Procédures légères

54 saumons atlantiques vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque poisson est isolé dans un faible volume d'eau moins d'une heure, exposé à une seringue puis infesté par des poux marins, pour comparer une phéromone apaisante et trois analogues censés réduire les infestations en pisciculture. Le porteur indique tuer les poissons avant la métamorphose du parasite pour leur épargner l'irritation la plus sévère, et affirme qu'ils ne peuvent être ni réutilisés ni replacés pour des raisons sanitaires. Il revendique le recours à des "organismes entiers" capables de réagir aux composés, faute de méthode de remplacement.

Objectifs

Il s'agit d'une étude de recherche appliquée investiguant les mécanismes d'action physiologiques de la phéromone apaisante S.N.A.P. (Salmon Nest Appeasing Pheromone) libérée lors de l’éclosion des oeufs de saumon atlantique (Salmo salar). Le copépode marin, Lepeophtheirus salmonis, couramment dénommé "pou du saumon" est un ectoparasite du saumon atlantique, responsable de pertes économiques importantes dans les fermes d’élevage de l’hémisphère nord. Les moyens de lutte actuels sont limités par les problématiques de résistance aux traitements chimiques et de bien-être animal des traitements physiques et mécaniques. L'espèce de salmonidé la plus couramment produite en pisciculture est le saumon atlantique. En dépit de la sélection basée notamment sur la recherche de souches moins farouches, ce poisson continue de présenter des réactions de stress très intenses, aigües, mais aussi chroniques, ayant des conséquences physiologiques importantes, parmi lesquelles on note des altérations des défenses spécifiques et non-spécifiques contre les infections. Ces perturbations sont à l’origine de nombreuses infections bactériennes, virales, fongiques et parasitaires, qui conduisent à l’emploi de différents xénobiotiques (antibiotiques, antiparasitaires, antifongiques, antiseptiques divers), mais aussi de traitements physiques préjudiciables pour le bien-être des poissons, comme les traitements thermiques utilisés lors d’infestation par les poux marins (principalement Lepeophtheirus salmonis). La phéromone S.N.A.P. est une sécrétion composée de l'ester éthylique d'un acide oméga-7 et de l'ester éthylique d'un acide gras saturé. Le produit qui sera utilisé est une composition protégée par un brevet. La phéromone S.N.A.P. augmente l’activité des cellules à mucus de la peau et du tube digestif, et entraîne une diminution de l’attractivité des salmonidés pour les larves infestantes de poux marins. L’objectif de ce programme est de vérifier et comparer l’efficacité d’analogues structuraux de cette phéromone chez le saumon atlantique et d'ainsi mesurer leur capacité à limiter le recours aux traitements médicamenteux.

Bénéfices attendus

La comparaison de la phéromone S.N.A.P. et de ses 3 analogues permettrait de valider leurs effets sur le copépode Lepeophtheirus salmonis et de proposer ce(s) traitement(s) naturel(s) et dépourvu(s) de toxicité, tant pour les poissons, que pour le consommateur et l’environnement, comme alternative aux solutions actuelles. Le contrôle de ces infections et infestations constitue une cause importante de souffrance pour les salmonidés en pisciculture et les nombreuses stratégies actuelles de gestion des poux peuvent, paradoxalement, augmenter le risque de réinfestation en manipulant ou en stressant le saumon atlantique. Ce projet permettra de mettre au point des mesures préventives contre les infestations du saumon atlantique par le copépode Lepeophtheirus salmonis qui seront plus respectueuses du bien être animal que les pratiques actuelles encore autorisées. L'une d'elle consiste notamment à déplacer les saumons atlantiques depuis les cages en mer dans des bassins aménagés sur des bateaux plateformes. Les animaux sont alors plongés dans de l'eau douce chauffée à 37°C (quand l'eau des cages ne dépasse pas 14°C), et ce changement radical d'environnement s'accompagne d'un système de brossage des poissons, avant que ceux-ci ne soient remis en eau de mer.

Procédures

Les animaux seront soumis à un isolement social et à un environnement de volume limité: 1 évènement unique par animal de 1 h maximum. Les animaux seront soumis à l'administration d'un traitement dans le volume d'eau à l'aide d'une seringue, c'est à dire à une perturbation liée à la proximité d'un opérateur et à la présence de la seringue dans le cristallisoir: 1 seul évènement par animal pour 35 poissons (les 7 individus du lot témoin 2 ne sont pas concernés). Temps d'injection de 15 secondes environ. Les animaux subiront l'infestation par les copépodes Lepeophtheirus salmonis: 1 seul évènement par animal de durée maximale d'1 h pour 35 poissons (les 7 individus du lot témoin 2 ne sont pas concernés).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour les animaux sont le recours à un isolement social et la limitation de l'environnement à une enceinte de volume restreint à 5 L d'eau de mer: ces deux contraintes ne sont appliquées que pendant un laps de temps court, celui de la durée du test (< 1h). Deux autres événements potentiellement perturbateurs seront subis par quasiment tous les poissons: l’introduction de la seringue qui permet d'administrer le traitement (durée environ 15 secondes) et l’introduction des copépodes. Le témoin 2 se distingue des autres traitements par le fait qu'il n'y a pas introduction de la seringue dans le cristallisoir. Dans ce cas-là, l'opérateur n'approche donc pas sa main de l'enceinte pour réaliser un traitement. L'irritation engendrée par l’accrochage superficiel des larves de copépode Lepeophtheirus salmonis restera bénigne comme en atteste la littérature scientifique: la brièveté du test ne permet pas en effet à la métamorphose en larve chalimus de s’opérer, ce qui évite l’irritation plus sévère liée à l’ancrage du filament dans la peau du poisson. Les molécules utilisées dans les traitements mis en oeuvre sont sans effets indésirables attendus, soit parce qu'elles ne modifient pas la nature du milieu (absence de traitement ou eau de mer), soit parce qu'il s'agit d'une phéromone apaisante propre à l'espèce considérée, ou d'analogues structuraux de celle-ci, qui sont autorisés comme additifs alimentaires et sont dépourvus de toute toxicité. Ces molécules sont donc inoffensives pour les poissons, notamment à la dose de 6 ppm. Les autres manipulations, pêche, déversement, relèvent de pratiques zootechniques courantes qui ne justifient pas un classement en procédure expérimentale.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure car ils ne peuvent ni être ré-utilisés, ni être replacés, dans ce dernier cas pour des raisons sanitaires.

