Procédures légères

150 chats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 50 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 100 un niveau léger. Une maladie rénale chronique leur est induite par un agent viral, avec prises de tension, prélèvements d'urine par cystocentèse et de sang répétés, avant mise à mort pour analyse des reins. Le porteur énumère les atteintes possibles de la maladie induite, de l'anorexie à l'anémie, tout en affirmant vouloir empêcher l'atteinte d'un stade sévère par des points limites. Le modèle doit servir à tester de futurs médicaments chez le chat et à éclairer la maladie humaine.

Objectifs

Le projet a pour objectif la mise au point d’un modèle félin de maladie rénale chronique chez le chat, représentatif de la pathologie dans son développement réel. A terme, le modèle pourra permettre l’évaluation de l’efficacité et de l’innocuité de candidats médicaments dans la prise en charge des MRC félines.

Bénéfices attendus

Le bénéfice de ce projet repose sur la mise au point d’un modèle de MRC peu invasif et reproductible chez l’espèce cible (chat), permettant d’induire des changements rénaux identiques à ceux d’une maladie rénale chronique chez l’animal sain. La mise au point de ce modèle pourra permettre, par la suite, d’investiguer de nouveaux candidats médicaments ayant une action au niveau des mécanismes pathogéniques, afin d’améliorer la qualité de vie et d’allonger l’espérance de vie chez les chats atteints de MRC. L’établissement d’un modèle de MRC chez le chat pourra améliorer notre connaissance du développement et de la pathophysiologie de la MRC chez l’homme. Le succès d’un modèle de MRC chez le chat ouvre aussi la voie à l’investigation de nouvelles modalités de prise en charge des fibroses rénales, néphropathies et maladies rénales chroniques chez l’humain.

Procédures

Les animaux issus du groupe test et contrôle positif ou du groupe contrôle si placebo subissent une administration de l'agent viral pour induction MRC ou placebo. Cet acte technique est pratiqué sous anesthésie générale en intra-veineux une fois au début de l'étude. Tous les animaux ont une prise de la tension arterielle en vigil à l'aide d'un bracelet et doppler à la queue. Cet acte technique est répété 1 à 4 fois par mois si nécessaire tout au long de la procédure expérimentale. Tous les animaux ont des prélèvements d'urine en vigile ou durant l’anesthésie. Cet acte technique est pratiqué en cystocentèse (sous échographie, si nécessaire) 1 à 4 fois par mois ou si nécessaire tout au long de la procédure. Tous les animaux ont des prélèvements sanguins en vigile ou durant l’anesthésie. Cet acte technique est pratiqué à la jugulaire 1 à 4 fois par mois ou si nécessaire (prélèvement maximal de 15% du volume circulant sur 28 jours en cumulé) tout au long de la procédure expérimentale. Tous les animaux ont des examens physiques complet en vigile 1 à 4 fois par mois ou si nécessaire tout au long de la procédure expérimentale.

Impact sur les animaux

L’objectif du projet étant la mise au point d’un modèle félin de MRC, les nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont ceux d’une MRC, à savoir : - Lésions associées à la maladie rénale chronique, par exemple : fibrose rénale, inflammation tubulointerstitielle. - Répercussions extrarénales d’un dysfonctionnement rénal : • Azotémie et urémie, pouvant se traduire cliniquement par : de l’apathie, de l’anorexie, un amaigrissement, des ulcérations des muqueuses, de la déshydratation, de l’apathie, des troubles digestifs (vomissements, diarrhées ou constipation), des signes nerveux, du ptyalisme, une polyurie-polydipsie (liste non exhaustive). • hypertension systémique pouvant impacter différents systèmes (ex : système nerveux central, cardio-vasculaire, oculaire), • protéinurie rénale persistance pouvant se traduire par des signes cliniques (ascite, œdèmes périphériques) correspondant au « syndrome néphrotique » • Perturbation des fonctions rénales et par conséquent des paramètres biochimiques et hématologiques : o diminution de l’excrétion de créatinine, de sulfates o diminution de l’excrétion de phosphate et de la synthèse de calcitriol, pouvant conduire à une hyperparathyroidie secondaire rénale entraînant des signes cliniques ou augmentation de la kaliémie entraînant des signes cliniques (ex : troubles cardiaques) o perturbation de l’équilibre acido-basique (acidose métabolique) o diminution de la production d’érythropoïetine pouvant mener à une anémie o dépression immunitaire • Modifications de la volémie Cependant, la durée de la procédure étant limitée, il n’est pas attendu de voir l’ensemble de ces signes cliniques et/ou des signes de sévérité importante. Les points limites, établis sur la base d’un suivi clinique attentif et paraclinique, visent à empêcher toute atteinte d’un point sévère.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de procéder à des analyses histologiques des tissus rénaux, pour évaluer la pertinence du modèle à induire des modifications rénales semblables à la MRC. Les changements structurels rénaux pourront aussi être évalués par une analyse macroscopique.

