Procédures légères

6 rates vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque rate est rasée sous anesthésie, équipée d'un harnais portant un dispositif à LED, puis soumise éveillée à des séances d'irradiation lumineuse de cinq heures sur deux jours, pour tester un dispositif de traitement des plaies cutanées breveté. Le porteur indique que l'irradiation ne devrait provoquer aucune douleur, qu'un érythème reste possible et que l'isolement en cage individuelle génère un stress limité à quarante-huit heures. Il affirme que le remplacement par des modèles in vitro ou ex vivo n'est pas envisageable pour valider un dispositif destiné à l'humain.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de faire des essais préliminaires in vivo chez le rat de la mise en place, du maintien et de la tolérance locale d’un nouveau dispositif expérimental conçu pour le traitement des plaies cutanées chroniques, dispositif expérimental ayant fait l’objet d’un dépôt de brevet. Ce dispositif expérimental utilisera les effets thérapeutiques de la lumière visible pour empêcher le développement d’une infection de la plaie cutanée et pour favoriser le processus de cicatrisation. Ce tout premier essai sera mené chez le rat sans induction d’une plaie cutanée afin de s’assurer du maintien de la partie du dispositif expérimental appliquée directement sur le dos (système d'éclairage mince et flexible utilisant la technologie LED), sous anesthésie, laissé en place pendant plusieurs heures sur le rat vigile, du maintien de la connexion avec le module de contrôle placé en dehors de la cage d’habitation, et de la tolérance locale au niveau de la peau saine pendant l’irradiation lumineuse à l’aide du dispositif expérimental et sur 48 heures par la suite. Un ensemble de capteurs, intégrés dans la partie du dispositif expérimental appliquée directement sur le dos pour diffuser l’irradiation lumineuse, permettra de suivre en continu la température de la surface cutanée lors de l’irradiation lumineuse et de stopper immédiatement l’irradiation lumineuse en cas d’atteinte d’une température supérieure à 39°C, ainsi que des paramètres d’oxygénation du sang. Des irradiations longues ou séquentielles envisagées pour le traitement futur de plaies cutanées chroniques seront utilisées pour ces essais préliminaires. L’ensemble des données sera enregistré par le le module de contrôle et permettra d’optimiser si nécessaire le fonctionnement de ce nouveau dispositif expérimental.

Bénéfices attendus

La cicatrisation des plaies cutanées est un phénomène naturel de reconstruction de la barrière cutanée mais si les plaies sont mal soignées, cela peut aboutir à des complications. La cicatrisation cutanée fait intervenir différentes phases qui entrainent la disparition de la lésion et le remplacement des cellules atteintes par des cellules saines. On distingue 4 stades dans le processus de cicatrisation : inflammation, revascularisation, réépithélialisation et remodelage. Les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, les plaies chirurgicales,les ulcères du pied chez le diabétique, les ulcères veineux… représentent un fardeau pour les patients, les professionnels de la santé et les systèmes de soins de santé, affectant plus de 40 millions de patients et induisant des coûts d’environ 50 milliards d’euros annuellement, et avec un taux de mortalité plus élevé que dans la population générale, pouvant atteindre jusqu’à 20% en fonction de la pathologie considérée. Il est donc très important de tester de nouvelles substances, de nouveaux pansements ou de développer de nouveaux dispositifs médicaux sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation de ces plaies, surtout les plaies chroniques. Nous allons donc évaluer un nouveau dispositif expérimental qui pourrait, après des études d’efficacité à mener sur des modèles expérimentaux de plaies cutanées, être utilisé dans un avenir proche chez l’Homme, pour le traitement de plaies chroniques qui ne cicatrisent pas ou très difficilement.

Procédures

Les 6 rats seront soumis à une anesthésie générale à l’isoflurane pour le rasage de la totalité de la surface du dos, la mise en place d’un harnais et la partie du dispositif expérimental diffusant la lumière (4x4 cm) positionnée dans le harnais qui sera ajusté à la taille du rat afin d’être au contact direct de la peau. Cela ne sera réalisé qu’une seule fois pour les 6 rats en 7-8 minutes environ. Ils seront ensuite tous les 6 soumis à un protocole d’irradiation lumineuse à l’état vigile sur 2 jours consécutifs, avec soit une irradiation pendant 5 heures le 1er jour et une irradiation séquentielle de 7 minutes 30 toutes les 15 minutes pendant 5 heures le 2ème jour pour 3 des 6 rats (groupe 1), soit à l’inverse une irradiation séquentielle de 7 minutes 30 toutes les 15 minutes pendant 5 heures le 1er jour et une irradiation pendant 5 heures le 2ème jour pour les 3 autres rats (groupe 2). Les rats seront donc libres de leurs mouvements dans leur cage pendant toute la durée des irradiations lumineuses effectuées. Les rats seront placés en cage individuelle pendant 2 jours pour la réalisation du protocole d’irradiation lumineuse, nécessaire pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux le harnais et surtout la partie de dispositif expérimental placé dans le harnais, puis ils seront replacés à 2 par cage pendant les 48 heures de suivi avant leur mise à mort.

