Procédures légères

432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections d'un composé (tamoxifène) cinq jours de suite, avant prélèvement du cerveau, pour étudier le rôle d'une protéine dans les cellules immunitaires du cerveau. Le porteur décrit l'inconfort comme lié aux injections répétées, sans détailler d'autre suivi que le poids et un scorage de posture et de toilettage. Il s'agit d'une recherche fondamentale dont les bénéfices annoncés restent la connaissance générale et une cible pharmacologique "potentielle".

Objectifs

Les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central façonnent les réseaux de neurones au cours du développement. Chez l’adulte elles participent à la surveillance et l’entretien du cerveaux en éliminant les cellules mortes ou inutiles. Dans le cerveau sain, les cellules immunitaires ont une morphologie complexe caractérisée par des prolongements ramifiés en perpétuelles mouvements. Ces mouvements sont importants car grâce à eux les cellules peuvent explorer le cerveau à la recherche de dysfonctionnements. Il se trouve que dans la plupart des pathologies du cerveau le mouvement de ces prolongements s’arrêtent et il est difficile de savoir si l’arrêt de ces mouvements est une cause ou une conséquence de la pathologie. De plus les mécanismes cellulaires contrôlant ces mouvements sont pour la plupart inconnus. Il est donc important de comprendre le fonctionnement de ces mouvements et leur rôle exact pour mieux comprendre leurs impacts sur les pathologies du cerveau. Nous avons identifié une molécule exprimée par ces cellules immunitaires qui pourrait être impliquées dans ces mouvements, nous proposons de la supprimer pour étudier les effets sur le fonctionnement des cellules et la réponse cellulaire lors d’une inflammation mimant une pathologie. Ce projet a deux objectifs principaux. 1) Caractériser le rôle de cette protéine dans la physiologie des cellules immunitaires du cerveau. 2) Etudier les répercussions de l’invalidation de la protéine sur la neuro-inflammation, et le fonctionnement du cerveau. Ces expériences nous permettront de mieux comprendre la fonction de cette protéine mais également de d’appréhender le rôle que jouent les cellules immunitaires aux cours des pathologies du système nerveux central.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’un projet de recherche fondamentale dont les résultats bénéficieront à la connaissance générale du système nerveux central tant chez l’homme que l’animal, et permettront de mieux comprendre les interactions entre le système nerveux central et le système immunitaire. Les résultats attendus de cette recherche permettront de mieux comprendre les processus cellulaires conduisant aux pathologies neurodégénératives du système nerveux central et aux troubles engendrés par l’auto-immunité. Il permettra surtout de mieux comprendre les voies de signalisations associées à notre protéine d’intérêt et d’en faire une potentielle cible pharmacologique.

Procédures

Une Injections IP de tamoxifene sur 5 jours consécutifs/ animal. Chaque injection se fait en 30 secondes max/animal. Prélèvement de tissus sur des animaux morts (432).

Impact sur les animaux

Inconfort lié à l’injection répétée de tamoxifène

Devenir

Mise à mort pour récolter les tissus et faire des analyses morphologique et transcriptomiques

Remplacement

Il s’agit d’un projet de recherche fondamental visant à étudier le rôle d’une protéine jusqu’alors inconnue. Les expériences réalisées dans ce projet ne peuvent donc pas être modélisées. Nous travaillons sur des cultures de cellules primaires provenant d’animaux nouveaux nés ou réaliserons des études histologiques sur des cerveaux de souris pour obtenir nos données.

Réduction

Les lots et procédures ont été élaborés de manière à optimiser les groupes contrôles et à éviter la redondance. Les effectifs ont été déterminés à l’aide d’un test statistique de puissance. La significativité sera déterminée à l’aide de test ANOVA ou non paramétrique si la normalité des échantillons n’est pas obtenue. Il s’agit de travaux originaux jamais réalisés à notre connaissance dans la littérature.

Raffinement

Afin de limiter le nombre d’expériences et l’inconfort lié aux expériences in vivo, nous avons développé un modèle de culture dans lequel la morphologie de nos cellules d’intérêt est préservée. Ceci nous permettra de limiter l’utilisation de souris entière pour réaliser nos expériences. De façon générale le bien-être des animaux sera évalué de façon quotidienne. Les souris seront observées dans leurs cages pendant plusieurs minutes puis pesées. L’évaluation se fera selon un scorage établi (posture, poids, toilettage) de sorte à identifier les points limites.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle car couramment utilisée au laboratoire. Les souris permettent d’avoir recours à des animaux transgéniques. Il existe une abondante littérature sur le fonctionnement synaptique chez la souris ce qui évitera de reproduire certaines expériences pour valider notre modèle. Pour la culture cellulaire les animaux seront âgés de 2 à 5 jours lors des injections stomacales de tamoxifène et de 10 jours lors de la mise en culture. Cet âge permet d’obtenir une résistance suffisante aux conditions d’hypoxie et d’ischémie des cellules rencontrées lors de la mise en culture et une maturation suffisamment avancée pour obtenir des cellules ramifiées. Les expérimentations in vivo seront réalisées sur des animaux adultes âgés de 6-10 semaines.

