état de santé. Ces observations permettent d'effectuer une estimation de la douleur générée (grâce à une grille de score et des points limites prédéfinis) et, le cas échéant, de mettre en place des moyens adaptés pour la soulager de façon appropriée, efficacement et sans interférence avec le protocole. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux sur de la litière en cellulose et auront à disposition au minimum deux enrichissements, (ex : tunnel, un carré de cellulose).

Choix des espèces

La souris a été choisie pour ce projet car cette espèce mammifère présente des caractéristiques physiologiques et des réponses tissulaires proches de celles observables chez l’homme. La souris, étant fréquemment utilisée à des fins de recherche, l’étude des effets de composés chez cet animal de laboratoire, permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, un volume suffisant de liquides biologiques peut-être récupéré et analysé. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Les vecteurs que nous utiliserons à titre de comparaison ont été validés in vivo sur la souris. Afin d’éviter les études préliminaires pour optimiser les conditions d’injection et multiplier les contrôles, nous utiliserons la même espèce pour réaliser nos futures études. Dans la continuité des études antérieures, les souris utilisées dans ce projet seront âgées de 8 semaines afin de permettre une comparaison avec l’ensemble des résultats des études. Dans la continuité des études antérieures, les souris utilisées dans ce projet seront âgées de 8 semaines afin de permettre une comparaison avec l’ensemble des résultats des études.

240 souris humanisées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Sous anesthésie, elles reçoivent des injections intranasales d'un allergène et des injections intraveineuses d'un anticorps censé éliminer des cellules immunitaires, puis sont euthanasiées pour des prélèvements post mortem. Le porteur indique qu'aucun analgésique ne peut être utilisé, celui-ci fausserait les résultats. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" à la souris, tout en mentionnant les brevets et partenariats industriels attendus.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est de démontrer l'effet thérapeutique d'un nouvel outil immunologique spécifiquement dirigé contre les cellules lymphoïdes innées ILC2 pulmonaires responsables du déclenchement de l'allergie dans les poumons. Le résultat attendu sera l'élimination de ces cellules pathogéniques et donc une guérison de l'allergie pulmonaire. Les maladies allergiques sont une priorité de santé publique car elles touchent des millions de personnes et leur prévalence devrait augmenter dans les années à venir. Aucun médicament permettant une guérison totale des patients n'existe aujourd'hui. Cette étude préclinique permettra de valider ce nouvel outil thérapeutique. Ce projet nécessite l'utilisation de souris humanisées dans lesquelles le gène humain codant pour CRTH2, gpr44, remplace le gène murin (Knock-In). Les souris anesthésiées seront soumises à l'administration d'IL33 puis de l'allergène "papaïne" par voie intranasale pour déclencher une inflammation pulmonaire. Ce modèle n'induit pas d'asthme mais une infiltration de cellules immunitaires dans les poumons. Un protocole d'administration de l'anticorps censé éliminer les ILC2 sera réalisé (suite à l'administration de IL33/papaïne) et les souris seront euthanasiées afin de réaliser des prélèvements post-mortem pour évaluer l'évolution de la pathologie induite et déterminer l'effet thérapeutique de notre médicament.

Bénéfices attendus

Le résultat attendu sera l’élimination des cellules pathogéniques et donc de guérir de l’allergie pulmonaire. Ce projet a donc un impact sociétal fort puisqu’il permet de répondre aux besoins médicaux non satisfaits dans le cadre des allergies sévères. En effet, ce trouble inflammatoire chronique des voies respiratoires affecte le bienêtre des patients à tout âge (avec une dégradation des performances scolaires et professionnelles), et les symptômes sont traités par des traitements palliatifs coûteux. Il n'existe actuellement aucun traitement curatif de cette maladie. Notre projet vise à fournir de nouveaux traitements pour l'asthme sévère en éliminant spécifiquement les ILC2, acteurs clés de la maladie, et à améliorer le bien-être des patients. Grâce à la haute spécificité des anticorps de déplétion, cette stratégie réduira les effets secondaires et améliorera ainsi le bien-être des patients. Notre projet a aussi un impact économique puisqu’il permettrait de développer un nouveau traitement innovant pour l'asthme sévère. Les innovations potentielles qui pourraient émerger du projet seront protégées par des demandes de brevet avant tout rapport ou publication des résultats scientifiques. A l'issue du projet, nous rechercherons des collaborations avec des partenaires industriels afin de favoriser le partenariat public-privé et d'assurer le transfert de notre anticorps thérapeutique à travers un processus optimisé de découverte et de développement de médicaments.