Impact sur les animaux

Aucune douleur ne sera générée par le rasage du dos des animaux puis par la mise en place du harnais, ainsi qu’en principe lors de l’irradiation lumineuse du tissu cutané et à la suite de celle-ci. L’apparition d’un érythème suite à l’irradiation lumineuse est toutefois possible. Un ensemble de capteurs intégrés dans la partie du dispositif expérimental diffusant l’irradiation lumineuse permettant de suivre en continu la température de la surface cutanée lors de l’irradiation lumineuse stopperait automatiquement et immédiatement l’irradiation lumineuse en cas d’atteinte d’une température supérieure à 39°C, évitant ainsi l’apparition d’un érythème. L’hébergement en cage individuelle des rats lors de la réalisation du protocole d’irradiation lunimeuse, nécessaire pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux le harnais et surtout la partie de dispositif expérimental placé dans le harnais, pourra engendrer un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité dans le temps (48 heures).

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 6 rats nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort par injection intrapéritonéale d’une surdose de pentobarbital effectuée sous anesthésie gazeuse profonde à l’isoflurane (5,0%), et un prélèvement de peau correspondant à la zone irradiée par la lumière sera effectué pour réaliser des analyses histologiques et ainsi vérifier l’intégrité du tissu cutané irradié.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo et sur des temps prolongés pour valider un tel dispositif expérimental destiné à être utilisé chez l’Homme par la suite. L’ensemble des paramètres suivis ne peuvent être appréhendés qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de cette étude pilote mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs quant aux objectifs envisagés. L’ensemble des données générées sur un même animal permettra de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de la réalisation du protocole d’irradiation lumineuse et après réalisation de celui-ci, plus particulièrement les observations de leur comportement. Aucun traitement antalgique ou analgésique n’est envisagé, les irradiations lumineuses ne devant engendrer aucune douleur. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré avant puis quotidiennement après réalisation du protocole d’irradiation lumineuse, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal est observée ou si des modifications importantes du comportement sont observées pendant ou suite à l’irradiation lumineuse (convulsions, absence totale d’activité, vocalises,…), ceux-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Des briques d’Aspen seront placées dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer le bien-être des animaux, et seront remplacées lors de chaque change de litière (au moins 2 fois par semaine).

Choix des espèces

Le rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet, en raison de sa taille et de celle du dispositif expérimental qui va être testé (4x4 cm pour la partie au contact direct de la peau), et également en raison de sa facilité de manipulation. Les animaux seront de jeunes rats âgés de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations, avec un poids de 175-200 g. Cela correspond au poids de rat nécessaire afin d’avoir une surface corporelle suffisante pour mettre en place le harnais et le dispositif expérimental d’irradiation lumineuse (4x4 cm pour la partie au contact direct de la peau), et cela correpond également au poids des rats qui seront utilisés pour réaliser les études d’efficacité sur la cicatrisation après induction de plaies cutanées.

96 crapauds épineux, une espèce sauvage, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, maintenus en vie puis relâchés sur leur site de capture. Ils subissent des mesures morphométriques, des pesées hebdomadaires pendant un an et deux ponctions cardiaques sur animal vigile, pour étudier les effets de la salinisation des zones humides côtières sur leur physiologie. Le porteur indique que la salinité testée reste proche de celle rencontrée dans le milieu naturel et n'affecte que légèrement la croissance. Il affirme préférer une espèce sauvage aux lignées de laboratoire, dont la domestication aurait "canalisé" les phénotypes.