192 rats transgéniques HLA-B27 vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent des prélèvements de sang par voie rétro-orbitaire sous anesthésie tous les sept jours jusqu'à J63, pour tester des inhibiteurs d'ERAP contre des maladies auto-immunes comme la spondylarthrite ankylosante. Le porteur indique que l'inflammation de ce modèle reste légère et transitoire, ce qui l'amène à ne prévoir ni analgésique ni anti-inflammatoire. Il présente ces maladies comme relevant d'un fort "besoin médical" et le rat transgénique comme un modèle de référence.

Objectifs

Les ERAPs sont des cibles thérapeutiques intéressantes pour traiter les maladies auto-immunes et auto-inflammatoires. Les ERAP 1 et 2 sont des amino-peptidases intracellulaires (métalloprotéases) chargées de la transformation finale des antigènes peptidiques pour présentation par les molécules du CMH de classe I. Ils régulent ainsi la réponse immunitaire adaptative par les lymphocytes T cytotoxiques (LcT) et affectent l'immunodominance en impactant le répertoire peptidique global présenté par le CMH-I. Ces enzymes ont beaucoup attiré l'attention depuis la première découverte d'ERAP1, puis d'ERAP2. Les enzymes ERAP ont des rôles complémentaires et des fonctions importantes in vivo. Un certain nombre d'haplotypes ERAP sont liés au risque de souffrir de diverses maladies auto-immunes ou auto-inflammatoires, notamment le diabète de type 1 (T1D), la spondylarthrite ankylosante (SA), le psoriasis, la maladie rare de Behçet (BD) et l'uvéite de Birdshot (BU). Plusieurs études (voir état de l'art) ont révélé comment les ERAP modulent l'immunopeptidome dans différents contextes pathologiques. Un obstacle scientifique est la disponibilité de petites molécules inhibitrices d'ERAP efficaces, sélectives et biodisponibles. Aucun inhibiteur d'ERAP n'a été évalué in vivo jusqu'à présent et les rapports sur la modulation de l'immunopeptidome par les composés ERAP ne sont pas disponibles. L'objectif du projet est d'identifier des inhibiteurs pharmacologiques d’ERAP à travers méthodes intégrés de chimie médicinale (du criblage fonctionnel de la présentation de l'antigène combiné au profilage des immunopeptidomes dans les cellules des patients) et l’évaluation préclinique de leur efficacité thérapeutique dans un modèle de rat transgénique HLAB-27. Ce modèle présente une maladie inflammatoire multi-systémique avec un phénotype proche de la clinique des spondylarthropathies humaines, des arthrites réactives et autres maladies. La susceptibilité génétique des rats transgéniques exprimant l’allèle HLA-B27/β2-microglobuline humaine en fait un modèle de choix pour cet objectif.

Bénéfices attendus

Ce projet et les composés identifiés pourraient ouvrir la voie à des traitements personnalisés des maladies auto-immunes/auto-inflammatoires. A terme, nous souhaitons proposer de nouvelles options thérapeutiques pour la spondylarthrite ankylosante et la maladie de Behçet qui sont des maladies à fort besoin médical.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins réalisés en rétro-orbitaire, à partir de J0 et chaque 7 jours après le début du protocole de traitement, jusqu'au sacrifice (J63). Ces prélèvements seront effectués sous anesthésie gazeuse à l'isofluorane 2%. Le volume maximal prélevé sera égal à 500μL. Pour chaque rat, le prélèvement sanguin durera au maximum 5 minutes, y compris la durée de l'anesthésie