Remplacement

Les MRC sont le résultat de phénomènes dynamiques entrainant l’altération progressive et irreversible de la fonction rénale, avec des répercussions extrarénales importantes et délétères. La mise au point d’un modèle in vivo s’avère indispensable, afin d’améliorer la compréhension de la maladie et d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments non seulement sur le rein, mais également sur les répercussions des MRC sur les autres organes et sur l’organisme. La capacité du TGF-β sur l’induction de modifications fibrotiques rénales a été évaluée in vitro et in vivo. Le tropisme de FeMV pour les cellules rénales a déjà été démontré in vitro et in vivo. Les FeMV recombinant exprimant TGF-β auront montré une capacité d’expression de TGF-β in vitro. L’évaluation finale des candidats médicaments sélectionnés sur un modèle vivant de MRC reste indispensable pour apprécier leur efficacité et/ou leur innocuité dans le cadre d’une maladie dégénérative complexe, d’où la nécessité de disposer d’un modèle de MRC félin. De plus, des données d’efficacité et d’innocuité sur l’espèce cible doivent être fournies dans les dossiers réglementaires.

Réduction

Dans la perspective de réduction, les effectifs sont évalués au plus juste (historique, définition des objectifs…) de façon à minimiser le nombre de chats utilisés tout en garantissant une approche rigoureuse et ceci afin d’éviter le risque d’études non conclusives. Une recherche de littérature non systématique a montré que les groupes se constituaient de 4 à 21 chats (5; 6; 7) dans les modèles antérieurs de CKD. Lorsque le statut des animaux le permet, les animaux utilisés peuvent être issus de procédures (légère ou modérée) antérieures. La réutilisation permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Seuls les animaux ayant retrouvé un état de santé et bien-être complet, attesté par un vétérinaire, seront réutilisés

Raffinement

Pour chaque étude, une période d’acclimatation systématique des animaux est prévue dans le but de limiter leur stress et de stabiliser leur état physiologique. La durée optimale est de 7 jours pour des chats provenant de fournisseurs référencés. Des points limites spécifiques ont été définis afin de limiter le plus précocement possible la douleur des animaux. Ces critères sont en constante évolution pour les améliorer afin de réfleter au mieux l’expérience du terrain et l’état actuel des connaissances vétérinaires. Le personnel est compétent pour identifier des signes d’inconfort ou de douleur. Une anesthésie et une analgésie peuvent être réalisées lors de certains actes si nécessaire. Pour réduire l’inconfort provoqué par l’administration et/ou les prélèvements : - Des opérateurs qualifiés réalisent une contention adaptée de l’animal. - En cas d’administration et/ou de prélèvements douloureux ou répétées, ou pouvant entrainer un stress important, une anesthésie et/ou une analgésie peuvent être réalisées - La zone de prélèvements peut évoluer - Les animaux sont entrainés à la contention et aux méthodes de prélèvement afin de réduire le stress et l’inconfort lors de la réalisation des actes techniques. Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’espèce et à l’âge pour maximiser leur confort et leur bien-être. Dans la majorité des cas, les animaux sont hébergés en groupe. Les chats ont à disposition des méthodes d’enrichissement adaptées afin de stimuler l’exercice physique et leurs activités cognitives. La Structure du Bien Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.

Choix des espèces

Le développement d’un modèle spécifique pour les MRC félines est nécessaire pour l’étude de ces maladies et les études d’efficacité et/ou d’innocuité de médicaments candidats sur l’espèce cible. Des jeunes chats et des adultes seront utilisés. Les 2 catégories d’animaux peuvent être utilisés pour parvenir à mettre au point un modèle fiable. Les maladies rénales chroniques affectent les chats adultes.

9 900 souris, rats et lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Une sécheresse oculaire leur est induite par instillations répétées, pose de patchs, pompes osmotiques sous-cutanées ou ablation chirurgicale des glandes lacrymales, avant mise à mort pour analyses. Le porteur décrit picotements, brûlures et sensibilité à la lumière comme nuisances attendues. Les modèles doivent servir à tester de futurs traitements, dont l'efficacité reste à démontrer.

Objectifs

L'objectifs de ce projet est de pouvoir proposer des modèles expérimentaux de sécheresse oculaire chez le rat, la souris et le lapin afin de tester l'efficacité de nouveaux traitements. L’œil sec est une maladie multifactorielle des larmes et de la surface oculaire plus fréquente chez les femmes, les personnes âgées et qui concerne 5 à 35% de la population. Les manifestations cliniques sont variées et impactent considérablement la qualité de vie des patients. Les modèles de sécheresse oculaire chez les rongeurs et le lapin sont relativement bien représentés et décrits dans la littérature. Nous en avons sélectionné 3, parmi les plus référencés, les plus efficaces en terme d’impact sur la surface oculaire et la diminution de la sécrétion de larmes et les moins contraignants pour l’animal.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est de proposer des modèles expérimentaux qui permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements. La recherche de traitements est en constante évolution et nécessite de pouvoir les tester dans les meilleurs conditions possibles et dans le respect du bien-être animal.