Objectifs

La salinisation de l’environnement a été identifiée comme une menace globale pour les systèmes océaniques, dulçaquicoles (d'eau douce) et terrestres. Plus d’un quart des zones humides de la planète ont déjà été touchées par la salinisation, d’autres sont en voie d’être affectées par ce processus, notamment les zones côtières menacées par la montée des niveaux marins et l'augmentation de la fréquence d'évènements extrêmes (submersions marines). A l’échelle globale, l’impact de la salinisation sur la biodiversité est en voie de devenir un problème de conservation majeur. Il est connu que la salinisation du milieu peut avoir des conséquences importantes sur l’utilisation de l’habitat, les dépenses énergétiques ou la reproduction chez de nombreuses espèces. Mais ces travaux ont souvent examiné les effets aigüs (à court terme) de niveau de salinité élevés (effets souvent toxiques ou létaux). Par ailleurs, certaines espèces possèdent des capacités de dispersion élevés qui leur permettent d’échapper à ces conditions négatives et de se reporter sur des habitats encore favorables (par exemple les oiseaux). D’autres groupes sont beaucoup moins mobiles et sont particulièrement soumis à ce type de perturbation. C’est typiquement le cas des amphibiens qui sont caractérisés par de faibles capacités locomotrices. Ils sont également caractérisés par une peau très perméable qui facilite les échanges avec le milieu ce qui peut poser des problèmes de maintien de l’équilibre hydro-minéral (osmotique). Ces caractéristiques font des amphibiens des espèces particulièrement adaptées pour examiner l’impact de la salinisation de leur environnement sur leur physiologie. Le projet consiste à évaluer l’impact de la salinité environnementale (similaire aux mesures effectuées sur le terrain) sur la physiologie d’un amphibien répandu, le crapaud épineux (Bufo spinosus). Afin d’évaluer les capacités d’adaptation des amphibiens à la salinisation de l’environnement, nous comparerons les réponses d'individus capturés en zones côtières (présumés habitués à ces conditions de salinité) et en zones continentales (non soumis à cette contrainte environnementale) afin d’identifier si des mécanismes spécifiques permettent aux populations côtières de faire face à cette contrainte environnementale.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de répondre à deux questions cruciales. D'une part, ce projet permettra d'évaluer si la salinité environnementale affecte négativement les mécanismes physiologiques des amphibiens côtiers. D'autre part, ce projet permettra d'élucider les capacités d'adaptation des populations côtières à ce paramètre environnemental en comparant les réponses de populations naturellement soumises ou non à la salinité environnementale. Les données récoltées seront utilisables dans un objectif de conservation (protection contre les intrusions marines, aménagement de zones refuge ou tampon qui permettront de limiter les effets de la salinisation en recréant un gradient d'habitat, et qui permettront aux populations naturelles de se réfugier). Les résultats permettront de proposer des pistes pour la gestion des milieux côtiers. La création d'un gradient d'habitat grâce à des zones tampons permettra aux individus de subsister si la salinité augmente.

Procédures

Préhension et contention pour mesure morphométriques : 2 fois 1 min séparée par 1 an. Préhension pour pesée : 30 secondes toutes les semaines (52 fois) Préhension et cardiocentèse sur animal vigile : 2 fois 1 minute séparée par 1 an.

Impact sur les animaux

Les niveaux modérés de salinité testés dans ce projet sont similaires à ceux auxquels les individus font face dans l'environnement naturel (zones côtières). Les effets indésirables potentiels seront donc similaires à ceux auxquels les individus font face sur le terrain. Pour les animaux exposés à la salinité : altération légère de la croissance sans impact sur la survie de l’animal. Pour tous les inidividus : inconfort de courte durée (environ 1 min) lors des prélèvements sanguins, stress de courte durée lors des manipulations.

Devenir

Les niveaux sublétaux de salinité testés dans ce projet sont similaires à ceux auxquels les individus font face dans l'environnement naturel (zones côtières). Les effets indésirable potentiels seront donc similaires à ceux auxquels les individus font face sur le terrain. Tous les individus seront donc maintenus en vie et relâchés sur leur site de capture.

Remplacement

L'étude de l'influence de la salinité environnementale sur les réponses physiologiques des amphibiens a des implications importantes à la fois pour la recherche fondamentale en écologie et la recherche appliquée en conservation. La domestication et la sélection de lignées de laboratoire a canalisé l’expression de phénotypes qui sont beaucoup plus diversifiés chez les organismes sauvages. Les réponses des organismes sauvages face aux contraintes de l’environnement seront plus complexes que chez leurs homologues de laboratoires. Par ailleurs, nous souhaitons tester l’existence d’adaptations locales à la salinité. Il est donc nécessaire d'examiner les réponses des populations naturellement soumises (ou non) à ce paramètre environnemental. C’est là que réside l’intérêt de travailler sur des populations côtières ou continentales. L’espèce sélectionnée est présente sur ces deux milieux et nous maitrisons son maintien au laboratoire. De manière ultime, le projet vise un but de conservation qui nécessite de comprendre les réponses des populations naturelles à la salinité.

