Procédures légères
Impact de la délocalisation cytoplasmique de la protéine FUS dans les oligodendrocytes sur le développement de symptômes moteurs modélisant la sclérose latérale amyotrophique et la démence frontotemporale
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
606 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 580 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une mutation modélisant la sclérose latérale amyotrophique, sont suivies jusqu'à douze mois avec des tests moteurs, comportementaux et de mémoire, reçoivent pour certaines un traitement par la cuprizone dans l'alimentation, puis sont tuées à la fin du projet. Le porteur indique que les symptômes moteurs ne sont pas visibles à l'œil nu et n'entraînent pas de paralysie, et que le traitement provoque une perte de poids restant en principe sous 15 %. Il affirme qu'aucun système de coculture ni modèle cellulaire n'est assez complexe pour étudier ces interactions du système nerveux.
Objectifs
La sclérose latérale amytrophique est une maladie neurodégénérative qui affecte les neurones moteurs et entraine la paralysie progressive du patient jusqu'à la mort. Nous soupçonnons d'autres types cellulaires d'être impliqués dans la maladie, notamment des cellules de soutien des neurones moteurs. Ces cellules de soutien ont pour rôle de mettre en place une gaine autour des neurones afin d'accélérer l'influx nerveux et de nourrir les neurones. L'objectif de ce projet est d'établir si ces cellules de soutien sont affectées par la maladie, si leur fonction en est altérée, et si elles sont responsables de la mort des neurones moteur.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'affiner les connaissances que nous avons de la SLA, et de préciser la fonction de certaines protéines mutées dans cette maladie, ainsi que les types cellulaires affectés. Ces connaissances auront un impact bénéfique sur les patients et sur leur prise en charge.
Procédures
Certains des animaux de ce projet seront suivis longitudinalement pendant 12mois. Ils réaliseront un test moteur d'une durée de 3x5 minutes tous les deux mois , un test comportemental d'une durée de 5 minutes à 5 et 10 mois, et un test de mémoire à 10 mois d'une durée de 5 minutes + 3x5 minutes + 5 minutes, avec 15 minutes de repos entre chaque partie du test. D'autres animaux de ce projet seront traités à l'âge de 3 mois pendant 6 semaines, puis le traitement sera interrompu pendant 6 nouvelles semaines. Ces animaux traités réaliseront 3 tests moteurs de 5 minutes espacés de 6 semaines (avant le début du traitement, après les 6 semaines de traitement et 6 semaines après l'arrêt du traitement), ainsi que 3 tests comportementaux d'une durée de 5 minutes espacés de 6 semaines (avant le début du traitement, après les 6 semaines de traitement et 6 semaines après l'arrêt du traitement).
Impact sur les animaux
La mutation entraine un phénotype moteur visible à l'aide de tests spécifiques. Les premiers symptômes apparaissent aux alentours de 5 mois et atteignent leur pic à 10 mois. Ces symptômes ne sont pas visibles à l'oeil nu et n'entrainent pas la paralysie de l'animal. Les animaux mutés présentent également une hyperactivité et hypersociabilité visibles à 5 mois seulement. Le traitement entraine chez ces animaux une légère perte de poids qui n'excède normalement pas un 15% du poids initial.
Devenir
Les animaux produits seront gardés en vie pour réaliser le projet puis seront mis à mort à la fin de celui ci.
Remplacement
Nous voulons étudier le rôle d'un type cellulaire spécifique dans le déclenchement, la propagation et la gravité de la neurodégéneresnce observée dans la Sclérose Latérale Amyotrophique. Cet objectif exige d'étudier l'interaction entre différents types cellulaires, ainsi que l'impact que ces altérations ont sur le développement des symptômes moteurs et comportementaux. Il n'existe à ce jour pas de système de coculture assez complexe pour modéliser les interactions cellulaires du système nerveux. De plus, aucun modèle cellulaire ne permet d'étudier l'apparition et la gravité des symptômes, c'est pourquoi l'utilisation d'un modèle murin est nécessaire.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux dans ce projet, les animaux destinés aux analyses biochimiques ou histologiques seront au préalable inclus dans les études comportementales. Le nombre de souris tient compte des tests statistiques utilisés lors de l'analyse des résultats ainsi que de la variabilité interindividuelle de ces modèles génétiques.
Raffinement
Les animaux sont hébergés à plusieurs dans les cages, et des enrichissements (cabanes, bouts de bois, cotons) sont mis à leur disposition. Le traitement à la cuprizone se fera par l'alimentation afin de supprimer le stress lié aux injections. Nous avons également favorisé des tests moteurs et cognitifs non invasifs. L'enrichissement de l'environnement des animaux (bâtonnets à ronger, matériel de nidification maisons en carton...), le maintien des intéractions sociales et la surveillance quotidienne des animaux permettront de s'assurer de leur bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée. Des points limites permettant de soustraire l'animal à la souffrance ont été établis
Choix des espèces
Dans le domaine de recherche sur la SLA, le modèle animal le plus pertinent reste encore à l’heure actuelle la souris. En effet, l’utilisation d’invertébrés comme la drosophile ou le nématode se heurte à une organisation du système nerveux qui n’a pas la complexité requise et ne permet pas de répondre aux questions cliniques posées. De plus, notre laboratoire a une grande expertise avec les modèles murins de la SLA. Nous avons le matériel chirurgical et les équipements dédiés aux études impliquant des souris mais aussi, et surtout, l'expertise nécessaire pour surveiller l'état de la souris. Pour le suivi longitudinal, les animaux les plus agés auront un an. Pour le traitement, les animaux seront utilisés à 3 mois qui est l'âge où le traitement a montré le plus de différences entre les animaux génétiquement modifiés et les animaux non OGM.