Impact sur les animaux

Le rat transgénique HLA-B27 présente une maladie inflammatoire multisystémique avec un phénotype proche de la clinique des spondylarthropathies humaines, des arthrites réactives, et autres maladies. L'apparition et la sévérité des symptômes inflammatoires chez le rat HLA-B27 sont liées à l'environnement extérieur (le microbiote intestinal pathogène est responsable des lésions inflammatoires plus sévères). L'état sanitaire de l'animalerie centrale de l'Institut Pasteur de Lille prévoit un élevage sans pathogènes. Dans ces conditions, notre cohorte de rats HLA-B27 présente des formes légères d'inflammation multisystémique, c'est pourquoi l'utilisation d'analgésiques ou d'anti-inflammatoires n'est pas envisagée. L'inflammation intestinale, ainsi que les douleurs articulaires apparaissent dès la 10ème semaine de vie mais surviennent de manière ponctuelle, discontinue et transitoire (d'une durée variable d'un ou deux jours) et se manifestent, respectivement, par des diarrhées, sans perte de poids et par des douleurs d'articulations, touchant les membres inférieurs, uni ou bilatérale. L'uvéite se manifeste aussi de façon ponctuelle et transitoire avec un dégrée de sévérité très limité. Concernant les molécules candidates qui seront administrés, leur toxicité est préalablement testée par la plateforme ADME de l'institut Pasteur de Lille et leur administration tiendra compte des études de toxicité et de pharmacodynamique afin de ne pas avoir d'effets indésirables qui pourraient interférer avec les résultats de l'expérimentation.

Devenir

A l'issue de la procedure tous les animeaux seront euthanasiés

Remplacement

Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, le criblage d'une série d'inhibiteurs d'ERAP1/2 préalablement modélisés et synthétisés par l'équipe partenaire (Deprez) sera réalisé sur des modèles cellulaires par la plate-forme ADME de l'Institut Pasteur de Lille (incluse dans l'Infrastructure Nationale ChembioFrance), par quantification LCMS-MS. De plus une évaluation de la sécurité sera exprimée sous la forme d'un rapport IC50 et CC50 (test cellulaire à haut contenu d'apoptose ou de nécrose (Caspase-3/7 activité Propidium iodure) et évalué la plateforme Equipex Imaginex. Les inhibiteurs candidats seront préalablement testés par des expériences de pharmacodynamiques afin de garantir une exposition et une voie optimale avant les tests chez les rats HLA-B27.

Réduction

Dans le respect des règles des 3R, le nombre minimum d'animaux sera utilisé pour garantir une analyse statistique correcte prenant également en compte la variabilité de l'expression des gènes. Les paramètres mesurés seront analysés par des tests non-paramétriques pour petits échantillons (tests de Kruskal Wallis, Wilcoxon, Mann-Whitney, et corrélation de Spearman). Le nombre d’animaux par groupe est de n = 8, qui est calculé sur la base de la puissance statistique des tests utilisés (intégrant la dispersion des valeurs individuelles, déterminés auprès de la littérature et suite à des expériences pilotes).

Raffinement

Tout rongeur montrant des signes de douleur ou de mal-être sera euthanasié. Les animaux sont observés et pesés d’une manière quotidienne pour une attention particulière aux points limites suivants: -une modification du comportement (prostration, poils hérissés, cris, blessure) -une perte de poids supérieur à 15%. Le suivi quotidien de l'état de santé des rats permettra d'observer l'apparition et l'évolution des manifestations inflammatoires typiques de ce modèle (uvéite, orchite, douleurs articulaires). Le modèle de rat HLA-B27 est maitrisé au laboratoire depuis plusieurs années et nous avons pu observer que ces types de manifestations inflammatoires sont transitoires (d'une durée maximale d'un ou deux jours) et souvent extrêmement légères et ne sont pas prises en compte comme points limites.

Choix des espèces

Le rat transgénique HLA-B27/β2-microglobuline est, à ce jour, considéré comme un modèle animal de référence des maladies inflammatoires systémiques. Caractérisé par un faible nombre de copies de HLA-B27 et une expression transgénique élevée de la β2-microglobuline humaine, le rat HLA-B27 présente une forte ressemblance clinique et histologique avec les spondylarthropathies humaines, avec arthrite réactive, rhumatisme psoriasique, inflammation articulaire périphérique et axiale, uvéite et l'iritis. Chez l'homme, ces maladies sont fortement associées à l'allèle HLA-B27. Les bases moléculaires de la maladie inflammatoire multisystémique chez les rats HLA-B27 résident principalement dans le stress du réticulum endoplasmique (RE) généré par le mauvais repliement des chaînes lourdes de HLA-B27 avant leur association avec ß2m, avec une accumulation conséquente dans le RE induisant l'activation de la réponse protéique dépliée (UPR), en particulier dans les macrophages. Ces évidences soutiennent la pertinence du modèle HLA dans l'évaluation de l'effet thérapeutique des inhibiteurs d'ERAP. L'utilisation des rats non transgéniques (nTg-Fisher 344) de la même colonie sera justifiée par la nécessité de comparer d’un côté la difference du niveau d’inflammation entre les rats HLA-B27 et les rat wild-type et d’un autre coté les effets des molécules testées dans un modèle non inflammatoire.