Procédures

Les procédures expérimentales nécessitent l'administration, le plus souvent quotidienne, de différents produits par instillations (gouttes oculaires), par voie transdermique (pose de patchs dermiques), sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale (anesthésies). Ces procédures ne durent que quelques secondes. Dans certains cas, comme la pose de pompes osmotiques en sous cutanée ou l'ablation des glandes lacrymales extra-orbitales situées juste sous la peau, une petite chirurgie unique dont la durée n'excèdera pas cinq minutes sera nécessaire. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives (imagerie, observations au biomicroscope). Ces examens sont réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif ou tout autre marqueur d'intérêt. Les prélèvements de sang se feront par ponction et basé sur les recommandations du Gircor et durent moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont essentiellement celles observées dans la sécheresse oculaire à savoir des picotements, des démangeaisons, des sensations de brûlure, de sable ou de corps étranger dans les yeux ou bien encore une sensibilité accrue à la lumière. Toutes ces manifestations sont imputables à la composante inflammatoire de la maladie. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une gêne transitoire de courte durée et éventuellement une hyperémie des conjonctives comme on peut le constater chez l’homme. L'administration en sous cutanée ou en transdermique pourra occasionner une petite inflammation avec l'apparition de rougeurs sans conséquence majeure.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour permettre des réalisés les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, ELISA...).

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’oeil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’oeil est composé de différents tissus (cornéen, rétinien, vitréen, vasculaire, nerveux...) de physiologie différente soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux compte tenu des particularités de l’organe concerné par le projet et l’absence de modèle alternatif.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est limité pour cependant rester adapté à l'analyse des résultats par des tests statistiques afin de permettre de conclure sur l'efficacité ou non d'un traitement. Une analyse de puissance (placé à 0,8) avec un calcul de l’effectif sera réalisé ce qui permettra d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures Des évaluations non invasives de la pathologie sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal. l'analyse des deux yeux sera effectuée chaque fois que possible afin de réduire le nombre d'animaux.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les rongeurs seront placés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum et enrichissement à ronger. Si la procédure expérimentale le permet un abri sera ajouté. Les lapins seront placés individuellement ou par deux dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture et enrichissement à ronger. Les examens non invasifs choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou chez l’animal en cabinet vétérinaire. Les examens de l'œil qui requièrent l’immobilité de l'animal pourront être réalisés pour son confort sous anesthésie. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans l'études auront 8 à 12 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation de 3 jours minimum.

1 062 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent une injection dans le muscle puis sont soumis au test du digit abduction score pour mesurer l'effet myorelaxant de nouvelles molécules, avant d'être tués pour prélever les muscles. Le porteur qualifie ce test de bref, indolore et peu stressant, tout en signalant une douleur liée à l'injection. Sur le remplacement, il affirme que les modèles de co-culture cellulaire restent d'une pertinence débattue et ne reproduisent pas la diffusion dans le muscle.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de caractériser une nouvelle génération de produits potentiellement d’intérêt identifiés récemment Cette étude a pour objectif de caractériser le pouvoir myorelaxant de nouvelles molécules ; ces molécules ont été décrites dans la littérature scientifique, notamment en termes d’efficacité in vitro sur les cellules cibles (IC50). Dans cette étude, le produit sera injecté localement aux rats, dans les membres postérieurs pour un suivi de de la tolérance sur un petit nombre d’animaux dans un premier temps. Puis dans un second temps, nous réaliserons un suivi du « digit abduction score » (DAS). Cette procédure (injection et test DAS) est brève, indolore, et peu stressante pour les animaux. Nos produits seront comparés au traitement actuel de référence afin de s’assurer de leur bénéfice.