Effet d’un stabilisateur dopaminergique sur les comportements compulsifs associés à la prise d’alcool chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 80 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont soumis à deux mois d'alcoolisation avec évaluation d'une consommation incontrôlée, maintenus isolés, reçoivent des injections sous-cutanées d'un stabilisateur dopaminergique, puis sont tués par dose létale d'anesthésique pour prélèvement du cerveau. Le porteur reconnaît que le modèle de consommation d'alcool et l'isolement augmentent le niveau d'anxiété des rats, et renvoie les retombées thérapeutiques contre l'addiction à un "moyen terme" conditionnel. Il affirme qu'"il n'existe pas de méthodes alternatives" sans animaux pour évaluer un tel traitement.
Objectifs
L’addiction à l'alcool est associée à des problèmes de la communication entre les neurones impliquant la dopamine. Malheureusement, ces dysfonctionnements sont encore mal compris, ce qui empêche de trouver des médicaments efficaces pour traiter cette maladie. Il a été récemment montré qu’une prise excessive et incontrôlée d’alcool chez le rat était liée à une anomalie bien précise de cette communication liée à la dopamine. De manière intéressante, des stabilisateurs chimiques de cette communication sont en cours de développement et ils pourraient corriger cette anomalie dopaminergique. L'objectif du projet est donc de tester si ces stabilisateurs dopaminergiques peuvent réduire la prise excessive et incontrôlée d'alcool chez le rat.
Bénéfices attendus
Ouvrira la voie vers de nouvelles stratégies thérapeutiques et le développement à moyen terme de nouvelles molècules contre l'addiction à l'alcool, avec de plus amples études si les résulats sont positifs, notamment cliniques.
Procédures
Les animaux seront soumis à trois type d'interventions différentes : une procédure d'alcoolisation et d'évaluation de la consommation incontrôlée d'alcool (durée : deux mois), une procédure d'injection sous-cutanée du stabilisateur dopaminergique (durée :2 fois une semaine, soit deux semaines au total) et mise à mort par dose létale d’anesthésique pour prélèvement de tissus cérébraux afin d'étudier les mécanismes neuronaux pouvant expliquer les comportements observés. Dose létale d’anesthésique par injection intrapéritonéale de pentobarbital (durée de la procédure : 5 minute pour l'anesthésie profonde).
Impact sur les animaux
L'effet du modèle de consommation d'alcool que nous allons utiliser et l'isolement nécessaire des animaux pour cette experimentation, à un impact d'ordre modéré sur l'animal, augmentant son niveau d'anxiété mais n'induisant pas par exemple de symptômes physiques de manque. Cette forme d'angoisse est prise en charge par une manipulation régulière des animaux (interaction) avec l'expérimentateur. Nous n'attendons pas d'effet indésirable du traitement au vu de la littérature et des doses modérées que nous allons utiliser et tout sera mis en oeuvre (habituation, aiguilles fines) pour limiter les gênes qui pourraient être causées par les injections sous-cutanées). L'utlisation d'une dose létale d'anesthésique permettra d'éviter toute souffrance lors de la dernière procédure.
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'obtenir les tissus cérébraux afin de mieux comprendre les mécanismes de ces comportements et du traitement.
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, qui permettront l’évaluation de l'effet d'un traitement sur la consommation d'alcool.
Réduction
Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe afin d’avoir une chance d’au moins 80% de détecter une différence significative (risque β standard en statistique déterminant la puissance statistique minimal requise) et un risque d’erreur α étant fixé dans nos conditions à 5% (degré de significativité fixé à 95%), et donc de ne pas compromettre les objectifs du projet.
Raffinement
Afin de réduire les potentielles gênes induites par les injections sous-cutanées, nous utiliserons des aiguilles très fines. D’autre part, le produit très soluble dans le NaCl sera injecté à un volume de 1 ml/kg soit entre 0,4 et 0,6 ml par rat. L’injection sera réalisée sur la partie souple du dos en la regroupant entre les doigts, limitant ainsi la contention du rat. Les animaux seront habitués à ce geste et les aiguilles seront changées entre chaque injection, ainsi que le site d'injection chaque jour. Les animaux seront également stabulés selon la procédure mise en place par l'animalerie, afin de maintenir un milieu socialement riche et d’éviter tout stress supplémentaire, avec notamment une semaine d'acclimitation après la livraison et avant le début de l'expérimentation. Après cette semaine d'acclimatation regroupés par 4, nous serons cependant dans l'obligation de les isolés pendant la procédure de choix à deux bouteilles et pendant l'auto-administration, mais toujours dans des cages enrichies avec des objets.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des structures que nous allons étudier. De plus, ce projet est dans la continuité d'études faites chez le rat, modèle de choix pour étudier en préclinique l’addiction à l'alcool. Au début de l’étude, les rats seront de jeunes adultes, ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, qui n’évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui prendront plusieurs mois.