6 crapauds verts mâles, espèce protégée, vont être capturés dans la nature puis maintenus en captivité trois semaines dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, avant d'être relâchés. Une vingtaine de sangsues sont placées sur eux et comptées chaque jour, pour déterminer si ce parasite se nourrit du sang des adultes ou se contente de les transporter. Le porteur reconnaît que le stress de la capture et de la captivité peut entraîner une mortalité qu'il ne peut réduire à zéro. Il affirme qu'aucun élevage de cette espèce n'existe et qu'une autre espèce ne refléterait pas la relation étudiée.

Objectifs

Nos études récentes portent sur le rôle de piège éclogique que pourrait jouer les bassins d’orage routiers (‘BO’, bassins contruits pour récupérer les eaux d’écoulement polluées) pour bien des espèces d’amphibiens en danger, dont le Crapaud vert (Bufotes viridis). Nos résultats indiquent qu’une espèce de sangsue (Helobdella stagnalis) s’y développe sélectivement et serait directement impliquée dans la mortalité massive des têtards du Crapaud vert nés dans ces bassins artificiels. Les têtards y sont dévorés jusqu’au dernier et la charge « parasitaire » de ces sangsues sur les adultes est très élevée dans certains BO. La biologie de cette famille de sangsues dépourvues de rostre reste très peu connue et l’objectif de la présente étude est de déterminer si ces sangsues sont uniquement transportées par les crapauds adultes (phorésie) ou sont véritablement hématophages (parasitisme vrai). En effet si c’était le cas chez les crapaud adultes, cela pourrait fortement impacter leur vitalité, leur comportement reproducteur dans les bassins, voire leur survie post-reproduction. Si c’est le cas, des mesures de gestion de cette espèce de sangsue dans les BO seront indispensables , afin de limiter son impact sur les populations du Crapaud vert, mais éventuellement d’autres espèces d’amphibiens en danger.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de confirmer ou infirmer le parasitisme effectif d’une espèce de sangsue sur la phase adulte d’une espèce d’amphibien en danger. Ces sangsues sont très peu étudiées dans le monde, et le parasitisme par cette espèce sur le crapaud vert ou d’autres amphibiens n’a jamais été démontré ni prouvé. Ces résultats nous permettront, si le parasitisme est confirmé, de valider nos hypothèses de travail et de proposer des mesures de gestion de ces sangsues dans les bassins d’orage infestés.

Procédures

Capture dans la nature, transport (15 minutes maximum) et maintien en captivité (3 semaines maximum). Un comptage du nombre de sangsue sur chaque individu, sera réalisé 1 fois par jour manuellement sur animal vigile. En fin d’expérimentation, l’ensemble des sangsues fixées aux crapauds seront retirées délicatement à l’aide d’une pice à épilé.

Impact sur les animaux

La probabilité de mortalité des individus suite à un stress dû à la capture, au déplacement, à l’expérimentation et au maintien en captivité ne peut être réduite à zéro. En revanche, sur le terrain la charge « parasitaire » observée était d’environ 20 sangsues/individus, sans avoir noté des comportements ‘anormaux’ des individus hôtes. Ici, nous allons mettre 20 sangsues avec 6 crapauds, aussi nous supposons que cela n’impactera pas les capacités de locomotion, de nourrissage, ni la survie à court- ou long-terme de ces individus. Enfin le prélèvement de sangsues (i.e. délicatement à l’aide d’une pice à épilé) sur les crapauds ne devrait pas entraîner de nuisance particulière, étant donné que : (1) Hs est une espèce de sangsue sans machoire mais muni d’une ventouse buccale qui lui permet de se fixer sur les téguments ; (2) comme toutes les espèces de sangsues, elle utilise une salive anesthésiante.

Devenir

Le Crapaud vert est une espèce en danger d’extinction, il va de soit de relacher l’ensemble des individus à la fin de l’expérimentation

Remplacement

Cette étude concerne spécifiquement le Crapaud vert et ne peut pas être réalisée via une approche in silico ou via des tissus vivants.

Réduction

Un nombre réduit d’individus sera utilisé lors de l’expérimentation (6 mâles). Cela nous permettra de mettre en évidence le parasitisme par Helobdella stagnalis. De plus, certains individus de crapaud pourraient montrer des comportements différents liés au stress de la captivité, en allant moins souvent dans l’eau par exemple et donc être moins susceptible d’être en contact avec les sangsues.

Raffinement

L’aquarium où seront maintenus les crapauds sera aménagé avec un enrichissement maximum. Il comportera une partie terrestre avec de nombreux abris et cachettes, de la mousse humidifiée quotidiennement et une partie aquatique de faible profondeur (3cm), afin d’éviter toute noyade. Les crapauds seront nourris ad libitum avec des grillons vivants (Acheta domestica ; 1cm).