Réduction

Sur la base d’un test statistique (test de puissance) et des expériences antérieures, le nombre d’animaux est réduit au strict minimum pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, c’est-à-dire concluants.

Raffinement

Tout au long de la procédure, les individus disposeront de conditions de maintien en captivité optimisées. La température sera maintenue à 17°C. Ils seront maintenus dans des terrariums dédiés, dont le substrat et l'eau de boisson seront changés de façon hebdomadaire (plus souvent en cas de besoins) et auront un accès à la nourriture adapté à leur taille et leur besoin. L'accès à l'eau a été raffiné pour correspondre aux besoins de cette espèce lors de sa phase terrestre sans induire d'effets indésirables. Afin de maintenir un comportement d'animal sauvage (enrichissement), les individus disposent d'abri pour se cacher, et leur alimentation (insectes) sera vivante pour entrenir le comportement de chasse. Pour raffiner nos approches, nous avons développé les méthodes de prélèvement les moins stressantes et les méthodes de contention adaptées pour le prélèvement sanguin. Les gestes techniques sont réalisés par des personnels expérimentés. Un suivi journalier de l'état de chaque individu et de son terrarium sera effectué. Afin de limiter limiter le dérangement des animaux pendant leur phase de repos diurne pour réaliser les surveillances quotidiennes et les manipulations hebdomadaires, celles-ci seront effectuées tôt en début de journée (fin de la période d'activité). Les points limites spécifiques au projet sont associés à un suivi de l'apparence physique et posturale, du comportement, de l'alimentation et de la masse corporelle. En cas d’atteinte du bien-être animal, des mesures adaptées seront prises sans délai.

Choix des espèces

Nous étudions une espèce sauvage non-domestique le crapaud épineux (Bufo spinosus). La domestication et la sélection de lignées de laboratoire (par exemple Xénope du Cap) a canalisé l’expression de phénotypes qui sont beaucoup plus diversifiés chez les organismes sauvages. Les réponses des organismes sauvages face aux contraintes de l’environnement seront plus complexes que chez leurs homologues de laboratoires. Par ailleurs, nous souhaitons tester l’existence d’adaptations locales à la salinité. Il est donc nécessaire d'examiner les réponses des populations naturellement soumises (ou non) à ce paramètre environnemental. C’est là que réside l’intérêt de travailler sur des populations côtières ou continentales. L’espèce sélectionnée est présente sur ces deux milieux et nous maitrisons son maintien au laboratoire. Animaux adultes afin de statuer sur les effets d'une exposition chronique à la salinité lors de la phase terrestre du cycle de vie de ces organismes.

24 lapines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une injection intraveineuse de stimulation hormonale et une échographie, avant d'être mises à mort pour prélever les cellules épithéliales de leur glande mammaire, dans un projet visant à modéliser in vitro la glande mammaire afin de produire des protéines thérapeutiques dans le lait de lapines transgéniques. Le porteur qualifie les nuisances de "minimes". Il affirme que la production de protéines recombinantes dans le lait de lapines est le "principe fondateur" de sa société et qu'elle n'est "pas remplaçable".

Objectifs

Notre société est intéressée par la production des protéines recombinantes thérapeutiques (protéines produites par une cellule dont le matériel génétique a été modifié par recombinaison génétique) avec l’objectif de soigner des patients ayant des maladies génétiques orphelines létales et a choisi de produire ces protéines dans le lait de lapines transgéniques. La lapine a été séléctionné parce qu’elle synthétise des protéines en qualité (nécessaires pour soigner efficacement ces patients) et en quantité, que l’on ne peut obtenir par d’autres systèmes d’expression (bactéries ou levures). Pour la création des animaux transgéniques, nous devons modifier le génome des lapins par micro-injection dans des embryons de lapine avant de les transférer dans des receveuses. Comme la production de ces protéines dépend de la modification effectuée, nous devons utiliser plusieurs stratégies de modification génomique. Nous avons mis en place des cultures cellulaires commerciales afin de sélectionner les meilleures stratégies. Nous avons déterminé la présence et l’integrité de l’ARNm correspondant à la protéine recombinante cible pour chaque stratégie, mais nous ne pouvions pas estimer l’efficacité de production des ARNm ou de la protéine produite dans le lait. Ces critères sont impératifs afin de poursuivre des études precliniques.. Il n’existe pas de lignées de cellules de glande mammaire de lapines, commerciales ou non, avec lesquelles nous pourrions étudier les différentes stratégies pour la production des protéines d’intérêts. Nous souhaiterions mettre au point des systèmes cellulaires en deux dimensions (2D) pour quantifier les ARNm codant pour les protéines d’intérêts et dans un deuxième temps trois dimensions (3D, organoïde) afin d’analyser les protéines d’intérêts produites. La génération d’un tel système mammaire modélisant les processus de lactation peut être utile pour estimer la quantité de la protéine recombinante produite et sélectionner les meilleures protéines pouvant être produire dans le lait des lapines. Avec ce système, nous pensons pouvoir diminuer d’au moins 75 pour cent le nombre d’animaux utilisés pour la création des animaux transgéniques produisant des protéines recombinantes thérapeutiques. Pour réussir le plus rapidement possible la mise au point de ces systèmes, nous collaborons avec une équipe ayant de l’experience sur la glande mammaire et les cellules souches, nécessaires à la création des cultures cellulaires 3D.

