Procédures légères

800 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une injection de cellules souches humaines, avec pour certaines une incision au genou sous anesthésie, avant d'être tuées pour prélever les organes et suivre par PCR la migration des cellules. Le porteur indique que l'étude sert à constituer le dossier réglementaire préalable à un essai clinique chez l'humain. Il affirme que l'injection dans un modèle vivant est le seul moyen de tester la biodistribution de ces cellules.

Objectifs

Notre groupe travaille sur la mise au point d’approches de thérapies cellulaires pour apporter des solutions thérapeutiques dans le cas de maladies rhumatismales ou auto-immunes. Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) possèdent des propriétés anti-inflammatoires et régénératrices qui les rendent particulièrement intéressantes pour mettre en place un traitement de ces maladies. Ces CSM sont des cellules souches adultes isolées de différents tissus (moelle osseuse, tissue adipeux) dont la fonction principale est de régénérer les tissus malades ou détruits. Une des questions qui se posent est leur devenir après implantation in vivo en terme de survie et de migration vers différents organes. Evaluer leur biodistribution ou leur migration est aussi un pré-requis réglementaire pour la mise en place d’essais cliniques chez l’Homme. L’objectif de ce projet vise à évaluer la biodistribution des cellules stromales mésenchymateuses humaines (ou tout autre type de cellules humaines) et de leurs vésicules extracellulaires après injection chez la souris immunodéficiente.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer le devenir des cellules humaines après implantation dans des souris immunodéficientes, en termes de survie et de localisation/migration. Ces données sont importantes d’un point de vue fondamental afin de contribuer à la compréhension de l’effet d’un traitement cellulaire ou vésiculaire. Ces données sont nécessaires pour rédiger le dossier réglementaire qu’il faut soumettre aux agences réglementaires en vue de l’obtention d’une autorisation à réaliser un essai clinique chez l’homme.

Procédures

Les animaux recoivent des injections du traitement 1 fois à J0 (différentes voies d’administration possibles).

Impact sur les animaux

Les cellules stromales mésenchymateuses et leurs vésicules extracellulaires ont été déjà testées dans des expériences de bioditribution et aucun effet indésirable n’a été montré. Nuisance et effets indésirables : faibles. Les incisions au niveau cutanée pour les injections intra-articulaires sont réalisées sous anesthésie (

Devenir

L’ensemble des animaux sera euthanasié à l’issue des procédures pour permettre l’analyse du modèle expérimental et des traitements réalisés (prélèvements d’organes et tests PCR).

Remplacement

Avant de proposer une thérapie cellulaire chez l’homme, il est nécessaire d’évaluer la survie et la migration/biodistribution des cellules humaines ou de leurs vésicules extracellulaires dans un modèle pertinent in vivo. C’est le seul moyen de tester la biodistribution de ces cellules ou des vésicules.

Réduction

Nous nous sommes basés sur les données de la littérature pour déterminer le nombre de souris nécessaires à inclure dans chaque groupe expérimental. Nos études précédentes ont été réalisées sur 10 animaux /groupe. Nous utiliserons donc 10 souris par groupe expérimental. Nous réaliserons plusieurs groupes pour tester l’effet de la voie d’injection sur la biodistribution des cellules in vivo.

Raffinement

Enrichissement du milieu : Les animaux sont hébergés en portoirs ventilés dans une zone à statut sanitaire contrôlé. Aucun phénotype dommageable n’a jamais été observé. L’enrichissement du milieu consiste en l’apport de copeaux dans les litières et carrés de cellulose. Des igloos sont également installés dans les cages. Les animaux font l’objet d’un contrôle quotidien.

Choix des espèces

Ces expériences sont réalisées chez la souris car selon les recommendations internationales, les tests de biodistribution/pharmacocinétique doivent être réalisés dans une espèce animale chez laquelle le produit testé est biologiquement actif. Nous avons montré que les cellules humaines, tout comme les cellules murines, ont un effet thérapeutique dans des modèles murins de maladies rhumatismales ou auto-immunes. Des souris immunodéficientes ont été choisies pour permettre l’injection de cellules humaines en évitant une réponse immunitaire. Les animaux sont utilisés à semaine 6, âge de maturité des animaux.