Bénéfices attendus

Les troubles du mouvement sont des maladies neuromusculaires, qui handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La dystonie, par exemple, est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires, pouvant entrainer des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces maladies implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène… Ces traitements systémiques comportent cependant tous des effets secondaires conséquents. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces malades : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente des avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Cette approche doit encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après l’injection, et dont les effets seraient durables. L’objectif de notre projet global est de mettre en évidence les effets bénéfiques de l’utilisation locale de différents produits myorelaxants novateurs à effet rapide et durable, sur la contraction musculaire pour les patients souffrant de troubles du mouvement comme la dystonie et la spasticité. Au cours d’une étude princeps, nous avons pu identifier au moins 5 produits présentant une activité myorelaxante d’intérêt ; ensuite, grâce aux différents projets déposés, nous avons avancé notre premier Lead (FTP-501) quasiment au terme de son développement préclinique. Chacun des produits identifiés au cours de l’étude princeps semble avoir des caractéristiques pharmacologiques différentes : certains induisent une myorelaxation très rapide (FTP-101), et d’autres offrent un effet durable par exemple (FTP-501). Or, selon la maladie neuromusculaire, le besoin clinique est différent, et donc chaque caractéristique est plus ou moins critique. Nous visons ainsi le développement de plusieurs produits, car nous envisageons la possibilité de positionner chacun des produits finaux pour le traitement de différentes maladies neuromusculaires.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - Injection intramusculaire = 1 injection , durée 30 secondes / animal - Pesée des animaux = maximum 8 pesée / animal => 30 secondes / pesée => 4 minutes / animal - Test du DAS ( uniquement pour les animaux suivant la procédure 2) = 30 sec / test DAS (environ 28 stimulation sur la durée de l'étude / animal ) => 14 minutes / animal

Impact sur les animaux

Bien que certaines des 20 molécules de ce projet n’aient jamais été injectées chez l’animal, elles font partie de la même famille. Or, certains membres de cette famille ont été injectés, sans aucun signe clinique rapporté. Nous n’attendons ainsi pas de signe clinique particulier après injection des FTP-8xx ; toutefois, afin de se prémunir de tout imprévu, nous suivrons avec attention tout signe, et avons mis en œuvre les mesures décrites dans le tableau fourni en annexe. De plus, dans cadre de nos procédures, les nuisances attendues sont : le stress des animaux dû à la contention pour l’injection et le test du DAS ; une douleur liée à l’injection i.m.

Devenir

Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés car les muscles injectés seront prelevées pour des analyse histo-pathologiques.

Remplacement

Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés). Le test DAS nous permet au contraire de mesurer l’activité myorelaxante tout en prenant en compte ce paramètre.

Réduction

Pour la réduction, les études précédemment réalisées nous ont donné un certain recul sur la taille des groupes nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs (test de Kruskal Wallis pour les sections B & C); Nous utiliserons donc le nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à une conclusion. Soit 6 animaux par groupe.

Raffinement

Concernant le raffinement, les animaux seront hébergés en groupe de 2 avec enrichissement du milieu, et surveillés quotidiennement permettant un suivi clinique de chaque animal. Ainsi, des points limites sont mis en place durant tout ce projet permettant de définir des critères d’arrêt si nécessaire Nos études précédentes nous ont permis un raffinement du modèle DAS chez le rat : l’injection intramusculaire dans le membre inférieur est réalisée sous contention par un expérimentateur entraîné, et les mesures de DAS sont brèves, indolores et peu stressantes pour les animaux. Au cours de cette étude, nous souhaitons continuer à limiter au maximum le stress des animaux.

Choix des espèces

La comparaison de la rapidité d’action entre notre molécule et les traitements sur le marché ne pourra se faire que sur un modèle : i) exprimant les cibles moléculaires d’intérêt à la jonction neuromusculaire, et ii) dans lequel il existe une limite de diffusion dans les tissus. En effet, la cinétique des molécules après injection intra-musculaire est fortement dépendante de la capacité à diffuser dans le muscle, un tissu très compartimenté comportant plusieurs membranes internes. Or, bien qu’il existe des modèles in vitro qui permettent d’étudier la jonction neuromusculaire, la pertinence de ces modèles pour mimer la fonctionnalité de la jonction est débattue, et ils ne récapitulent pas les problématiques de diffusion qui se jouent in vivo. Le test DAS chez le rongeur, déjà éprouvé lors de notre étude princeps, est au contraire un test reconnu pour sa pertinence pour étudier les myorelaxants. Rats femelles Sprague Dawley femelles âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (200g) et 10-12 semaines maximum en fin d’expérimentation (300g). Des animaux juvéniles seront choisis pour leur capacité à exhiber un réflexe lors des tests DAS. Les animaux âgés peuvent effectivement répondre de manière moins spontanée aux stimulations. Ils sont également plus légers, donc plus facile à stimuler.

225 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la plupart (215) tués et un petit nombre réutilisés ou adoptés. Ils reçoivent des administrations répétées d'un vaccin, des prélèvements de sang et des écouvillons, et sont euthanasiés quand un prélèvement terminal ou une nécropsie est requis. Le porteur présente ces tests comme une exigence réglementaire d'évaluation de l'innocuité sur l'espèce cible. Il affirme que les essais in vitro ne peuvent pas se substituer aux études sur l'animal vivant.

Objectifs

Le projet a pour but d’évaluer l’innocuité d’un vaccin sur le chat ainsi que sur son environnement (animaux en contact, environnement, humains).