Bénéfices attendus

Notre société s’est focalisée sur le traitement enzymatique substitutif pour soigner des patients ayant des maladies génétiques orphelines létales. Nous avons déjà produit des protéines thérapeutiques dont un médicament autorisé et nous voulons produire de nouvelles protéines thérapeutiques par l’intermédiaire de lapines trangéniques. La mise au point de systèmes cellulaires 2D/3D pour modéliser in vitro la glande mammaire de lapine en lactation va nous permettre de tester plusieurs constructions génétiques pour multiplier les chances de produire en grande quantité des protéines thérapeutiques. Nous pourrons ainsi commencer des études précliniques pour vérifier l’efficacité de ces protéines à soigner différentes maladies, tout en diminuant le nombre d'animaux dont nous aurions besoin pour produire ces médicaments. Jusqu’à présent, nous avons besoin d’euthanasier 4 lapines pour récupérer des embryons au stade 1 cellule pour les microinjecter avec une construction génétique puis d’utiliser 4 lapines receveuses des embryons micro-injectés pour être capable d’avoir 1 animal transgénique mosaïque F0 et étudier l’expression de la protéine recombinante d’intérêt sur une géneration F1 et/ou F2. Nous estimons que nous pouvons diminuer au moins 75 pour cent le nombre d’animaux utilisés si nous pouvons tester nos constructions génétiques dans des organoïdes de la glande mammaire de lapines, car nous aurons besoin de juste 1 lapine gestante pour valider nos constructions génétiques.

Procédures

2 injections en intraveineuse d'une durée de 30 secondes environ : une pour la stimulation hormonale, l’autre pour l’euthanasie. 1 échographie de 5 à 10 minutes environ. Prélèvement de glande mammaire sur animal euthanasié.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés subiront des nuisances minimes à savoir : - une injection intra-veineuse mais sur une veine précédemment anesthésiée localement, - une contention lors de l'échographie de conrôle de la gestation.

Devenir

Nous devons euthanasier les lapines pour pouvoir récupérer les cellules épithéliales de la glande mammaire.

Remplacement

La production de protéines recombinantes dans le lait de lapines transgéniques est le principe fondateur de notre société et n’est pas remplaçable. En tant que mammifère, la lapine synthétise des protéines recombinantes complexes, de l’ordre de centaines de milligrammes à plusieurs grammes par litres de lait, dont la glycosylation et la gamma-carboxylation sont nécessaires pour soigner efficacement les patients et que l’on ne peut obtenir en qualité et en quantité par d’autres systèmes d’expression (bactéries ou levures).

Réduction

Pour créer des animaux transgéniques, nous devons modifier le génome de lapins en transférant une construction génétique nécessaire à la production de la protéine recombinante thérapeutique d’intérêt, par des cellules de la glande mammaire. Ce transfert génétique se fait par micro-injection de la construction génétique dans des embryons de lapine au stade une cellule, qui seront ensuite transférés chirurgicalement dans des femelles dites receveuses (transfert d’embryon). Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons décidé de tester nos constructions génétiques dans des cultures cellulaires de glande mammaire avant de passer au modèle animal. Actuellement, nous utilisons des cultures de cellules non issues de la glande mammaire de lapines (il n’existe pas des cellules de glande mammaire de lapins, commerciales ou non) pour sélectionner les meilleures constructions génétiques. L’utilisation de ces cultures cellulaires nous a permis de faire un premier tri et de déterminer la présence et l’intégrité de la protéine recombinante, mais nous n’avons pas d’informations sur la quantité de protéine produite (du fait d’un site d’expression différent entre une cellule lambda et une cellule de glande mammaire). C’est pourquoi nous voudrions mettre au point des systèmes cellulaires 2D et 3D pour modéliser in vitro la glande mammaire de lapine en lactation. Quand ces systèmes seront mis au point, nous pensons diminuer d’au moins 75 pour cent le nombre d’animaux que nous utilisons, pour produire des protéines recombinantes thérapeutiques humaines.