Remplacement

La présente étude possède une composante physiologique très importante. Elle doit nécessairement porter sur des êtres vivants, qui représentent des systèmes biologiques intégrés, où de multiples organes/tissus fonctionnent de façon associée et coordonnée. En effet, l’utilisation de traitements sémiochimiques est une stimulation sensorielle par exposition à des phéromones qui nécessite l’utilisation d’organismes entiers pouvant détecter et réagir aux composés testés. La détection de ces composés peut engendrer une cascade de réactions physiologiques pouvant mener à une modification du comportement ou de la physiologie de l’animal. Cela ne peut être obtenu et observé que sur animaux entiers pouvant pleinement exprimer leurs comportements et physiologies naturels. Il n'existe pas actuellement de méthodes de remplacement pouvant simuler ces changements suite à une stimulation sensorielle.

Réduction

Préalablement à cette étude, et afin de réduire le nombre de sujets nécessaires à la mise-en-évidence de l’efficacité des différents analogues potentiels, une étude des pharmacophores de la phéromone S.N.A.P. en bioinformatique a été menée, ce qui a permis de réduire leur nombre à 3. Avec les deux témoins (absence de traitement et traitement à l'eau de mer), la phéromone de référence et les 3 analogues, le nombre total de traitements à tester est ainsi ramené à 6. De précédentes études réalisées sur un nombre de sujets similaires par modalité, ont pu, via une ANOVA à un critère, complétée d'un test d'homoscédasticité (test de Levene) et de normalité (Shapiro-Wilk) et en utilisant la méthode des comparaisons multiples de Tukey, montrer une sensibilité suffisante pour mettre en évidence des différences significatives entre traitements. Différentes répétitions de tests comparables ont validé une bonne robustesse et reproductibilité du test d’attractivité, avec 7 sujets par groupe de traitement: c’est le nombre que nous avons retenu, portant l'effectif total d’animaux utilisés dans le test d’infestation à 42: 6 traitements X 7 individus/traitement.

Raffinement

Les manipulations susceptibles d’entraîner stress majeur ou douleur, seront réalisées post-mortem. La mise à l’isolement social et la limitation à un environnement de volume réduit seront limités au temps du test (< 1h). De plus les cristallisoirs seront placés sous une tente en nylon blanc afin d'éviter que la présence et les mouvements des opérateurs à proximité, ou qu'une intensité lumineuse trop forte, ne génèrent une perturbation supplémentaire des poissons. La fixation des copépodes, à la surface de la peau, reste une irritation bénigne et superficielle, ainsi qu’en témoigne la littérature. Les poissons sont sacrifiés avant la métamorphose du copépode Lepeophtheirus salmonis en chalimus, ce qui écarte les animaux de l'infestation par ce stade du parasite qui possède un ancrage cutané générateur d’inflammation.

Choix des espèces

Il s’agit de l'espèce de salmonidés la plus massivement produite en aquaculture. Les saumons seront au stade smolt, jeunes sujets pesant environ 200g. Ce stade est compatible avec le test d’attractivité, les smolts constituant la population la plus attractive pour les poux.

136 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles sont soumises à des séances d'IRM sous anesthésie, un groupe subissant jusqu'à cinq anesthésies répétées de deux heures pour en optimiser les doses, dans le cadre d'une étude sur l'athérosclérose cérébrale et les troubles cognitifs vasculaires. Le porteur indique qu'au réveil les souris peuvent avoir du mal à se réchauffer et présenter une posture voûtée, et qu'une déshydratation des yeux peut survenir. Il précise que les souris servant à régler l'anesthésie sont tuées, les autres étant gardées vivantes pour un transfert vers un autre établissement, et décrit le modèle animal comme le seul permettant d'étudier ces atteintes multifactorielles.