Caractérisation et étude de biodistribution in vivo de nanoparticules multimodales EU0583- 2
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
230 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 30 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 200 un niveau léger. Une partie subit une chirurgie d'induction de tumeur pancréatique, les autres des injections intraveineuses et des séances d'imagerie TEP et IRM sous anesthésie, avant dissection pour mesurer la distribution de nouvelles nanoparticules servant d'agents de contraste. Le porteur décrit l'induction du cancer pancréatique comme relevant d'une classe sévère et déclare la réserver à une seconde phase pour limiter le nombre d'animaux. Il mène l'optimisation des nanoparticules in vitro mais affirme que la validation de leur distribution ne peut se faire que chez l'animal.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est de valider l’utilisation de nouvelles familles innovantes d’agents de contraste, appelés Hybrid PolyIon Complex (HPIC) obtenus par une voie de synthèse/formulation simple et reproductible à une échelle industrielle. Ces agents sont issus de la complexation de polymères fonctionnels avec des ions métalliques utilisés en imagerie médicale (imagerie par résonance magnétique (IRM), Tomographie par Emission de Positons (TEP), SPECT (de l'anglais : Single Photon Emission Computed tomography)…), comme par exemple des ions Gadolinium, Gallium, Zirconium… avec des polymères . Leurs propriétés paramagnétiques et leur grande stabilité en milieu physiologique démontrent la grande potentialité de ses systèmes. Ainsi, en se basant sur cette nouvelle approche et grâce à un choix judicieux des composants de la formulation, des agents de contraste possédant des fonctionnalités variées (luminescence, propriétés de reconnaissance...) et utilisables dans différentes techniques d’imagerie peuvent être facilement accessibles et ouvrent de nouvelles opportunités cliniques. Dans ce projet, différentes stratégies d’optimisations des HPIC seront utilisées pour augmenter leur stabilité chimique et les composés les plus prometteurs seront évalués in vivo. Pour étendre le champ d'application, nous devons répondre à trois questions importantes : Comment assurer une grande stabilité chimique des HPIC pour les expériences in vivo ? Comment étendre le champ d'application de ces HPIC à des techniques d'imagerie autres que l'IRM, comme la TEP ? Comment avoir accès à des agents de contraste ayant des propriétés de ciblage ? Le cancer du pancréas est actuellement la quatrième cause de décès par cancer dans les pays occidentaux. La survie à cinq ans est de 3%. Le seul traitement curatif du cancer pancréatique est la résection chirurgicale, qui n’est malheureusement possible que dans 10 à 15 % des cas, avec un gain minimal de survie de 5% à 5 ans. Il est donc urgent de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ce cancer. Pour cette raison, un modèle murin de cancer du pancréas sera mis en œuvre pour étudier les propriétés de ciblage des HPIC. Les modalités d’imagerie mises en œuvre dans ce projet permettront d’étudier in vivo ces propriétés de ciblage et de biodistribution. L’objectif serait d’utiliser ces nanoobjets comme vecteur d’adressage d’agents thérapeutiques qui pourraient être encapsulés à l’intérieur.
Bénéfices attendus
Les observations et quantification faites dans le cadre de ce projet d'imagerie multimodale ouvriront de nouvelles opportunités pour utiliser cette plateforme colloïdale comme nouveaux agents de contraste moléculaires ou de ciblage.
Procédures
5 types de procédures expérimentales sont mises en œuvre dans ce projet. La chirurgie pour induction des tumeurs pancréatiques a une durée moyenne de 20 minutes par souris. Les animaux sont placés sous anesthésie préalablement à l'acte chirurgical et un analgésique leur est administré avant chirurgie pour éviter toute souffrance. Les autres procédures sont des procédures d'imagerie in vivo, non invasives et atraumatiques. Les animaux subissent, sous anesthésie isoflurane, une injection par voie intraveineuse (veine caudale). Ce geste se fait en moins de 5 minutes généralement. Ces injections permettent de leur administrer soit un radiotraceur (procédures d’imagerie TEP, durée totale d’anesthésie 90 minutes maximum pour les acquisitions TEP) soit un agent de contraste non radioactif (procédure d’imagerie IRM, durée totale d’anesthésie 90 minutes maximum pour les acquisitions IRM). Les prélèvements sanguins sont effectués sur les animaux anesthésiés en moins de 5 secondes et les prélèvements d'organes sont faits post-mortem (15 minutes par souris).
Impact sur les animaux
Les modalités d'imagerie TEP et IRM n'engendreront aucune nuisance aux animaux puisqu'il s'agit de modalités d'imagerie non invasives et atraumatique utilisées en routine clinique. Le modèle de cancer pancréatique en revanche de classe sévère, c'est pourquoi il ne sera mis en œuvre qu'après une première phase de caractérisation de la distribution et sélection des HPIC présentant les meilleures caractéristiques pour réduire autant que possible le nombre d'animaux mis en œuvre. La douleur sera supprimée par administration d'analgésique immédiatement après la chirurgie et répétée si nécessaire.
Devenir
Tous les animaux sont sacrifiés en fin de procédures expérimentales. Les animaux ayant reçu injection de HPIC radiomarqués pourront être disséqués post-mortem pour comptage radioactif de leurs organes.
Remplacement
Les phases d'optimisation des HPIC (augmentation de la stabilité, quantification de la libération des ions métalliques) seront intégralement menées in vitro. Cependant, la validation des propriétés de distribution aux organes, d’élimination par voie urinaire et/ou hépatobiliaire tout comme les propriétés de ciblage tumoral ne peuvent se faire qu’en utilisant le petit animal. Les propriétés pharmacocinétiques des nanoparticules (HPIC) de distribution et élimination seront caractérisées chez l’animal sain avant de passer sur un modèle tumoral pour caractériser et mesurer leur capacité de ciblage des tumeurs.
Réduction
L'imagerie, par opposition aux biodistributions in vivo classiques, permet de réduire le nombre global d'animaux mis en oeuvre pour une procédure donnée car la même cohorte pourra être suivie au cours du temps ce qui permet de réduire la variabilité inter animal (chaque souris étant son propre contrôle). Les mêmes animaux pourront également subir plusieurs sessions d’imagerie (une session par semaine pour le suivi du développement tumoral). Les variables quantitatives issues de l'analyse des images obtenues en PET et en IRM seront analysées en utilisant des méthodes de statistique non paramétrique. En particulier le test de Kruskal-Wallis sera utilisé pour comparer les résultats obtenus avec les 5 HPIC prévus dans l'étude.
Raffinement
Les premières phases de caractérisation in vivo des HPIC (imagerie TEP et IRM) seront menées sur des souris saines (procédures classées légères) pour réduire autant que possible l’inclusion d’animaux porteur de cancer pancréatique (procédure d’induction du cancer classée modérée). Tous les animaux sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur (directive européenne 2010/63, décret n°2013-118 du 1er février 2013). Tout animal présentant des signes de souffrance, de léthargie, une perte de poids supérieure à 20% ou une tumeur de 10% du poids corporel sera exclu de l’étude et sacrifié. Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Pour les animaux devant subir une chirurgie pour greffe de cellule tumorales pancréatiques l’analgésie est assurée par injection préalable, sous cutanée de Buprenorphine (0.05mg/kg) pour limiter la douleur. Les animaux sont conservés dans la salle de chirurgie sous une source de chaleur et leur respiration est observée jusqu’à leur réveil. En cas d’apparition de signes de douleur (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, déshydratation, yeux et abdomen creux, automutilation etc.), une nouvelle dose d’analgésique sera administrée une fois par jour jusqu’à disparition des signes.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies comme modèle d’étude selon plusieurs critères : -Il s’agit d’une espèce de petite taille facile à manipuler, son cycle de vie est court et son élevage facile et peu couteux. -leur petite taille facilite la manipulation en particulier pour l’imagerie in vivo (ou plusieurs souris peuvent être placées en même temps dans certaines caméras) Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (7 à 12 semaines environ) après atteinte de la maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ce stade est également optimal pour l'induction tumorale par transplantation de cellules cancéreuses pancréatiques.