Bénéfices attendus

Ces études sont encadrées selon les exigences de la Directive Européenne 2010/63/UE, de la Pharmacopée Européenne, de guidelines (dont VICH, EMEA) et d’autres exigences spécifiques à chaque pays. Ces études permettent in fine d’assurer le soin des animaux avec des vaccins présentant un risque minimal. Elles permettent également aux propriétaires de disposer des meilleurs traitements pour leurs animaux.

Procédures

Administrations de produit : 1 à 4 administrations sur une durée de 2 à 16 semaines. Cet acte peut être effectué sous anesthésie selon la sensibilité de l'animal. L'acte technique a une durée de 1 à 2 minutes. Prélèvements sanguins : 1 à 10 prélèvements sur la durée de l'étude. L'acte a une durée de 1 à 2 minutes. Des écouvillons (conjonctival ou pharyngé ou salivaire, nasal ou rectal) peuvent être effectués en fonction de l'objectif de l'étude. 0 à 10 écouvillons sur la durée de l'étude. Cet acte technique est inférieur à 1 minutes

Impact sur les animaux

La contention peut être une contrainte pour l'animal. Celle-ci doit être adaptée pour que la technique soit la plus rapide, moins douloureuse et moins traumatisante. La répétition des administrations et des prélèvements sur le long terme peut occasionner une douleur de quelques minutes.

Devenir

Les animaux, sur lesquels un prélèvement sanguin terminal ou une biopsie post-mortem du site d’injection ou une nécropsie est requis(e), sont euthanasiés. Les animaux dont les points limites sont atteints sont euthanasiés pour raison éthiques. En fonction des études antérieures et si leur statut le permet, les animaux peuvent être utilisés dans d’autres projets. En fonction du produit administré et de l’état de l’animal et si les circonstances le permettent (acquéreur sérieux, bonnes conditions d’accueil après examen du candidat par la SBEA), les chats peuvent être adoptés. La réutilisation et l'adoption de l’animal est de la responsabilité du vétérinaire désigné qui évalue le bien-être des animaux à la fin de la procédure expérimentale.

Remplacement

Il est nécessaire d’utiliser des animaux vivants car l’innocuité doit être réalisée sur l’animal. La diffusibilité, la persistance et l’intégration de l’agent vaccinal doivent être réalisées dans l’organisme cible pour que les conclusions soient valides. Il s’agit d’exigences réglementaires. Les essais in vitro et in vivo sur des espèces alternatives permettent d’obtenir des informations complémentaires et prédictives, mais ne peuvent se substituer à des études in vivo sur l’espèce cible. De plus, les procédures expérimentales sur l’espèce cible ne disposent pas toute d’un modèle in vitro ou in vivo sur espèces alternatives. Une série de tests analytiques permet de garantir un certain niveau de sécurité pour les animaux recevant le produit. Un recueil d’informations est aussi apporté par la bibliographie lorsque cela est possible.

Réduction

Le nombre minimum d’animaux à inclure est très souvent une exigence réglementaire. En amont, lors des phases recherche, les effectifs sont évalués au plus juste (analyse statistique, historique, définition des objectifs…) de façon à limiter les études non conclusives. Lorsque cela est possible, une première étape dans le projet de développement d’un vaccin consiste à tester in vitro différents candidats. Ceci permet une première sélection de ces derniers, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Pour chaque étude une période d'acclimatation systématique des animaux est prévue dans le but de limiter leur stress et de stabiliser leur état physiologique. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Une anesthésie de l’animal peut être envisagée lors de certains actes, ainsi qu’une alternance des zones ou site de prélèvements lorsque cela est possible. Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’espèce et à l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Dans la majorité des cas, les animaux sont hébergés en groupe. Des enrichissements adaptés au milieu sont mis en place. La Structure du Bien Être Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.

Choix des espèces

L’évaluation sur l’espèce cible est une exigence règlementaire. Le chat est l’espèce cible pour le produit testé. Les chats utilisés ont entre 8 et 104 semaines. L’âge dépend des besoins pour les études d’innocuité et de diffusibilité qui sont à effectuer. Ces besoins dépendent de l’objectif de l’étude, du produit testé et répond à l’exigence expérimentale d’utilisation du vaccin mis sur le marché et des exigences des autorités.

4 800 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils servent à provoquer des atteintes du foie pour tester des médicaments, l'un des modèles imposant chez le rat une chirurgie de ligature du canal biliaire suivie d'une jaunisse, d'une ascite et d'une perte d'appétit. Le porteur indique que le stade de coma hépatique n'est pas atteint car les animaux sont tués avant, et que le prélèvement du foie ne permet pas leur maintien en vie. Sur le remplacement, il affirme que les cultures d'hépatocytes ne peuvent pas suppléer le modèle animal, faute de reproduire un environnement biologique et immunologique intact.