3200 souris et 2500 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Une hyperpression oculaire leur est provoquée par instillation de produit ou injection sous la conjonctive, avant des mesures de pression, une imagerie et une électrophysiologie sous anesthésie sur environ quatre semaines, pour tester de nouvelles molécules contre le glaucome. Le porteur qualifie les complications de mineures, essentiellement une rougeur des conjonctives ou un trouble de la cornée, les animaux étant ensuite tués pour des analyses histologiques. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode ne permet de reproduire l'œil dans sa globalité fonctionnelle.

Objectifs

Le glaucome est une maladie grave et fréquente, le plus souvent indolore, qui touche principalement les personnes âgées de plus de quarante-cinq ans et peut entrainer une perte de la vision. Quatre-vingts millions d’individus sont atteints dans le monde, un million en France. L’hyperpression oculaire est la principale cause de glaucome. Ce projet a pour but d’utiliser des modèles expérimentaux de glaucome afin de tester l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques à diminuer cette hyperpression et à protéger les cellules rétiniennes permettant la vision. La pression à l’intérieur de l’œil (PIO) est due à un équilibre entre la production et l'élimination de l'humeur aqueuse (liquide transparent contenu dans l’œil), une méthode d’augmenter la PIO consiste à altérer l’évacuation de l’humeur aqueuse. Cette stragérie sera à la base de ce projet.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est de proposer un modèle expérimental pour évaluer l'efficacité de nouveaux traitements du glaucome et de l’augmentation de la PIO. La recherche de traitement est en constante évolution, pour intervenir à différents stades de la maladie et preserver au mieux la vision des patients.

Procédures

L'induction de la pathologie se fait par instillations de produit, ou par injections sous conjonctivales. La mesure de la pression intraoculaire, réalisée à l’aide d’un appareil spécialement conçu pour cet usage, est indolore et ne dure que quelques secondes. L'observation de l'oeil en lampe à fente n'est pas un acte inavasif et se fait sans anesthésie. Les examens effectués par la suite en imagerie ou en électrophysiologie pour étudier le fonctionnement des cellules de l’œil ainsi que certains traitements administrés par voie péri ou intraoculaire se font sous anesthésie générale afin d’immobiliser l’animal et de ne pas occasionner de stress pour celui-ci, chaque examen ne dure que quelque minutes puis l'animal est replacé dans son cadre d'hébergement habituel. Il est possible de réaliser des prélèvements de sang si besoin de doser le médicament administré ou tout autre marqueur. La durée de l'etude est d'environ quatre semaines.

Impact sur les animaux

Le but du produit choisi pour l’induction de la pathologie est d'agir en empêchant l'élimination correcte d'humeur aqueuse, liquide produit dans l'œil et normalement éliminé par une structure qu'on appelle le trabéculum. Les complications attendues sont mineures et sans conséquences à long terme pour l’animal. On attend essentiellement une rougeur des conjonctives due à l’inflammation locale des tissus, ou un trouble de la cornée.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure pour des analyses pour obtenir des informations au niveau tissulaure en histologie ou au niveau moléculaire en biochimie sur les mécanismes impliqués dans le glaucome et les effets des traitements testés.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’oeil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’oeil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse) de physiologie différente soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux compte tenu des particularités de l’organe concerné par le projet et l’absence de modèle alternatif.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est limité pour cependant rester adapté à l'analyse des résultats par des tests statistiques afin de permettre de conclure sur l'efficacité ou non d'un traitement. Une analyse de puissance (placé à 0,8) avec un calcul de l’effectif sera réalisé ce qui permettra d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. Des évaluations non invasives de la pathologie sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal. L'analyse des deux yeux sera effectuée chaque fois que possible afin de réduire le nombre d'animaux.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum, de l’enrichissement adapté (abri et morceaux de bois à ronger). Les examens non invasifs pour évaluer la pathologie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou en cabinet vétérinaire. Les examens de l'oeil qui requièrent un immobilisme de l'animal pourront être réalisés sous anesthésie pour son confort. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l‘établissement.