Raffinement

Les lapins sont hébergés seuls dans leur cage, reçoivent des enrichissements dès trois semaines de vie, et les parois latérales de leurs cages sont équipées de plexiglas transparent permettant de maintenir un niveau d’interaction entre les individus. Leurs cages sont aussi équipées de plateforme qui leur permettent de pouvoir se cacher. De la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et les bruits environnementaux, et elle est associée à la lumière et la présence des techniciens animaliers. Dans ce projet, il n’y a peu de gestes invasifs : deux intraveineuses mais après application de crème anesthésiante et l’échographie est un peu contraignante pour la lapine mais des mesures sont prises pour atténuer la contrainte : la tête de lapine est cachée par le bras d’une technicienne, ce qui peut la rassurer car le lapin apprécie de pouvoir se cacher, et elle reçoit des caresses de la part de la technicienne qui réalise l’échographie, pour l’apaiser. Certaines lapines se sont endormies dans cette position.

Choix des espèces

Le lapin (de souche New Zealand White) a été choisi pour : sa courte période de gestation (30 jours), sa maturation sexuelle rapide (4 à 5 mois), le volume de lait produit (jusqu’à 10 litres/an/femelle), la synthèse de protéines complexes (glycosylation et gamma carboxylation). Les lapins sont utilisés dès la la maturité sexuelle atteinte, à 4 mois et demi pour les femelles, 5 mois pour les mâles.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections hormonales de superovulation puis des cotraitements anti-inflammatoires, et subissent un prélèvement sanguin sous-mandibulaire terminal avant leur mise à mort, pour étudier l'étiologie du syndrome d'hyperstimulation ovarienne sur des souris invalidées pour les récepteurs LXR. Le porteur affirme anticiper l'"absence d'effets indésirables" liés au protocole, qu'il dit pratiquer en routine. Il indique avoir d'abord mené des tests in vitro sur cellules de granulosa, censés limiter le nombre d'individus utilisés in vivo.

Objectifs

Le projet s’inscrit dans l’étude l’étiologie moléculaire de l’OHSS. Nous utiliserons des échantillons ovariens issues de souris sauvages, invalidées pour les récepteurs LXRs et ces mêmes souris avec un transgène permettant le sauvetage spécifique des cellules de Granulosa. En effet, le modèle invalidées pour les récepteurs LXRs a été identifié et publié comme un modèle de référence pour ce syndrome. Les études seront conduites sur des animaux de 7 mois environ puisque la mise en place du phénotype est associé à l'age des souris. Les souris seront soumises à un protocole de stimulation hormonale comme suit en vue d’une superovulation. - Jour 1 : Injection IP de l'hormone 1 (PMSG, 7,5UI/souris) - Jour 3 : Injection IP de l'hormone 2 (hCG, 5UI/souris). Nous envisageons donc de réaliser des cotraitements avec des corticoïdes (methylprednisolone), avec des AINS (Ketophen) et enfin avec des inhibiteurs de l'inflammasome (MCC950). Les tissus prélevés seront prélevés à 2 temps spécifiques : 40 heures apres la première stimulation par la PMSG (lot H40) et en fin de protocole après l'ovulation (lot J4). Les échantillons tissulaires seront analysés par des techniques d’histologie et d’immunohistochimie par l’étude de marqueurs d’acteurs de la stéroïdogenèse ovarienne et de l'inflammation. En parallèle des tests de fécondation in vitro (FIV) seront conduit pour déterminer la qualité des ovocytes produits et leurs capacités à reprendre la méiose après fécondation.

Bénéfices attendus

Nous avons précédemment montré le rôle qu'occupe les récepteurs LXR dans l'étiologie moléculaire de l'hyperstimulation ovarienne. Il est maintenant très clair que le phénotype est associé chez la souris à une réponse inflammatoire anormale et à la constitution d'un infiltrat de cellules immunitaires au nievau ovarien qui et totalement anormal et incontrolé. L'etude de l'effet de traitements anti-inflammatoires dans un contexte d'hyperstimulation pathologique de l'ovaire, nous permettra ainsi de connaître le potentiel thérapeutique d'un telle traitement dans le cadre de la clinique humaine.