Objectifs

L’accumulation de cholestérol dans les cellules est associée à la survenue de pathologie du cerveau telles que les maladies d’Alzheimer, de Parkinson, ou Niemann-Pick, caractérisées – entre autres – par des altérations dans la communication entre les différentes régions du cerveau. En effet, l’accumulation de cholestérol dans certaines cellules est à l’origine de la formation d’atherosclérose dans les vaisseaux cérébraux, correspondant à une atteinte de la paroi interne des artères. Ce type d’atteinte peut donc aboutir à des troubles vasculaires dans le cerveau, entrainant des démences vasculaires, associées aux pathologies citées plus haut. Deux protéines semblent jouer un rôle-clé pour empêcher l'accumulation de cholestérol dans les cellules et la prévention de l''athérosclérose. L'objectif est d’identifier les différents liens et implications du régime alimentaire et de l’activité de ces deux protéines, dans la formation d’athérosclérose et la survenue d’altérations de la communication cérébrale.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude devraient contribuer à mieux comprendre les conséquences au niveau de la connectivité cérébrale d'une accumulation de cholestérol dans les cellules jouant un rôle central dans le developpement de l'athérosclérose, aboutissant à des troubles cognitifs vasculaires ou démences vasculaires.

Procédures

Les animaux utilisés pour l'étude seront soumis à une anesthésie combinée induite par voie veineuse et par voie gazeuse lors de l'IRM, pour un temps maximal de 1h. Pour optimiser les doses d'anesthésie à utiliser au cours de l'IRM, un groupe de souris sera soumis à des anesthésiées répétées (5 maximum) d'une durée de 2h maximum chacunes espacées de 2 semaines.

Impact sur les animaux

Après l’examen IRM, pendant la phase de réveil, l’animal peut présenter des difficultés à se réchauffer ou à récupérer de l’anesthésie, observable par des déplacements lents, une posture voutée et une absence de toilettage. Une potentielle altérations des yeux liés à une déshydratation au cours de l’examen IRM peut survenir.

Devenir

Les souris seront mises à mort après la détermination des conditions optimales d’anesthésie et gardées en vie après les IRMs pour transfert dans un autre établissement.

Remplacement

Le modèle animal est, pour le moment, le seul modèle qui permet d’étudier dans son ensemble les phénomènes complexes mis en oeuvre dans les maladies neurodégénératives et les troubles cognitifs. En effet ces atteintes sont multifactorielles et nécessite un grand nombre d’acteurs comme les cellules de l’immunité, les particules de cholestérol circulantes (les LDL ou mauvais cholestérol), les globules rouges entre autre.

Réduction

Le nombre de souris est réduit au minimum d’animaux nécessaire afin d’assurer l’efficacité des tests statistiques et donner des résultats statistiquement fiables en fonction des expériences réalisées : optimisation de l’anesthésie pour l’IRM et exploration IRM.

Raffinement

Durant l'examen IRM, le raffinement sera respecté par l'usage d'une anesthésie afin de réduire au maximum le stress de l'animal. La température et la respiration des animaux seront en permanence surveillées par un système de monitorage. En cas de chute de la température et/ou de la respiration non gérable, l'acquisition en cours sera immédiatement interrompue et l'animal sorti de l'IRM. Il sera alors placé dans une cage mis sous une lumière chauffante jusqu'à son réveil, sous surveillance. L’établissement de points-limites permettra de soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus utilisée pour la création de modèle génétiquement modifiée grâce aux connaissances importantes de sa génétique, et c'est pourquoi nous avons choisi cette espèce pour la création de notre modèle. Nous utiliserons des souris adultes de 3 mois, afin de déterminer l‘état de la maladie sur le plan de l'IRM fonctionnelle. Les souris de 3 mois ont atteint leur taille et poids adulte, ce qui permet une meilleure reproductibilité des résultats.

1 332 poissons, carpes, tanches, gardons et sandres, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réutilisés ou gardés comme géniteurs. Ils sont répartis dans des étangs expérimentaux et pesés puis mesurés à deux reprises sous anesthésie, pour tester l'effet d'une séparation temporaire des espèces sur la productivité et la biodiversité d'une polyculture d'étang. Le porteur décrit un projet à finalité zootechnique visant à optimiser les pratiques d'élevage tout en préservant la richesse en espèces. Il affirme que la modélisation in silico de ces interactions n'est pas encore possible mais que les données recueillies doivent y contribuer.

Objectifs

L’expérience Pacage en étang s’inscrit dans le cadre d’un projet financé par l’Europe, qui a pour objectif d’établir de nouvelles pratiques alliant le respect de l’environnement, la biodiversité et la productivité des polycultures de poissons en étang. La définition de la composition de la polyculture est le thème central de ce projet, c’est-à-dire d’être capable de définir les différentes espèces de poissons à élever et d’en établir leurs effectifs. Ces propositions de pratiques prendront en compte l’ensemble des compartiments biologiques du système et la diversité qui le compose pour produire la ressource de manière plus durable. Ce projet s’appuie sur une co-construction de scenarii avec des représentants professionnels et sur une démarche expérimentale en étang. L’expérience Pacage en étang vise à tester l’effet d’une segmentation temporaire de l’étang, permettant la séparation des espèces (carpes, tanches, gardons, sandres), sur la productivité totale en poisson, la croissance de chaque espèce, le recrutement en juvéniles, les paramètres physicochimiques du milieu et la biodiversité en invertébrés (macro-invertébrés et zooplancton) et en macrophytes.Le projet vise à caractériser les interactions entre les facteurs du milieu, les différentes espèces et la biodiversité aquatique, dans la conduite de la polyculture de poissons en étang. En particulier, nous cherchons à caractériser l’effet du regroupement temporaire des espèces ayant différents rôles fonctionnels et trophiques sur la productivité totale en poisson, la croissance de chaque espèce, le recrutement en juvéniles, les paramètres physicochimiques du milieu et la biodiversité en invertébrés (macro-invertébrés et zooplancton) et en macrophytes. Les rôles majeurs des différentes espèces retenues sont, pour la carpe commune : bioturbation et croissance rapide ; pour la tanche et le gardon : production de juvéniles et alimentation opportuniste ; pour le sandre : prédateur pour invertébrés et juvéniles de poisson. Les données récoltées permettront d’alimenter une modélisation trophique des systèmes d’étangs en polyculture, à même de représenter l’effet des interactions entre espèces.