Objectifs

La stéatose hépatique non alcoolique (NASH) représente la première cause d’hépatopathie chronique dans les pays occidentaux. Elle est caractérisée par un dépôt excessif de lipides dans le foie (stéatose), d’une inflammation et d’une nécrose hépato-cellulaire pouvant évoluer vers la cirrhose. L’hépato-toxicité liée aux médicaments, aux plantes médicinales ou aux agents chimiques est un problème de santé publique. Le foie joue un rôle essentiel dans la transformation et l'élimination des médicaments. Mais lorsque la quantité ou la puissance du toxique dépassent les capacités métaboliques du foie, il peut se produire une destruction de cellules hépatiques: c'est l'hépatite toxique. La toxicité hépatique des médicaments est l’une des principales causes d’arrêt dans le développement de substances ou de retrait de médicaments. Par exemple, le paracétamol (antalgique et antipyrétique de référence) est l'un des médicaments les plus utilisés et est considéré comme une substance d'utilisation sûre, du moins à doses thérapeutiques. Toutefois, le potentiel hépatotoxique du paracétamol en cas de surdosage, accidentel ou plus souvent à visée suicidaire, est néanmoins connu de longue date. L’exposition à des produits chimiques est également un problème croissant dans les sociétés industrielles. Le risque est plus difficile à apprécier que pour les médicaments car il n’existe pas de réseaux spécifiques centralisant les effets secondaires rapportés par des cliniciens. De plus, les effets à long terme à des expositions intermittentes à doses variables, susceptibles de produire des maladies chroniques du foie et des cancers, restent peu connus. Parmi les agents chimiques identifiés, on retrouve le tétrachlorure de carbone (CCl4). L’hépatite auto-immune est une maladie d’étiologie inconnue, qui progresse spontanément vers la cirrhose et l’insuffisance hépatique. Certains modèles murins d’hépatite auto-immune sont induits par des produits chimiques tels que la concanavaline A. Enfin, l'obstruction des voie biliaires (cholestase), dont l'origine peut être diverse, entraine également des nombreuses complications. Les tests décrits dans ce projet ciblent l'évaluation des effets de substances dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles sont mis en place et utilisés afin de tester l'efficacité de médicaments (par la réduction de l'hépatite, du NASH) ou de s'assurer qu'ils n'induisent pas eux-mêmes une hépatotoxicité.

Bénéfices attendus

Ces différents modèles sont nécessaires à la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces pour traiter l'hépatotoxicité chronique (NASH) ou aigüe (intoxication, cholestase). Par exemple, il n’existe pas, pour l’instant, de traitements médicamenteux établis pour traiter le NASH et le risque associé de développer d’autres affections du syndrome métabolique (par exemple augmentation du risque de développer un diabète) Jusqu’à présent, le traitement reste basé sur le contrôle de chacun des facteurs de risque métabolique (limiter le surpoids par le régime et l'exercice physique et/ou combattre l'insulino-résistance par la prescription de médicaments qui améliorent la sensibilité des tissus périphériques à l'insuline).

Procédures

Dans les procédures chez la souris (modèles d'hépatotoxicité aigüe et NASH), un prélèvement sanguin terminal (euthanasie sans réveil) sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane est réalisé. Dans les procédures chez le rat (modèles d'hépatotoxicité aigüe, NASH et cholestase), un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane est réalisé (juste avant l'euthanasie). Selon les besoins de l'étude (et plus particulièrement pour les procédures NASH et cholestates, des prélèvements sanguins supplémentaires (fréquence à adapter en fonction des besoins de l'étude) peuvent être réalisés (sous anesthésie avec retour à l'état conscient). Dans le cas des prélèvements intérmédiaires, le volume prélevé sur chaque animal sera inférieur ou égal à 15% de sa volémie et ne pourra être répété que toutes les 2 semaines au minimum. Dans la procédure cholestase, une phase de chirurgie est nécesaire. Les rats sont anesthésiés (anesthésie gazeuse isoflurane) et reçoivent une administration d'un anti-inflammatoire non stéroïdien. Une laparotomie médiane est pratiquée en condition d'asepsie. Le canal biliaire est répéré, liguaré puis sectionné (entre 2 ligatures). Les plans musculaires et cutanés sont suturés et l'animal est placé près d'un dispositif chauffant jusqu'au réveil. Pendant la phase de récuprération post-chirurgicale, les animaux recoivent un traitement antibiotique et de nouvelles administrations de l'anti-inflammatoire non stéroïdien. NB: un groupe d'animaux subit la même procédure (anesthésie, laparotomie...) à l'exception de la ligature/section du canal biliaire. Les animaux de ce groupe (groupe Sham) servent de contrôle.