Choix des espèces

Les rongeurs ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’oeil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux d’hypertonie oculaire et de glaucome sont largement utilisés et décrits sur ces espèces. Les animaux seront de jeunes adultes âgés de minimum 3-4 semaines à l’arrivée dans notre animalerie, notamment pour le mode d’induction par instillation de corticoïdes. Des animaux jeunes sont plus sensibles aux corticoïdes au niveau oculaire.

231 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs gamètes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent deux injections hormonales à quarante-huit heures d'intervalle pour une stimulation ovarienne, certaines femelles âgées de plus de cinquante semaines étant choisies pour produire davantage d'embryons anormaux, afin de développer un microscope 3D évaluant la qualité des embryons en fécondation in vitro. Le porteur ne décrit comme atteinte que la préhension liée aux injections. Il affirme qu'aucun système in vitro ne fournit de gamètes matures et conclut à la nécessité de les prélever sur des souris.

Objectifs

L’un des principaux défis des laboratoires de fécondation in vitro est de sélectionner les embryons qui ont le plus grand potentiel de développement et d’implantation, afin de maximiser les chances d’une grossesse rapide. En effet, au cours du processus de fécondation in vitro de nombreux embryons sont arrêtés dans les divisions initiales ou après l’implantation, et même si les techniques d’imagerie récentes peuvent suivre la cinétique du développement embryonnaire, leur utilisation n’a pas vraiment amélioré les taux de grossesse ou défini des critères clairs pour identifier les meilleurs embryons. L’objectif de ce projet est de développer un microscope holographique neuronal en 3D innovant pour suivre le développement d’embryons vivants directement dans un incubateur. Notre dispositif mesurera les paramètres physiologiques originaux pour identifier de nouveaux marqueurs de la santé embryonnaire préimplantatoire des mammifères et ainsi identifier les embryons ayant les plus grandes chances d’implantation et de développement.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de proposer un nouveau microscope associé à une méthode d'analyse systématique et non invasive de la qualité embryonnaire. Les paramètres de qualité embryonnaire seront définis dans les 3 dimensions, ce qui ne peut etre actuellement visualiser sur les embryoscopes. D'un point de vue médical, seuls les embryons les plus prometteurs en terme de dévloppement pourront être sélectionnés en vue de leur implantation, favorisant ainsi les chances de grossesse.

Procédures

La stimulation hormonale des souris nécessitera l'injection des hormones par voie intra-péritonéale. La stimulation consiste en 2 injections à 48h d'intervalle.

Impact sur les animaux

La stimulation hormonale des souris nécessitera leur préhension.

Devenir

La récupération des gamètes nécessite leur mise à mort

Remplacement

L'étude du développement embryonnaire nécessite la génération des embryons par fécondation in vitro. Il n'existe aucun système de culture in vitro permettant d'obtenir des gamètes matures et fécondables (femelle) ou fécondantes (male). Il est donc nécessaire de récupérer ces gamètes sur des modèles murins ayant atteint leur maturité sexuelle.

Réduction

Le nombre minimal d'animaux sera utilisé dans chaque procédure tout en garantissant une étude statistique correcte. Lorsque les gamètes sont utilisées en fécondation in vitro, la stimulation hormonale des souris permet de récupérer un grand nombre d'ovocytes, cela permet de réduire le nombre de souris femelles.

Raffinement

Les souris seront placées en conditions de température régulée, eau et nourriture ad libitum. Afin de limiter l'angoisse et le stress, les souris sont hébergées à plusieurs par cage. Pour qu'elles puissent interargir avec leur environnement, faire leur nid et se cacher, des rouleaux et du papier sont ajoutés lors du change. Les animaux seront maintenus le moins de temps possible afin d'injecter les hormones nécessaires à la stimulation ovarienne. Le sacrifice des animaux sera effectué dans une pièce différente de celle de l'hébergement.