Bénéfices attendus

L’expérience pacage en étang doit permettre d’éclairer les interactions entre espèces dans le cadre de polyculture de poisson en étang. Le rôle de ces espèces et de leur conduite sur la biodiversité sera mis en évidence dans l’objectif d’optimiser les pratiques d’élevage pour améliorer les impacts sur l’environnement et préserver la richesse en espèces, tout en maintenant une production rentable pour l’exploitant. De façon plus générale, ce travail doit contribuer aux réflexions en cours sur le rôle de la diversité sur la robustesse et la résilience des systèmes d’élevage.

Procédures

Mesures biométriques non invasives réalisées deux fois, de façon ponctuelle.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour les animaux consistent en la manipulation en début et fin d’expérience, afin de réaliser des mesures (poids, longueurs) individuelles et les répartir dans leurs structures d’accueil (étangs expérimentaux en début d’exprience, étangs de stockage en fin d’expérience).

Devenir

Les poissons n’ayant subi aucun traitement invasif, pourront être réutilisés dans des expériences ultérieures ou servir de géniteurs pour utilisation interne à l’installation expérimentale.

Remplacement

Cette expérience est principalement à vocation zootechnique. Elle nécessite le recours aux espèces utilisées en élevage classique. Le manque de recul et de modèle sur les interactions entre les espèces aquatiques d’élevage, il n’est pas encore possible de réaliser ce type d’expérience in silico. Néanmoins, les données récoltées dans le cadre de l’expérience, ont vocation à alimenter des démarches de modélisation qui vont dans le sens de la limitation au recours aux animaux à l’avenir.

Réduction

Les proportions des différentes espèces et leurs effectifs ont été déterminés pour représenter les pratiques d’empoissonnement en polyculture d’étang courrantes. Il est n’est pas possible de les diminuer sans perdre le caractère plausible des pratiques. Le nombre de trois répliquats est le minimum que nous pouvons admettre pour obtenir des résultats statistiquement exploitables.

Raffinement

Afin de limiter les nuisances envers les poissons, les conditions de contention sont surveillées, notamment en maintenant un renouvellement d’eau lors des stockages temporaires et le contrôle des comportements. Avant chaque manipulation pour mesures (non invasives), les poissons sont anesthésiés, afin de limiter le stress, les risques de chute, limiter la durée hors d’eau en augmentant la rapidité des mesures de biométrie. La phase de réveil est contrôlée dans des bassins séparés par espèce, avec renouvellement d’eau.

Choix des espèces

Les espèces choisies : carpe commune (Cyprinus carpio), tanche (Tinca tinca), gardon (Rutilus rutilus) et sandre (Sander lucioperca), sont représentatives des polycultures de poissons d'étangs extensifs ou semi-intensifs en France. Ce sont par ailleurs, des espèces particulièrement tolérantes aux bas niveaux de qualité d’eau, ce qui les rend tolérantes aux manipulations. Les carpes et les sandres sont de petites tailles (un an de croissance), afin d’optimiser leur croissance dans le dispositif. Les tanches et les gardons sont des géniteurs afin d’optimiser leur reproduction.

64 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent une injection intraveineuse d'un agent fluorescent censé marquer les nerfs, puis sont tués avant une chirurgie de dissection des nerfs, pour évaluer un outil d'aide au repérage nerveux en chirurgie maxillo-faciale. Le porteur affirme n'attendre aucune nuisance, la toxicité ayant selon lui déjà été testée et le seul geste sur l'animal vivant étant l'injection sous anesthésie. Il décrit l'expérimentation animale comme "incontournable" pour l'anatomie une fois les tests in vitro réalisés.

Objectifs

Les agents de contrastes fluorescents seront injectés in vivo par voie intraveineuse. De par leur conception, ces agents sont capables de marquer les nerfs en les rendant fluorescents et détectables en intraopératoire lors d’une chirurgie guidée par l’imagerie proche infra-rouge. La visualisation immédiate et en temps réel des nerfs nous permet donc de mieux opérer et enlever les tissus affectés sans endommager les nerfs présents dans le champs opératoire et parfois difficiles à voir par le chirurgien. C’est en particulier un problème aigu pour la chirurgie maxillo-faciale. Chez le rat qui nous servira de modèle, au cours d’une chirurgie cervicale il est possible de repérer les nerfs moteurs équivalent au nerf vague (X) chez l'humain et le nerf grand hypoglosse (XII) chez l'humain. Des dissections préliminaires sont nécessaires pour étudier l'anatomie du nerf facial (VII) chez l'humain au sein de la glande salivaire principale chez le rat (glande parotide chez l'humain).