Émulsifiants alimentaires synthétiques et infection gastro-intestinale eucaryote: effets sur l’homéostasie intestinale et le bien être de l’hôte
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
5 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, l'une menée sous anesthésie sans réveil. Elles sont infectées par le parasite Blastocystis puis soumises à une distension colorectale, avant d'être tuées pour prélèvement de tissus, afin d'étudier l'hypersensibilité digestive du syndrome de l'intestin irritable. Le porteur indique qu'une souris atteignant 20 % de perte de poids ou présentant une douleur trop forte serait mise à mort de façon anticipée. Il juge "indispensable" de travailler sur des animaux pour établir un lien de causalité avec le parasite.
Objectifs
De nombreuses études épidémiologiques ont rapporté une forte prévalence de Blastocystis chez des patients atteints de différentes pathologies, plus particulièrement au niveau du tractus intestinal (syndrome de l'intestin irritable (SII), maladies inflammatoires...). Il est donc important de mieux comprendre les causes et conséquences de la prévalence de ce parasite chez les patients souffrant de SII. Un modèle reproductible d'infection chronique à Blastocystis chez le rat a déjà été mis en place et a permis de mettre en lumière le lien entre ce parasite et l'hypersensibilité viscérale d'origine colique (HSVC) non inflammatoire, la dysbiose intestinale ou encore le comportement anxio-dépressif. Dans l’optique de la transposition des données à l’espèce humaine, le passage au modèle souris apparait nécessaire afin d'étudier les mécanismes d'actions de Blastocystis et d'envisager des cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet étant de mieux comprendre les mécanismes des douleurs associées au SII afin de développer de nouveaux outils pharmacologiques, le premier bénéfice attendu serait la caractérisation de cette physiopathologie et l’identification de nouvelles cibles pharmacologiques. Dans un second temps, la validation pré-clinique des effets bénéfiques de nouvelles molécules agissant sur les nouvelles cibles identifiées nous permettraient d’envisager une étude clinique grâce à une collaboration avec les services de gastroentérologie d'un CHU. L’objectif à plus long terme serait donc de mettre en place cette étude clinique qui ferait intervenir des patients atteints de SII afin de tester les potentiels outils pharmacologiques développés au laboratoire. Cette étude permettrait d’ouvrir le champ des perspectives thérapeutiques visant à traiter les symptômes associés au SII et, in fine, à soulager les patients SII douloureux. Le bénéfice à long terme serait ainsi une meilleure prise en charge des douleurs chez le patient, qui reste actuellement extrêmement limitée.
Procédures
Suite à l'infection par Blastocystis, des feces seront prélevés afin de s'assurer de l'implantation du parasite au niveau intestinal de la souris. De plus les procédures 3, 4 et 5 seront effectuées une seule fois après une infection de 4 semaines
Impact sur les animaux
L’infection par Blastocystis induira chez les animaux les symptômes associés au SII-PI à savoir une hypersensibilité colique. Le développement de ce symptôme nous permettra d’étudier les mécanismes mis en jeu dans les douleurs et les atteintes centrales afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Les animaux seront cependant surveillés quotidiennement par l'expérimentateur et si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20%, celui-ci sera mis à mort par overdose d’isoflurane suivie d’une dislocation cervicale.
Devenir
Pour l'ensemble des procédures, les animaux seront maintenus en vie. A l’issue de la procédure 5 (Distension colorectale), les animaux seront mis à mort pour effectuer différents prélèvements de tissus.
Remplacement
Il apparait indispensable de travailler sur des animaux afin de pouvoir étudier l’impact de Blastocystis sur la sensibilité colique, le comportement et le microbiote intestinal. De plus, une étude comparant des données de métagénomique entre animaux infectés et animaux non infectés permettra d’établir un lien de causalité avec Blastocystis. Ce type d’étude n’est envisageable que chez l’animal. D’autre part, nous voulons également évaluer les conséquences physiologiques sur la sensibilité viscérale et la perméabilité intestinale, pour lesquelles il n’existe pas d’autre alternative.
Réduction
Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Les tests statistiques seront réalisés grâce au programme d'analyse statistique GraphPad Prim 9.0 et les principales analyses, notamment de suivi du poids seront effectuées grâce à des test ANOVA one-way ou two-way suivi d'un post test adéquat en fonction du résultat.
Raffinement
Afin de réduire une éventuelle souffrance, les animaux seront surveillés quotidiennement (Week-end et jours fériés compris) par l'expérimentateur mais aussi par le personnel de l'animalerie. Si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20%, celui-ci sera euthanasié par le personnel de l’unité de stabulation animale. Ces animaux seront au maximum 5 par cage (5 mâles ou 5 femelles) et ceci en respect de la réglementation en vigueur concernant la superficie au sol par souris. De plus, ces cages contiendront des milieux d'enrichissements de type petite maisonnette de chez Genobio ainsi que du coton.
