Procédures légères

48 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Vingt-quatre reçoivent un régime alcoolisé pendant onze jours et des gavages répétés d'une bactérie productrice de toxine, pour mettre au point un modèle d'hépatite alcoolique jugé plus proche de la maladie humaine. Le porteur indique une perte de poids servant de point limite et une agressivité possible provoquant morsures et dépilations. Il affirme qu'aucune approche in vitro n'existe pour cette maladie et que l'animal est "indispensable".

Objectifs

L'hépatite aiguë alcoolique apparaît chez des patients consommant de l'alcool de manière chronique et excessive. La mortalité atteint 30 à 40% à 28 jours d'évolution. La cortisone, un anti-inflammatoire est le seul traitement validé mais son utilisation est limitée par l'absence de réponse au traitement dans 40% des cas, des potentiels effets secondaires et l'absence de bénéfice sur la mortalité au-delà de 28 jours. Ainsi, un nombre significatif de patients se retrouve sans alternatives thérapeutiques. A ce jour, les modèles murins disponibles sont imparfaits en raison d'une faible inflammation et d'une fibrose légère. Ces données sont ainsi très loin de la physiopathologie observée chez les patients atteints d'hépatite aiguë alcoolique. La bactérie Entéroccocus faecalis est présente dans le tractus gastro-intestinal des humains et chez certains animaux. Chez des patients atteints d'hépatite alcoolique aiguë, elle est notamment responsable de la production d'une toxine appelé cytolysine. Récemment, il a été démontré que cette toxine est responsable de la mort des cellules du foie, les hépatocytes et ainsi aggraverait le pronostic vital du patient. Le lien étroit entre cette maladie et le microbiote intestinal est due à l'induction d'une perméabilité intestinale accrue causée par une consommation aiguë et chronique d’éthanol. L'objectif du projet est d'utiliser un modèle murin d'alcoolisation chronique connu en ajoutant des gavages intragastriques à des temps précis de la souche bactérienne productrice de la toxine, la cytolysine. Cela permettra d'obtenir un modèle murin représentatif de la réalité médicale et permettra par la suite de valider des médicaments soignant la pathologie.

Bénéfices attendus

Aucun modèle actuel ne synthétise parfaitement les caractéristiques de l'hépatite aiguë alcoolique limitant la compréhension des mécanismes permettant le développement d'étude chez l'Homme. Le modèle que nous proposons de mettre au point se veut rapide (16 jours), reproductible (souches bien identifiées et purifiées de la bactérie) et transposable à l'homme. Par ailleurs ce modèle nous permettra de tester nos molécules d'intérêts que nous avions à ce jour testé sur les modèles connus mais imparfaits. Avec ce modèle plus pertinent, les résultats de cette étude pourront conduire au développement rapide d'études chez l'Homme.

Procédures

Toutes les souris (n=48) du protocoles vont bénéficier d'un régime alimentaire semi liquide pendant 16 jours. Ce régime sera alcoolisé ou non (11 jours sur 16) ce qui est une variation par rapport à leur standard d'alimentation lorsqu'il y a de l'alcool. Cette intervention à base d'alcool concernera 24 souris. L'appétence pour la texture semi liquide est très importante pour les souris qui l'apprécient. 24 animaux seront soumis à des gavages intragastriques à J6, J9, J12 et J15 de la souche E. faecalis pour les groupes 2 et 4. Les gavages intragastriques en termes de temps sont très court pour l'animal et ne représentent pas de douleurs. Les 24 autres souris ne subiront pas cette intervention.

Impact sur les animaux

Nous possédons une expertise du protocole murin d'alcoolisation. Les effets indésirables observables pour ce protocole sont la perte de poids qui représente le point limite. Une procédure de raffinement spécifique est mise en place pour permettre d'endiguer la perte de poids trop importante. Le gavage intragastrique par une souche bactérienne est une inconnue cependant nous nous sommes entourés d'un laboratoire de bactériologie. De plus, la concentration administrée à chaque gavage correspond à 10g de selles humaines soit des concentrations réalistes et acceptables. Le gavage de bactéries prévu est en quantité modeste et doit être répété car en quantité insuffisante pour coloniser la flore digestive des souris et induire une intoxication aiguë. Néanmoins, pour prévenir toute incertitude liée à la tolérance des ingestions répétées de bactéries par gavage, nous avons développé un score clinique de surveillance détaillé dans la partie raffinement et constituant un point limite. Les gavages intragastriques itératifs peuvent stresser l'animal, une procédure de raffinement est prévue. L'alcoolisation chronique peut entrainer une agressivité chez certaines souris dominatrices. Cette aggressivité n'est pas constante et ni spécifique de ce protocole. L'aggréssivité se manifeste en premier lieu par des lésons de dépilation ou de morsures qui restent modestes. Les animaux seront surveillés quotidiennement et les souris agressives ou à l'inverse blessées seront isolées et soignées par soins locaux de bétadine. Cela ne constitue pas un point limite et la souris aggressive peut rester dans le protocole d'étude bien qu'elle soit isolée. Les maladies du foie comportent un large spectre allant de la stéatose jusqu'au cancer du foie. Des complications graves comme la jaunisse ou de l'accumulation de liquide dans l'abdomen (ascite) sont observées chez les patients malades. Ces stades ne sont pas retrouvés chez les modèles murins et ainsi ne représentent pas une nuisance potentielle.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour des analyses post mortem de différents organes (foie, rate, intestin).

Remplacement

A ce jour, il n'existe aucune approche in vitro pour étudier l'évolution d'une pathologie inflammatoire multifactorielle comme l'hépatite alcoolique et notamment le lien avec le microbiote intestinal en corrélant la présence de la cytolysine, la toxine produite par la bactérie Entéroccocus faecalis avec la mort des cellules du foie, les hépatocytes. Une étude chez un organisme vivant telle que la souris est indispensable pour pouvoir valider par la suite des études de phase 2 chez l'Homme.

Réduction

L'étude sera menée avec un nombre total de 48 jeunes souris adultes mâles pesant 18 à 20g, basé sur le calcul a priori du nombre de souris nécessaires tenant compte de la variabilité interindividuelle sur l'évolution de la pathologie hépatique. Ce nombre correspond au nombre de souris mâle permettant de former chaque groupe (n=12) au sein de l’étude statistiquement significatif.

Raffinement

Dès la réception, les animaux auront une période d'acclimatation d'une semaine pour s'adapter à leur nouvel environnement. Ils seront hébergés dans une animalerie dotée de tous les paramètres nécessaires (température, hygrométrie, filtration de l'air, ...) à leur bien-être. Une procédure d'estimation (avec des paramètres définis) et suppression de la souffrance sera mise en place. Les points limites de ce protocole concerne 1) la perte de poids de l'animal. Ainsi, une surveillance pondérale régulière (J0, J6, J8, J10, J15) et un protocole de raffinement spécifique est prévu (augmentation de la stimulation les conduisant à mieux s’alimenter, renutrition par des croquettes riches en protides). Dans les cas éventuellement graves, les animaux seront mis à mort selon le protocole en vigueur à l'animalerie. 2) Nous prévoyons d'utiliser un score de surveillance prenant en compte l'apparence, la mobilité, la réponse aux stimuli, l'ouverture des yeux, la froideur au toucher et la fréquence respiratoire. Un score élevé constitue un point limite. 3) En cas d'aggréssivité persistantes des animaux attesté par des morsures et lésions de dépilation, la souris dominante sera isolée pour prévenir toute éventualité d'aggravation des lésions. En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et des prélèvements d'organes seront effectués pour permettre de réaliser les analyses biochimiques et immuno-pathologiques.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi est la souris C57BL/6. Ce choix a été motivé par l'expertise de l'équipe pour cet animal et cette souche pour la mise en place de modèle murin dans le cadre des maladies du foie. Ce choix nous permettra des comparaisons entre nos modèles et au niveau international avec les modèles en vigueur. De plus nous prévoyons l’utilisation future d’inhibiteurs de TREM-1 sur ce modèle s’il est probant. Le choix de l’espèce est ainsi étayé par l’existence d’un modèle transgénique KO-TREM-1. L’étude sera réalisée sur des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines au début du projet. Ce choix est motivé par l’analyse de travaux publiés dans des journaux scientifiques internationaux portant sur l’étude de l'hépatite aiguë alcoolique.

340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Deux cent quarante subissent une chirurgie créant deux plaies sur le dos, jusqu'au muscle, pour tester si un régime cétogène ou un composé favorise la cicatrisation. Le porteur écrit que l'étude vise à apporter la preuve exigée pour déposer un brevet. Il indique traiter la douleur par de la buprénorphine et affirme que seul un modèle in vivo garantit des conditions proches de la clinique.

Objectifs

Le composé X est produit naturallemnt par l’organisme lors de la prise d’une alimentation riche en graisses : régime cétogène. Le composé X a montré sur les cellules immunitaires des propriétés benefiques lors de leurs infiltration des zones lésées durant la réparation tissulaire. Ainsi le changement de régime alimentaire ou l’application topique de ce composé X lors d’une pathologie nécessitant une réparation tissulaire (brûlures, plaies…) peut être bénéfique au patient. Ce composé peut être délivré par injection ou en application topique. Ce projet a été évalué par cellule de valorisation de brevets et afin de déposer un brevet, une preuve des bienfaits de ce régime chez la souris est demandée.

Bénéfices attendus

Au-delà des informations fondamentales qui permettront de caractériser les cellules de l'immunité, les macrophages , les observations ouvrent des perspectives thérapeutiques pour le traitement de pathologies/situations nécessitant une réparation tissulaire. A titre d’exemple, nous pouvons citer les lésions post-ischémiques ou la cicatrisation de grandes zones cutanées (grands brulés). De plus, le composé X utilisé dans ce projet est produit naturellement par l’organisme lors de la prise d’une alimentation riche en graisses : régime cétogène. Ce composé a montré des propriétés benefiques sur les cellules immunitaires dans un contexte de réparation tissulaire. Ce projet a été évalué par Ouest Valorisation et afin de déposer un brevet, une preuve des bienfaits de ce composé chez la souris est demandée.

Procédures

L’Injection intra péritonéale est utilisée dans les 2 procédures du projet. Elle permet une distribution systémique rapide des produits injectés. Elle concerne tous les animaux, soit 340 au total. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire. Le paracetamol sera contenu dans l’eau de boisson 24h avant la mise en place du modèle et jusqu’à la fin de la procédure 2. Pour la chirurgie induisant les lesions cutanées, les souris seront anesthésiées par l’injection de kétamine et xylazine. Le maintien de l’anesthésie durant la procedure chirurgicale se fera par isofluorane. La chirurgie durera environs trente minutes et sera effectuée sur 240 souris. La buprénorphine sera administrée régulièrement en sous cutanée ) avant le réveil, 1h et 5h après. Ensuite les souris seront visitées 4 fois par jour et suivant les signes cliniques observés, la buprénorphine sera injectée. De plus chaque soir à la visite de 18h, de la buprénorphine en gel sera mise à disposition des souris pour la nuit.

Impact sur les animaux

Les animaux seront utilisés une semaine après leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Ils subiront ensuite une procédure expérimentale appelée modèle de cicatrisation consistant en l’induction de deux lésions cutanées (tissus sous cutanés incluant la couche de muscle de la peau panniculus carnosus) sur le dos de l’animal. Les souris pourront présenter (i) aucun signe clinique particulier (asymptomatique), (ii) certains signes cliniques et comportementaux traduisant une douleur potentielle. La souris pourra présenter une fermeture plus prononcée des yeux (fatigue), une modification de comportement par l’absence de mobilité, un suintement de la plaie et une ouverture plus importante de la plaie, un aspect général de son pelage présentant des pics (poils piqué), en présence d’un de ces signes, un analgésique sera donné. La présence de 3 signes simultanés constituera le point limite de l’expérimentation car traduisant une douleur plus importante.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procedure. Les animaux ne sont pas réveillés car nous allons prélever le sang et différents organes pour des évaluations biochimiques et histologique.

Remplacement

L’utilisation des animaux est indispensable avant de proposer un traitement facile à mettre en œuvre et dénué de toxicité pour améliorer le processus de cicatrisation et de réparation tissulaire. En effet, seul un modèle in vivo nous assure de l’implication de notre traitement dans des conditions physiopathologiques proches de la réalité clinique.

Réduction

Les modèles seront réalisés sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux (340 souris). Ce nombre a été défini afin d’exploiter des résultats statistiquement fiables. Chaque lot dans chacune des procédures expérimentales a été prévu en fonction des résultats attendus afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Ainsi, l’analyse statistique du modèle de cicatrisation des plaies et le recrutement des cellules immunitaires dans les modèles d’inflammation sera faite en suivant le test de Wilcoxon-Mann Whitney.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées à l’espèce avec un enrichissement du milieu. Le protocole expérimental comprend un suivi quotidien des animaux, des indicateurs comportementaux et physiques prédéfinis (état général, prostration, poil hérissé, suivi pondéral de l’animal) seront évalués quotidiennement, et constitueront les points limites de l’expérience . Pour éviter toute souffrance de l’animal au cours du protocole expérimental des analgésiques, seront donnés. La douleur des animaux sera gérée en pré-opératoire par l’adjonction de paracétamol (1mg/ml) dans l’eau de boisson 24h avant la mise en place du modèle de cicatrisation. Les souris seront anesthésiées par l’injection de kétamine et xylazine (100microg de kétamine et 10 microg de xylazine par gramme de souris). Le maintien de l’anesthésie se fera par isofluorane 2%. Les souris seront maintenues sur tapis chauffant pendant toute la durée de l’opération et jusqu’à leur réveil. Des doses de buprénorphine seront administrées régulièrement (0,1mg/kg) en sous cutanée (sous 100 microL) avant le réveil, une seconde 1h après (100 microL) puis 5h après. Ensuite les souris seront visitées 4 fois par jour et suivant les signes cliniques observés, la burénorphine sera injectée. De plus chaque soir à la visite de 18h, de la buprénorphine en gel (15μg/ml) sera mise à disposition des souris pour la nuit. Ce projet s’inscrit ainsi dans une gestion éthique de l’expérimentation animale et est donc en accord avec les réglementations européennes et françaises de bonnes pratiques de laboratoire.

Choix des espèces

Les modèles de cicatrisation chez la souris sont connus et utilisés dans la littérature chez la C57BL/6J. Les souris seront utilisées à partir de 6 semaines et jusqu'à 12 semaines car la cicatrisation est plus longue et peut devenir pathologique avec l’âge. Nous voulons donc tester le composé X afin de favoriser la cicatrisation indépendamment des difficultés de cicatrisation liée à l’âge.

1 895 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie tuée, d'autres gardés pour l'élevage ou adoptés. Des lapines reçoivent des injections hormonales et des transferts d'embryons sous anesthésie, des mâles sont vasectomisés, pour renouveler des lignées transgéniques produisant des protéines thérapeutiques humaines dans leur lait. Le porteur indique que les lapines donneuses de gamètes sont tuées, leurs voies génitales devant être prélevées entières, et affirme que les animaux transgéniques ne présentent aucun phénotype anormal. Le lait des lapines modifiées sert à produire des médicaments.

Objectifs

L’Homme peut être atteint de maladies génétiques, affectant la synthèse par notre corps, de protéines indispensables à la vie. Selon le gène et les modifications de l’ADN, la protéine qui aurait dû être produite peut être absente, ou présente mais non fonctionnelle. L’administration de la protéine manquante sous forme de médicament est alors la meilleure thérapie. Nous avons choisi de produire des protéines recombinantes (car produites par une cellule dont le matériel génétique a été modifié par recombinaison génétique) à partir de la glande mammaire de lapines génétiquement modifiées, pour les récupérer dans le lait lors de la lactation. Les protéines recombinantes seront ensuite purifiées et deviendront des médicaments. Ce dossier présente nos activités de recherche : 1. l'optimisation de la production de protéines recombinantes. En effet, nous voulons améliorer la qualité et l’efficacité des protéines recombinantes produites dans le lait de lapines transgéniques, en modifiant leur génome par transgénèse, dans des embryons au stade une cellule. 2. notre société avait créé des lapines transgéniques produisant dans leur lait, l’inhibiteur C1 estérase recombinant (InhC1), utilisé comme médicament pour soigner les patients souffrant d’angioœdème héréditaire (AOH). Cette maladie génétique rare, causée par le déficit de production de la protéine inhibiteur C1 estérase, se caractérise par la survenue d'œdèmes sous-cutanés et/ou sous-muqueux, entrainant un gonflement localisé des tissus, de fortes douleurs abdominales et des décès (25% des cas) sans traitement approprié. Du fait de l’augmentation de la demande de l’InhC1 pour traiter l’AOH, les tests précliniques en cours pour d’autres pathologies (Covid-19) et pour renouveler les lapines transgéniques de 4ème génération produisant l’InhC1 dans notre animalerie de production, nous avons besoin de régénérer des lapins transgéniques de 2èmes et 3èmes générations à partir de semence transgénique de mâles des 1ères et 2èmes générations. Leur sperme avait été congelé il y a plus de 20 ans et ne parvient plus à féconder des lapines lors d’inséminations artificielles. Pour pallier ce problème, nous devons utiliser l’ICSI (Intra Cytoplasmic Sperm Injection, plus efficace que la fécondation in vitro) qui permet d’introduire un spermatozoïde dans l’ovule pour le féconder, puis le transférer dans l’utérus de lapines receveuses, pour régénérer des animaux transgéniques InhC1 de 2ème et 3èmes générations.

Bénéfices attendus

Nous avons déjà produit des protéines thérapeutiques pour l'Homme en utilisant des lapines trangéniques, ce qui nous a permis de commercialiser en 2014 un médicament plus efficace que les autres médicaments autorisés pour traiter les crises d’angioedème héréditaire (AOH) : notre protéine recombinante est identique à la protéine humaine et hautement purifiée alors que les produits concurrents sont eux isolés à partir de plasma humain, ne sont pas aussi bien purifiés et ne garantissent pas un médicament aussi sûr . Aujourd'hui, nous souhaitons améliorer la quantité et la qualité des protéines recombinantes produites dans le lait de lapines transgéniques en augmentant le niveau et l'efficacité de la production de la protéine d’intérêt, grâce à des outils de modifications du génome plus efficaces. Cela aura pour effet d’augmenter la durée de vie de la protéine recombinante dans l’organisme du patient et ainsi diminuer le nombre d’injections et la dose à injecter. Ces bénéfices pour l’Homme auront des avantages pour l’animal car produire des protéines recombinantes de meilleure qualité nous permettra de diminuer le nombre d'animaux dont nous aurions eu besoin pour produire ce médicament. Le deuxième bénéfice attendu de ce projet est de régénérer les lignées d'animaux transgéniques produisant notre médicament commercialisé afin de pouvoir soigner le plus de patients possibles, de réaliser de nouvelles études pré-cliniques et cliniques car cette protéine a un grand potentiel thérapeutique pour d'autres maladies comme le Covid-19.

Procédures

Les animaux vigiles recevront des injections sous-cutanées, intra-musculaires et des injections intraveineuses mais dans ce cas, sous anesthésie locale. Pour la procédure 1, obtention de gamètes femelles, les lapines vigiles reçoivent 2 injections sous-cutanées par jour pendant 2,5 jours, 1 injection intra-veineuse sous anesthésie locale. Cette procédure est prévue pour 1006 femelles. Pour la procédure n°2, vasectomie, 10 mâles subiront une seule chirurgie sous anesthésie générale (30 min). Pour la procédure n°3, transfert d’embryons chez une lapine receveuse, les lapines vigiles reçoivent 1 injection intra-veineuse sous anesthésie locale, 2 injections intramusculaires et 4 injections sous-cutanées (liées à l’anesthésie et aux soins post-opératoires) et une chirurgie sous anesthésie générale (30 min). Cette procédure est prévue pour 440 femelles. - Pour la procédure n°4, Césarienne, les lapines ont une chirurgie sous anesthésie générale (30 min) et reçoivent 2 injections intramusculaires et 4 injections sous-cutanées, liées à l’anesthésie et aux soins post-opératoires. Cette procédure est estimée pour 22 femelles - Pour la procédure n°5, prélèvements de sang, 212 lapins vigiles auront au maximum 2 prélèvements de sang (< 2 min) au cours de leur vie. - Pour la procédure n°6, prélèvement de lait, 205 lapines recevront une injection en intra-veineuse sous anesthésie locale, 1 fois par jour pendant la durée de la lactation, de J3 à J30 après la mise-bas, et ce uniquement les jours de semaine. Elles sont donc traites une fois par jour (10 min) pendant 20 jours environ. Concernant l’euthanasie des animaux, elle se fait majoritairement en intraveineuse mais il peut arriver qu’elle soit réalisée en intracardiaque sur des animaux précédemment anesthésiés (par une injection intramusculaire d’un mélange de kétamine et xilazyne).

Impact sur les animaux

Les lignées d'animaux transgéniques créées et renouvellées ne subiront aucune nuisance ou effet indésirable car les outils de biologie moléculaire que nous utilisons sont de classe 1, c'est à dire, sans effet sur l'Homme, les animaux et l'environnement. Les animaux transgéniques ne présentent aucun phénotype différent des animaux de génotype sauvage, seule la composition du lait produit lors de la lactation de la lapine transgénique est légèrement différente, et n'entraine d'ailleurs aucun trouble de croissance des lapereaux.

Devenir

La procédure obtention de gamètes femelles, est classé légère mais suivie d'une euthanasie car nous ne pouvons pas récupérer les gamètes sans récupérer les tractus génitaux. Cela implique de devoir euthanasier la lapine donneuse de gamètes. Concernant la procédure 2, vasectomie, nous avons besoin des mâles pour qu’ils stimulent l’ovulation des lapines donneuses d’ovocytes, mais sans les féconder, c’est pourquoi les animaux seront gardés en vie après avoir été opérés. Le transfert d’embryon dans une lapine receveuse a pour but de placer des embryons dans l’utérus d’une femelle pour qu’ils puissent se développer et devenir des lapereaux. Les lapines opérées dans le cadre de cette procédure seront gardées en vie pendant quelques mois et nous les utiliserons ensuite soit pour un nouveau transfert soit pour la procédure « obtention de gamètes femelles ». La césarienne, qui ne sera réalisée qu’en cas de difficulté de la lapine à mettre bas, a le même but : nous permettre d’obtenir des lapereaux vivants, qui auront besoin de leur mère pour être nourris et élevés. Les procédures qui consistent à prélever du sang et du lait sur les lapins, ont pour but de nous permettre de déterminer si nous avons atteints nos objectifs. Ces animaux seront laissés en vie après la procédure et remis dans l’élevage.

Remplacement

La production de protéines recombinantes dans le lait de lapines transgéniques est le principe fondateur de notre société et n’est pas remplaçable. Concernant le projet de renouvellement, nous avons essayé d’inséminer des lapines avec de la semence décongelée de mâles transgéniques InhC1 de 1ères et 2èmes générations mais avec un succès très limité. Le stock de paillettes de semence s’épuisant, il est nécessaire de trouver une alternative : l’ICSI (injection intracytoplasmique de sperme) .

Réduction

Pour l'optimisation de la production des protéines, nous mettons au point des tests prédictifs d'efficacité de nos vecteurs dans des lignées cellulaires. Nous souhaitons à terme, pouvoir tester tous les vecteurs de nos cibles génomiques afin de pouvoir pré-sélectionner les plus efficaces avant de passer à la micro-injection dans des embryons au stade 1 cellule et ainsi diminuer le nombre total d’animaux utilisés pour ce projet. Pendant cette mise au point, nous testons l’efficacité de nouveaux outils d’ingéniérie génétique en laissant en culture des embryons micro-injectés, jusqu’à ce qu’ils aient 5 jours (stable morulae/blastocyste) et nous réalisons ensuite leur génotypage pour vérifier l’efficacité des outils choisis . Cela nous permet de diminuer le nombre d’animaux utilisées pour un transfert d’embryon, de ne pas faire naître des animaux qui n’ont pas d’intérêt scientifique. Une fois les nouveaux outils validés, nous réitérons l’expérience en transférant cette fois les embryons micro-injectés dans des lapines dites receveuses. Les cibles génétiques sélectionnées concernent soit la production des protéines récombinantes soit l’amelioration de glycosylation de ces protéines récombinants. Les lapines reçoivent un traitement de super-ovulation qui, en moyenne, double le nombre d’ovocytes émis lors de l’ovulation (passe de 15 à 30, en moyenne), ce qui permet de diminuer par deux le nombre de lapines à utiliser. Après transfert, gestation et/ou lactation, les femelles receveuses d’embryons sont ré-utilisées en tant que femelles donneuses d’ovocytes ou d’embryons. L’optimisation de l’utilisation des lapines nous permet de réduire de moitié le nombre d’animaux utilisés réaliser la procédure « obtention de gamètes femelles ».

Raffinement

Les lapins reçoivent des enrichissements dès trois semaines de vie, et les parois latérales de leurs cages sont équipées de plexiglas transparent, ce qui leur permet d’interagir. Leurs cages sont aussi équipées de plateforme qui leur permettent de mettre en œuvre leur comportement naturel de se cacher. De la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et les bruits environnementaux. Les gestes invasifs associés aux procédures sont faits sous anesthésie locale et/ou générale et les animaux recoivent des anti-inflammatoires locaux et généraux après chaque intervention. Notre protocole post-opératoire est mis en œuvre pour assurer le plus de confort et le moins de douleur à l’animal par l’application de produits cicatrisants et désinfectants en spray (pour ne pas toucher la zone potentiellement douloureuse), par l'injection d’anti-inflammatoire les 3 jours suivants l’opération, par la pose d’une collerette pour éviter que l’animal ne mange ses points de suture, pendant 10 jours environ après l’opération. La quantité d'aliment est augmentée pour que la lapine puisse accéder à sa nourriture facilement.

Choix des espèces

Le lapin (de souche New Zealand White) a été choisi pour : sa courte période de gestation (32-33 jours), sa maturation sexuelle rapide (4 à 5 mois), le volume de lait produit (jusqu’à 10 litres/an/femelle), la synthèse de protéines complexes (glycosylation et gamma carboxylation). Les lapines sont utilisées dès qu'elles ont atteint la maturité sexuelle, à 4 mois : Elles peuvent être utilisées comme receveuse d'embryons, par réimplantation chirurgicale d'embryons. Elles peuvent être super-ovulées et accouplées (ou non) avec des mâles pour être fécondées et être donneuses de gamètes. Les mâles sont utilisés comme reproducteurs à partir de 5 mois, lorsqu’ils ont atteint la maturité sexuelle, pour générer une descendance.

48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une arthrose du genou leur est provoquée par injection d'une substance, la MIA, sous anesthésie, pour tester un gel de chitosan censé limiter les lésions. Le porteur indique qu'il n'est pas possible de soulager la douleur par des antalgiques, ceux-ci fausseraient l'inflammation et les lésions recherchées, et décrit une douleur modérée liée au développement de la pathologie. Les rats sont tués quatorze jours après l'injection pour prélever et analyser les genoux.

Objectifs

L’arthrose du genou est un problème majeur de santé publique à travers le monde. Des études basées sur la population révèlent que l'arthrose symptomatique du genou est présente dans 20 à 30 % de la population âgée de plus de 65 ans et sa prévalence augmente en partie à cause du vieillissement de la population. Des études récentes ont montré que la progression de l'arthrose pouvait significativement être liée au stress oxydatif et aux radicaux libres. En effet, la production de radicaux libres a été trouvée élevée chez les patients atteints d'arthrose. Notre étude vise à cibler la voie de signalisation du stress oxydatif impliquée dans la pathologie de l'arthrose en évaluant l’effet d'une viscosupplémentation par un gel chélateur à base de chitosan (production d’un composé non toxique à partir des radicaux libres) sur le développement de la pathologie arthrosique. Le modèle d’arthrose utilisé est un modèle expérimental d’arthrose chez le rat par injection intra-articulaire de mono-iodoacétate de sodium (MIA). L’injection intra-articulaire de MIA entraine l’apparition rapide en 14 jours de lésions articulaires similaires aux lésions arthrosiques.

Bénéfices attendus

En ciblant la voie de signalisation de ce stress oxydatif impliquée dans la pathologie de l'arthrose, la viscosupplémentation par injection intra-articulaire locale à l'aide d'un gel chélateur de chitosan (permettant la production d’un composé non toxique) pourrait donc permettre de soulager les patients et de retarder voir de supprimer l'apparition des lésions arthrosiques, évitant ou retardant ainsi la mise en place d'une prothèse (seule technique efficace pour le moment).

Procédures

Tous les animaux subiront 2 injections intra-articulaires à J0 et à J3 (d'une durée de moins d'une minute chacune), qui seront réalisées sous anesthésie gazeuse générale, ce qui permettra de supprimer la douleur de l'injection. La première injection de MIA va permettre d'induire l'arthrose expérimentale. Il n’est cependant pas possible de diminuer la douleur par l’administration d’antalgiques, car ces molécules auraient une influence sur l’inflammation et l’apparition des lésions arthrosiques, essentielles dans ce modèle. Les nuisances attendues sur les animaux sont une douleur de niveau modérée liée à l'inflammation initiale puis liée au développement de la pathologie arthrosique. L'accès à la nourriture et à l'eau n'est pas impacté et les animaux conservent une mobilité et un comportement social normal. La deuxième injection intra-articulaire de gel à base de chitosan n'induit pas de douleur "post-injection". La formulation du gel de chitosan n'est pas toxique pour l'animal et n'induit aucun signe de douleur.

Impact sur les animaux

Ce modèle animal est indispensable pour évaluer l’intérêt d’une viscosupplémentation dans un modèle d’arthrose expérimentale sur les lésions arthrosiques. Les injections intra-articulaires sont réalisées sous anesthésie gazeuse générale, ce qui permettra de supprimer la douleur de l'injection. Ce modèle d’arthrose expérimentale par injection de MIA est un modèle bien connu en termes de douleur. Il n’est cependant pas possible de diminuer la douleur par l’administration d’antalgiques, car ces molécules auraient une influence sur l’inflammation et l’apparition des lésions arthrosiques, essentielles dans notre modèle. Les nuisances attendues sur les animaux sont une douleur de niveau modérée liée à l'inflammation initiale puis liée au développement de la pathologie arthrosique. Il pourra y avoir également un handicap moteur d'ordre modéré.

Devenir

A la fin de l'étude, tous les animaux seront mis à mort 14 jours après l'injection de MIA. Chaque genou (droit et gauche) sera ensuite prélevé pour des analyses histologiques pour évaluer les lésions articulaires et osseuses à l'aide de scores quantitatifs en comparaison avec le cartilage natif du genou controlatéral. Le liquide synovial sera récupéré pour la réalisation des dosages des médiateurs de l'inflammation. La synoviale sera également prélevée pour l'analyse du degré d'inflammation via un score de Rooney.

Remplacement

Afin de développer de nouveaux produits dans le traitement des symptômes de l'arthrose (douleur et inflammation), des études pré-cliniques sont requises pour évaluer leur efficacité avant de les tester chez l'Homme. Il n'y a pas de méthode «in silico" permettant de remplacer un organisme vivant pour obtenir un modèle de lésions diffuses qui reproduit les lésions arthrosiques observées chez l'homme. En effet, ce modèle animal est indispensable pour évaluer l’intérêt d’une viscosuplémentation dans un modèle d’arthrose expérimentale sur les lésions arthrosiques.

Réduction

Dans un souci d’éthique, le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum et est nécessaire et suffisant pour les études statistiques. De plus, seul le côté droit sera injecté de façon à conserver le genou gauche comme témoin. Pour le traitement de nos données, le test ANOVA est la méthode de référence pour l'analyse statistique. Tous les scores histologiques (MANKIN pour les lésions du cartilage et ROONEY pour l'inflammation de la membrane synoviale) seront réalisés en double aveugle avec moins de 5% d'erreurs entre les deux observateurs expérimentés.

Raffinement

Les rats seront hébergés par 4 dans des cages conventionnelles conformes pour cette espèce (directive 2010/63/EU) au sein de notre animalerie conventionnelle. L'enrichissement se fera par un tunnel dans la cage et la distribution quotidienne de quelques céréales (type miels pops). Les injections intra-articulaires sont réalisées sous anesthésie gazeuse générale. Ce modèle d’arthrose expérimentale par injection de MIA est un modèle bien connu et maîtrisé au laboratoire en termes de douleur. Nous surveillerons quotidiennement les animaux. Les animaux seront pesés deux fois par semaine. Si des anomalies du comportement (vocalisation, pilo-érection, cachexie), pouvant traduire une douleur intense et/ou une perte pondérale supérieure à 20% sur 3 jours après injection de MIA étaient observés, les animaux concernés seraient mis à mort en conformité avec les recommandations éthiques. L’apparition éventuelle d’une infection au niveau du site d'injection nous obligerait également à mettre à mort l’animal.

Choix des espèces

Le rat est courament utilisé dans l'arthrose et ce modèle mécanique reste une alternative à l'utilisation du chien. Les animaux utilisés seront livrés à l'âge de 5 semaines (150 - 175 g) et auront une semaine d'acclimatation. L'arthrose sera induite sur des animaux agés de 6 semaines pour être en accord avec la littérature. La mise à mort sera ensuite réalisée en fin d'expérimentation 14 jours après l'induction de l'arthrose pour réaliser des explorations histologiques et immunohistologiques des lésions arthrosiques et pour évaluer le degré d'inflammation.

750 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des tumeurs de glioblastome ou pancréatiques leur sont implantées, suivies d'injections de nanoparticules et de prélèvements sanguins répétés, pour tester la distribution de ces nanoparticules et leur accumulation dans les tumeurs en vue d'améliorer la radiothérapie. Le porteur cite comme effets attendus l'immunodéficience des souris, les douleurs des injections et le stress des contentions et anesthésies. Les animaux sont ensuite tués sous anesthésie pour prélèvement d'organes.

Objectifs

Le but de ce projet est d’améliorer l’efficacité de la radiothérapie en utillisant des nanoparticules scintillatrices. L'objectif de l'étude proposée ici est de tester la biodistribution des nanoparticules, leur pharmacocinétique, leur potentiel à s'accumuler dans les tumeurs, ainsi que le délai d'injection qui permet une accumulation optimale des composés dans les tumeurs. Les nanoparticules utilisées seront fluorescentes (fluorescence intrinsèque ou nanoparticules marquées avec un fluorophore). Dans ce cadre, nous prévoyons l'étude in vivo de 10 nanoparticules (5 nanoparticules pour des modèles de glioblastome et 5 nanoparticules pour des modèles pancréatiques). Nous étudierons deux modèles de glioblastomes (un modèle sous cutané implanté chez la souris et un modèle orthotopique implanté chez le rat) et deux modèles pancréatiques (un modèle sous cutané et un modèle orthotopique implanté chez la souris).

Bénéfices attendus

Nous espérons démontrer le bénéfice d'un nouveau mode de radiothérapie, basé sur des nanoparticules qui boostent l'effet de la radiothérapie, dans des modèles particulièrement agressifs et pour lesquels trop peu de solutions thérapeutiques existent. En cas de succès, ce type de traitement pourrait être proposé pour un grand nombre de pathologies tumorales.

Procédures

Pour l'étude 1: Du sang sera prélevé à différents temps après injection ( 30 minutes / 7 Jours / 14 Jours ) pour analyses ex vivo. Les prélèvement seront de 200μL pour les souris et 500μL pour les rats. Pour l'étude 2: Les prélèvements seront effectués 15 min après l'injection, puis à 1h, 2h, 3h, 5h et 7 heures post-injection. La quantité totale de sang prélevé sera d'environ 180μL soit moins de 1% du poids total de nos souris et moins de 1 millième du poids de nos rats. La mesure de 24h sera réalisée avec le sang récupéré lors du sacrifice. Pour l'étude 4: 500uL de sang seront prélevés dans la veine caudale des rats 5 heures et 24 heures après l’injection de nanoparticules. Ce volume total représente moins de 10% du volume de sang de nos rats et ne devrait ainsi pas entraîner de contraintes pour l’animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus sont : immunodéficience des souris, douleurs et conséquences des injections sous-cutanées, orthotopiques et intraveineuses, stress de la contention et des anesthésies.

Devenir

Euthanasie sous anesthésie générale gazeuse (Isoflurane 4%) de l'ensemble des souris avec prélèvements de pièces anatomiques/organes/sang. L'euthanasie des rats sera effectuée par injection intra-cardiale de barbituriques (Exagon 1ml/kg) sous anesthésie gazeuse, avant le prélèvement de pièces anatomiques.

Remplacement

Ce projet a été initié depuis 2017. Afin de réduire le nombre de composés à évaluer, beaucoup d'essais visant à évaluer les caractéristiques des nanoparticules ont été réalisés en solution. L’ensemble des nanoparticules testées in vivo aura été préalablement testé et validé in vitro sur des cultures de cellules tumorales (2D / 3D). Seules les molécules les plus performantes seront testées chez l’animal. Cette étape d’expérimentation animale permet de progresser dans la mise au point de nouvelles thérapies anti-tumorales et de procéder à leur évaluation pré-clinique avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n'existe pas de méthodes alternatives pour réaliser ce travail.

Réduction

La stratégie de réduction a été réalisée grâce aux études préliminaires in vitro. De plus, nous avons choisi de réaliser les expériences de cinétique sanguine et de biodistribution avec 6 animaux par groupe pour obtenir des résultats statistiquement fiables (ANOVA). Afin d'employer au mieux les animaux, les protocoles présentés ont été optimisés afin d'obtenir le maximum d'informations sans augmenter la douleur infligée aux animaux. La collection d'échantillons post-mortem permettra notamment des études à postériori des organes.

Raffinement

Des mesures de raffinement ont été prises afin de réduire la douleur, la soufrance et l'angoisse notament en mettant en place des points limites. De plus, toutes les procédures possiblement traumatisantes sont effectuées sous anesthésie gazeuze, avec une gestion de la douleur adaptée à chaque situation.

Choix des espèces

Les souris Nudes permettent le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. Les méthodes utilisées pour induire une tumeur sont rapides et reproductibles et la bonne connaissance de ce modèle de pathologie chez la souris fait que les limites éthiques de ce type d’expérimentation sont bien connues. Les rats sont intéressants dans notre cas du fait de leur taille plus importante ; les injection intracérébrales sont plus faciles à mettre en œuvre de façon fiable et reproductible. Souris nudes de 5 semaines. Ce stade de développement permet d’avoir des souris adultes avec une prise tumorale optimale, avant le pic de production de leucocytes NK natural killer à l’âge de 8 semaines. Rats Fischer mâles de 6-8 semaines. Les rats mâles sont utilisés entre 6 à 8 semaines après la naissance, ce qui est un bon compromis pour avoir des animaux de petite taille et sevrés mais néanmoins disponibles en plus grande série chez les éleveurs agréés. Par ailleurs les animaux plus vieux développent des rapports de dominants/dominés plus difficiles à gérer en animalerie.

1 050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de vecteurs de thérapie génique puis des prélèvements de sang répétés sous anesthésie, certaines souris modèles de la maladie de Pompe développant une faiblesse musculaire évaluée par un test de force, pour optimiser le ciblage tissulaire de ces vecteurs. Le porteur signale une douleur possible à l'injection et un risque de cannibalisme chez les nouveau-nées. Toutes les souris sont tuées par dislocation cervicale pour analyser la distribution des vecteurs dans les organes.

Objectifs

Ce projet de recherche a pour but de développer des outils de thérapie génique pour améliorer les traitements de maladies rares. La thérapie génique est un outil de plus en plus utilisé pour le traitement d’un grand panel de pathologies génétiques (maladies hépatiques, musculaires, neurologiques, etc.), il est donc important de cibler spécifiquement les tissus touchés par telles ou telles pathologies. Néanmoins, certaines difficultés restent à être surmontées et d’autres points peuvent être améliorés. L'objectif de ce projet est d'optimiser un vecteur de thérapie génique, l'AAV (virus adéno-associé), afin de le rendre plus efficace et plus spécifique pour l'organe à traiter dans le cadre de la maladie. Pour cela, nous allons travailler sur deux éléments du vecteur : la capside, la partie externe du vecteur responsable du ciblage des organes, et le promoteur, un élément qui permet l'expression du gène thérapeutique (le transgène) dans l'organe à traiter. Ce projet utilisera des souris saines pour sélectionner les meilleures capsides et promoteurs, qui seront ensuite validés sur des souris adultes et juvéniles atteintes de la maladie de Pompe pour tester leur efficacité thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'identifier les meilleurs vecteurs AAV pour cibler de manière spécifique les organes couramment touchés par les maladies génétiques : le foie, les muscles et le système nerveux central. Le développement de vecteurs optimisés pour le(s) organe(s) cible(s) permettra de réduire la dose de vecteur nécessaire pour atteindre l'effet thérapeutique et ainsi diminuer le risque d'effets indésirables du traitement (e.g. la réponse immunitaire contre le vecteur).

Procédures

L’injection intraveineuse des vecteurs dans la veine caudale pour les souris adulte ou dans la veine temporale pour les souris juvénile sera effectuée une seule fois au début de l'étude. Le prélèvement de sang sur les souris adultes sera réalisé sous anesthésie au niveau de la veine faciale à 1, 4, 7, 15, 30, 45 et 60 jours post-injection et après une fois par mois. Les souris juvéniles seront prélevées une fois par mois. Un test d’évaluation fonctionnel (grip test) sera réalisé sur les souris atteintes de la maladie de Pompe à 3 mois et 6 mois post-injection afin de vérifier l'efficacité du vecteur.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir une douleur instantanée due à l'injection du vecteur. Le stress de la manipulation peut durer jusqu'à 30 secondes. La prise de sang sera réalisée sous anesthésie, la souris ne ressentira donc aucune douleur, mais la manipulation (environ 1 minute) pourra être un facteur de stress. Les souris modèle de la pathologie de Pompe pouvaient développer le phénotype pathologique progressive (faiblesse musculaire) au cours des derniers mois de l'étude. Un risque de cannibalisme pourrait être observé chez les souris nouveau-nées.

Devenir

Tous les animaux sains utilisés pour la sélection des meilleures capsides et promoteurs seront euthanasiés par dislocation cervicale à la fin des procédures expérimentales afin de prélever des organes et analyser la biodistribution et l'efficacité des vecteurs dans les différents tissus. Toutes les souris atteintes de la maladie de Pompe utilisées pour tester l'efficacité thérapeutique des meilleures combinaisons capside-promoteur seront euthanasiées par dislocation cervicale à la fin des procédures expérimentales afin de prélever des organes et analyser la biodistribution et l'efficacité des vecteurs dans les différents tissus. Une procédure d'élevage de souris atteintes de la maladie de la Pompe est prévue dans cette étude, les souris de cette procédure seront utilisées dans les procédures expérimentales.

Remplacement

Afin de limiter au maximum le nombre de souris utilisé, nous avons réalisé un premier tri parmi notre liste des capsides et des promoteurs grâce à l'utilisation de culture cellulaire. Ces premiers tests nous ont permis de mettre en évidence 80 capsides et 50 promoteurs intéressants. Néanmoins, nous devons approfondir ces résultats en mesurant l’efficacité de ces traitements sur un organisme entier, pouvant réagir contre ce traitement (réponse immunitaire) et également mesurer sont efficacité de traitement d'une maladie.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera le minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiquement et statistiquement fiables. Pour le garantir, nous avons établi une approche statistique autour du paramètre d’intérêt commun mesurable dans toutes les procédures : l’expression de notre transgène. Nous utiliserons 6 souris/groupe pour nous donner la possibilité de détecter une augmentation significative du transgène. De plus, nous allons prioriser l'utilisation d'animaux sains (798 souris) lors de la sélection de nos meilleurs candidats. Les souris souffrant de la maladie de Pompe seront utilisées en dernier recours, afin de valider nos meilleurs candidats (252 souris).

Raffinement

Nous allons tout mettre en œuvre pour maximiser le bien-être des animaux (limitation du nombre de souris par cage, enrichissement des cages, limiter le stress lors de la manipulation des animaux, etc.). Chaque geste expérimental réalisé sur les animaux (injections et prise de sang) sera réalisé par du personnel formé, la mise en place d'anesthésies et des mesures de récupération (surveillance accrue des souris, utilisation de plaque chauffante jusqu'au réveil, etc.) seront utilisées lors de des prises de sang. Le prélèvement de sang sera réalisé au niveau de la veine faciale sur des souris préalablement anesthésiées afin de diminuer leur stress. L’injection intraveineuse des vecteurs dans la veine caudale sera réalisée après avoir favorisé la dilatation des veines (sous une source de chaleur) pour un maximum d’efficacité et de rapidité d’intervention sur l’animal, pour limiter le temps de passage en boîte de contention nécessaire à l’injection dans la queue.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux disponibles pour la maladie de Pompe (bovins, chats, moutons et caille), la souris Gaa-/- [B6;129-Gaatm1Rabn/J] est l'espèce animale la plus facile à produire. Elle reproduit la maladie de Pompe, car elle ne montre aucune activité enzymatique de GAA (dans le sang et dans les tissus), elle présente une accumulation de glycogène dans tous les tissus et l'activité locomotrice des souris est altérée. De plus, nous disposons déjà de ce modèle dans notre animalerie et nous disposons de toutes les techniques pour mesurer la réversion du phénotype liée à la pathologie. La maladie de Pompe est une maladie liée à une accumulation de glycogène dans différents tissus (foie, muscles, système nerveux central, etc.). Les outils développés ont pour but d’augmenter l’efficacité du traitement déjà disponible afin de réduire la dose de vecteur injecté. 1) Certaines souris seront injectées à l’âge adulte (4 mois) ; âge où les premiers symptômes de la maladie de Pompe apparaissent pour la colonie de souris Gaa-/-. Cette approche permettra de tester si notre stratégie permet de traiter la pathologie sur les organes matures. 2) D’autres souris seront injectées à la naissance (0-2 jours). Cette approche permettra de déterminer si notre stratégie perdure dans le temps malgré la croissance des souris et des différents tissus, notamment le foie. Les souris saines utilisés pour la sélection des meilleures capsides et promoteurs seront injectées à 6 semaines, âge pour lequel la souris est considérée comme adulte.

458 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la grande majorité tuée à l'issue et dix-huit réutilisés. Quarante rates gestantes sont gavées quotidiennement pendant quarante-deux jours avec un polluant retardateur de flamme, le HBCDD, et reçoivent une injection intrapéritonéale, pour étudier son rôle dans les troubles du spectre autistique de leur descendance. Le porteur indique que les mères sont tuées au sevrage des petits et que les ratons en surnombre, au-delà de dix par portée, sont prélevés au hasard et tués. Les descendants restants subissent des tests comportementaux puis sont mis à mort.

Objectifs

Les Troubles du Spectre de l’Autisme (TSA) se manifestent par des déficits de communication sociale associés à des intérêts restreints et des comportements stéréotypés. Alors que la prévalence de ces troubles est en augmentation dans les pays développés, seuls 25% des cas impliquent la composante génétique questionnant le rôle des facteurs environnementaux, dont les polluants chimiques, dans cette pathologie. Des résultats obtenus chez l’Homme et chez l’animal montrent des modifications des capacités motrices, de l’anxiété et de l’attention chez des individus ayant été exposés précocement à des niveaux environnementaux de retardateurs de flamme bromés dont l’HexaBromoCycloDoDecane (HBCDD), justifiant sa classification en Europe en tant que substance à très haut niveau de préoccupation. La neurotoxicité développementale de l’HBCDD a été montrée par l’équipe porteuse de ce projet qui se propose maintenant d’étudier les mécanismes sous-jacents de cette toxicité cérébrale induite par une exposition périnatale à l’HBCDD et le rôle que cette exposition pourrait jouer en tant que facteur de susceptibilité dans un modèle expérimental de Troubles du Spectre de l’Autisme. Il est donc proposé ici d’étudier l’incidence et les mécanismes sous-jacents de l’exposition précoce à l’HBCDD comme facteur de susceptibilité dans l’apparition des TSA induite par l’administration d’acide valproïque au cours de la gestation.

Bénéfices attendus

Les retombées scientifiques de ce projet visent donc à associer le modèle de Troubles du Spectre de l’Autisme précédemment validé à une exposition de la mère à deux doses d’HBCDD (HexaBromoCycloDoDecane) au cours de la période périnatale (Jour de gestation 1 à 21 jours postnataux) dans le but ultime d’étudier l’impact de l’HBCDD en tant que facteur de susceptibilité pour cette pathologie dans la descendance.

Procédures

Ce projet d’une durée de 3 ans inclura un total de 40 rats femelles Wistar gestantes ainsi que leurs descendants. Les 40 rates adultes seront réparties en 4 groupes expérimentaux (n=10 par groupe) et constitueront le lot 1. La voie orale étant la voie principale de l’exposition humaine à l’HBCDD, le polluant sera administré via la même voie par gavage. Les animaux du groupe C seront administrés quotidiennement avec le polluant à la dose de 0.1 µg/kg et le groupe D à une dose 100 fois supérieure à celle-ci. Les groupes A et B recevront le véhicule (huile neutre). L'administration durera 42 jours couvrant ainsi les périodes de gestation (21 jours) et de lactation (21 jours) de manière à mimer une exposition humaine dans un environnement contaminé pendant les 9 mois de grossesse et les 6 mois d’allaitement (durée établie par l’OMS). A l’issue de la naissance, les ratons de chaque portée seront sexés et marqués pour pouvoir être suivis individuellement et le poids mesuré tous les 3 jours jusqu’au 21e jour de vie postnatale (PND) puis 1 fois par semaine. Un suivi de l’ouverture des yeux sera réalisé entre les jours 14 et 16 de vie postnatale en tant que marqueur précoce dans les premières semaines. Le lot 1 concernera également les ratons (n=400) lors du suivi de leur développement jusque PND21 puis une partie de ces descendants (n=240) seront mis à mort. Plusieurs tests comportementaux seront effectués par le lot 2 (n=96) au cours des semaines 9 à 11 après la naissance et viseront à étudier l’expression des 3 critères comportementaux (somesthésie, activité/anxiété et interactions sociales/stéréotypies) caractéristiques d’un phénotype autistique tels que mentionnés plus avant. A la fin de l’évaluation comportementale, les animaux de ce lot seront mis à mort pour collecter des tissus. Le lot 3 (n=64) sera dédié à l’étude de la réactivité à un stress psychologique lors d’un test de stress de contention qui sera réalisé à PND90. Les animaux de ce lot seront ensuite mis à mort pour réaliser des prélèvements.

Impact sur les animaux

- L'administration orale du polluant chez les mères se fera par gavage, les effets attendus sur les animaux sont une gêne de courte durée due à l'administration de la canule de gavage. - Une injection intrapéritonéale est ensuite prévue au 12ème jour de gestation pouvant entrainer une douleur légère au point d'injection. - Le marquage, le suivi de l'ouverture des yeux et le suivi de croissance des animaux par pesée n'entrainent aucun effet indésirable. Ces interventions nécessiteront une séparation de la mère de courte durée lorsqu'elles seront réalisées sur les animaux à un jeune âge pouvant entrainer un stress de séparation. - Le test de la plaque chaude prévue dans ce protocole entrainera une sensation de chaleur sous les pattes de l'animal suffisamment importante pour qu'il exprime une gêne sans aller jusqu'à une brulure car le test est stoppé en amont. - Le test de la pince calibrée entrainera une gêne de l'animal au niveau des pattes postérieures qui seront pincées par le dispositif sans aller jusqu'à une douleur. - Les tests du labyrinthe en crois surelevé et de l'open-field mettent les animaux dans une situation stressante pour eux, l'effet attendu est donc le ressenti d'une anxiété. - Les tests de l'enfouissement des billes et celui de sociabilité de Crawley n'ont pas d'effets indésirables prévus. - Le test du résident-intrus peut amener l'animal à exprimer une certaine agressivité envers l'autre congénère réalisant le test. - Le stress de contention aura pour effet indésirable le ressenti d'une anxiété par l'animal puisqu'il sera placé dans une situation stressante pour lui. Des prélèvements sanguins seront réalisés au début et à la fin du test et entraineront alors une douleur légère liée à la piqure des aiguilles. Un suivi de température sera également réalisé par l'administration d'une sonde rectale causant chez l'animal une gêne le temps de ce suivi.

Devenir

Procédure 1 : Les 40 femelles allaitantes (groupes A, B, C et D) seront gardées en vie jusqu’au sevrage des jeunes à 21 jours, puis seront mises à mort. A la mise bas, dans le cas de portées avec un nombre de ratons trop important (>10), les animaux en surnombre seront prélevés au hasard et mis à mort. Une partie des descendants seront également mis à mort (n=240) à 21 jours postnataux. Procédure 2 : Tous les animaux seront mis à mort (n=96) à 80 jours postnataux. Les 18 rats (9 femelles et 9 mâles) ayant servi d'intrus dans les tests de sociabilité pourront être gardés en vie à l'issue des tests de comportement et réutilisés selon les besoins Procédure 3 : Tous les animaux seront mis à mort (n=64) à 90 jours postnataux. Les prélèvements réalisés sur les animaux de tous les lots serviront pour des dosages tissulaires et plasmatiques.

Remplacement

Seul le recours à l'animal peut permettre de mimer la complexité comportementale et cérébrale des Troubles du Spectre Autistique (TSA) tels qu'ils sont observés chez l'homme, justifiant le recours à un modèle animal pour cette étude. Le modèle de TSA développé chez les rongeurs par administration d'acide valproïque (VPA) est reconnu pour générer des phénotypes comportementaux comparables à ceux observés chez les autistes chez l'Homme. Aucun système alternatif ne permet de simuler le niveau de complexité de l'organisme entier nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.

Réduction

Le nombre total d'animaux est le nombre estimé juste et nécessaire pour pouvoir atteindre les objectifs du projet dans des conditions de réalisation acceptables garantissant ainsi le bon déroulement de l'expérimentation, la prise en charge adaptée des animaux de façon à garantir au mieux leur bien-être et une exploitation statistique satisfaisante des résultats avec l'assurance d'une puissance statistique adéquate (60 à 80%). Le nombre d’animaux prévu pour cette étude est de 40 rats adultes (40 rates gestantes) ainsi que la descendance obtenue (400 ratons),18 rats (9 femelles et 9 mâles) qui serviront d’intrus pour les tests d’interaction sociale. Le nombre de 10 rates gestantes par groupe est estimé suffisant pour pouvoir s’affranchir d’un effet propre à la portée sur la variabilité des résultats. De plus, le nombre de descendants est ajusté à 10 par portée de façon à standardiser les effets de la taille de la portée sur la croissance et le développement dans l’ensemble des portées. Dans le cas d’un nombre de ratons supérieur à 10, les animaux en surnombre pourront être utilisés pour compléter des portées nées le même jour et comprenant moins de 10 ratons. Si ce n’est pas le cas, ces animaux surnuméraires seront mis à mort. En cas d’un nombre plus faible (inférieur à 10), l'ajout d'animaux excédentaires provenant d'autres portées du même groupe pourra être réalisé si les portées sont nées le même jour. Si cet ajout n'est pas possible, des portées de 8 ratons seront considérées comme de taille minimum. Les portées de taille inférieure seront écartées et les ratons mis à mort pour des prélèvements.

Raffinement

Les femelles gestantes puis allaitantes seront hébergées avec leurs jeunes jusqu’à 21 jours postnataux. Puis les jeunes rats seront hébergés ensemble par portée après retrait de la mère entre 21 et 28 jours de vie afin de maintenir les liens sociaux formés dans la portée. A 28 jours, les rats seront séparés par sexe. Les animaux seront finalement placés à 2 par cage selon les dispositions réglementaires en termes de rapport hauteur/surface au moment où leur poids et taille le nécessiteront. L'eau et la nourriture seront disponibles ad libitum durant tout le protocole. Les cages seront maintenues dans des conditions d'hébergement contrôlées en cycle lumineux inversé (lumière allumée à 19h). Le milieu sera enrichi avec des feuilles de papier absorbant de manière à éviter le grignotage des matières plastiques des objets habituellement utilisés qui contiennent des substances de toute sorte pouvant interférer avec le polluant (HBCDD). Les tests comportementaux se feront ainsi durant la phase d’activité naturelle (phase nocturne) des rats de manière à préserver leur période de repos. Les animaux seront surveillés quotidiennement et les points limites suivants relevés (diminution de la consommation alimentaire et hydrique, ralentissement de la prise de poids, modifications de l'apparence physique externe et du comportement de l'animal). Si l'un de ces points limites est atteint, l’animal sera isolé et surveillé, voire mis à mort selon une méthode réglementaire (injection létale) en cas de persistance de l’état de mal-être de l’animal. Tous les animaux seront traités par les mêmes personnes entrainées de manière à réduire le stress de l’administration des produits et de la manipulation.

Choix des espèces

Alors que le modèle de Troubles du Spectre Autistique (TSA) induit par l'acide valproïque (VPA) a été développé chez le rat et la souris, les caractéristiques comportementales du rat, en particulier au plan du comportement social diffèrent de celles de la souris et font que cette espèce est à privilégier pour induire des phénotypes comportementaux de type autistique. De plus, cette espèce est celle qui a été utilisée lors des expérimentations animales précédentes visant à mettre au point ce modèle de TSA dans un contexte de co-exposition au polluant environnemental (HBCDD) rendant nécessaire de poursuivre avec la même espèce pour cette étude. Les femelles qui seront utilisées pour la reproduction seront utilisées au même stade adulte (12-13 semaines) que dans les études précédentes de manière à obtenir des résultats comparables. Les femelles seront placées au moins une semaine avant la phase d’accouplement dans une salle d’hébergement en cycle inversé. L’œstrus (période pendant laquelle la femelle est fécondable) sera confirmé grâce à l’utilisation d’un moniteur de cycle œstral digital pour rongeur, par un personnel expérimenté et habitué à ce geste de contention manuelle légère. Une fois l’œstrus confirmé, les rates seront placées en accouplement. Pour cette étape, une seule femelle est placée en présence d’un seul mâle pendant la 2ème partie de la phase d’obscurité (après-midi). Si la femelle montre des signes de réceptivité sexuelle (comportement caractéristique de lordose c’est-à-dire d’une position permettant la copulation et frémissement des oreilles qui normalement précèdent l'acceptation de la monte), la femelle sera laissée en présence du mâle jusqu’au lendemain matin (soit une période d’environ 12h). Leurs descendants seront utilisés aux stades postnataux PND1 à PND90 afin de valider d’un point de vue comportemental, l’expression phénotypique des trois critères principaux de diagnostic des TSA qui sont : i) un déficit d’interactions sociales et une stéréotypie, ii) une atteinte de la sensibilité au niveau du système somesthésique et iii) une hyperactivité et une hyperanxiété.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des prélèvements sanguins hebdomadaires sous anesthésie et, pour une partie, une greffe de peau entre donneuse et receveuse préalablement immunisée, pour étudier des traitements contre le rejet d'organe. Le porteur indique des complications possibles de cicatrisation, de saignement ou d'infection au site de greffe, et une déshydratation liée à un bandage trop serré. Toutes les souris sont ensuite tuées par dislocation cervicale pour prélèvement de sang et d'organes.

Objectifs

L’insuffisance cardiaque, respiratoire ou rénale terminales sont des problèmes majeurs de santé publique. La transplantation d’organe est le meilleur traitement car elle permet d’améliorer la qualité et la durée de vie des patients. Cependant, la morbidité et la mortalité des patients transplantés restent élevées. Ceci s'explique notamment par une forme particulière de rejet d’organe, le rejet humoral. Ce dernier est causé par les lymphocytes B qui produisent des anticorps contre les protéines HLA du donneur, exprimées à la surface des cellules de l’organe transplanté. Certains patients possèdent déjà des anticorps anti-HLA avant la transplantation, parce qu’ils ont été exposés à du HLA étranger à l’occasion d’une transfusion, d’une grossesse, ou d’une précédente transplantation. Ces anticorps préexistants compliquent l’accès à la transplantation de nombreux patients. Certaines protéines HLA, comme le HLA A2, sont plus souvent en cause, parce qu’elles sont communes à une grande partie de la population. Actuellement, la seule prise en charge possible de cette immunisation du receveur contre le HLA du donneur repose sur une immunosuppression globale, visant toutes les sous classes des lymphocytes. Cette immunodépression massive expose le receveur à un haut risque d’infections et de cancers. En outre, certains plasmocytes producteurs d’anticorps anti-HLA ne peuvent pas être ciblés par les thérapeutiques actuelles, ce qui explique l’efficacité médiocre des protocoles existants. Notre projet vise à développer une approche thérapeutique plus sélective qui cible uniquement les lymphocytes B et plasmocytes qui produisent les anticorps contre une protéine HLA spécifique du donneur. Une telle approche permettrait à la fois d’obtenir une meilleure efficacité en ciblant également les plasmocytes, et une meilleure tolérance, en préservant les lymphocytes et plasmocytes qui ne sont pas impliqués dans la production des anticorps anti-HLA.

Bénéfices attendus

Cet étude permettra le développement et la validation préclinique des nouvelles stratégies de thérapie cellulaire et moléculaire visant à prévenir et traiter le rejet humoral, de façon à faciliter l’accès à la transplantation des patients sur liste d’attente.

Procédures

Les procédures #1, 2 et 3 impliquent des prélèvements sanguins hebdomadaires (100ul) sur souris anesthésiée ( pour monitorer l’efficacité, d’abord, du protocole d’immunisation (J-7 avant début du traitement) et, en suite l’efficacité, de nos traitements dans évolution du tôt d’anticorps et lymphocytes B spécifiques. La procédures #3 prévoie aussi une procédure de greffe de peau entre souris donneuse et souris receveuse pre-immunisée contre le donneur : la procédure chirurgicale est effectué une seule fois sur souris anesthésiée pendant 10-15 minutes.

Impact sur les animaux

Des complications éventuelles peuvent survenir au cours de la procédure 3, notamment une mauvaise cicatrisation, un saignement ou une infection du site de la greffe ou du site de l'injection. Ces complications sont rares (

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale pour collecter le sang (ponction intracardiaque) et les organes d'intérêt (ratte, foie, os, poumon, ganglions) pour l'analyse des effets des traitement sur les différents sous populations de lymphocytes B.

Remplacement

Des études préliminaires sur cellules sont en cours pour établir l’efficacité in vitro des différents traitements (cellulaire et moléculaires) sur une population mixte de lymphocytes dérivés de souris immunisées contre le HLA A2. Néanmoins, aucune méthode alternative au modèle in vivo n’est disponible pour aller plus loin dans notre étude pré-clinique.

Réduction

Les études in vitro nous permettront d’estimer l’efficacité des différentes approches testées. Dans le cas de résultats clairement négatifs (absence d’effets), la procédure relative au traitement en question sera retirée du projet et les souris ne seront pas utilisées.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe et en milieu enrichi. Ils seront surveillés quotidiennement (comportement, apparence, signes cliniques) par le personnel animalier d'une part, et par les personnes en charge de l'expérimentation d'autre part. Toute apparition de signes de douleur tels que prostration, dos vouté, isolement et poil hérissé entrainera l’ouverture d’une fiche de score avec des points limites bien définis qui pourront entrainer le cas échéant l'euthanasie de l‘animal par dislocation cervicale. Une attention particulière sera portée au point d’injection abdominal (rougeur) et à la zone de la chirurgie pour les animaux greffés.

Choix des espèces

Le modèle murin permet une étude in vivo et permet de se rapprocher de la physiologie humaine. Il s'agit d'un prérequis indispensable à toute application de nos approches à l’Homme. De plus, l'utilisation de souris permet l'accès aux modèles transgéniques qui, ici, nous permettent de répondre à des questions précises. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, soit à un stade de développement adulte (système immunitaire mature).