Procédures

Les animaux subiront un prélèvement unique sous-mandibulaire sanguin de 150microlitres environ en point final juste avant leur mise à mort. Cette procédure aura lieu une fois avec une durée moyenne d'une minute.

Impact sur les animaux

Les procédures décrites dans la présente demande sont largement utilisée dans de nombreux laboratoire, et notre groupe de recherche les utilisent en routine sur ces même modèles génétiques. Ainsi, nous pouvons aidsement anticiper l'absence d'effets indésirables liés au protocole présenté dans la demande. En parallèle, nous pouvons anticiper aue les traitements anti-inflammatoires vont diminués au moins partiellement les manifestations phénotypiques d'hyperstimulation, donc plutôt des effets bénéfiques. Néanmoins, une surveillance renforcée (2 fois par jourà) sera conduite sur les animaux en protocole.

Devenir

L'ensemble des animaux est mis à mort en fin de protocole pour le prélèvement pour l'analyse des ovaires par des techniques d'histologie et d'immunodétection in situ.

Remplacement

Cette étude fait suite à des tests réalisés in vitro en culture de cellules ayant permis de caractériser le comportement des cellules de granulosa en modulant le contexte inflammatoire. Ceci permet donc de limiter notre étude fonctionnelle sur un nombre limiter d’individus pour valider le phénotype in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante (test ANOVA) à l’issue du protocole, celui-ci a été fixé à 15 individus par lot.

Raffinement

Les animaux en particulier les lignées transgéniques peuvent répondre de manière « exagérée » au traitement hormonale qui induit l’hyperstimulation. De fait, ces lots de souris seront suivis avec une fréquence observationnelle plus élevée (deux fois par jour) pour détecter toute manifestation occasionnelle de mal-être ou de souffrance. Cependant, le protocole post induction est relativement court puisque les souris seront mis à mort 96 heures après l’injection de PMSG - Pregnant Mare Serum Gonadotropin, les études antérieures n'ont pas montrées de manifestation délétère pour l'animal. En parallèle, un erichissement renforcé des cages d'hébergement sera conduit (cabane et/ou tube carton, pads cellulose pour formation de nids). Si des signes de souffrance ou de mal-être se manisfeste, l'application des points limites décrit dans la DAP seront mis en oeuvre.

Choix des espèces

Le cycle oestrien et la physiologie de l’ovaire chez la souris sont très proche de l’espèce humaine. En parallèle, l’existence de lignées transgéniques d’intérêt pour l’étude de l’OHSS justifie le choix du modèle murin. Nous utiliserons des individus de 7 mois, ce stade de développemente est justifié par le lien qu’il existe entre la survenue d’OHSS chez la femme et la réponse inflammatoire que nous avons observé dans nos études précédentes dans lesquelles cette fenêtre temporelle présente une réponse significativement pathologique dans le modèle Lxr ab-/-.

Injectées dans une veine à deux jours de vie, éveillées, puis soumises chaque mois pendant six mois à une échocardiographie sous anesthésie, 40 souris porteuses d'une mutation du gène Lmna qui atteint le muscle cardiaque vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. L'injection apporte des outils d'édition génomique CRISPR Cas9 destinés à corriger la mutation, une correction déjà obtenue sur des cellules souches pluripotentes induites différenciées en cellules cardiaques. Pour justifier l'arrêt à six mois, le porteur écrit que les souris "ont peu de risques de développer des symptômes de la maladie". Il indique ailleurs que "Les premiers symptômes sont détectés entre 3 et 6 mois chez les mâles homozygotes" et que "Le phenotype devient dommageable à 6 mois".

Objectifs

Ce projet a pour but l’évaluation de l’effet bénéfique de la correction d'une mutation Lmna chez des souris atteintes d’une maladie génétique touchant le muscle cardiaque. Il a été démontré que cette approche était un moyen de corriger le défaut génétique sur des cellules iPSC différenciées en cardiomyocytes, porteurs de mutations LMNA. Nous souhaitons à présent tester cette preuve de concept in vivo, sur un modèle murin avec la même mutation.

Bénéfices attendus

Correction génique et phénotypique pour les souris traitées. Ce projet peut aboutir à la première démonstration du bénéfice de la correction du génome sur l'atteinte cardiaque dans la cardiomyopathie due à des mutations du gène LMNA. Les repercussions peuvent etre majeures en santé humaine, en tant que medecine personnalisee pour cette pathologie, pour laquelle aucun traitement n'est actuellement disponible.