Choix des espèces

Le but de l’étude est d’observer le parasitisme d’une sangsue sur une espèce d’amphibien sauvage : le Crapaud vert. Il n’existe pas d’élevage disponible de cette espèce en laboratoire. L’utilisation d’amphibiens d’élevages de tout autre espèce ne pourrait pas refléter le lien hôte-‘parasite’ que l’on souhaite étudier. La prédation des sangsues sur les têtards a été démontré dans une de nos études précédentes, aujourd’hui nous souhaitons démontrer le parasitisme de ces sangsues sur les individus adultes uniquement.

512 poules pondeuses vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent une unique prise de sang, puis sont abattues à 90 semaines par étourdissement électrique et saignée, pour relier des marques génétiques et épigénétiques à la persistance de la ponte et à l'efficience alimentaire. Le porteur précise que cette mise à mort entre dans le cycle de routine d'un sélectionneur privé, dont les animaux servent aussi à l'étude. Il affirme qu'il n'est pas possible de remplacer les animaux par des analyses in vitro pour un objectif portant sur des performances de production en fin de carrière.

Objectifs

Ce travail est financé dans l'appel d'offres SFS-13-2020, en collaboration avec un partenaire du projet. Un accord de consortium a été signé. L'objectif de l’expérimentation est d'évaluer, chez la poule pondeuse en sélection, la contribution des effets génétiques et épigénétiques à la variabilité des caractères liés à la persistance de la ponte, la qualité des œufs et l’efficience alimentaire, en fin de production (90 semaines).

Bénéfices attendus

L'évaluation à l'échelle du génome de la variabilité génétique et épigénétique nous permettra d'identifier les régions génomiques et les marques épigénétiques contribuant à la variation phénotypique des caractères de production, de qualité et d'efficacité à un âge de la poule qui n'a pas été analysé jusqu'à présent (90 semaines de vie). Ces données seront utilisées pour développer de nouveaux modèles de prédiction génomique. Ces données nous permettront également d'estimer la variabilité génétique et épigénétique de cette lignée parentale et de proposer des stratégies de conservation de la diversité génétique et épigénétique dans les lignées parentales.

Procédures

Les 512 poules pondeuses seront soumises à une seule prises de sang qui seront réalisées par des personnels qualifiés.La durée de la prise de sang pour chaque animal est inférieure à 10 secondes.

Impact sur les animaux

Nous n’attendons pas de nuisances ou effets indésirables sur les animaux. La prise de sang sera effectuée par des personnes expertes.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en vue de prélèvements de tissus par étourdissement électrique suivi d'une saignée. Cette mise à mort entre dans le cycle d’activités de routine du sélectionneur, le bâtiment accueillant une nouvelle génération d’animaux après un vide sanitaire de quelques semaines.

Remplacement

L'objectif de l'étude étant d'évaluer la contribution génétique et épigénétique à la variabilité des caractères liés à la production, la persistense de la ponte, la qualité des œufs et l’efficience alimentaire chez la poule pondeuse à un âge avancé de production, il n'est pas possible de remplacer les animaux par des analyses in vitro.

Réduction

Nous n'avons pas produit d'animaux pour cette étude car nous utilisons les animaux produits par le sélectionneur privé pour son programme de sélection. Ceci nous donne la possibilité d’avoir accès à un grand nombre de phénotypes ainsi qu'au pedigree des animaux sans avoir besoin de produire d’avantage d'animaux. Notre étude consiste à ajouter aux phénotypes fournis par le sélectionneur des phénotypes métaboliques et à produire des données de génotypage et d'épigénotypage afin de pouvoir identifier des QTL (quantitative trait loci : variants d'ADN associés à un phénotype) et des QTM (quantitative trait methylation : variants de méthylation associés à un phénotype). Les caractères que nous souhaitons étudier sont multifactoriels et sous le contrôle de multiples gènes situés à différents QTL et/ou QTM. L'approche que nous prévoyons d'utiliser pour identifier ces régions est l'étude d'association génétique/épigénétique à l'échelle du génome (GWAS) qui nécessite l'analyse d'un grand nombre d'individus. C'est tout l'intérêt d'utiliser des animaux qui sont produits par le sélectionneur dans le cadre de sa sélection, plutôt que de produire de nouveaux animaux expérimentaux. On attend ainsi une puissance raisonnable, supérieure à 70%, avec notre échantillon de 512 descendants.

Raffinement

À l'âge de 90 semaines, juste avant l’abattage des animaux, nous effectuerons une prise de sang et une échographie. Ces procédures seront effectuées par du personnel qualifié afin de causer le moins d'inconfort possible aux animaux, en particulier la prise de sang au niveau du sinus occipital (voir plus loin) qui est très rapide mais nécessite d’être faite par une personne expérimentée. Toutes les activités jusqu'à l'âge de 90 semaines (phénotypages divers, prise de sang à 70 semaines) sont liées aux activités de sélection de l'éleveur privé et ne font pas partie de cette DAP. La possibilité d'avoir accès à une lignée parentale commerciale nous permet d’avoir un dispositif animal puissant, qui devrait nous permettre de transposer nos résultats à d'autres lignées commerciales sans avoir besoin de mettre en place de nouvelles expériences.

Choix des espèces

Nous sommes intéressés par l'identification des régions génomiques et des variants de méthylation qui contribuent à la variation des caractères d'intérêt tels que la persistance de la ponte, la qualité des œufs, l'efficacité alimentaire et la composition corporelle chez la poule pondeuse à un âge avancé de production. La poule domestique est donc l’espèce de choix. Nous travaillerons avec des poules adultes de 90 semaines pour étudier les performances et l'efficacité à la fin de leur carrière productive. La nécessité de collecter des données à un âge aussi tardif est due au fait que les performances antérieures ne sont pas nécessairement corrélées aux performances tardives.

1 800 poules vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit d'une à onze administrations de vaccins par voie injectable ou muqueuse, avec prises de sang et écouvillons répétés sur des poulets vigiles, pour étudier l'innocuité et l'efficacité de combinaisons de vaccins déjà autorisés. Le porteur affirme que les vaccins sont "essentiels" en élevage de volaille et que seule l'étude in vivo confirme leur innocuité. Les poules sont euthanasiées en fin d'étude pour autopsie, une partie pouvant toutefois être remise dans la chaîne alimentaire selon les vaccins utilisés.

Objectifs

Le projet a pour but d’évaluer l’innocuité et/ou l’efficacité par suivi de la réponse immune de vaccins sur l'espèce poulet. La finalité de ces études est visée à améliorer les connaissances d’utilisation de vaccins aviaires déjà pourvus d’une autorisation de mise sur le marché (AMM). Les vaccins sont essentiels en élevage de volaille afin de protéger les animaux contre les maladies infectieuses, de diminuer l’usage des antibiotiques et de garantir les performances zootechniques et économiques. Une connaissance plus approfondie de leur mécanisme d’action permet une utilisation optimale de ces produits. En fonction du type de produits étudiés ou de l’objectif de l’étude, le statut des animaux exigé peut être EOPS (Exempt d’Organismes Pathogènes Spécifiques) ou conventionnel.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, la quasi-totalité des poulets en France et au niveau mondial est vaccinée à l’aide des vaccins vivants atténués et inactivés. Plusieurs vaccins et combinaison de plusieurs vaccins sont souvent nécessaires afin de garantir une protection optimale contre les agents pathogènes qui affectent les productions avicoles. Due à la vaste gamme de produits à disposition des praticiens, des choix et souvent des mélanges doivent être réalisés dans des conditions « terrain ». Grace à ce projet, on compte améliorer les connaissances sur l’utilisation des vaccins utilisés dans les productions avicoles en Europe et dans le monde. On espère grâce à différentes études du projet pouvoir éclaircir certains aspects de l’interaction (positive ou négative) que certains vaccins peuvent avoir entre eux et évaluer l’innocuité que les programmes vaccinaux ont sur les animaux.

Procédures

• Administration de vaccin par voie parentérale (IM/SC) • Administration de vaccin par voie mucosale (nébulisation, oculo-nasale, oculaire) • Prise de sang • Ecouvillons cloacaux • Ecouvillons Oro-pharyngées • Ecouvillons trachéaux • Prélèvements des plumes alaires • Voir Annexe 1 et 2 Tous les prélèvements seront réalisées sur animaux vigiles et sans anesthésie. La contention sera adapté à l’âge et au poids des animaux et les intervention seront réalisé à 2 opérateurs afin de garantir le meilleur confort aux animaux. Les modalités sont décrites dans les annexes 1 et 2. Tous les actes techniques réalisés sur les animaux auront une durée variable assez courte et difficile à estimer avec précision : on a estimé que pour une contention correcte et la réalisation de l'acte technique le temps total ne dépassera pas les 2 minutes par animal et par acte technique. Chaque animal est soumis à 1 administration de vaccin et jusqu'à 11 pour les études longues (60 semaines) avec des intervalles entre chaque administration de 2 à 5 semaines. Les prélèvements sont réalisés sur 20% maximum des animaux du groupe en alternance.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont ceux décrits comme effets secondaires dans les RCP des vaccins utilisés (inflammation au site d’injection, réaction locale au niveau respiratoire et/ou digestif). Des effets négatifs plus importants pourront être observés dans le cas d’associations de plusieurs vaccins. Les réactions attendues restent néanmoins à niveau locale. Suite à l’injection sous-cutanée et/ou intramusculaire, les réactions indésirables pourront aller de la simple inflammation jusqu’à la nécrose des tissus. Les effets indésirables les plus attendus lors de l’administration des vaccins vivants atténués, pourront aller d’un simple irritation/inflammation temporaire aux voie respiratoire jusqu’à de la toux. La plupart des réactions liées à l’administration des vaccins sont bénignes et transitoires. Les cas graves sont rares et une observation biquotidienne et un examen clinique sera réalisé tout au long des études par du personnel qualifié.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés compte-tenu des autopsies souvent envisagées en fin d’étude (exigées notamment dans le cadre d’étude d’innocuité). Il n’est pas attendu de dégradation de l’état de l’animal, mais si dans des cas exceptionnels, une douleur ou souffrance survient, l’animal est euthanasié pour raison éthique. Ces euthanasies sont réalisées selon les procédures décrites dans le paragraphe 3.3.3 Dans la limite du possible et selon les études, tous les animaux pour lesquels une vaccination réalisée avec des vaccins sous AMM française pourront être remis dans la chaîne alimentaire. Une approbation au préalable du vétérinaire de l’élevage sanitaire sera demandée avant la mise en liberté des animaux

Remplacement

Seules les études in vivo permettent de confirmer l’innocuité et l’efficacité du vaccin ou d’une combinaison de vaccins. Une série de tests analytiques permet de garantir un certain niveau de sécurité pour les animaux recevant le produit. Un recueil d’informations est aussi apporté par la bibliographie lorsque cela est possible.

Réduction

Les effectifs d’animaux sont calculés au plus juste afin d’utiliser le nombre minimal pour garantir l’atteinte de l’objectif du projet. Pour les études d’innocuité et d’efficacité, on se réfère directement aux textes officiels (European Pharmacopea , Monographie 50206 et 50207).

Raffinement

Le personnel est formé et compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans son état physiologique optimal. Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’espèce et à l’âge des animaux afin de maximiser leur confort et leur bien-être. En plus, les animaux ont à disposition des méthodes d’enrichissement afin de stimuler l’exercice physique et leurs activités cognitives : tous les animaux sont hébergés en groupe. La Structure en charge du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux. L’enrichissement adapté à l’espèce Gallus gallus qui sera mis en place de façon régulière au lancement des études: • Litière adaptée pour le confort des animaux ; • Niche plastique (adapté selon la taille des animaux) pour donner une cachette aux animaux ; • Boite à œufs vides dans la première semaine de vie pour donner des nids aux poussins ; • Perchoir en carton pour les études sur poulet de chair ; • Perchoirs ; nids et accès à un parcours extérieur pour les études sur les poules pondeuses.

Choix des espèces

Les espèces aviaires, utilisées ici, sont les espèces cibles des substances d’essai testées. Les essais in vivo réalisés dans ce projet doivent être conduits chez l’animal afin qu’ils puissent répondre aux exigences réglementaires. Dans le cadre d’études non réglementaires, les procédures expérimentales réalisées chez les espèces cibles permettent d’avoir des résultats plus conclusifs. De plus, les procédures expérimentales sur l’espèce cible, décrites dans le présent projet, ne disposent pas d’un modèle in vitro ou in vivo sur espèces alternatives. Dans la majorité des études, les animaux utilisés ont entre 1 jour et 18 semaines d’âge (en fonction des études et des espèces). Les animaux utilisés dans des études menées chez les poules pondeuses, peuvent avoir jusqu’à 80 semaines d’âge. L’âge des animaux au moment de la vaccination dépend des besoins des différents types d’études qui sont à effectuer. Ces besoins dépendent de l’objectif de l’étude, du produit testé et répondent à l’exigence expérimentale d’utilisation du produit mis sur le marché et des exigences des autorités.

28 gerbilles de Mongolie vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles sont soumises pendant huit semaines à des régimes carencés ou enrichis en provitamine A, la seule intervention déclarée douloureuse étant l'injection anesthésique terminale, pour évaluer si des larves d'insectes peuvent servir de source de vitamine A. Le porteur présente ce débouché alimentaire comme pertinent pour les pays où la carence persiste. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'analyser la digestion et le métabolisme des vitamines chez un mammifère.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier la conversion de précursseurs de la vitamine A en vitamine A chez la gerbille consommant des aliments enrichis en précursseur (provitamine A). Ceci afin de pouvoir considérer les insectes riches en caroténoïdes comme de futurs aliments pour l’homme. Des études antérieures ont montré que les larves de l’insecte Hermetia Illucens (mouche soldat noire) sont capables de bioaccumuler de fortes concentrations de provitamine A quand elles sont élevées sur des substrats riches en cette provitamine. Mais on ne sait pas si ces larves pourraient servir de source de vitamine A chez l’homme ou l’animal de rente. L’objectif est donc de déterminer, en utilisant le modèle gerbille qui est un modèle reconnu pour étudier l’activité provitaminique A de caroténoïdes, si des larves enrichies en provitamine A sont capables de rétablir le statut vitaminique A de gerbilles carencées en cette vitamine.