Choix des espèces

Les mécanismes de développement embryonnaire murins sont similaires à ceux de l'homme avec un temps de développement de 6 jours de la fécondation au blastocyste éclos. La souris est donc un modèle relevant pour notre étude. Les souris femelles seront utilisées à maturité sexuelle (6 semaines) et pas au delà de 12 semaines pour la récupération d'ovocytes. En effet, après 12 semaines, les souris répondent moins bien à la stimuation hormonale et le nombre d'ovocytes récoltés décroit. Les embryons murins sont naturellement moins aneuploides (l'aneuploidie est un nombre anormal de chromosomes dans les cellules). Afin de la favoriser, nous stimulerons des souris agées (>50 semaines) pour lesquelles le taux d'aneuploidie est supérieur d'environ 50 % par rapport aux souris jeunes (

6 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, trois conservés ensuite pour la reproduction et trois proposés à l'adoption. Déjà issus d'autres projets expérimentaux, ils reçoivent la pose d'un cathéter puis la perfusion d'une solution salée concentrée sur deux heures, quatre prises de sang, quatre prélèvements d'urine et une privation d'eau de seize heures, pour évaluer un dosage sanguin comme outil de diagnostic du diabète insipide canin. Le porteur indique qu'une légère déshydratation est envisageable, sans gravité chez des animaux sains. Il affirme que ce dosage ne peut être étudié qu'in vivo chez le chien et présente ce projet comme une première étape vers un test vétérinaire.

Objectifs

Le diabète insipide est un trouble endocrinien dû soit à un défaut de production de l'hormone anti-diurétique (ADH ou vasopressine) par le système nerveux central, soit à un défaut de sensibilité des reins à cette hormone. Dans le premier cas on parle de diabète insipide central, dans le second, de diabète insipide néphrogénique. Dans les deux cas cette maladie se manifeste par une forte production d'urine (très diluée) entraînant une forte consommation d'eau (polyuro-polydipsie), celles-ci étant anormalement diluées. En médecine vétérinaire, il est actuellement difficile de différencier ces deux types de diabètes insipides et une "polydipsie primaire" (augmentation de la prise de boisson sans raison médicale). Le test de référence pour diagnostiquer ces affections est le test de privation hydrique, qui peut s'avérer stressant, dangereux pour des animaux souffrant de diabète insipide, et d'interprétation souvent difficile. Le dosage de l'ADH est difficile, peu répandu, et cette hormone n'est stable que très peu de temps dans les échantillons ce qui rend son utilisation en routine peu réaliste. Depuis quelques années, le recours au dosage de la copeptine (un des peptides composant le précurseur de l'ADH, beaucoup plus stable que l'ADH elle-même) en médecine humaine apparait comme une alternative aux examens diagnostics précédemment cités. Le dosage de la copeptine plasmatique a été étudié précédemment afin d’établir un intervalle de référence chez des individus canins sains. L’objectif de ce projet est d’étudier l’intérêt du dosage de la copeptine pour l’exploration d’un syndrome de polyuro-polydipsie. Dans cette perspective, il s’agit d’observer l’évolution de la copeptine circulante chez des chiens sains à la suite d’une modification de la concentration sanguine en sodium par protocole de perfusion d'une solution de concentrée en sel dans un premier temps, puis à la suite d’un protocole de restriction hydrique modifié.

Bénéfices attendus

Dans le diagnostic d’un syndrome polyuro-polydipsique (= augmentation de la prise de boisson et de la production d'urine), après avoir écarté les causes les plus courantes par les examens biochimiques et d'imagerie, les hypothèses restantes sont le diabète insipide d'origine soit rénale soit cérébrale, et la potomanie (sensation de soif irrépressible). Le diagnostic entre ces trois affections repose sur un test de restriction hydrique modifié. En théorie, le dosage de l'hormone anti-diurétique permettrait de différencier plus aisément diabète insipide rénal, cérébral et potomanie. Cependant, l’hormone anti-diurétique est peu stable et son dosage imprécis ce qui rend son interprétation hasardeuse. Depuis quelques années, le dosage de la copeptine en médecine humaine apparait comme une alternative diagnostique pour les patients souffrant de diabète insipide. Il existe une bonne corrélarion entre la concentration en hormone anti-diurétique et celle en copeptine. De plus, cette dernière est stable plusieurs jours à température ambiante. Ce projet permettrait d’étudier l'évolution de la copeptine lors d'une deshydratation légère. Il s'agit d'une première étape dans l'évaluation du dosage de la copeptine comme outil diagnostique du diabète insipide en médecine vétérinaire.