Bénéfices attendus

Le premier bénéfice attendu de ce projet est de nous permettre de bien évaluer les performances des agents de contrastes de notre collaborateur. Après injection nous vérifierons donc la capacité de ces molécules à bien colorer les nerfs chez le rat. En termes de chirurgie, les bénéfices attendus concernent : - La qualité du repérage des fibres du nerf laryngée inferieur dans la neurotomie sélective des nerfs laryngées inférieures. Chez les patients, l’endommagement de ces nerfs entraine des problèmes dysphonie spasmodique, qui résistent aux injection de toxines botulique. Nous vérifierons donc que ces nerfs peuvent être très clairement visibles sous lumière infrarouge lors de la chirurgie. - Qualité du repérage du nerf récurrent du larynx pour éviter les paralysies laryngées - Qualité du repérage du nerf laryngé supérieur. Au final, si ces expériences précliniques donnent satisfaction, nous envisageons de lancer des procédure cliniques avec notre partenaire.

Procédures

injection intra veineuse, une fois, 5 minutes

Impact sur les animaux

Nous n'attendons pas de nuisance ni d'effet indésirable sur les animaux. En effet, la toxicité a déjà été testé par notre collaborateur et l'injection de ce produit aux rongeurs ne pose pas de problème. De plus les aimaux seront mis à mort avant la dissection, donc aucun geste ne sera effectué sur les animaux vivants à part l'injection du produit en intra veineuse sous anesthésie gazeuse.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure 1 car ensuite une chirurgie autour des nerfs sera effectuée sur l'animal.

Remplacement

A ce stade du projet, tous les tests in vitro ont été effectués. Le modèle murin nous semble le plus approprié, il permet de se rapprocher d'un grand nombre des caractéristiques humaines. De plus, puisqu'il s'agit ici d'anatomie, l'expérimetation animale est incontournable.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés afin d’obtenir des résultats significativement exploitables et valides. Dans la première partie du protocole, n=3 est suffisant car nous nous attendons à des résultats très homogènes. Dans la seconde partie du protocole, une partie des nerfs disséqués sans la caméra ne seront pas endommagés, nous devons donc avoir 20 individus par groupe expérimentaux afin d'avoir une puissance statistique nécessaire.

Raffinement

Le composé et la stratégie ont été testés in vitro sur des cultures cellulaires. Ces expériences nous ont permis de déterminer des doses efficaces qui seront injectées in vivo. Toutes les procédures expérimentales seront réalisées dans un établissement autorisé et en stricte conformité avec le comité local de protection des animaux, les lignes directrices de l'UE (directive 2010/63/UE) et le Comité national français (2010/63) . Les animaux seront hébergés et surveillés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément. La conception et l’application des procédures expérimentales, le soin et l’hébergement des animaux seront effectuées par du personnel compétent et formé. La plus grande vigilance sera apportée aux animaux afin de prévenir, minimiser et/ou abroger la souffrance et le stress. L'état des animaux sera surveillé durant les 24h maximum entre l'injection intra-veineuse et la mise à mort. La mise à mort sera faite sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Le modèle rat nous semble le plus approprié, il permet de se rapprocher d'un grand nombre des caractéristiques humaines. Les animaux seront utilisés "à l'âge adulte" c'est à dire à partir de l'âge de 2 mois. A cet âge, les animaux sont de bonne taille et cela facilite la chirurgie post mortem.

30 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Leur cycle est synchronisé par éponge vaginale et injections hormonales, puis elles sont inséminées et tuées huit jours après pour prélever leur utérus et récupérer les embryons, afin d'étudier trois mutations récessives qui réduisent la fertilité des élevages ovins laitiers. Le porteur présente les bénéfices d'abord comme "technico-économiques", limitant les pertes liées à la baisse de fertilité, puis évoque la santé des animaux. Il affirme qu'aucune alternative n'existe et que l'espèce ovine est étudiée pour elle-même.