Procédures

Chaque souris subira sous anesthésie 4 injections intranasales (une injection dure moins de 30 seconde), 1 ou 3 injections intraveineuses (une injection dure moins de 10 seconde). Ces injections ne se font pas le même jour.

Impact sur les animaux

La littérature sur les modèles allergiques se réfère exclusivement aux souris et aux rats. Il est nécessaire d'utiliser un modèle animal approprié reflétant la pathologie humaine en étude préclinique pour valider nos anticorps thérapeutiques. Nous utiliserons une souris humanisée sur fond C57BL6, qui exprime le récepteur CRTH2 humain (au lieu du récepteur CRTH2 murin) sur les cellules ILC2 pour tester l’effet thérapeutique de nos anticorps spécifiquement dirigés contre un CRTH2 humain à des fins cliniques (la procédure concerne l’induction de l’inflammation dans ces souris). Par ailleurs, les souris humanisées KI ne présentent aucun phénotype dommageable avant procédure. Concernant le modèle choisi d’induction d’allergie à la papaïne (procédure décrite), il provoque une inflammation pulmonaire induite par la papaïne, mais aucun autre phénotype n’a été décrit dans ce modèle d’allergie (tel que l’asthme). Ce modèle d’allergie pulmonaire est décrit comme étant asymptomatique. L’inflammation au niveau des poumons dure 1 mois puis se résorbe spontanément.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. Tous les prélèvements permettant de valider l'effet thérapeutique de nos outils immunologiques se font post mortem.

Remplacement

Le projet vise à tester l’effet thérapeutique de nos outils Anticorps pour des fins thérapeutique chez l’homme. Pour tester cet effet nous devons reproduire la pathologie humaine dans un modèle animal. La souris est de loin le système modèle le plus fiable pour étudier les cellules du système immunitaire comme les ILC et les maladies influencées par ces mêmes cellules telles que l’allergie. L’utilisation de souris humanisées reste une des rares méthodes permettant la validation préclinique de médicaments tels que les anticorps en immunothérapie. Il n’y a donc pas d’alternative actuellement à l’utilisation des souris pour atteindre l’objectif de ce projet, qui est la guérison de l’inflammation pulmonaire avec des outils immunologiques. L’inflammation pulmonaire est une réponse immunitaire intégrant des systèmes de communications cellulaires complexes (endothélium, système lymphatique et vasculaire, système neuronal) que l’on ne peut actuellement pas reproduire in silico, ni in vitro, ni ex vivo. Il n’existe pas de méthodes in vitro (cultures cellulaires, organoïdes) pour étudier les maladies influencées par cellules ILC comme l’allergie, car elles ne permettent pas d’étudier une réponse immunitaire globale comme possible sur animal entier et ne répondent que partiellement à la nécessité de valider des anticorps en immunothérapie. Toutefois, dans le cadre de ce projet des alternatives à l’utilisation animale sont réalisées telles que les tests de cytotoxicité in vitro où nous pouvons valider la fixation de nos anticorps sur les cellules attendues (mais cela ne démontre pas la guérison d’une maladie pulmonaire).

Réduction

Le plan de nos expériences sera construit de sorte à limiter le nombre de souris selon la loi des 3R selon une approche conditionnelle (lot 1 testé, puis lot 2 testé selon le résultat obtenu sur le lot 1). Afin de réduire au minima le nombre de souris et d'assurer la robustesse statistique, des groupes de 5 individus seront analysés à 4 conditions et à 2 temps donnés, l'expérience devra aussi être reproduite au moins 2 fois. Le maximum de souris pouvant être utilisé est de 240 souris. Le minimum serait de 80 souris. NB : le test est dit concluant si l’outil immunologique a réduit significativement l’inflammation pulmonaire (nombre diminué des cellules pathogéniques) par rapport au contrôle de référence (sans anticorps).

Raffinement

Afin de réduire au maximum la douleur et la souffrance animale, les souris seront anesthésiées légèrement au vetisoflurane gazeux avant tout acte invasif. Les souris seront hébergées en cage standard avec toit filtrant au nombre de 5 par cage, avec de la sciure de bois utilisée comme litière, des rouleaux de coton comme matériau de nidification et de maisons de souris achetées dans le commerce et fournies pour l'enrichissement environnemental. Les souris sont nourries et boivent ad libitum, et sont libres de leur déplacement. Aucun analgésique ne peut être utilisé car les analgésiques ont un effet immunomodulateur et ne peuvent donc être utilisés sans compromettre les résultats expérimentaux. Afin de s’assurer du bien-être des animaux, ces derniers feront l'objet d'une surveillance régulière renforcée par les animaliers et l'expérimentateur. Des actions à réaliser en fonction des scores d’observation (grille fournie aux animaliers) seront réalisées comme suit : -Pour tout score de 1 ou plus --> Vigilance accrue et contacter le responsable du projet -Pour tout score cumulé supérieur à 3 --> Consulter le vétérinaire référant -Pour tout score cumulé supérieur à 6 ou mentionné "Eutha"--> Euthanasier l'animal.