Procédures

Les chiens seront soumis à : - Une pose de cathéter veineux suivie d'une perfusion lente sur deux heures d'un soluté hypertonique. - Quatre prises de sang - Quatre prélèvements d'urine

Impact sur les animaux

Une privation alimentaire et hydrique de 16 heures lors du protocole de restriction hydrique est comparable avec la restriction hydrique en amont d’une chirurgie. Une légère déshydratation est envisageable, sans gravité chez des animaux sains. Le protocole de perfusion a été employé dans une étude chez 11 chiens, et aucune complication n’a été constatée. Les deux prélevements de 10 mL de sang pour les analyses est sans risque pour un individu sain, il correspondent, cumulés, à environ 1% du volume sanguin d'un chien de 20 kg. Les prélèvements d'urine seront pratiqués par sondage urinaire, un geste courant et peu risqué.

Devenir

Certains animaux utilisés dans cette procédure sont des chiens reproducteurs qui seront donc conservés pour cette raison. Les autres chiens pourront être proposés à l'adoption.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’étudier le dosage de la copeptine chez le chien, en fonction de variations de l'osmolarité (concentration en ions) plasmatique. Cela ne pourrait donc pas être modélisé autrement qu'in vivo chez le chien.

Réduction

Les chiens qui participeront à ce projet seront des chiens issus d'autres projets expérimentaux, qui seront réutilisés dans ce projet avant d'être mis à l'adoption ou conservés pour de la reproduction. Le même groupe d'individus sera soumis au protocole de perfusion puis au protocole de restriction hydrique. Le recours au même groupe permet de réduire de moitié le nombre d’animaux prévu pour ce projet. Pour s’assurer de l’indépendance de résultats des deux protocoles, une semaine de repos sans aucune procédure expérimentale sera mise en place entre le premier et le second protocole.

Raffinement

Les gestes techniques (prises de sang, poses de cathéter, perfusion, prélèvements d'urine) seront effectués par des personnels formés et pratiquant couramment ce type de geste. Pour chacun des gestes pratiqués, une attention particulière sera portée au confort de l'animal, et le temps nécessaire sera pris pour rassurer le chien. Après chaque geste technique, le chien sera félicité par la voix et des caresses. A la fin de chacun des protocoles, une friandise sera donnée à chacun des chiens.

Choix des espèces

S'agissant de mettre au point un test diagnostique pour des chiens, le projet sera mené dans cette espèce. L’intervalle de confiance de la concentration plasmatique de la copeptine a été établie chez des individus aldultes, aussi dans l’hypothèse où l’âge pourrait jouer un rôle de confusion, l’intégralité des animaux choisis seront des adultes de plus de deux ans.

90 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent une injection de vecteur de thérapie génique dans une veine, puis des prises de sang chaque semaine pendant six mois et des examens cardiaques mensuels, pour vérifier si ce traitement d'une maladie du foie provoque des effets sur le cœur. Le porteur indique ne pas attendre d'effet indésirable mais surveiller infarctus et troubles du rythme éventuels. Il affirme que tester la fonction cardiaque impose un animal vivant.

Objectifs

Notre projet a pour but de développer des solutions thérapeutiques pour patients atteints de glycogénose de type 1A (GSD1A), due à des mutations de la sous-unité catalytique de la glucose-6-phosphate (G6pc). La G6pc permet de fournir de l’énergie à tout l’organisme (sous forme de glucose) et de maintenir la glycémie lors d’un jeûne. La technologie de transfert de gène consiste à introduire un gène médicament dans les cellules malades cibles via un vecteur. Il existe plusieurs types de vecteurs, dont les vecteurs dérivés des virus adéno-associés (AAV) qui sont aujourd’hui les plus utilisés et les plus prometteurs pour cibler le foie. Plusieurs équipes dont la nôtre ont déjà démontré l’efficacité de ce type de stratégie dans un modèle murin de la GSD1A (en cours de publication). Dans ce projet, nous voulons explorer l’expression de la G6pc dans le cœur et les conséquences sur la fonction cardiaque. En effet, l’AAV apporte la protéine G6pc dans le cœur, alors qu’il n’y est pas exprimé naturellement. L’expression cardiaque de la G6pc pourrait induire une surcharge en glucose. Or, il est connu que la surcharge en glucose conduit à une toxicité responsable de cardiomyopathies diabétiques. Afin de poursuivre le développement de notre produit, le projet présenté ici a pour but d’évaluer l’expression d’un ensemble de biomarqueurs tissulaires et fonctionnels permettant de détecter tous les signes de complications cardiaques. Nous utiliserons des rats, mâles et femelles, de 4 à 6 semaines.