Objectifs

La ségrégation de mutations récessives de l'ADN dans les populations d’élevages en sélection peut conduire à des anomalies génétiques lorsqu’elles se retrouvent à l’état homozygote (2 copies mutées) chez un individu. Ces anomalies peuvent être bégnines, affectant la couleur du pelage, la taille, ou l’absence de cornes par exemple, d’autres sont délétères. Ces mutations délétères peuvent affecter la survie de l’embryon au cours du développement précoce et/ou induire des avortements au cours de la gestation, impactant négativement les résultats de fertilité. Elles peuvent également donner lieu à de la mortalité des jeunes animaux (en périnatal ou avant le sevrage). Elles peuvent encore créer des altérations morphologiques handicapantes, ou de multiples syndromes affectant la santé et le bien-être. Il y a donc un enjeu socio-économique pour les filières d'élevage dans la découverte et le contrôle de la diffusion de ces mutations dans les populations en sélection de façon à limiter la procréation d’animaux homozygotes et ainsi limiter l'impact négatif sur la santé et le bien-être. Une étude préliminaire de génétique chez des ovins laitiers a permis de mettre en évidence trois de ces mutations nommées « m1 à m3 » qui affectent trois gènes importants pour le métabolisme et la multiplication cellulaire. Les données populationnelles chez ces moutons indiquent une fertilité réduite (baisse de réussite à l’insémination animale) lorsque deux animaux porteurs supposés de ces mutations sont accouplés, laissant penser à une action délétère de ces mutations sur le développement embryonnaire précoce. L’objectif de ce projet expérimental est d’étudier l’effet des mutations « m1 », « m2 » et « m3 » à l’état homozygote (m/m) chez le mouton pour expliquer le défaut de fertilité dans l’accouplement d’animaux hétérozygote m/+. Ainsi, la réalisation d’accouplements orientés entre individus porteurs hétérozygotes (m/+) pour ces mutations est une étape essentielle pour produire des embryons homozygotes m/m et établir si la période du développement embryonnaire précoce est affectée. Avec un déterminisme supposé récessif (les deux copies du même gène doivent être mutées pour observer un effet), il y a une chance sur quatre qu’un tel accouplement génère un embryon homozygote (m/m) atteint d’une anomalie.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de pouvoir objectiver le/les phénotype(s) affecté(s) par des mutations récessives supposées délétères découvertes chez les ovins laitiers. Les bénéfices attendus sont multiples. D’un point de vue scientifique et cognitif, la réalisation de ce projet permettra d’apporter à court terme des connaissances de biologie fondamentale sur le rôle et le fonctionnement des gènes touchés par les mutations « m1 », « m2 » et « m3 » dans le développement des embryons de mammifères. D’un point de vue appliqué, ce projet bénéficie du soutien de l’interprofession en génétique pour l’élevage ovin. Par une gestion adaptée des reproducteurs porteurs de ces mutations, les bénéfices attendus à moyen terme sont d’ordre technico-économique d’une part pour limiter les pertes économiques dues à la baisse de fertilité engendrée (entretien de brebis vides, coûts vétérinaires pour avortements, manque à gagner pour la production laitière et la vente d’agneaux) et d’autre part pour améliorer la santé et le bien-être des animaux (baisse de la mortinatalité et de l’apparition d’anomalies génétiques handicapantes directement imputables à ces mutations).

Procédures

Pour réaliser les inséminations animales chez la brebis en vue de la production d’embryons après une stimulation ovarienne, nous devons préalablement synchroniser le cycle reproductif de chaque brebis par l’introduction intravaginale (J0) d’une éponge imprégnée d’une hormone progestagène (une pose d'éponge dure 2min) que l'on retire 14 jours plus tard (J14, le retrait prend quelques secondes). La stimulation ovarienne est réalisée par l’injection intramusculaire d'hormones gonadotropes en 6 doses décroissantes, avec 12h d’intervalle entre chaque injection et sur 3 jours (entre J12 et J14, chaque injection dure quelques secondes). Puis, l'insémination par dépôt intra-vaginal de la semence est réalisée 55h après retrait de l’éponge (J16, l'insémination dure 2 minutes). Huit jours après l’IA (J24), les brebis ainsi inséminées seront euthanasiées pour le prélèvement post-mortem des utérus et la collecte et l'analyse des embryons présents dans les cornes utérines (l'injection létale dure quelques secondes).

Impact sur les animaux

Cette procédure (sans euthanasie) est classiquement utilisée pour produire des embryons en centre d’élevage agrée des entreprises de sélection ovine et n’induit pas d’effets indésirables récurrents connus. Néanmoins, la procédure nécessitera plusieurs contentions des brebis (pose de l’éponge, intravaginale, injections intramusculaires, insémination) qui peuvent générer du stress durant les quelques minutes (5 min maximum) que durent les contentions.

Devenir

La procédure expérimentale pour produire des embryons est de classe légère. Cependant, le projet scientifique dans lequel s'inscrit cette procédure expérimentale nécessite la récupération des embryons produits pour analyse génétique. Pour cela, les 30 brebis seront euthanasiées 8 jours après la dernière intervention de la procédure (insémination animale) pour la collecte post-mortem des utérus contenant les embryons.

Remplacement

La réalisation et le suivi d’accouplements orientés pour produire des embryons ovins du génotype désiré ne peuvent se faire que par l’utilisation d’animaux vivants. Aucune alternative existe.

Réduction

Nous souhaitons obtenir une vingtaine d’embryons homozygotes mutés pour chaque mutation. Le projet utilisera 30 brebis (10 brebis par mutation, 3 mutations étudiées) identifiées comme porteuses d’une de ces mutations récessives délétères pour obtenir le nombre d’embryon souhaité. Cette estimation prend en compte l’efficacité du traitement de superovulation (12 ovulations/brebis en moyenne), le taux de fécondation après insémination (80%) et le taux de récupération des embryons (85%). Ainsi, la réalisation d’accouplements à risque de 30 brebis permettra d’obtenir environ 240 embryons (=30*12*0,8*0,85). Parmi ces 240 embryons, un quart devrait être homozygote, soit une soixantaine. De ce fait, ce projet permettra d’obtenir environ 20 embryons homozygotes par mutation étudiée permettant l'observation d'une altération du développement embryonnaire précoce par comparaison aux 20 autres embryons non porteurs de la mutation (observation d'un écart de 5 embryons au stade blastocyste entre les deux groupes, avec une puissance de 88%). Sans l’utilisation de biotechnologies de la reproduction (stimulation ovarienne, insémination animale), le nombre de brebis nécessaire serait de 210 pour obtenir 240 embryons (1,5 ovulation/brebis en moyenne, 90% de fertilité en monte naturelle, 85% de récupération des embryons) avec la gestion d’au moins 5 béliers en 2 lots de lutte.