Choix des espèces
Le choix de l'espèce "souris" a été fait pour ce projet pour 2 raisons : (1) il est connu que cet espèce est résistante à une infection par Blastocystis ST4 et (2) qu'un traitement chronique par des émulsifiants déstabilise le microbiote intestinal et la barrière de mucus. Ainsi, ce projet permettra de définir si une perturbation de l'homéostasie intestinale par des émulsifiants (largement utilisés dans les pays industrialisés) favoriserait l'implantation du parasite Blastocystis et entrainant d'autres perturbations du "Bien-être" de l'hôte. De plus, malgré le modèle d'étude déjà publié chez le rat, des études complémentaires sont indispensables afin de transposer chez la souris les données précédemment obtenues chez le rat. Ainsi, les outils génétiques accessibles uniquement chez la souris (principalement les animaux KO pour un gène d'intérêt) pourront nous permettre de mieux comprendre par quel récepteur ou mécanisme physiopathologique le parasite Blastocystis parvient à s'implanter et induire des troubles du comportement chez son hôte. Les souris seront utilisés au stade de jeune adulte. En effet, l’utilisation des animaux à ce stade de développement permet de limiter les biais liés à des différences pouvant se développer au cours de la vie de l’animal. La réduction de la variabilité inter-individus permet ainsi de réduire le nombre d’animaux à expérimenter.
Obtention d’oocystes de Toxoplasma gondii par Felis catus
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
3 chats vont être utilisés sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger, puis placés dans une famille d'adoption. Ils sont infectés par le parasite Toxoplasma gondii en leur faisant consommer un cerveau de souris porteur de kystes, afin de récolter dans leurs selles les formes environnementales du parasite, que la culture cellulaire ne permet pas de produire. Le porteur affirme qu'aucune intervention n'est pratiquée et que le chat "ne ressent aucune douleur", et revendique le félidé comme "seul animal" capable d'assurer la reproduction du parasite. Il précise choisir des chatons, qui excrètent davantage d'oocystes que les chats adultes.
Objectifs
Toxoplasma gondii est un parasite capable d'infecter un large éventail d’animaux y compris l'Homme. La forme environnementale du parasite peut persister et rester infectieux dans l'environnement pendant plusieurs années. Malgré l'importance de ces formes comme une source majeure d'infection, les études qui se concentrent sur la transmission, la distribution dans l'environnement, et la résistance à l'inactivation sont extrêmement limitées. Un obstacle majeur à la réalisation d'études avec ce parasite est la difficulté de produire un grand nombre de forme environnementale. De plus, cette forme ne peut pas être reproduite in vitro par culture cellulaire, il y a donc obligation d'utiliser l'hôte définitif : les félidés. La production nécessite l'infection orale de l'hôte définitif (félidé) avec un nombre suffisant d'organisme de parasites, afin d'obtenir une excrétion dans les selles pendant 3 à 10 jours après l'infection. Nous prévoyons 3 chats sur 5 ans afin d'obtenir une production suffisante pour les projets en cours et à venir.
Bénéfices attendus
Selon la physiologie de l'animal, obtention d'une grande quantité d'oocystes qui permettra de mieux appréhender l'infection de l'Homme par le stade environnemental (oocystes) ainsi que de rendre non infectieux les oocystes pas différents procédés industriels (industries agroalimentaires).
Procédures
Aucune intervention ne sera effectuée sur les chats. Nous n'utilisons pas de produits chimiques ou pharmacologiques au cours de nos expériences. Et nous n'effectuons pas de prélevements sanguins. Après une diète alimentaire de 1 jour, une infestation par voie orale par consommation d'un cerveau de souris contenant des kystes d'une souche de T. gondii sera effectuée.
Impact sur les animaux
Aucun effets indésirables n'est prévus sur les chats.
Devenir
Lorsque le chat n'excrète plus d'oocystes, une visite finale du vétérinaire est prévue avant sa sortie de l'enceinte de l'animalerie. Les chats sont placés dans une famille d'adoption.
Remplacement
Le félidé est le seul animal permettant d'obtenir des oocystes de T. gondii.
Réduction
Un nombre maximum de 3 chats pour 5 ans est requis. Selon le taux d'excrétion de chaque individu, il pourra être diminué au cours du projet.
Raffinement
Le chat ne ressent aucune douleur lors de la procédure, innocuité de l'infestation par T. gondii. Suivi de santé et socialisation du chat par une visite journalière du personnel de laboratoire et/ou des animaliers. Lors de cette visite, observation du chat, stimuli de jeux ... pour le confort de l'animal.
Choix des espèces
Seul des félidés sont capables d'assurer la reproduction sexuée du parasite et donc l'obtention d'oocystes. Chats de 14 semaines, sevrés, pucés, vaccinés (rage inclu). Les chatons excrètent plus d'oocystes que les chats adultes.
Optimisation des conditions d’acquisitions par IRM des données anatomo-fonctionnelles
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
Rats : 50
250 souris et 50 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent des injections de produits de contraste sous anesthésie pour régler les paramètres d'un appareil d'IRM, l'enjeu déclaré étant d'optimiser les réglages de l'imageur plutôt que de produire une connaissance biologique. Le porteur décrit ces injections comme n'entraînant "aucune douleur ou stress" puisque réalisées sous anesthésie, et prévoit la mise à mort des animaux de réforme après la séance comme des animaux extérieurs en fin de projet. Il affirme que le recours aux rongeurs est "inévitable" parce que l'étude porte sur "l'organisme en entier".