Bénéfices attendus

La GSD1A touche 1 naissance sur 100 000 chaque année. Il n’y a à ce jour aucun traitement curatif sur le marché. Notre but est de développer une thérapie génique efficace pour traiter ces patients. Dans nos études chez le modèle murin de la GSD1A, nous avons mis en évidence une correction de la glycémie (les hypoglycémies sont les principales causes de décès chez les patients) et une diminution de la fréquence d’apparition des tumeurs grâce à notre vecteur AAV. Afin de poursuivre le développement de notre produit vers la clinique, nous devons déterminer s’il peut entraîner des effets indésirables dans le cœur. En effet, l’AAV est capable d’apporter la G6pc dans le cœur, or, cette protéine n’y est pas exprimée naturellement. Ces études nous permettront donc de déterminer si nos vecteurs AAV conduisent à l’apparition d’effets cardiaques indésirables.

Procédures

Tous les animaux seront injectés sous anesthésie gazeuse avec des vecteurs AAV au niveau de la veine caudale. Tous les animaux seront prélevés en sang, sous anesthésie gazeuse ou sur animal vigile selon le site de prélèvement, toutes les semaines pendant 6 mois. Les sites de prélèvements seront alternés (veine caudale, veine sous-mandibulaire droite ou gauche et veine rétro-orbitale droite ou gauche sous anesthésie). L’activité cardiaque sera mesurée mensuellement par électrocardiogramme sur animal vigile, et par échocardiogramme sur animal endormi par anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

Lors nos études précédentes chez la souris, nous n’avons pas observé d’effet indésirable, cardiaque ou autre, ni de surmortalité chez les groupes traités par AAV. Nous ne nous attendons pas à une mortalité supérieure chez les rats traités par AAV. Néanmoins, ces complications cardiaques, si elles survenaient, pourraient être de trois types : infarctus (fibrose cardiaque), cardiomyopathie (hypertrophique ou dilatée) ou troubles primaires du rythme.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

L’utilisation d’animaux n’est pas remplaçable pour réaliser cette étude car (1) il faut tester la fonction cardiaque sur animal vivant ; (2) il est nécessaire de tester nos produits sur un corps entier pour observer les effets simultanés sur le foie et sur le cœur ; et (3) il faut obtenir des fluides (sang, urine) pour mesurer les biomarqueurs.

Réduction

Afin d’utiliser un minimum d’animaux, nous avons utilisé une approche statistique nous permettant de définir le nombre minimum d’animaux nécessaires pour obtenir un résultat significatif nous permettant de répondre aux problématiques posée. Ce nombre minimum est respectée pour chaque procédure.

Raffinement

La taille des cages devrait permettre aux rats de démontrer des comportements importants pour leur qualité de vie : ils seront hébergés par 2 ou 3 individus (selon leur poids) de même âge, favorisant les comportements normaux de l’espèce, comme le jeu et les relations sociales (Pellis et coll., 2010). L’enrichissement des cages avec des éléments tels que des aménagements pour favoriser l’activité physique (structures pour grimper) ou se cacher / éviter le contact (tubes, séparateur), des matières pour permettre de creuser, des objets à mâcher (blocs en bois) etc… devraient limiter le stress des animaux, les rendre moins craintifs et moins agressifs et favoriser leur bien-être général (Botelho et coll., 2007; Patterson-Kane et coll., 1999). Dès leur arrivée en zone d'expérimentation (2 semaines avant le début des traitements), les rats seront manipulés et contentionnés au moins 3 fois avant le début de la procédure, afin d’être familiarisés aux expérimentateurs et aux gestes expérimentaux. Le rat étant très sensible au stress, cette habituation est importante. Ceci devrait réduire stress et angoisse. Avant chaque intervention, l’identification de l’animal doit être vérifiée et son état général observé avec attention. Les informations pertinentes pourront alors être notifiées sur une fiche d'évaluation. En effet, l'évaluation du comportement de l'animal et de ses signes cliniques doit être réalisée de manière minutieuse afin de détecter tout changement ou signes d'inconfort de stress ou de douleur. Après intervention, une surveillance minutieuse sera mise en place pour garantir que l’animal récupère pleinement de l’acte réalisé.