Choix des espèces

Les expériences doivent être effectuées sur des souris, car elles disposent d’un système immunitaire qui est très similaire à celui de l'homme. La souris est de loin le système modèle le plus important et le plus fiable pour étudier les cellules du système immunitaire comme les ILC et les maladies influencées par ces mêmes cellules telles que l’allergie. L’utilisation de souris humanisées reste une des rares méthodes permettant la validation préclinique de médicaments tels que les anticorps en immunothérapie. D'autres méthodes expérimentales ne peuvent pas être utilisées de manière comparable. La littérature sur les modèles allergiques se réfère exclusivement aux souris et aux rats. Il est donc nécessaire d'utiliser ce modèle approprié reflétant la pathologie humaine. Nous utiliserons une souris humanisée sur fond C57BL6, qui exprime le récepteur CRTH2 humain (au lieu du récepteur CRTH2 murin) sur les cellules ILC2 pour tester l’effet thérapeutique de nos anticorps spécifiquement dirigés contre un CRTH2 humain à des fins cliniques. Ces souris humanisées KI ne présentent aucun phénotype dommageable. Nous utiliserons des souris âgées entre 6 et 10 semaines car à cet âge les souris sont adultes et disposent d’un système immunitaire mature.

366 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Reproduisant un rachitisme génétique lié au chromosome X, elles reçoivent une injection unique d'un virus-médicament, puis des prélèvements sanguins rétro-orbitaux répétés cinq à vingt fois sur trois à dix-huit mois, avec des mesures morphologiques et un test de la grille inversée. Le porteur indique n'attendre aucun effet secondaire du traitement, les nuisances se limitant au stress de contention et à la douleur des piqûres. Il affirme que les résultats sur cellules "ne reflètent pas toujours" ceux obtenus chez l'animal, ce qui justifie le recours à la souris.

Objectifs

Notre projet a pour but de développer une solution thérapeutique pour les patients atteints d’hypophosphatémie liée au chromosome X (XLH). L’XLH est la forme de rachitisme génétique la plus fréquente touchant 1 naissance sur 20 000 chaque année. Cette maladie métabolique rare se traduit principalement par des malformations squelettiques. Les patients sont de petite taille et souffrent de douleurs osseuses, dentaires, et musculaires. Leurs os sont plus fragiles et les fractures nombreuses. Deux traitements sont actuellement disponibles, mais ils présentent des limitations importantes : i) leur efficacité est transitoire et/ou partielle et nécessite une réadministration fréquente; ii) ils peuvent provoquer des effets néphrotoxiques sévères. C’est pourquoi nous développons une alternative par thérapie génique, qui a le potentiel de guérir les patients en une seule administration. Ce projet va nous permettre d’identifier chez le modèle murin de XLH, un traitement sûr et efficace.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mettre au point, chez un modèle murin, un traitement sûr et efficace pour la maladie XLH. Nos précédents travaux ont permis d’établir la preuve de faisabilité d’une approche par thérapie génique. Dans ce projet, qui durera 5ans, nous voulons améliorer le produit que nous avons conçu et réaliser l’ensemble des études nécessaires à son développement vers la clinique. Les résultats obtenus nous permettront alors d’envisager une solution thérapeutique pour patients XLH, efficace sur le long-terme, afin de stopper l’évolution de leur pathologie. Les bénéfices attendus concernent donc directement l’amélioration de l’état de santé des malades et de leur qualité de vie.

Procédures

Les animaux seront injectés une seule fois avec des virus médicaments dans la veine temporale ou les sinus rétro-orbitaux selon l’âge des souris. Ce geste dure moins de 30 secondes. Les animaux seront anesthésiés par voir gazeuse (isoflurane) puis prélevés en sang au niveau des sinus rétro-orbitaux. Ce geste dure moins de 30 secondes. OEil gauche et oeil droit seront alternés. Ce geste sera réalisé entre 5 et 20 fois, en 3 à 18 mois. Les mesures morphologiques (taille du corps, taille de la queue) seront réalisées juste après les prélèvements de sang afin d’éviter une autre anesthésie. Ce geste dure moins de 30 secondes. Ce geste sera réalisé entre 5 et 20 fois, en 3 à 18 mois. Le test de la grille inversée sera réalisé entre 5 et 20 fois, en 3 à 18 mois. Nous réalisons ce test couramment dans d’autres projets, et aucun traumatisme physique n’a été observé. Ce test dure 3 minutes et le nombre de chutes par minute est comptabilisé.