Raffinement

Les poses d’éponges intra-vaginales, injections intramusculaires et inséminations seront réalisées par du personnel animalier expérimenté et formé pour ce type de gestes. Grâce au suivi journalier, toute suspicion d’impact négatif sur la santé et le bien-être des animaux sera pris en compte par un traitement médicamenteux vétérinaire adaptée. Ce projet sera réalisé en condition d’élevage des ovins offrant une litière paillée, un accès à l'eau et à la nourriture sans restriction, et respectant le comportement grégaire de cette espèce.

Choix des espèces

Les mutations identifiées ne sont présentes que chez les ovins. Les conséquences technico-économiques des pertes embryonnaires affectant la fertilité ne concernent que l'espèce ovine. L'espèce ovine est donc étudiée pour elle-même. Pour réaliser les accouplements nécessaires, les brebis seront adultes et cyclées, aptes à la reproduction (2 à 7 ans).

56 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis gardés vivants pour une seconde étude ultérieure. Ils reçoivent une injection d'halopéridol induisant une catalepsie réversible, suivie d'une injection de venin d'abeille ou de son dérivé, pour tester un effet contre l'akinésie dans un modèle pharmacologique de la maladie de Parkinson. Le porteur rappelle qu'un premier essai clinique du venin d'abeille n'a pas amélioré le score moteur des patients et n'a réduit que les doses de L-DOPA. Il affirme que l'étude des performances comportementales rend l'utilisation des animaux "indispensable".

Objectifs

L'objectif du projet est d'évaluer le rôle bénéfique d'un venin d'abeille (Bee Venom, BV), sans son composé allergène la phospholipase A2 (sPLA2), appelé deltaBV, sur les symptômes mesurés dans un modèle pharmacologique de la Maladie de Parkinson (MP) par une approche comportementale. Nos études récentes ont démontré une action bénéfique du BV (alyostat) dans des modèles de la MP chez le rongeur. L'étude préliminaire clinique, quant à elle, n'a pas reporté d'effets bénéfiques marqués. Ces études ont été évaluées positivement par les comités scientifiques des fondations suivantes (Association France Parkinson, Fondation de France, AP-HP) et du CNRS. Notre projet vise donc à tester le delta BV, comparé au BV, afin d'établir les doses efficaces sans induire d'effets secondaires (choc anaphylactique) . Ce projet posera les bases à une étude clinique qui sera menée à plus long-terme chez des patients parkinsoniens. En effet, la première étude clinique menée chez un petit nombre de patients après une injection mensuelle de BV à faible dose pendant 1 an, n'améliore pas le score moteur (UPDRS) mais permet de diminuer les doses thérapeutiques de L-DOPA administrées chez les patients. Au vu du faible effet observé, il serait nécessaire de tester le BV à plus forte dose dans une nouvelle cohorte. Pour cela, le deltaBV, sans la sPLA2 responsable des allergies et récemment synthétisé à Sophia Antipolis à partir du BV (américain), doit être testé au préalable chez l'animal dans un modèle d'akinésie parkinsonienne (défaut d'inititation motrice). Nous comparerons les effets de la forme non allergène , deltaBV, à ceux obtenus avec le BV (américain) dont il est extrait. Cette première étude (présente DAP) dans le modèle d'akinésie induite par l'halopéridol (modèle pharmacologie de la MP) nous permettra de mettre en évidence les doses significativement efficaces pour contrecarrer l'akinésie et de tester dans une deuxième étude (seconde DAP) dans un modèle lésionnel de la maladie avec plusieurs tests moteurs. De plus, l'ensemble des expérimentations sera filmé de sorte qu'il fournira des données pour plusieurs séances de travaux dirigés dans le cycle 2 du Bachelor Universitaire Technologique de Génie Biologie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont multiples : - Reproduction de l'effet bénéfique du BV américain en comparaison avec le BV alyostat - Mise en évidence de l'effet bénéfique du delta BV : pré-requis à une étude ultérieure chez l'homme - Données sur la concentration efficace du BV et deltaBV sur l'akinésie motrice- Collecte de données pour la réalisation d'un TD

Procédures

Pour l'étude sur le modèle pharmacologique, les animaux reçoivent tous une injection ip d'halopéridol suivie d'une injection ip de BV/dBV selon le groupe. Ces deux injections seront réalisées à une demi-heure d'intervalles et ceci une seule fois.

Impact sur les animaux

L'injection d'halopéridol (1 mG/kG, volume injecté 1mL/kG) induit une catalepsie réversible en 12 H. L'injection intrapéritonéale de BV (1/5/5 µG/kG, volume injecté 1mL/kG) ne devrait pas induire de choc anaphyllactique car des études antérieures utilisant les mêmes concentrations d'un BV d'une autre composition n'en avait pas engendré.

Devenir

A la suite du test de catalepsie, les animaux seront hébergés dans l'animalerie par cage de 2 dans un environnement enrichi et seront laissés au repos jusqu'à l'obtention de l'autorisation pour la 2ème étude.

Remplacement

Cette étude concerne les effets du BV et du dBV sur des performances comportementales. L'utilisation des animaux est donc indispensable.

Réduction

Des études précédentes utilisant ce modèle nous ont permis de réaliser des statistiques en amont afin de réduire le nombre d'animaux tout en gardant une significativité de 5%.