Impact sur les animaux

A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée au médicament. Dans ce type de procédures, il est attendu une hépatotoxicité aigüe (intoxication, cholestase) ou chronique (NASH). Dans les modèles aigüs d'intoxication, une perte d'appétit et de poids peut être observées sur la durée de l'évaluation (généralement dans les premières 24 heures). Dans le modèle de cholestase (ligature du canal biliaire), les animaux doivent être hébergés en cage individuelle (avec enrichissement) pendant la période de récupération post-chirurgicale (quelques jours). Après la ligature du canal biliaire, une jaunisse apparait progressivement. Elle peut être accompagnée par de l'ascite (à un stade plus tardif, environ 4 semaines) et une diminution de d'appétit. Le stade d'encéphalopathie hépatique (et de coma), observé chez l'homme à un stade terminal, n'est pas atteint dans ce modèle (les animaux étant euthanasiés avant ce stade). Dans le modèle du NASH, il n'est pas attendu de nuisances ou d'effets indésirables sur les animaux.

Devenir

Chez la souris (procédures 1 à 4), le volume du prélèvement sanguin terminal et le prélèvement du foie (pour analyses, procédure 4) ne permettent pas le réveil et le maintien en vie. Chez le rat (procédures 4 et 5), le prélèvement du foie (pour analyses) ne permettent pas le réveil et le maintien en vie. Chez le rat (procédures 1 et 2), l'éventuelle toxicité long terme de la substance d'induction et l'eventuel prélèvement du foie (pour analyses) ne permettent pas le réveil et le maintien en vie.

Remplacement

En amont des tests in vivo sur les modèles d’hépatotoxicité aigue (acétaminophène, CCl4 ou concanavaline A), des tests in vitro (culture d'hépatocytes) peuvent être envisagés. Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires (comme par exemple les tests de viabilité cellulaire), les hétatocytes en culture ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer les pathologies dans un environnement biologique et immunologique intact comme cela est possible chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif. Nos analyses statistiques (Student'st test) indiquent qu’un effectif de 10 animaux par groupe (nombre de groupes variable en fonction du nombre de doses et de produits à testés) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Lorsque celà est possible, et chez le rat uniquement, des prélèvements sanguins intermédiaires (autre que terminal) peuvent être envisagés sur un même animal, permettant ainsi de générer des données sur la cinétique d'action de la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.

Raffinement

Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs, et sont suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.

Choix des espèces

L’impact de substances pharmacologiques sur le système hépatique du rat et de la souris dans les modèles décrits, sont prédictifs de leur efficacité en clinique. Principalement rongeurs sevrés, âge variant entre 3 semaines et 6 mois, conformément aux données historiques.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 50 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis passent des séances d'imagerie TEP, IRM, échographie et optique sous anesthésie, non pour produire des connaissances mais pour former des participants à une école d'imagerie du petit animal. Le porteur décrit ces ateliers comme une "offre" de formation aux différentes modalités disponibles dans sa structure, et présente l'imagerie comme un moyen de limiter la souffrance animale. Des tumeurs sont pourtant induites chez chaque souris pour les besoins de la démonstration.

Objectifs

Dans le domaine de l'exploration non-invasive, de nombreuses modalités d'imagerie ont vu le jour afin de se rapprocher au mieux de ce qui est fait et utilisé chez l'Homme. C'est dans ce contexte, qu'une formation à l'imagerie du petit animal a été créée en 2009. Depuis 6 éditions, elle accueille des participants de tous horizons et permet de s'approprier les modalités d'imagerie de façon théorique (cours) et en conditions réelles d'utilisation par l'intermédiaire de TP/ateliers. Dans le cadre de la session 2022 de l’école et plus particulièrement dans le cadre des 4 ateliers proposés aux participants de l'école par notre unité, 6 modalités d'imagerie seront présentées. Les ateliers proposés aux participants sont: 1/ Imagerie nucléaire (Tomographie par émission de positons (TEP)-FDG et Tomodensitométrie (TDM)); 2/ IRM; 3/ Echographie et 4/ Imagerie optique (bioluminescence et fluorescence). Pour l'ensemble de ces ateliers, nous utiliserons 50 souris SCID beige femelles de 8 à 10 semaines. 10 souris pour la procédure d’imagerie multimodale (TEP/CT, IRM, Echographie, Imagerie optique) réalisée quelques jours avant l’école d’imagerie. 40 souris pour les ateliers de l’école réalisés en présence des participants : - Tomodensitométrie (10 souris) - IRM (10 souris) - Echographie (10 souris) - Imagerie optique (bioluminescence et fluorescence) (10 souris)