Impact sur les animaux

Traitement injecté : aucun effet secondaire n'est attendu suite à l'injection du traitement. Traitement des souris HypDuk : diminution des problèmes liés à la maladie (augmentation taille et poids des souris) Injection : Stress lié à la contention + douleur liée à la piqure d'aiguille. Prise de sang : Stress lié à la contention + douleur liée à la piqure. Mesures morphologique : Réalisé sur souris endormies lors du prélèvement de sang : pas de stress supplémentaire. Test musculaire : Stress lié à la manipulation. Euthanasie : Stress lié à la manipulation. Souris HypDuk : pas de douleur quotidienne lié à la maladie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Dans un premier temps, nous avons réalisé un premier tri de nos candidats sur des cellules en culture. Ces tests nous ont permis d'éliminer les candidats produisant une trop faible quantité de protéine. Néanmoins, par expérience, nous savons que les résultats obtenus sur cellules ne reflètent pas toujours les résultats obtenus chez l'animal et ne permettent pas d’identifier si l’approche permet de traiter les symptômes de la maladie. L’utilisation d’animaux est donc primordiale pour réaliser cette étude car (1) il est nécessaire de tester nos produits sur un corps entier pour observer les effets simultanés sur le foie, les reins et sur les os (2) il est nécessaire d’évaluer la croissance ainsi que la force musculaire des souris (3) il faut obtenir des fluides (sang, urine) pour mesurer les marqueurs de la maladie.

Réduction

Afin de d'utiliser le moins d'animaux possible, nous avons calculé le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir des résultats suffisamment fiable (6 souris par groupe soit 186 souris saines et 166 souris malades). Le nombre de souris déterminé ici est le nombre maximal de souris utilisé, si la deuxième procédure n'aboutit pas à des résultats concluant, nous ne passerons pas aux étapes suivantes ou seulement avec 1 candidat. De plus, nous allons prioriser l'utilisation d'animaux sains (186 souris) lors de la sélection de nos meilleurs candidats, cela permettra d'obtenir des animaux plus rapidement (il est plus facile d'accoupler des animaux sains que malades et le nombre de petits par portée est plus important) et permettra aussi de limiter la génération de souris malade.

Raffinement

Dès leur arrivée en zone d’expérimentation, les souris seront manipulées et contentionnées afin d’être familiarisées aux expérimentateurs et aux gestes expérimentaux. Cette habituation devrait réduire le stress et l’angoisse des animaux. Les souris utilisées lors de ce projet ne présentent pas de signes de douleurs évidents. Les virus utilisés sont non dangereux et les doses utilisées ne sont pas toxiques, de ce fait aucune toxicité n’est attendue. Prélèvements de sang: ils seront réalisés au niveau de la veine mandibulaire sur animal vigile. Une fois le prélèvement terminé, un éventuel saignement sera stoppé par l’application d’une compresse au niveau du point de prélèvement. L’animal sera remis dans sa cage. Si des signes de souffrance venaient à apparaitre, la souris sera pesée et surveillée de manière assidue. En absence d’amélioration sur une semaine, ou en cas de perte de poids supérieure à 20% du poids initial, la souris sera euthanasiée. Le nombre d'accouplement mit en place sera réduit au strict nécessaire afin de ne pas générer de souris inutilisées. Certaines souris générées ne seront pas utilisées (comme les femelles qui ne portent pas la maladie), elles seront rapidement euthanasiées afin de limiter le nombre de souris en élevage.

Choix des espèces

A notre connaissance, les seuls modèles animaux de la maladie XLH sont des modèles murins. Il y a 2 modèles : le modèle HypDuk-B6 et le modèle HypDuk-Balb. Ces deux modèles reproduisent les signes cliniques retrouvés chez les patients XLH. La population de patients que nous visons sera composée d’enfants, de jeunes adultes et des adultes, aussi, nous avons besoin de traiter des souris à des âges qui correspondent à ces étapes chez l’homme (souris de 0-2 jours, de 2 semaines, de 4 semaines et de 6 semaines) et d’évaluer si notre traitement pourra être efficace en : (1) en prévention de la pathologie : le traitement est-il efficace s'il est administré avant l'apparition de symptômes important (traitement des souris les deux premiers jours de vie (=nourrisson)) ? (2) le traitement est-il efficace s'il est administré à l'apparition des premiers signes de la maladie (traitement des souris à 2 ou 4 semaines (=enfant ou adolescent)) ? (3) le traitement est-il efficace s'il est administré une fois que la pathologie est bien établie et que les symptômes sont important (traitement des souris à 6 semaines (=adulte)) ?