Bénéfices attendus

Des nombreuses recherches sont axées depuis une vingtaine d’années sur la biodisponibilité des caroténoïdes. Dans le contexte du changement climatique et des changements des habitudes alimentaires qu’il implique, il est particulièrement pertinent d’étudier la capacité des insectes comestibles à être des sources complémentaires et durables de caroténoïdes provitaminiques A. En effet, la carence en vitamine A persiste dans de nombreux pays en développement et pouvoir utiliser des insectes comme source de cette vitamine serait très intéressant à la fois pour l’alimentation des animaux de rente dans ces pays, et pour certaines populations qui consomment des insectes depuis de nombreuses générations. Par ailleurs, l’insecte que nous allons utiliser dans ce projet est un insecte qui a la capacité de croitre sur des déchets organiques et qui est utilisé pour les recycler et les valoriser. Montrer que l’on peut aussi l’utiliser pour recycler des déchets de fruits ou légumes riches en caroténoïdes provitamine A, e.g. patate douces oranges, et obtenir des larves riches en caroténoïdes provitamine A capables de rétablir le statut vitaminique A d’un animal modèle serait très intéressant pour cette filière de l’entomoconversion. Utiliser des insectes comme source de caroténoïdes pour l’homme pourrait être envisageable à long terme pour certains pays en voie de développement ou les carences en vitamine A sont toujours d’actualité pour certaines populations.

Procédures

Cinq jours d’acclimatation sont prévus à l’arrivée des animaux – Pendant cette période l’habituation progressive des animaux à être pesé sera réalisée. Ces pesées auront lieu 2 fois à 3 fois par semaine afin d’assurer le suivi de croissance. La seule intervention que subiront les animaux est l'anesthésie finale. La modification du régime alimentaire n’a aucun effet sur la croissance normale des gerbilles, et n’occasionnent aucune souffrance. Les gerbilles des groupes dits « carencés en vitamine A » sont en fait nourries pendant 5 semaines avec un régime classique avec un apport faible en vitamine A (1050 UI). Ces témoins ont déjà étaient utilisés et les résultats publiés ont indiqués une croissance et une consommation normale.

Impact sur les animaux

Il s’agit de tester plusieurs régimes alimentaires, éventuellement carencés en vitamine A, sur une durée maximale de 8 semaines. Il n’y a pas d’effets indésirables graves ni de perte de poids prévus sur la durée de l’expérience, relativement courte. Les effets indésirables attendus sont le stress des animaux liès à la manipulation (pésée) et à l'injection terminale d'anesthésique

Devenir

A l'issue des 8 semaines de régime alimentaire carencé ou non les animaux sont euthanasiés

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives permettant d’analyser les capacités nutritionnelles d’un aliment pour mammifères, comprenant la digestion et le métabolisme des vitamines.

Réduction

Il s’agit d’une étude pilote permettant d’évaluer, en 8 semaines, l’interêt potentielle d’une source alimentaire permettant de lutter contre les carences en vitamine A. Afin d’éviter de multiplier le nombre d’expériences, deux suppléments alimentaires sont testés en parallèle : les patates douces et les insectes, permettant ainsi de limiter les groupes témoins.

Raffinement

Aucune douleur n’est attendue au cours de l’expérimentation. Des maisons en cartons et bâtons de peuplier sont ajoutés dans les cages.

Choix des espèces

La gerbille est un modèle animal très intéressant pour les chercheurs qui veulent mimer le taux de bioconversion des caroténoïdes provitaminiques A en vitamine A chez l’homme. En effet, contrairement à l’homme et à la gerbille, le rat et la souris ont des taux de conversion très élevés, proche de 100%, et quand on leur fait consommer de la provitamine A on ne retrouve pratiquement que de la vitamine A dans leur organisme. Chez l’homme et la gerbille, le taux de conversion est compris entre quelques % et 80% (ce taux dépend de nombreux facteurs dont le statut vitaminique A, le sexe et la matrice alimentaire dans laquelle est la provitamine A) et on retrouve donc dans l’organisme à la fois de la vitamine A et de la provitamine A absorbée mais non convertie en vitamine A. Gerbilles de 7 semaines âge minimum pour être sevrées