Choix des espèces

Les rats de type sauvage ont été choisis comme animaux modèles car ce modèle est plus sensible aux éventuels effets secondaires cardiaques que les modèles de souris (meilleure entrée du vecteur dans le cœur de rats que dans le cœur de souris). De plus, nous regardons l’expression supraphysiologique d’une protéine et ses conséquences au niveau cardiaque, nous n’avons donc pas besoin de rats modèles de la pathologie. Nous allons utiliser de jeunes rats et des rats adultes pour cette étude (4 et 6 semaines) Ce choix est basé sur trois considérations : 1) Nous souhaitons traiter de jeûnes adultes et des adultes lors des essais cliniques, nous voulons utiliser une population de rats « mimant » cet âge. 2) L’utilisation de rats de 4 ou 6 semaines nous permettra par comparaison d’évaluer l’effet de notre produit sur un cœur en développement. 3) Le foie est un tissu en forte croissance lors des premières semaines de vie chez le rongeur, entraînant ainsi une dilution du génome de l’AAV dans les hépatocytes ce qui a pour conséquence de réduire son efficacité au cours du temps, nous souhaitons donc minimiser cet effet en utilisant des rats dont le foie est suffisamment développé pour que la prolifération soit modérée. Selon les études précédentes réalisées au sein du laboratoire, des animaux de plus de 4 semaines peuvent être inclus.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles courent sur un tapis roulant motorisé dix minutes par jour pendant quatre jours, et une partie reçoit une injection de fixateur sous anesthésie, pour mesurer l'effet d'une protéine sur l'activité motrice et le fonctionnement des mitochondries. Le porteur indique que le tapis peut provoquer un léger stress et de la fatigue. Il conduit une partie du projet sur des cellules in vitro et réserve l'animal aux tests d'effort et aux analyses de tissus.

Objectifs

Dans le cadre de notre projet nous nous intéressons à une famille de protéine, dont un membre de la famille est responsable d’une maladie mitochondriale caractérisée par des atteintes neuromusculaires sévères. A ce jour, les causes de cette pathologie sont inconnues. Récemment, nous avons montré que des homologues de cette protéine possèdent la même fonction dans la régulation du métabolisme énergétique et nous avons donc mis en évidence un mécanisme original pouvant expliquer l’atteinte mitochondriale observée chez les patients. Afin de confirmer que ce mécanisme est bien à la base de la pathologie et de la régulation du métabolisme énergétique, nous voulons étudier le rôle d’un des membres de cette famille de protéines selon 3 axes : 1-Tester l’impact de la protéine sur l’activité motrice de la souris puisque les attentes énergétiques engendrent des déficits musculaires et une intolérance à l’effort. Pour cela, nous souhaitons mesurer la vitesse roulant motorisé et l’endurance des souris à l’aide d’un tapis de course. La vitesse du tapis sera progressivement augmentée et l’activité locomotrice de l’animal sera monitorée grâce à une caméra hautes fréquences. 2-Nous voulons mesurer l’atteinte énergétiques au niveau des tissus par des tests biochimiques. 3- nous voulons voir les défauts d’organisation et de morphologie des usines énergétiques des tissus, les mitochondries) par des analyses histologiques.