Raffinement

Tout au long de cette étude, les animaux seront observés, pesés et manipulés. Ils seront maintenus par 2 dans un environnement enrichi avec eau et nourriture ad lib. Pour éviter le stress lors des injections intrapéritonéales, les animaux seront manipulés durant la semaine précédente.

Choix des espèces

Le rat représente le modèle de choix dans cette pathologie au regard des différents tests comportementaux qu'il peut effectuer. Par ailleurs, la plupart des études portant sur cette neuropathologie repose sur le modèle rat de la MP, ce qui permet de disposer d'une littérature abondante sur laquelle s'appuyer. Enfin, nos travaux antérieurs sur le venin d'abeille ont été réalisés chez le rat, ce qui permet de comparer les résultats issus de nos projets. Le projet vise à établir l'effet bénéfique du BV et du dBV chez le sujet jeune adulte. De façon à pouvoir réutiliser ces rats (coordonnées stéréotaxiques pour induire la lésion), nous utiliserons des animaux d'environ 4 mois.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, dans le cadre de travaux pratiques d'étudiants en licence de nutrition animale. Chaque année, 8 à 10 anciennes reproductrices "vouées à la mort" subissent un test de tolérance au glucose ou à l'insuline, avec coupure du bout de la queue et six prélèvements de sang pratiqués par les étudiants. Le porteur affirme n'avoir jamais observé de couinement ou de comportement anormal lors de ces prélèvements et présente le stress de manipulation comme le seul effet négatif. Les souris sont anesthésiées à l'isoflurane puis décapitées par l'enseignant à la fin de la séance.

Objectifs

La présente demande concerne un projet d’enseignement destiné à des étudiants de 3ème année de Licence Professionnelle TCNA Technico-Commerciale en Nutrition Animale. La LP TCNA forme des technico-commerciaux en nutrition/alimantation animale.

Bénéfices attendus

L'analyse de la régulation glucidique chez la souris est une base de travail pour aborder certaines physiopathologies dont les signes cliniques ne sont pas toujours aisés à détecter selon les animaux.

Procédures

Travaux pratiques sur 8 à 10 souris vouées à la mort (vieux reproducteurs...) par an, soumisent à soit un test de tolérance au glucose intrapéritonéal (IGTT) soit à un test de tolérance à l’insuline (ITT); les injections étant pratiquées par l'enseignement qui par ailleurs prend en charge la coupe du bout de la queue de l'animal. Deux microlitres de sang, récupérés en massant délicatement la veine de la queue de l'animal à chaque prise avec un nombre total de 6 par animal (de T0 avant injection à T90 min), est suffisant pour que la détection sur la bandelette de l'appareil de mesure de la glycémie puisse être effectué. Les animaux manipulés en matinée on été mis à la diete par retrait de nouriture le soir précédent.

Impact sur les animaux

La validité de ce test est largement tributaire des méthodes de manipulation des animaux. Les étudiants qui pratiquement cette procédure doivent se familiariser avant le test avec les méthodes de manipulation afin de réduire le niveau d'anxiété de l'animal. Les étudiants qui pratiquent la récupération au bout de la queue de 6 gouttes de sang de 2 µl au cours des 90 min doivent se familiariser avant le test avec les souris afin de réduire le niveau d'anxiété de l'animal. Lors de ce type de prélèvements réalisés anciennement courament au laboratoire de recherche pour des travaux sur les effets de nouveaux neuropeptides dans la régulation de la glycémie, aucune souris n'a émis de couinement ou présentée un comportement anormal indiquant une gène. Concernant la diminution de la glycémie lors du test de tolérance à l’insuline (ITT), si il survient une chute en dessous de 0.5 g/L l'enseignant réalise instantanément une injection du glucose à la souris (2kg/kg de poid corporel).

Devenir

A l'issue des expériences, après la cloture de la séance, les animaux sont euthanasiés par l'enseignant. Les souris sont profondément anesthésiées à l'isoflurane avant décapitation.

Remplacement

L’objectif de ce TP est de familiariser des étudiants de L3 à une technique de diagnostique clinique. Il n’existe pas de modèle de remplacement leur permettant d’acquérir ce type de connaissances. Grâce à leur double compétence scientifique/technique et commerciale, les diplômés apporteront un conseil technique et répondront aux attentes de leurs clients/professionnelles du soin et de l’élevage des animaux.

Réduction

Tous les efforts sont et seront faits pour minimiser le nombre d'animaux utilisés. Afin de réduire le nombre d’animaux, il est à préciser que nous utilisons que des animaux voués à être mis à mort (anciens reproducteurs…). De plus les étudiants travaillent par binôme.

Raffinement

L’enseignant veille tout au long de la séance de TP à ce que les animaux soient manipulés calmement et un dialogue permanent est entretenu entre les participants concernant le bien-être des animaux ainsi que les méthodes d’analgésie, d’anesthésie et du sacrifice des animaux. Il n'est anticipé aucun effet négatif sur les animaux autres que le stress lié à leur manipulation.

Choix des espèces

La souris de laboratoire est un modèle adapté à ce type d’expérience. La manipulation est aisée y compris pour des étudiants. La physiologie de cette espèce est bien connue. La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille réduite, taux de fécondité important, coûts d’entretien réduit Les animaux seront des adultes.