Objectifs
Notre service d’exploration non invasive du petit animal est équipé depuis Juin 2017 d’un imageur par résonance magnétique (IRM) 7T dont le diamètre utile est de 72 mm permettant son utilisation pour les projets de recherche précliniques du petit animal (souris, rat, marmouset). L'IRM est basée sur la mesure des propriétés magnétiques des tissus biologiques, permettant d'obtenir des informations anatomiques, fonctionnelles et métaboliques in vivo et de manière non traumatisante chez le petit animal. Afin de garantir le maintien du statut sanitaire des animaux durant tout le processus expérimental (prise en charge, analyse IRM, renvoi vers les différents sites de zootechnie d'expérimentation), notre service s’est doté d’installations (salle de préparation aménagée, PSM) et d’équipements (cellules de confinements compatibles IRM) spécifiquement développés en partenariat avec un fabricant d’équipements vétérinaires. Il s’agit de la première installation nationale complète permettant le maintien du statut sanitaire des animaux (souris, rat, marmouset) pour l’analyse par IRM. La demande concerne l’autorisation d’utilisation d’animaux pour l’optimisation des paramètres et des méthodes permettant la caractérisation anatomique et fonctionnelle par IRM sur des rongeurs (souris, rats). Ainsi, nous pourrons optimiser des méthodes adaptées à la cardiologie, la vascularisation, la diffusion de molécules d'eau, l'IRM fonctionnelle (cerveau), la mesure de la consommation d’oxygène dans le cerveau et la caractérisation des lipides dans les tissus adipeux par spectroscopie par résonance magnétique. Ces optimisations sont un préalable récurrent pour l’utilisation des nouvelles séquences d’IRM afin d'assurer la reproductibilité et un meilleur compromis sur la qualité de l'image pour les différents projets de recherche dans un environnement confiné, c'est-à-dire réalisées avec nos systèmes de confinement adaptés pour les rongeurs (souris et rats) et la configuration IRM ad hoc (résonateurs, antennes de surface). Les optimisations peuvent aussi inclure le recours à des agents de contraste. Ces agents de contraste, paramagnétiques (gadolinium) ou superparamagnétiques (oxyde de fer), permettent de modifier les temps de relaxation des tissus (foie, muscle, cerveau, cœur, etc.) de manière sélective et ainsi de mieux différencier les tissus sains et malades et les différentes régions anatomo-fonctionnelles.
Bénéfices attendus
L’optimisation de séquences en IRM permettra de réduire le temps que les animaux passent dans l’IRM lors des acquisitions. Ces optimisations permettent aussi de s’assurer de la reproductibilité de nos mesures et de la correcte visualisation des phénomènes physiologiques et physico-chimiques sur les différents modèles animaux qui seront étudiés.
Procédures
Des injections des produits de contraste pourraient être faites par voie intraveineuse ou par intrapéritonéale chez les rongeurs, selon la demande des utilisateurs. Sur des souris ou rats de réforme, on les injectera seulement une fois par projet de faisabilité. Pour des animaux commandés à des fournisseurs externes, le nombre d'injections par semaine sera maximum de 3 (une seule injection pourra être faite par jour). Il est important de mentionner que ces injections n'entrainent aucune douleur ou stress chez les animaux car elles sont faites sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Il s’agit des procédures non invasives, sans douleur et sous anesthésie.
Devenir
Pour les animaux de réforme la mise à mort est réalisée après la séance d'IRM. Pour les animaux des fournisseurs "externes", à la fin des acquisitions IRM, les animaux sont remis dans leur cage de vie et monitorés régulièrement jusqu'au réveil. Toutefois, ces animaux des fournisseurs externes seront sacrifiés à la fin du projet de faisabilité méthodologique.
Remplacement
L’utilisation des rongeurs est inévitable car nous travaillons sur des mécanismes intégratifs et donc sur l’organisme en entier.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé de façon à permettre une validation statistique des résultats expérimentaux préliminaires, tout en tenant compte des exigences de réduction. Nous réutiliserons les animaux disponibles pour différents projets de recherche quand cela sera possible et selon les demandes des utilisateurs.
Raffinement
Les animaux sont surveillés quotidiennement et une procédure d’estimation et de suppression de la douleur est mise en place. Le point limite est fixé à 20% de perte du poids corporel (chez les adultes) avec repérage des signes de mal-être définis au préalable par notre vétérinaire référent. Les animaux provenant des fournisseurs externes auront une période d'acclimatation de 2 semaines au nouvel environnement avant de chaque procédure expérimentale à l'IRM.
Choix des espèces
Comme nous avons indiqué dans le point 3.4.11, nous n'utiliserons que des animaux âgés de plus de 10 semaines dans ce projet. La plupart des utilisateurs de notre service d’imagerie font leurs études sur des animaux âgés de plus de 10 semaines, basés sur la littérature scientifique et le modèle étudié. Du point de vue de l’IRM, l’âge des animaux n’a pas d’impact sur la qualité de l’image. Cependant, nous utilisons des animaux du même âge et taille pour mieux interpréter les données anatomo-fonctionnelles obtenues.
Développement d’un nouveau système de régulation génique contrôlé par la nutrition. Application à un modèle murin de métastases hépatiques du cancer colorectal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
498 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 450 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une greffe de métastases hépatiques de cancer colorectal, des injections répétées d'un vecteur viral et de molécules anticancéreuses, un gavage trois fois par semaine et des prélèvements de sang jusqu'à une ponction intracardiaque terminale, pour valider un système de régulation génique appelé NUTRIREG. Le porteur renvoie le transfert vers l'homme à une échéance qu'il qualifie de "rapide", tandis que les atteintes infligées aux souris sont immédiates. Il indique avoir mené des expériences in vitro préliminaires mais juge "indispensable" de répéter les expériences sur les animaux.
Objectifs
ll est nécessaire de valider notre système de régulation génique NUTRIREG dans un modèle de pathologie pour pouvoir envisager des tests cliniques chez l'homme. Nous avons choisi le modèle des métastases hépatiques du cancer colorectal (MHCC), pour son intérêt médical, sa faisabilité et son transfert rapide en médecine humaine. En effet, le foie est le site privilégié des métastases du cancer colorectal puisqu'il concerne 50% des patients, avec seulement 25% de survivants à 5 ans. Par ailleurs, notre voie de régulation est très réactive dans le foie. Nous avons ainsi choisi d’utiliser NUTRIREG dans un modèle murin de métastases hépatiques du cancer colorectal (MHCC) par induction contrôlée du gène apoptotique TRAIL associé ou non avec une molécule anti-cancéreuse (ONC-212 ou 5-Fu). Il a été démontré que ces 2 molécules sont capables d'améliorer l'action de TRAIL pour induire l'apoptose des cellules cancéreuses.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons maintenant valider l’approche NUTRIREG dans un modèle animal pour le traitement d’une pathologie de façon à pouvoir rapidement transférer cette technologie à l’homme. Nous avons choisi d’utiliser NUTRIREG dans un modèle murin de métastases hépatiques du cancer colorectal (MHCC) par induction contrôlée du gène apoptotique TRAIL.
Procédures
Les souris seront soumises à une chirurgie sous anesthésie gazeuse pour implanter les métastases hépatiques (Procédure 1, 30 min par souris). Cette procédure inclut également une injection en sous-cutané de Torbugésic sur animal vigile 10 à 15 min avant la chirurgie). La luciférine sera injectée en IP sur animal vigile avant anesthésie gazeuse pour mesure de la bioluminescence 2 fois par semaine (Procédure 2, 15 min par souris). Un vecteur AAV sera injecté dans la veine de la queue au début de l'expérimentation, sur animal vigile maintenu en contention dans un tube, après dilatation des veines sous lampe chauffante (Procédure 3, 10 min par souris). L'anticorps MD5 sera injecté en IP sur animal vigile une fois par semaine (Procédure 5, 1 min par souris). La molécule ONC-212 sera administrée par gavage 3 fois par semaine sur animal vigile (Procédure 8, 3min par souris) et le 5-Fu sera injecté en IP une fois par jour sur animal vigile (Procédure 8, 1min par souris). Du sang sera prélevé chez ces souris, 2 fois au cours de l'expérimentation en sub-mandibulaire sur animal vigile (Procédure 6, 2 min par souris) et à la fin de l'expérimentation par ponction intra-cardiaque sous anesthésie gazeuse (Procédure 7, 2min par souris).
Impact sur les animaux
Durant l'étude, tout sera mis en oeuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis. Des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition tube plastique rouge et/ou bille métallique). Pour chaque expérience, des points limites (perte de poids, prise alimentaire, comportement...) seront définis et des groupes "contrôles" adaptés au protocole seront constitués.
Devenir
Pour toutes les procédures sauf la n°7 : il n’y a pas de mise à mort avant la fin de la totalité de l'expérience. Procédure 1 --> "Génération du modèle murin de métastases hépatiques par injection de cellules murines de cancer colique dans la rate" : le comportement des souris est surveillé afin de leur administrer une nouvelle dose de Torbugésic en cas de signe de mal-être.. Procédure 2 --> "Mesure de la bioluminescence émise par l'expression du gène rapporteur luciférase dans les cellules murines de cancer colique" : Les souris regagnent leur cage après le retour de la mesure de bioluminescence. Procédure 3 --> "Injection du vecteur AAV dans la queue des souris" : Les souris sont hébergées dans des cages à filtre durant une semaine après l’injection des AAV. Procédure 4 --> "Protocole nutritionnel avec consommation de régimes carencés en acide aminés" : les souris sont, de manière alternée : mises à jeun, nourries avec du régime carencé pour activer la voie puis avec du régime contrôle pour éviter les effets néfastes d’une carence trop longue. Procédure 5 --> "Potentialisation de l’action de la protéine TRAIL avec un anticorps monoclonal MD5-1 dirigé contre le récepteur à TRAIL (DR5)" : les souris regagnent leur cage après injection IP. Procédure 6 --> "Prélèvements sanguins au niveau de la veine submandibulaire " : les souris regagnent leur cage après la prise de sang Procédure 7 --> "Prélèvements sanguins par voie intra-cardiaque" : les souris sont anesthésiées sans réveil pour réaliser cette prise de sang. Procédure 8 --> "Amélioration de l’action de la protéine TRAIL par administration d'une molécule anticancéreuse" : les souris regagnent leur cage après administration de ces molécules.
Remplacement
De nombreuses expériences préliminaires réalisées in vitro sur la lignée de carcinome colique MC38 ont permis d'abord de tester l'efficacité de TRAIL combinée avec l'anticorps MD5-1 puis ensuite de sélectionner 2 molécules (5-Fu et ONC-212) qui sont capables de faciliter l'action apoptotique de TRAIL. Ces expériences ont permis dans un premier temps d'éviter d'expérimenter sur des souris.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour chaque expérience est calculé au minimum en fonction du test statistique retenu. Cependant, étant donné l'hétérogénéité inter-animal notamment pour le développement des métastases hépatiques, il s'avère indispensable de répéter les expériences.
Raffinement
Durant l'étude, tout sera mis en oeuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis. Des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition tube plastique rouge et/ou bille métallique). Pour chaque expérience, des points limites (perte de poids, prise alimentaire, comportement...) seront définis et des groupes "contrôles" adaptés au protocole seront constitués. Si un animal présentait un état douleureux inacceptable ou des signes de mal-être important, il sera examiné par un responsable de la mise en oeuvre du projet, et si nécessaire, anesthésié puis euthanasié. Par ailleurs, l'utilisation de cellules exprimant la luciférase pour générer les métastases hépatiques nous permettra de suivre leur évolution à l'aide d'une méthode non invasive (bioluminescence).
Choix des espèces
La souris est l'animal de référence dans ce type d'étude. Les souris utilisées dans ce projet sont de fond génétique C57 Bl/6. Des souris mâles jeunes adultes de 3-4 mois sont utilisées pour le modèle murin de MHCC. Le stade adulte (3-4 mois) permet de s’affranchir des effets liés au développement de l’animal ou par la suite de ceux liés au vieillissement.
« Read-out » pharmacologique par hypothermie induite et biodistribution chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Elles reçoivent des injections de vecteurs par plusieurs voies et des prélèvements de sang à la queue, l'effet étant lu à travers une baisse provoquée de leur température corporelle, pour évaluer des molécules censées franchir la barrière du cerveau. Le porteur reconnaît un risque de choc immunitaire, de réaction allergique ou de détresse cardio-respiratoire, tout en pariant sur l'absence d'effet à court terme. Les animaux sont tués par exsanguination sous dose létale d'anesthésique pour prélever sang et tissus.