Bénéfices attendus

La mitochondrie sont les usines de production d’énergie dans les tissues et elles sont donc nécessaire au bon fonctionnement des différents organes chez l’homme. Des déficits mitochondriaux induisent des pathologies sévères. A l’heure actuelle, plus de 120 syndromes mitochondriaux ont été décrits pour lesquels aucun traitement n’existe. Aussi, il est nécessaire de comprendre quelles sont les causes cellulaires de ces pathologies. Notre projet se place dans ce cadre. Nous souhaitons comprendre le rôle important joué par une famille de protéines dans la production énergétique. La protéine que nous étudions dans ce projet fait partie d’une famille de protéines dont certains membres sont responsables de syndromes mitochondriaux et dont la fonction reste inconnue. A court terme, en comprenant le mode d’action et l’impact de notre protéine sur la mitochondrie, notre projet permettra d’établir les causes des pathologies mitochondriales associées à cette famille et cela permettra de développer des traitements pour ces pathologies à plus long terme.

Procédures

Concernant, les tests d'effort, les animaux seront placés sur un tapis roulant motorisé pour une durée maximale de 10 minutes pendant 4 jours consecutifs. De plus, 40 animaux seront soumis a une injection unique de fixateur de tissus. Ces injections se feront sur des animaux anesthésiés. Au total, cette intervention dure 15 minutes au total.

Impact sur les animaux

Le versant comportemental de notre étude est basé sur une analyse de la marche sur tapis roulant. Ce test peut engendré un stress leger chez l'animal du à la découverte de l appareillage. Ces tests de efforts pouvent engendrés de la fatigue physique. Pour ce qui est de la perfusion intracardiaque, la procédure réalisée sur animal anesthésié suit les normes et pratiques en vigueur.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort afin de réaliser des analyses biochimiques et histologiques sur les tissus en postmortem.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet, nous combinons l’utilisation de modèles in vitro et animaux. L’utilisation des modèles animaux est limitée aux études qui ne peuvent être conduites sur les modèles in vitro. Ainsi, les tests d'effort locomoteur (sur tapis roulant) et les analyses biochimiques, morphologiques et structurelles des tissus sont des impératifs incontournables de notre projet qui, en l'état des connaissances et des méthodes disponibles, ne peuvent pas s'affranchir de l'utilisation d'un modèle animal. En revanche, les investigations des mécanismes cellulaires et des voies de signalisation sont développées sur des modèles cellulaires in vitro.

Réduction

D'un point de vue général, nous réalisons une grande partie de notre projet sur des modèles cellulaires in vitro et limitons autant que possible les approches expérimentales réalisées sur l'animal. Ces dernières sont uniquement destinées à valider/confirmer l'implication des processus révélés in vitro au niveau de l’organisme. Pour notre projet, nous avons procédé à une réflexion pour déterminer le nombre d’animaux par groupe. Nous avons établi strictement le nombre d’animaux nécessaire. Afin de limiter l'utilisation d'animaux, les tests biochimiques (20 animaux) et histologiques (40 animaux) seront effectués à partir des tissus collectés sur les animaux évalués sur tapis roulant (60 animaux). Cette approche combinée permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire à la réalisation du projet.

Raffinement

Nos souris seront hébergées dans une animalerie conventionnelle, au sein de laquelle le bien-être et la santé des animaux sont suivis quotidiennement, permettant de détecter toute anomalie physique ou comportementale potentiellement révélatrice de signes cliniques. Les animaux sont hébergés en cages collectives dans les conditions les mieux adaptées au modèle murin. Nos animaux sont hébergés en présence de raffinement spécifique permettant la création de nids (important pour les femelles gestantes et allaitantes) des tunnels en carton, qui leur servent à se cacher et à jouer. Dans le ,cadre spécifique de la procédure du projet, nous avons inclus une étape préalable d’habituation aux appareillages afin de limiter le stress et l'anxiété des animaux. Nous avons également établi des points limites objectifs et précoces permettant de mettre fin à toute procédure le cas échéant, et appliquons systématiquement un traitement analgésique et des mesures de soins lorsque nécessaire. L’ensemble des procédures est encadré et mis en oeuvre par du personnel dument formé et habilité aux méthodologies utilisées et au bien-être animal.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des animaux adultes âgés de 10 à 14 semaines. A cette période, les souris sont adultes et présentent la capacité d’activité élevée. Ainsi, il est plus facile d’observer des différences entre les phénotypes, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés.