Procédures légères

1 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur crée deux lignées invalidées pour des récepteurs hormonaux dans les cellules de Schwann, leur fait passer des tests comportementaux portant sur les capacités motrices puis prélève leurs nerfs sciatiques après une perfusion transcardiaque sans réveil. Il indique que la suppression du récepteur GR pourrait entraîner une démyélinisation et un handicap moteur, l'étude s'arrêtant alors aux points limites. Il reconnaît utiliser aussi des cultures de cellules de Schwann in vitro, mais affirme qu'elles ne reproduisent pas finement la myélinisation d'un axone chez l'animal.

Objectifs

La myélinisation permet d'augmenter la vitesse de l'influx nerveux. Elle est assurée par les cellules de Schwann dans le système nerveux périphérique. Les hormones glucocorticoïdes ont été décrites comme agissant sur la myélinisation, mais leurs effets semblent varier selon les modèles d’études. Ces hormones exercent leurs actions principalement par leur liaison à deux protéines, le récepteur aux glucocorticoïde, (GR) et le récepteur aux Minéralocorticoïde (MR), et sont d'une importance cruciale en physiologie et pathologie (stress, métabolisme immunité). Le but de ce projet est de comprendre l’implication des glucocorticoïdes et de leur deux récepteurs, MR et GR sur le développement et le maintien de la gaine de myéline autour des axones des nerfs périphériques chez la souris en utilisant des modèles d'inactivation des gènes codant pour le MR, le GR ou les deux en même temps chez la souris spécifiquement dans la cellule de Schwann. Nous avons déjà réalisé l'inactivation du gène du MR seul dans le cellule de Schwann. A ce niveau de notre étude, les altérations de la myélinisation chez ces souris ne semblent pas provoquer de dommage chez les animaux. Les deux récepteurs MR et GR présentent une forte similarité de structure et leurs actions sont parfois redondantes, c'est pourquoi la stratégie consistant à inactiver chez la souris chacun des deux récepteurs, puis les deux ensembles a été utilisée récemment par d'autres laboratoire, notamment dans le cerveau et le coeur. Notre étude analysera ainsi les conséquences fonctionnelles de l'inactivation du gène de chacun de ces récepteurs , ou des deux ensemble, sur les capacités motrices des souris à différents stades de vie grâce à des tests non invasifs validés par des études antérieures. Une analyse moléculaire et histologique sera aussi réalisée sur les nerfs sciatiques de ces animaux en post mortem. Cette étude nécessitera 1400 souris pendant 5 ans.

Bénéfices attendus

Ce projet s’appuie aussi par la démonstration récente au laboratoire de la présence des récepteurs MR et GR fonctionnels dans des cultures de cellules de Schwann. Mais ces modèles in vitro ne permettent par contre pas de reproduire finement la structure et la fonction d’une cellule de Schwann myélinisant un axone chez l'animal. Ce projet devrait permettre de mieux comprendre l'effet des hormones glucocorticoïdes sur la myélinisation périphérique. Les hormones glucocorticoïdes étant impliquées dans la physiologie du stress et de l'immunité, le stress chronique étant un problème majeur de santé publique, et les traitements par des glucocorticoïdes synthétiques étant largement utilisés, ce qui démontre ainsi l'importance d'étudier l'implication de leur récepteur GR dans la myélinisation périphérique. L'intérêt de ce projet est souligné par le fait que l'effet des hormones glucocorticoïdes sur la myélinisation est encore peu étudiée à ce jour.

Procédures

Les animaux proviendront d'une création d'une nouvelle lignée, ils subiront des tests comportementaux et prélèvement de tissus, notamment des nerfs sciatiques sur animal mort. La perfusion transcardiaque pour les études morphomogiques est une procédure sous anesthésie générale sans réveil qui entraine la mort immédiate de l'animal.

Impact sur les animaux

Nous avons déjà observé que l'inactivation du gène du MR dans la cellule de Schwann ne s'accompagne pas d'un phénotype domageable. Par contre, l'excision dans la cellule de Schwann du gène du GR qui est d'une importance cruciale dans de nombreux tissus pourrait s'accompagner d'une démyélinisation entrainant un handicap moteur chez l'animal. Dans cette éventualité, notre étude s'arrêtera au stade où l'animal présentera un certain nombre de points limites définis dans les procédures. Il en est de même concernant la double inactivation ds gènes du MR et du GR dans la cellule de Schwann.

Devenir

A l'issue des deux procédures, les animaux sont mis à mort pour prélèvement d'organes.

Remplacement

En complément de ces études in vivo, nous utilisons des méthodes in vitro de culture de cellules (lignées établies et cultures primaires de cellules de Schwann de souris) afin d’identifier les cibles moléculaires du MR et du GR, nous permettant de mieux comprendre le rôle de ces gènes sur la myéline et dans ce cas là de remplacer le modèle animal.

Réduction

Nous allons utiliser le minimum d’animaux en expérimentation (10 pour les échantillons biologiques et 5 pour les analyses morphologiques) en prélevant le maximum de tissus biologiques sur chaque animal et en utilisant les tests statistiques non paramétriques (car on ne peut pas s'attendre à une distribution normale des valeurs au vu du nombre d'échantillons) afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Les résultats obtenus dans les différentes conditions expérimentales seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les manipulations se font dans une pièce dédiée au comportement dans la zone expérimentale de l'animalerie. Les animaux issus d'une même portée sont hébergés dans les mêmes cages contenant du matériel de nidification. L'enrichissement est renforcé pour d'éventuels mâles isolés avec des dômes et des kleenex. Au minimum 4 heures s'écoulent entre chaque test de nature différente, et au maximum 2 tests seront effectués dans la même journée. Si des animaux se déplacent avec difficulté, du gel alimentaire sera mis à disposition. Des points limites avec une grille de scores ont été définis pour la gestion de la douleur de l'animal.

Choix des espèces

Les souris sont des mammifères suffisamment proches de l’Homme pour servir à l’évaluation de l’implication des voies de signalisation des glucocorticoïdes sur le développement et le maintien de la gaine de myéline périphérique. De plus, les techniques d’analyse à notre disposition pour évaluer l’implication de ces voies ont été principalement développés pour le rat et la souris. L’analyse comportementale ainsi que les techniques biochimiques et histologiques envisagées pour étudier le statut myélinique nous permettrons d’apporter des réponses claires quant à l’implication du MR et du GR sur le développement de la gaine de myéline mais aussi sur sa stabilité à l’âge adulte. Nous utiliserons des souris âgées de 14 jours à 6 mois, afin de pouvoir étudier la myélinisation (entre la naissance et P21) et le maintien des gaines de myéline formées au stade jeune adulte (12 semaines) et adulte (6 mois).

225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur leur administre du tamoxifène pour induire une mutation dans les cellules bêta du pancréas, puis les soumet à une thoracotomie et une perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde, sans réveil. Il précise que la mutation ne provoque ni diabète ni tumeur aux stades étudiés et que les analyses sont post-mortem. Il affirme que ses souris transgéniques sont les seules à permettre une telle étude représentative de la pathologie humaine.

Objectifs

Chez l’homme, la mutation d'un régulateur de l'expression d'un gène pancréatique cause le développement d’un diabète ou/et d’insulinome (tumeur). Ceci démontre que ce facteur est un acteur clef de ces pathologies. Afin d’étudier les mécanismes cellulaires impliqués dans l’apparition de ces maladies, le laboratoire a généré une souris transgénique représentative de la mutation de ces patients. Cette souris est porteuse de la mutation dans toutes ses cellules (modèle A). Nous avons également généré une variante de cette souris, dans laquelle la mutation étudiée est inductible spécifiquement dans les cellules bêta suite à l’injection d’une molécule particulière (Modèle B). Les cellules bêta sont les cellules du pancréas qui sécrètent de l’insuline, une hormone qui régule les niveaux de glucose dans le sang. Sur la base de la littérature, nous pensons que la masse de cellules bêta pourrait être perturbée chez nos animaux mutants. Nous allons donc utiliser une technique qui nous permettra de visualiser et mesurer la quantité de cellules bêta. Une altération de la masse de cellules bêta pourrait être associée à un diabète et une quantité excessive pourrait être liée à un insulinome. Ces expériences nous permettront ainsi de mieux comprendre le diabète et les insulinomes chez l’homme.

Bénéfices attendus

Ce projet constitue une méthode innovante pour visualiser les îlots de Langerhans (cellules endocrines) dans le pancréas entier. Il permettra notamment de quantifier la masse totale de cellules bêta productrices d’insuline, en fonction de la présence d’un allèle sauvage ou d’une forme mutée du facteur de transcription pancréatique étudié. Les conclusions apportées par ce projet permettront de mieux comprendre l’implication de ce facteur dans le développement d’un diabète ou d’un insulinome (tumeur du pancréas endocrine) chez les patients porteurs de telles mutations. A ce jour, on ne connaît pas de drogue capable de moduler la voie de signalisation étudiée. Nous espérons qu’à l’avenir, nos travaux permettront de développer de nouveaux traitements du diabète et de l’insulinome.

Procédures

Les animaux vigiles recevront 1 injection intrapéritonéale ou 1 administration par voie orale de tamoxifène. Tous les animaux profondément anesthésiés subiront ensuite une procédure sans réveil (perfusion par voie intracardiaque (durée de l’anesthésie

Impact sur les animaux

Les mutations induites suite à l’injection d’une molécule particulière (tamoxifène) n’induisent pas de diabète ou d’insulinome chez nos souris aux stades étudiés. Nous souhaitons toutefois analyser en profondeur les changements des cellules bêta au niveau histologique et génétique (analyses post-mortem). Les nuisances subies par les animaux seront celles liées à une thoracotomie sous anesthésie générale profonde. Les nuisances s’arrêteront en fin de chirurgie (sans réveil)

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyses post-mortem.

Remplacement

Les effets de la mutation étudiée ont déjà été décrits au laboratoire. Pour limiter les investigations in vivo, un maximum d’informations proviendra d’analyses in silico lors de comparaisons transcriptomiques. Nous souhaitons analyser les effets de la mutation du facteur étudié sur la masse et la biologie des cellules bêta. Les souris transgéniques sont les seules permettant une telle analyse représentative de la pathologie humaine.

Réduction

Une première étape de mise au point expérimentale sera réalisée sur un nombre restreint d’animaux Nous analyserons ensuite un minimum d’animaux. Si la significativité est atteinte avec ce nombre, nous stopperons ces expériences. Cela permettrait de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux injectés au tamoxifène seront observés de façon hebdomadaire, de manière à surveiller l'état général de la souris. Nous n’avons pas observé de diabète ou d’insulinome chez ces animaux aux stades étudiés. Néanmoins, une grille de score sera utilisée afin d’avoir un suivi objectif des animaux. Au moindre signe de mal-être, les souris seront euthanasiées. Lors de la thoracotomie les animaux seront anesthésiés profondément avec une prise en charge de la douleur. Pour limiter la douleur, les contentions sont douces et la perfusion intra-cardiaque ne se fait que lorsque les animaux sont anesthésiés et complètement insensibles à la douleur (test de sensibilité par pincement au niveau des espaces interdigités des postérieurs). Nous utiliserons à la fois des antalgiques et des anesthésiques pour limiter la douleur.

Choix des espèces

Nos modèles murins sont uniques et la souris est le seul organisme existant qui puisse permettre d’étudier les effets des mutations étudiées. La souris constitue de par son cycle de reproduction et sa parenté biologique avec l’homme, un modèle de choix pour mener nos expériences. Les animaux seront analysés à 3 stades adultes : 3 mois, 12 mois et 24 mois, représentants différents stades du vieillissement de la souris. Par ailleurs, on sait que ce type de phénotype lié aux cellules bêta est très dépendant du métabolisme et de l’âge de la souris. De plus, nous nous intéressons à la senescence des cellules bêta, qui pourrait être liée au vieillissement.

70 souris, dont dix femelles gestantes et leurs petits, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur expose les mères à un polluant perfluoré, le PFOS, dans l'eau de boisson de la gestation au sevrage, puis euthanasie tous les souriceaux à 21 jours pour prélever leurs tissus. Il indique n'attendre aucune souffrance notable et s'appuie sur des données non publiées chez le rat. Il justifie le passage à la souris in vivo par les limites de ses précédents modèles ex vivo et sur têtard de xénope.

Objectifs

Depuis une trentaine d'années, l'incidence de la sclérose en plaques (SEP) est en constante augmentation dans les pays développés. Des facteurs environnementaux sont suspectés de favoriser le développement et/ou la progression de la SEP. Notre hypothèse centrale est qu'une exposition à des perturbateurs endocriniens, notamment les retardateurs de flammes que nous retrouvons dans notre environnement quotidien (revêtement des poeles, vêtements déperlants...) comme les fluorofactants, peut interférer avec le processus de formation de la myéline. En particulier, ces polluants chimiques étant liposolubles, notre hypothèse de travail est qu'ils s'accumulent dans les structures riches en lipides, comme la myéline, et destabilisent ainsi sa structure et sa fonctionnalité. Ce projet vise à comprendre dans quelle mesure certains perturbateurs endocriniens auxquels nous sommes tous exposés, les perfluorés (PFOS), affecte l’intégrité de la membrane myélinique. Il s'agit de la première étude visant à montrer un lien entre une exposition environnementale à un polluant chimique de type perturbateur endocrinien et la formation de la myéline. Ainsi, nous souhaitons explorer le rôle de l’acide perfluorooctanesulfonique ou PFOS dans la génération de nouveaux précurseurs oligodendrocytaires (OPCs) et la myélinisation chez le jeune souriceau. Pour ce faire, nous déterminerons les effets cellulaires au sein de la zone sous-ventriculaire, niche neurogénique majeure chez les mammifères pour la production d'OPCs. De plus, nous déterminerons si les PFOS s'accumulent dans les faisceaux de substance blanche et altère la composition en lipides de la membrane myélinique par des expériences innovantes d'imagerie par spectroscopie de masse. Les résultats de cette étude pilote devraient aboutir à un faisceau d'arguments visant à soutenir l'hypothèse d'un lien entre une exposition développementale à certains perturbateurs endocriniens et la génération de cellules myélinisante

Bénéfices attendus

Cette approche in vivo menée chez la souris postnatale viendra compléter nos données récemment obtenues à l’aide de modèle ex vivo chez la souris (neurosphères, explants de cervelet) et in vivo chez le têtard de xénope. Plus largement, notre projet démontrera (ou non) si une exposition environnementale pendant le développement - à certains perturbateurs endocriniens, comme les perfluorés -modifie le profile lipidique de la membrane myélinique et la fragilise. Les bénéfices de cette étude pilote sont doubles : (i) une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires aboutissant à la production d'oligodendrocytes matures, processus susceptibles d'être affectés par les perfluorés chez tous les mammifères, y compris chez l'homme et (ii) l'apport d'une nouvelle voie d'étude témoignant du rôle néfaste des polluants environnementaux - auxquels nous sommes tous exposés tout au long de la vie - sur la stabilité de la myéline qui pourrait ainsi expliquer l'augmentation des cas de SEP via l'inhibition de la capacité à générer une myéline fonctionnelle.

Procédures

Les femelles recevront la molécule dans l'eau de boisson à partir du 15eme jour de gestation jusqu'au sevrage de la portée , les petits seront exposés in utero et lors de la lactation (de E15 à P21). A P21, tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement.

Impact sur les animaux

Notre procédure unique soumise ici dans le cadre de ce projet pilote est considéré comme légère. Les animaux seront étroitement surveillés. Le poids des nouveau-nés sera suivi 2-3 fois par semaine. Si trop d’effets négatifs sont observés (prostration, non-alimentation, blessure), l’animal sera euthanasié et retiré du groupe expérimental. Cependant, cette expérience ne devrait pas induire de souffrance ou d'effets néfastes ni sur la femelle en gestation/lactation ni sur les petits jusqu'au stade de 21 jours après la naissance. Dans le cadre du projet européen ENDpoiNTs , auxquels nous participons , notre collaborateur a récolté un ensemble de données (pas encore publiées) chez le rat montrant que des doses orales de la molécule utilisée en dessous de 2mg/kg bw sont bien tolérées par l’animal, notamment sans conséquences délétères en période néonatale. De plus, un ensemble de publications confirme également l’absence de problèmes chez les rongeurs en période postnatale pour des doses autour de 2mg/kg bw, donné soit dans le régime alimentaire, soit dans l’eau de boisson, soit par gavage. Les dommages attendus sont donc réellement réduits. Les femelles gestantes seront regroupées par 2 ou 3 par cage. De plus, ne sachant pas si le PFOS modifie le goût de l’eau, la quantité d’eau absorbée par les mères gestantes et en lactation sera mesurée en pesant 2 à 3 fois par semaine les biberons. Ainsi, la prise hydrique des animaux exposés à la molécule pourra être comparée aux animaux contrôles. Cependant, aucun changement dans la consommation hydrique n’est attendue. En effet, une précédente étude menée chez la rate a montré que la consommation d’eau ne différait pas entre les animaux contrôles et traités.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure car des prélèvements de tissus et analyses sont nécessaires post-mortem impliquant donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

Dans une étude antérieure récente, nous avons accumulé des données à l'aide de modèles ex vivo (culture chez la souris) et in vivo (tétard de xénope) afin de répondre à un effort de remplacement et de réduction. Cependant, la nouvelle question qui découle de nos résultats prometteurs - obtenus par ces approches - nous incite à utiliser le modèle murin in vivo afin de reproduire au mieux les conditions d'une exposition environnementale aux perturbateurs endocriniens lors de la période périnatale et d'examiner les conséquences sur la physiologie de la myéline. Avec notre approche ex vivo précédemment décrite, nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés afin de répondre à notre question première, celle des effets des perfluorés sur la génération d'oligodendrocytes myélinisants et la remyélinisation. Désormais, nous devons valider in vivo chez la souris nos résultats car nos précédents modèles ex vivo ne nous permettent pas de répondre à la problématique de l'accumulation des perfluorés dans la substance blanche ni de ses conséquences sur la stabilité de la myéline. Par ailleurs, le modèle du tétard de xénope a permis de montrer un effet de cette molécule sur la remyélinisation au niveau du nerf optique. En revanche, nous souhaitons étudier en amont les mécanismes cellulaires à l'origine de la génération de nouveaux précurseurs oligodendrocytaires. Pour ce faire, nous nous focalisons sur la zone sous-ventriculaire chez la souris où sont concentrées les cellules souches neurales à l'origine des OPCs. Cette niche est parfaitement définie en terme de types cellulaires chez la souris, contrairement au xénope. De plus, la composition en lipides n'est pas connue chez le xénope alors qu'elle est parfaitement définie chez la souris. Or, nous voulons étudier l'influence d'une accumulation potentielle du perturbateur sur le profil lipidomique. Ceci nous pousse à explorer le lipidome chez la souris. Nous souhaitons ainsi étudier l'influence des perfluorés sur le choix du destin cellulaire des cellules souches neurales et a fortiori sur la génération des précuseurs oligodendrocytaires qui migrent ensuite dans le corps calleux où ils se différentient en oligodendrocytes myélinisants. Ce modèle in vivo nous permettra d'étudier l'impact des perfluorés sur toutes les étapes du lignage oligodendrocytaire, de la cellule souche à l'oligodendrocyte mature.

Réduction

Avec notre approche ex vivo précédemment décrite, nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés afin de répondre à notre question première, celle des effets des perfluorés sur la génération d'oligodendrocytes myélinisants et la remyélinisation. Désormais, nous devons valider in vivo chez la souris nos résultats car nos précédents modèles ex vivo ne nous permettent pas de répondre à la problématique de l'accumulation des perfluorés dans la substance blanche ni de ses conséquences sur la stabilité de la myéline. Nous avons volontairement restreint le nombre d'animaux utilisés dans ce projet afin de s'en tenir au strict minimum pour obtenir rapidement des résultats préliminaires qui devraient nous conforter dans notre hypothèse, à savoir que les PFOS, de part leur propriété hydrophobe et liposoluble, s’accumulent dans la gaine de myéline, structure riche en lipides. Ainsi, la membrane myélinique serait modifiée en sa composition lipidiques ce qui pourrait entraîner une déstabilisation de celle-ci, favorisant ainsi sa vulnérabilité. Au cours d’une précédente expérience, nous avons exposé des mères gestantes (de E15 à P21) à un autre perturbateur endocrinien, le bisphénol F. Les résultats ont mis en évidence qu’un nombre de 8 souriceaux par groupe était nécessaire et suffisant pour obtenir des données statistiques significatives et robustes. Dans l'actuelle procédure, nous estimons donc à 8 le nombre de souris par condition (contrôle versus PFOS). Trois expériences seront réalisées à l'issu de cette procédure, chacune composée de 8 animaux contrôlés et 8 animaux traités. Cependant, compte tenu que le nombre de petits par portée pour les souris C57bL/6 n'est pas prédictible à l'avance (en moyenne 5 à 6 petits), nous préférons envisager une marge de 20% pour le calcul du nombre de petits afinde pallier cette variabilité. Ainsi nous augmentons notre besoin à 10 souris P21 par groupe et donc 10 femelles gestantes, soit 70 animaux au total.

Raffinement

Les indicateurs comme la prostration, détectée par les animaliers ou par l’expérimentateur, l’absence d’alimentation (la diminution des quantités de nourriture disponible entre deux nourrissage est vérifiée par les animaliers), des symptômes apparents de gêne ou de douleur (irritations, grattement, léchage) ou enfin des troubles du comportement (agressivité, sur-léchage, agitation anormale ou hyperréactivité) sont particulièrement suivis. Dans le cas où un ou plusieurs des symptômes cités varie de manière significative, l’animal est dans un premier temps sorti de la procédure, et/ou euthanasié dans les cas les plus extrêmes. Une bonne maîtrise de la procédure et un suivi assidu des groupes expérimentaux doit prémunir de la survenue d’incidents de ce type. Comme déjà mentionné, nous ne nous attendons pas à un phénotype sévère. Cependant, il n'est pas à exclure que des cas isolés réagissent plus fortement au traitement. En particulier, pour les nouveaux-nés, une attention particulière sera portée au suivi hebdomadaire du poids. Tout signe d'atteinte du système nerveux central (inclinaison de la tête, spasmes, convulsions, troubles de l'équilibre) entraînera systématiquement le retrait de l'animal de la procédure et son euthanasie. Les femelles gestantes et en lactation seront placées par 2 ou 3 par cage. Elles ne seront donc pas isolées et garderont ainsi des contacts sociaux. De plus, les femelles pourront s’entraider durant la lactation et ce, jusqu’au sevrage des petits. Durant toute la durée du traitement (de E15 à P21), l’environnement des animaux sera enrichi à l’aide de papier kraft et d’une maisonnette en carton. Les femelles pourront également construire leur nid avec du coton.

Choix des espèces

Le modèle biologique choisi est la souris (Mus musculus). Ce choix est dicté par plusieurs raisons -théoriques : la souris étant l’espèce animale la plus étudiée en expérimentation animale, les connaissances accumulées par la communauté scientifique ont permis d’identifier de nombreux mécanismes physiologiques et comportementaux impliqués dans le maintien de la balance énergétique et le vieillissement. Par ailleurs, l’utilisation des outils de séquençage à haut débit a permis un assemblage complet du génome de la souris, constituant un outil essentiel dans la détermination des gènes impliqués dans les processus étudiés. Pratiques : étant de petite taille, la souris est un modèle facile à maintenir en animalerie, avec un taux de reproduction élevé. Par ailleurs, tous les protocoles utilisés dans les projets de recherche ont été optimisés pour la souris, avec un contrôle maximum des paramètres vitaux. La souche C57bL/6 est notre souche de référence. La procédure sera réalisée sur des souris à P21 afin d'étudier les effets à court terme d’une exposition périnatale à un perturbateur endrocrinien sur la physiologie de la myéline. 60 nouveau-nés sont prévus afin de réaliser trois analyses pilotes post-mortem faisant appel à des expériences d'immunohistochimie, d’imagerie par spectrométrie de masse et d'analyses lipidomiques par spectrométrie de masse après extraction de la myéline. De plus, la procédure fait appel à de jeunes femelles gestantes afin de générer les nouveau-nés impliqués dans la procédure. Au sein d’un même cage, deux à trois femelles gestantes seront exposées soit à l’eau de boisson standard soit à l’eau supplémentée avec le perturbateur. A P21, les animaux d’une même condition (contrôle versus traité) seront sexés puis divisés en 3 groupes (chaque groupe correspondant à une expérience). Pour chaque condition expérimentale, nous attendons 30 souriceaux. Ainsi, les 30 souriceaux issus des 5 femelles contrôle ou traitées seront mélangés et répartis en 3 groupes selon leur poids et leur développement, le but étant d’avoir trois groupes expérimentaux homogènes. Dans cette procédure, nous débuterons l’exposition des embryons à E15, juste avant que le système endocrinien du souriceau ne devienne autonome. Les souriceaux seront exposés jusqu’à P21, stade post-développemental où la myélinisation est maximale.

162 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Après un gavage initial de norovirus, elles subissent des prélèvements quotidiens de selles pour mesurer la charge virale et le rôle d'une protéine dans la propagation du virus. Le porteur indique que l'infection peut provoquer diarrhée, saignements et perte de poids, une diarrhée de quatre jours ou une perte de 20 % du poids déclenchant la mise à mort par dislocation cervicale. Il précise avoir mené des travaux préalables sur cellules et présente l'étape animale comme une analyse "intégrée" de la réponse immunitaire.

Objectifs

De nombreuses études suggèrent un rôle important joué par l’autophagie dans la dégradation de divers agents pathogènes. Nos données préliminaires indiquent que le norovirus est capable d’empêcher le bon déroulement de l’autophagie. Nous cherchons maintenant à comprendre comment il parveint à le faire. Ainsi, nous étudions plus précisément le rôle joué par une protéine cellulaire, Smurf1, dans l'evitement de la dégradation.

Bénéfices attendus

À travers l’étude du dialogue moléculaire entre la protéine cellulaire Smurf1 et la capside virale nous cherchons à comprendre comment le norovirus murin parvient à accroître sa survie à l'intérieur de la cellule infectée. Nos données préliminaires indiquent que le norovirus est capable d’empêcher le bon déroulement d'un mécanisme de dégradation. Notre projet nous permettera de mesurer l’impact de l’inactivation génétique de Smurf1 sur la charge virale. Une réduction de celle-ci dans les souris KO ouvriait la voie vers une nouvelle piste thérapeutique pour limiter la propagation des norovirus.

Procédures

Au début de l'expérience un gavage initial avec du PBS (condition contrôle) ou avec les différentes souches de norovirus sera réalisé. Ensuite, des prélèvements quotidiens de selles seront réalisés pour mesurer la charge virale.

Impact sur les animaux

Diarrhée, saignements, perte de poids excessive.

Devenir

A la fin de l'expérience les anaimaux seront euthanasiés par dislocation cervicale conformément aux régles éthiques en vigeur sur le sacrifice des animaux lors de procédures expérimentales. De même, au cours de l'expérience, si les points limites définis pour chaque procédure sont atteints pour éviter une détresse et une souffrance excessive des animaux, ils seront également euthanasiés par dislocation cervicale.

Remplacement

Nos expériences in vitro avec une lignée de macorphage avec Smurf1 transitoirement inactivé, puis celles avec les macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris KO vs WT nous ont permis de ne pas utiliser des animaux pour ces expériences prléiminaires. Nos futurs expériences in vivo permetteront de compléter ces études in vitro et de réaliser une analyse intégrée de la réponse immunitaire dans la prise en charge de l'infection norovirale.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux avec une puissance statistique suffisante, des lots de 6 souris seront utilisés. Ce nombre est justifié sur la base d’expériences préliminaires montrant la variabilité entre les souris et associant la dispersion des valeurs individuelles intra-groupes et la puissance des tests statistiques de comparaisons inter-groupes.

Raffinement

Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse ainsi que l’impact environnemental, les animaux seront observés quotidiennement par des personnes formées. Un suivi régulier du poids des animaux, de la consommation de nourriture et d'eau et de signe clinique mesurable (respiration...), sera réalisé. En parallèle, l’apparence physique externe de l’animal sera observée afin de déceler des signes de diarrhée, de perte de sang nous permettant de réaliser un score de sévérité de la maladie, ainsi qu'un éventuel changement de comportement et perte de réponse comportementale au stimulus externe. Une diarrhée prolongée sur 4 jours, des saignements répétés au delà de 3 jours avec selles sanginolantes et/ou saignements au niveau anal, ainsi qu'une perte de poids supérieur ou égale à 20% du poids initial nous améneront à euthanasier les animaux concernés. Nos expérinces se focaliseront sur les souches virales S99 et MNV-1 qui sont respectivement persistente et aigue. Par ailleurs, nos expériences in vitro montrent des réponses cellulaires (signalisation) différentes entre ces deux souches. Par conséquence nous chercherons à mesurer dans nos expériences in vivo si la pathogénécité de ces deux souches dans nos souris WT et Smurf1 Ko est également différente. La dose virale que nous utiliserons est de 10e7 PFU. Elle a été validée par des expériences précédentes. La durée totale des expériences in vivo n'excédera pas 21 jours. Nos expériences précédentes montrent des effets de l'infection precepetibles entre 7 et 14 jours dans les souris WT. Les effets dans les souris Ko devraient être du même ordre. Le délai de 14 à 21 jours devrait nous permettre de détecter un eventuel décalage dans le temps entre les souris WT et Ko. Les effets de l'infection sont mesurables via une perte de poids progressive accompagnée ou non de diahrrées ou de saignements liée à une activation de l'inflammation intestinale. Ces effets sont résorbés en quelques jours avec la résolution de la phase aigue de l'infection et la prise en charge du virus par le sytème immunitaire inné. Dans le cas contraire, si l'inflammation persiste ou s'aggrave avec un ou plusieurs points limites atteints les animaux concernés seront euthanasiés.

Choix des espèces

Le modèle animal ‘souris’ permet une analyse intégrée de la réponse immunitaire à l’infection norovirale. L’inactivation de Smurf1 nous permettra de comprendre plus particulièrement le rôle joué par celui-ci dans la clearance virale par autophagie. Les procédures seront réalisées sur des animaux âgés entre 6 et 12 semaines. Des expériences in vitro sur des cellules dérivées de souris WT ou KO nous ont permis d'établir cette fourchette d'âge. Les protocoles d'infection peuvent durer jusqu'à 3 semaines.

250 poissons, dentis et corbs, vont être utilisés dans des procédures déclarées de gravité légère, gardés vivants et remis dans leurs bassins d'élevage à l'issue. Sous anesthésie et hors de l'eau pendant une trentaine de secondes, chacun subit un prélèvement d'un morceau de nageoire caudale pour comparer la diversité génétique des poissons d'écloserie à celle des populations sauvages. Le porteur reconnaît qu'une mauvaise réaction à l'anesthésiant peut conduire à euthanasier un individu. Il présente ces géniteurs et juvéniles comme "nécessaires" à la production de la station aquacole, à laquelle ils sont réintégrés.

Objectifs

Ce projet, vise à étudier la diversité génétique d’un lot de juvéniles de Dentex dentex et d’un lot de juvéniles de Sciaena umbra (deux poissons marins côtiers) produits en captivité et de comparer cette diversité génétique à la diversité génétique actuelle des populations sauvages de la zone. L'objectif est de s'assurer que les juvéniles produits en écloserie ont une diversité génétique peu ou pas différente statistiquement de celle retrouvée dans le milieu naturel. En effet, ce projet a pour objectif d'être un contrôle génétique afin d'envisager des relâchés de lots d'élevage dans un but de restauration de la biodiversité naturelle. Et un des points essentiels à vérifier au préalable de potentiels relâchés en vue de restauration, est de ne pas impacter la diversité génétique naturelle afin de conserver le potentiel évolutif des populations sauvages. L'étude de la diversité génétique des deux lots de géniteurs (issus du milieu naturel ; de corb et de denti) sera également effectuée afin de s’assurer que la diversité génétique de ces géniteurs reflète bien la diversité génétique retrouvée dans les populations du milieu naturel. Ces résultats pourraient permettre la meilleure gestion des lots d’élevage étudiés pour un potentiel objectif futur de restauration de population. Ce projet s’inscrit au sein d’un programme à plus grande échelle, comprenant également en parallèle deux autres projets ayant pour but de tester l’efficacité de relâché d’individus produits en écloserie via leur capacité d’adaptation au milieu naturel et l’estimation de leur taux de survie mesurés in situ ainsi que via l’estimation de leurs performances comportementales mesurées en bassin afin de soutenir les populations naturelles de corb et de denti. En résumé, ce projet-ci (décrit ici), correspond au contrôle génétique nécessaire à prendre en compte afin de pouvoir envisager des relâchés de lots d’élevage dans un but de restauration. Il est bien évident que ces résultats seront mis en parallèle avec de futurs contrôles sanitaires (c'est-à-dire une vérification de l’absence de pathogènes et virus des lots relâchés dans ces relâchés expérimentaux sera également effectuée par un vétérinaire spécialisé).

Bénéfices attendus

Ce projet permettrait de conclure quant à la faisabilité de l’utilisation des lots de juvéniles issus de nos géniteurs dans un but de restauration de population. Ainsi, ces résultats pourraient permettre la meilleure gestion de nos lots d’élevage afin de ne pas impacter la diversité génétique naturelle pour un potentiel objectif futur de restauration de population.

Procédures

Les 25 géniteurs de Sciaena umbra et les 25 géniteurs de Dentex dentex seront soumis à une anesthésie dans le but d’effectuer un prélèvement individuel d’un petit morceau de nageoire caudale. De plus, 200 juvéniles au total (100 juvéniles de Sciaena umbra et 100 juvéniles de Dentex dentex) seront également utilisés dans ce projet en étant également soumis à une anesthésie dans le but d’effectuer un prélèvement individuel d’un petit morceau de nageoire caudale. Chaque prélèvement génétique s’effectuera individuellement et ne durera pas plus de 30 secondes où l’animal sera hors de l’eau. Puis il sera immédiatement transféré dans un bac de réveil fortement oxygéné.

Impact sur les animaux

Aucune nuisance n’est attendue sur les animaux. Cependant, une mauvaise réaction à l’anesthésiant lors de la session de prélèvement de tissu (respiration très lente et discontinue) n’est jamais à exclure ni à négliger. Ce type de réaction entraînera l’arrêt complet de l’intervention et une aide à la ventilation (mouvements lents favorisant la circulation de l’eau sur les branchies) sera pratiquée dans une eau claire sans anesthésiant. Les réponses post-traumatiques étant maximales de 60 à 90 minutes après le traumatisme, un non-retour à un état considéré comme normal entraînera une euthanasie par balnéation (anesthésie puis transfert pour euthanasie dans une solution de Benzocaïne à 1000 ppm). La mort de l’animal sera confirmée en lien avec l’absence de mouvements operculaires.

Devenir

A l’issue de la procédure unique, les individus seront gardés en vie et retrouveront leurs bassins d’élevage au cœur de la station de production aquacole. Les géniteurs sont en effet nécessaires à la production de la station aquacole et les juvéniles seront réintégrés dans le circuit d’élevage de la plateforme à des fins de production aquacole (qui est le cœur de la station aquacole, permettant un partage de technologies à des aquaculteurs locaux). Tous les individus repartiront ainsi dans leurs bassins d’élevage dans les mêmes conditions que précédemment (température, photopériode, salinité, densité, volume d’eau, etc.)

Remplacement

Il est impossible dans le cadre de ce protocole de remplacer ces espèces par un autre modèle, l’intérêt du projet étant justement d’étudier la génétique de ces deux espèces.

Réduction

L’effectif d’individus prélevés pour la mesure de la diversité génétique sur les juvéniles (soit n=100 juvéniles par espèce) a été calculé à partir de données d’expérimentations précédentes et de la littérature pour assurer une puissance statistique de détections suffisante avec des tests statistiques adaptés. Les deux lots de géniteurs (pour rappel, issus du milieu naturel) sont tous prélevés pour comparer la diversité génétique des lots de géniteurs avec celle des populations sauvages et ainsi voir si leur diversité génétique reflète bien la diversité génétique naturelle. Ainsi pour ces analyses-ci, 100 juvéniles par espèce ainsi que les 25 géniteurs denti et les 25 géniteurs de corbs (soit 250 individus au total) semble être un effectif nécessaire et suffisant pour l’exploitation de données concernant la diversité génétique des lots d’élevage.

Raffinement

Plusieurs procédures d'anesthésie générale, d’asepsie et de prélèvements optimales ont été mises en place dans le cadre des procédures pour limiter la souffrance et le stress des animaux. Avec, notamment, un dosage anesthésique fin permettant la minimisation du stress chez tous les individus et un réveil rapide, des prélèvements dans la partie la plus fine de la nageoire caudale et une désinfection systématique entre chaque individu. La totalité des prélèvements de tissu seront effectués sous anesthésie générale. Ce prélèvement s’effectuera hors de l’eau mais ne sera pas plus long que 30 secondes. Entre chaque prélèvement, le matériel de prélèvement (ciseaux chirurgicaux) sera désinfecté (Ethanol 96% NORMAPUR) afin d’éviter toute contamination (par exemple, bactérienne) de la zone incisée de l’animal (bientraitance) et afin d’éviter toute contamination biologique (ADN) entre les différents échantillons (concernant les résultats expérimentaux).

Choix des espèces

Ces deux espèces sont des espèces emblématiques de Méditerranée et sont également considérées comme des espèces trophées, induisant une diminution de leurs stocks naturels à cause d’une surexploitation par la pêche et d’une dégradation de leurs habitats. De meilleures connaissances concernant leur génétique liée à l’élevage pourraient être utilisées dans une optique de restauration dans un but de sauvegarde de ces espèces pour la biodiversité. Les individus produits en écloserie de Dentex dentex et de Sciaena umbra sur lesquels nous ferons les prélèvements (de nageoire caudale) sont des individus au stade juvénile. Il faut savoir que les génotypes individuels ne sont en aucun cas influencés par la taille ou le stade de développement des individus. Il sera donc préférable de prélever les échantillons biologiques sur des individus au stade juvénile plutôt que sur des larves. En effet, l’anesthésie de larves est trop complexe et incertaine : cela risquerait d’engendrer un fort taux de mortalité. Le stage juvénile est, lui, un stade pour lequel les individus sont bien plus robustes à l’anesthésie. De plus, grâce à une connaissance de plus en plus conséquente de ces deux espèces par l’équipe en charge de ce futur projet, les dosages anesthésiques pour ces deux espèces et pour des petites tailles de juvéniles sont maîtrisées et n’induisent aucune mortalité. Egalement, l’analyse de la diversité génétique du lot de géniteurs de Dentex dentex et de Sciaena umbra (individus issus du milieu naturel) permettra de vérifier que ces lots de géniteurs ont une diversité génétique représentative de la diversité génétique retrouvé dans le milieu naturel pour les deux espèces. Ainsi des prélèvements génétiques seront effectués sur les 2 lots de géniteurs : des individus adultes et matures sexuellement.

30 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, gardés vivants et replacés dans leur environnement d'étude à l'issue. Soumis à un régime gras, ils subissent cinq prélèvements de sang à la jugulaire et des prélèvements de selles, dont certains par écouvillon rectal ou isolement de vingt-quatre heures, pour tester un extrait végétal censé prévenir les troubles métaboliques du surpoids. Le porteur indique provoquer volontairement chez eux un surpoids et des désordres métaboliques, objet de l'étude. Il présente le chien comme l'espèce cible et affirme qu'il n'y a "absolument pas d'alternative" à son remplacement.

Objectifs

De nombreuses études ont révélé le rôle central de la dysbiose intestinale dans l’initiation et l’entretien des désordres associés aux maladies métaboliques (i.e. syndrome métabolique). Le premier objectif de ce projet sera d’explorer l’action prébiotique potentielle d'un extrait végétal standardisé (versus un composant majoritaire de l'extrait) et son impact sur le profil métabolique chez des chiens exposés à un régime hyperlipidique, par leur suivi clinique et biologique (analyse du microbiote intestinal, paramètres biochimiques, métaboliques). L’activité prébiotique potentielle de l’extrait végétal standardisé sera également évaluée en présence d’un probiotique spécifique, déjà développé et commercialisé chez le chien. Parmi les facteurs susceptibles de participer aux dérèglements métaboliques et inflammatoires, les protéines sirtuines, notamment les sirtuines 1 et 3, émergent comme des cibles potentielles pour des interventions nutritionnelles ou pharmacologiques. Les sirtuines, des désacétylases NAD- dépendante, sont des régulateurs importants de l’activité des protéines impliquées dans le métabolisme cellulaire et le contrôle de l’inflammation. Différents travaux ont démontré les effets positifs de la modulation des sirtuines 1 et 3 dans les maladies métaboliques et inflammatoires. Par exemple, la modulation des sirtuines 1 et 3 induit des effets bénéfiques sur les métabolismes (notamment glucidique) via partiellement le contrôle de l’inflammation (voie PPARs et le facteur NF-KB) et du stress oxydatif. Par conséquent, tout traitement visant à augmenter l’activité désacétylase des sirtuines 1 et 3 pourrait constituer une approche thérapeutique qui pourrait s’avérer très prometteuse. Le deuxième volet de ce projet sera consacré à explorer les effets de l’extrait végétal standardisé (versus un composant majoritaire de l'extrait) sur l’expression et l’activité des facteurs susceptibles de participer aux dérèglements métaboliques, oxydants et inflammatoires comme les sirtuines 1 et 3, les PPARs et le facteur NF-KB. Notre hypothèse est que la richesse de cet extrait végétal en flavonoïdes, en anthocyanines et en acides phénols, et surtout leur potentielle action synergique et/ou additive pourrait lui conférer une action anti-inflammatoire et régulatrice des métabolismes lipidique et glucidique plus efficace en impliquant notamment un rôle des sirtuines 1 et 3.

Bénéfices attendus

Notre hypothèse principale est que l’action synergique des composants majeurs (acides phénoliques, flavonoïdes, anthocyanes) de l’extrait végétal standardisé augmente la diversité microbienne, renforce la barrière épithéliale intestinale et améliore le profil métabolique en prévenant l’accumulation des graisses. Par ailleurs, une des stratégies visant à limiter ou réduire le processus inflammatoire associé au surpoids est également l’utilisation de probiotiques ayant la capacité de supprimer la production de facteurs pro-inflammatoires ou favoriser la synthèse de métabolites anti-inflammatoires comme les acides gras à chaîne courte (AGCC). Les protocoles mis en œuvre dans le cadre de ce projet devraient permettre de déterminer si l’extrait végétal standardisé étudié (comparativement à son principal principe actif) est apte à prévenir l’inflammation et les perturbations métaboliques associées au surpoids. Les composants de l'extrait végétal testé pourraient avoir une action synergique et/ou additive conférant une action anti-inflammatoire et régulatrice des métabolismes lipidiques et glucidiques plus efficace en impliquant notamment un rôle des sirtuines 1 et 3. Ce projet pourrait apporter la preuve de concept que l’intérêt thérapeutique de plante étudiée chez le chien ne dépend pas d’un principe actif mais d’une action synergique de ses principaux constituants. Ce projet pourrait également permettre de faire émerger chez le chien une nouvelle classe de produits thérapeutiques qui combine l’extrait bactérien et l’extrait standardisé végétal dans la prévention de l'inflammation et des dérèglements métaboliques associés au surpoids.

Procédures

3 interventions : 30 chiens suivront un régime hyperlipidique avec administration ou non d'une supplémentation en extrait végétal standardisé ou d'un composant majoritaire de l'extrait étudié avec ou sans un probiotique déjà développé chez le chien, 30 chiens auront des prélèvements sanguins, 5 fois sur une période de 3 mois avec un intervale de 2 semaines minimum ; 30 chiens auront des prélèvements de selles (4 fois). 1- Les prélèvements sanguins se feront au niveau de la veine jugulaire par une personne expérimentée. L'acte de prélèvement dure 2 minutes environ (contention par un tiers, rasage et désinfection du site de prélèvement). 2- Concernant les selles, deux approches de prélèvement seront envisagées : - Dans la première approche, les chiens doivent être individualisés. Ils seront maintenus en box individuel de 4m² durant 24h pour le recueil des selles destinées aux analyses du microbiote (équilibre des différents groupes et espèces d’intérêt). Cela sera répété 4 fois lors de l'étude efficacité. - Dans la deuximème approche, les selles seront recueillies sur animaux vigiles à partir d'un écouvillon (stérile) rectal. le chien est légèrement contenu, un écouvillon est délicatement introduit de 2 à 3 cm dans l'anus et tourné sur la paroi une dizaine de fois, puis retiré. L'animal est alors remis dans son box. Les deux mode de recueil des selles sont de nature légère. Dans le cas d'individualisation, les animaux seront isolés en box individuel mais avec un contact visuel avec leurs congénères. La méthode par écouvillonnage rectal permet de recueillir une petite quantité de selles qui devrait être suffisante pour l'analyse. L'objectif secondaire de ce mode de prélèvement est d’établir si les selles récoltées par ce biais sont représentatives du microbiote intestinal. Si c’était le cas, nous pourrions envisager de ne plus individusaliser pendant 24 h nos chiens pour le recueil des selles dans le cadre de l'étude du microbiote intestinal (dans le cadre de la règle des 3R, nous raffinerons ainsi notre procédure de recueil des selles).

Impact sur les animaux

Les animaux soumis au régime hyperlipidique vont développer des désordres métaboliques liés au surpoids, ce qui est l'objet de l'étude. Les traitements mis en oeuvre ont comme objectif d'atténuer les complications générées par le surpoids. Aucune nuisance n'est attendue de l'extrait standardisé étant reconnu pour ses vertus par la pharmacopée et déjà utilisé chez le chien, de même pour le probiotique utilisé. En cas de souffrance, l’animal sera mis en observation pour d’éventuels soins. Si la souffrance, pour des raisons inconnues, persiste, il sera exclu de l'étude.

Devenir

Les animaux sont replacés dans leur environnement d'étude après chaque procédure. Le comportement des animaux est surveillé après chaque procédure pour s'assurer de leur bonne santé.

Remplacement

Il s'agit de l'espèce cible des résultats du projet. Eu égard à la nature de ce projet (démonstration scientifique de l'efficacité et de la tolérance sur espèce cible), il n’y a absolument (et à l’évidence) pas d’alternative qui permettrait le remplacement le chien.

Réduction

Nous utilisons 6 chiens par groupes afin d'avoir un nombre suffisant pour pouvoir réaliser des tests statistiques pertinents et anticiper les différences interindividuelles pour répondre aux objectifs de l'étude. Le nombre de prélèvement étant répété sur chaque chien, cela permet de réduire leur nombre au minimum et d'avoir des données suffisantes pour répondre aux questions posées par une utilisation optimisée de ces dernières sur chaque animal.

Raffinement

L'hébergement respecte les recommandations en vigueurs chez les animaux de l'étude. L'enrichissement du milieu de vie est régulièrement amélioré (balade et moments en liberté, jeux...). Un suivi régulier des animaux est assurés par le personnel animalier (observation quotidienne de l’état général et du comportement, pesées hebdomadaires). La définition de points limites et une grille de scoring de la souffrance et/ou de la douleur sont mis en place chez tous les animaux soumis aux différents traitements prévus dans le projet. Les protocoles expérimentaux sont optimisés pour chaque procédure afin d’obtenir le maximum d’informations et ainsi une meilleure analyse des résultats obtenus.

Choix des espèces

Il s'agit de l'espèce cible des résultats du projet. Il n'y a donc pas d'alternative qui permettrait leur remplacement. Les chiens sont des adultes de 2 ans, en bonne santé et n'ayant pas reçu de traitement antibiotique ou tout autre traitement pouvant modifier le microbiote, depuis au moins 3 mois.