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ces ateliers sont multiples, il s'agit tout d'abord de présenter les modalités, toutes disponibles dans notre structure, mais surtout de discuter de leurs spécificités respectives, avantages, inconvénients, coût financier, conditions de mise en œuvre et de démontrer l'intérêt de la multimodalité pour combiner les avantages et spécificités de chacune. Nous nous attacherons également à mettre en lumière les développements mis en œuvre par notre unité pour permettre le maintien du statut sanitaire des animaux par l'utilisation de cellule de confinement pour l'imagerie nucléaire et l'IRM ce qui permet d'ouvrir notre service à des animaux provenant de différentes zootechnies de statut sanitaire SPF tout en permettant que les animaux imagés puissent réintégrer ces zootechnies et poursuivre leur exploration selon d'autres procédures expérimentales alors qu'en règle générale, sans confinement, l'imagerie reste souvent terminale (les lots d'imagerie suivis par imagerie sont dédiés à l'imagerie puisqu'ils perdent leur statut sanitaire en quittant leur zone d'hébergement initiale).

Procédures

Les animaux subiront une greffe de cellules tumorales par voie sous cutanée (l'induction des tumeurs sera réalisée en moins de 7 minutes, induction de l'anesthésie comprise). Ces tumeurs étant parfaitement accessibles, nous serons vigilants à intervenir au moindre signe de douleur ou si la taille de la tumeur devait impliquer le sacrifice des animaux. Les autres procédures sont des procédures d'imagerie non invasives n'entrainant aucune douleur pour les animaux. Nous leur éviterons tout stress en les anesthésiant dès le début des sessions d'expérimentation. Durée des anesthésies selon la procédure d’imagerie : TEP FDG : durée d'anesthésie 45 minutes maximum, TDM : durée d’anesthésie 20 minutes maximum, IRM : durée d'anesthésie 90minutes maximum, échographie : durée d'anesthésie 40 minutes maximum, bioluminescence / fluorescence : durée d'anesthésie 60 minutes maximum.

Impact sur les animaux

Les modalités d'imagerie mises en œuvre ne causent aucune souffrance aux animaux. L’induction de tumeurs aux animaux affecte en revanche la santé des animaux. Aussi, nous serons vigilants à ce que cela n'entraine aucune douleur, aucune limitation de leur mobilité. Dans le cas contraire, les animaux seraient immédiatement sacrifiés. Le suivi quotidien du bien-être des animaux impliqués dans ce projet nous permettra de nous assurer que la taille des tumeurs n’atteigne pas 10% du poids des animaux.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet auront tous subi une induction de tumeur par injection sous cutanée de cellules tumorales. Tous seront tous mis à mort à l'issue des différentes procédures d’imagerie mises en œuvre.

Remplacement

L’exploration non invasive par imagerie est une méthode permettant d’assurer un suivi longitudinal en limitant la souffrance animale ainsi que le nombre d’animaux. Ceci sera répété à plusieurs reprises aux participants pendant les cours et pendant les ateliers.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour avoir au moins 2 à 3 souris par session d’ateliers afin de permettre aux participants qui le souhaitent de manipuler les souris en limitant leur stress (nous éviterons la manipulation multiple d’un même animal sur 2 heures d’atelier). Les souris qui n’auraient pas développé de tumeur après induction (procédure expérimentale n°1) pourront néanmoins être utilisées dans le cadre des ateliers ce qui évite de prévoir des animaux supplémentaires.

Raffinement

Tous les animaux sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur (directive européenne2010/63, décret n°2013-118 du 1er février 2013). Tout animal présentant des signes de souffrance, de léthargie, une perte de poids supérieure à 20% ou une tumeur de volume supérieur ou égal à 10% du poids corporel sera exclu de l’étude et sacrifié. Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Les animaux sont anesthésiés pour chaque procédure et une attention particulière est apportée au maintien de leur température corporelle pendant l'anesthésie. Le recours aux animaux dans le processus de formation est essentiel. L'objectif de la formation est en particulier d'informer les participants quant aux différentes modalités d'imagerie disponibles (dans notre structure et/ou ailleurs) et pouvant remplacer des procédures expérimentales nécessitant la mise en œuvre de nombre plus importants d'animaux (biopsies, biodistribution ex vivo etc.). Il est indispensable de mettre en images au cours des ateliers les potentialités de ces différentes techniques au travers d’exemples concrets et en permettant aux participants de faire eux-mêmes ces observations après avoir reçu des informations théoriques lors des sessions de formations précédents les ateliers. De plus, les modalités d’imagerie présentées par notre structure dans le cadre de l'école sont non invasives et n’entrainent pas de souffrance physique importante.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix dans les pathologies comme le cancer. C'est également un animal facile à manipuler et adapté aux modalités d'imagerie présentes dans notre structure. C’est dans ce contexte que seront utilisées des SCID Beige femelles de 8 à 10 semaines. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (8 à 11 semaines environ) après atteinte de la maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ce stade est également optimal pour le développement de tumeurs (l'induction tumorale sera effectuée à 8 semaines).