Procédures

1) Injection intraveineuse à l'âge de 2 jours dans un etat vigile de l'animal. Dans son intégralité (contention+injection), le geste s'effectue rapidement en une dizaine de secondes; 2) Echocardiographie tous les mois, pendant 6 mois, sous anestesie. La durée d’une échocardiographie est de 5 à 10 minutes par souris.

Impact sur les animaux

L'injection intraveineuse est une modalité d’administration peu invasive, peu douloureuse et facile à mettre en œuvre chez le nouveau-né. La fonction cardiaque sera évaluée par échocardiographie, sous anesthésie. Cette technique d'imagerie cardiaque n'est pas invasive. Les effets indésirables attendus sur les animaux sont surtout dû à un éventuel développement précoce du phénotype dommageable de la lignée. Notre connaissance approfondie de l’histoire naturelle du développement de ce phénotype permet de déterminer précisément la progression de l’atteinte cardiaque et en particulier l’âge (10 mois pour les males et 12 mois pour les femelles) auquel 80% des souris entrent en insuffisance cardiaque. Afin d’éviter toutes douleurs liées à l’insuffisance cardiaque, dans ce projet, les souris sont euthanasiees à 6 mois d'âge et ont peu de risques de développer des symptômes de la maladie. Il se peiut q'une inflammation apparaise au lieu d'injection.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure (thérapie génique et suivi par échocardiographie). Les organes des animaux seront prélévés pour une étude moléculaire de la correction génique et du recouvrement des mécanismes cellulaires.

Remplacement

Le but de notre projet est l’identification d’une possible stratégie thérapeutique pour optimiser le traitement pour la cardiomyopathie causée par des mutations du gène LMNA. Pour cela il est nécessaire d’étudier le rôle de notre approche corrective, et les effets du traitement dans un modèle animal tel que la souris pour avoir accès à la fonction cardiaque. Pour réaliser cette étude, l’utilisation du modèle murin est donc indispensable. La pathologie d'intérêt est modélisée uniquement dans l'espèce mus musculus. Les souris mutantes récapitulent à l’état homozygote toutes les caractéristiques phénotypiques de la cardiomyopathie humaine liée aux mutations du gène LMNA.

Réduction

Les processus expérimentaux seront conçus de façon à utiliser un nombre de souris limité permettant une analyse statistique. Néanmoins, 8 animaux par groupe (pour un total de 40 souris) seront malgré tout nécessaires pour permettre une analyse statistique. Les protocoles seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que l’expérience soit interprétable et que l’on n’ait pas à la refaire.

Raffinement

Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérés par l’animalerie. Les souris sont stabulées sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et nourriture à volonté. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (les lumières s'allument automatiquement à 6h du matin et s’éteignent le soir à 18h). Les zootechniciens assurent un contrôle quotidien des animaux afin de relever le moindre signe de souffrance, un changement régulier ds cages, un nombre réduit d’animaux par cage (5 maximum hors cages d’accouplement) et pas d’animaux isolés. Le changement des cages se fait sous hotte aspirante et les cages possèdent des filtres. L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de lanières de papier Kraft afin que les souris puissent faire un nid ainsi que des tunnels en carton. Enfin, si nécessaire, la nourriture pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage et de la bouillie pourra être introduite dans les cages si nécessaire. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne jusqu’à leur euthanasie (suivi de poids hebdomadaire, évaluation du bien-être général, vérification de l’absence de lésions). Nous avons des mesures mises en place pour réduire la douleur pendant la procédure expérimentale (avec des points limites adaptés)

Choix des espèces

La pathologie d'intérêt est modélisée uniquement dans l'espèce mus musculus. Nous utilisons une souche sur laquelle la mutation Lmna a été dérivée. Les souris mutantes récapitulent à l’état homozygote les caractéristiques phénotypiques de la cardiomyopathie liée aux mutations du gène LMNA. Les premiers symptômes sont détectés entre 3 et 6 mois chez les mâles homozygotes et évoluent rapidement jusqu’au décès des animaux provoqué principalement par l’aggravation du phénotype cardiaque. Les souris seront utilisées en J2 en pré-symptomatique, pour une injection en IV de nos outils de correction génique. Les souris seront ensuite maintenues pour 6 mois car cela permet d'observer l'apparition et l'évolution de phénotype avant l'apparition des premiers symptomes. Le phenotype devient dommageable à 6 mois.