Objectifs
Les neuropathies, myopathies, et maladies rares font partie des causes majeures de handicaps sévères dans le monde et, à l'heure actuelle, les besoins médicaux actuels restent très insatisfaits, sans aucuns traitements curatifs, ou palliatifs. Les maladies neurodégénratives telles qu’Alzheimer ou démences associées, les maladies lysosomales, les myopathies (Duchenne) sont des exemples d'enjeux de santé publique. Ces dernières années, les recherches privées et publiques ont augmenté leurs efforts de recherches, suscitant de grands espoirs pour les patients malades et leurs familles. Cette demande de projet s’inscrit dans cette dynamique, avec pour objectif d’améliorer et de proposer à terme des perspectives thérapeutiques. Le savoir-faire de la société consiste en la conjugaison de peptides vecteurs à des pro-drogues ou molécules en cours de développement, voire déjà utilisées sur le marché, mais dont l'efficacité reste insuffisante ou encore à démontrer. En effet, la plupart des médicaments restent inefficaces par manque de passage et d'accès au région ou organes à traiter. La maladie d’Alzheimer est un de ces exemples de neuropathies majeures, pour laquelle aucun traitement efficace n’existe, tout comme bon nombre de pathologies périphériques ou cancers. L’objectif principal de notre société sera donc de proposer de nouvelles formulations capables de reconnaitre des partenaires endogènes spécifiques (récepteurs cellulaires) et d'utiliser leurs mécanismes naturels de trancytoses pour traverser les barrières cellulaires, protectrices des régions et organes sensibles de l'organisme. Dans notre cas, il s'agira en priorité du passage de la Barrière HématoEncéphalique (BHE) vers le système nerveux central (SNC). Par ce principe, nous pouvons passer naturellement ces barrières et amener in situ le médicament par la technique du cheval de Troie. Un avantage considérable qui permet de concentrer les médicaments au niveau des tissus à traiter et ainsi, de potentialiser les chances de traitements. Cette demande de projet s'inscrit dans ce contexte, en développant et optimisant nos molécules-vecteurs (VHH : Domaine variable chaine lourde Anticorps) pour améliorer la délivrance d’agents thérapeutiques. Par des approches systémiques, en administration intra-veineuses ou dermiques, en sous-cutanées, nous tenterons d’améliorer le potentiel d’actions de nos vecteur-médicaments, sur lignée murine consanguine (C57BL/6J) et génétiquement modifiée pour un récepteur cible.
Bénéfices attendus
En ce qui concerne la partie expérimentale, notre procédure met en avant la sensibilité d’action de nos VHH et les faibles quantités administrées (3R : raffinement), ce qui réduit également les risques de toxicités pour les animaux. Le faible nombre d'individus et l'optimisation des tests mettent en avant l'importance et la nécessité de bien caractériser la procédure. D'un point de vue médical, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos Vecteurs médicaments (VHH) constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.
Procédures
Au cours de notre procédure, nous allons manipuler les animaux en vigile, ce pour toutes les administrations (administration i.v. 5.5ml/kg ; i.p. ou s.c.10ml/kg) ou prélèvements de sang intermédiaires (Prélèvement caudal ≤50 μl). Les administrations, rapides (quelques secondes) et précises, se feront sous forme de bolus ou injections répétées. L’expertise des expérimentateurs garantit la rapidité du geste et de la manipulation sans stress. De même, le prélèvement intermédiaire, en caudal (PI) (≤ 50 microlitres) sera réalisé en 1 seule fois. L'animal sera alors placé et immobilisé en contention spécialisée, puis, par une légère et micro-incision cutanée de l’extrémité de la queue (idem biopsie génotypage), le sang sera collecté sur tube hépariné (10UI/ml) ou EDTA, à raison de 2-3 gouttes de 50 µl de sang. En point final de la procédure, les animaux seront euthanasiés pour l’exsanguination et les prélèvements de tissus/organes. Les prélèvements finaux en post-mortem (exsanguination, prélèvements tissulaires) se feront sur animal euthanasié : anesthésié/analgésié à dose létale (Kétamine 150 mg/kg ; Xylazine 15 mg/kg), aiguille 25G (‘’5/8’’ ; 0.5*16mm), environ 10 minutes avant la fin de la cinétique. Donc ici, pas de procédures chirurgicales avec réveil, seulement une euthanasie et prélèvements sur du post-mortem.
Impact sur les animaux
Dans ce projet nous proposons d’étudier nos VHH sur des temps d’incubation relativement courts. D’une part, sur un read-out de la thermorégulation corporelle, pour valider le passage spécifique à travers la barrière hémato-Encéphalique du cerveau. D’autre part et sur les mêmes animaux, une biodistribution plus précise et quantifiable de nos VHH sélectionnés, et/ou une mesure d’efficacité, par dosage des quantités d’ANRm rémanentes dans les organes ou tissus d’intérêts. Les cinétiques d'incubations (maximum quelques jours) ne suffisent pas à générer d'effets indésirables ou de conséquences physiologiques, notamment, car les conjugués administrés présentent une demi-vie relativement courte, de quelques minutes à quelques heures. Le principal risque se trouve être la réaction immunitaire aigüe et spontanée. Dans le cadre de nos recherches, ces problématiques sont étudiées en amonts et en post-expérimentales (immunogénicité) couplée par de la littérature, ainsi que de notre expertise chimie et in vivo. Les composés VHH administrés aux souris ne doivent pas présenter de toxicité. Le savoir-faire de la société et les données issues de la littérature nous permettent d'anticiper les principaux risques de toxicité, couramment observés post-administration (choc immunitaire (anaphylactique) ; réaction allergique ; détresse cardio-respiratoire ; modification et troubles comportementaux). Dans le cadre de nos études, les conjugués VHH pourront être couplés à des peptides, drogues, ou autres, tel que de petits ARN interférents (siRNA). Ces derniers nous intéressent particulièrement, car leur rôle sera de bloquer en amont les ARN messagers responsables de l’expression de protéines impliquées dans l’apparition symptomatique de certaines pathologies. Notre étude, sur fond standard C57BL/6J et lignée hTfr (même fond ; cf. Annexe 2), permettra de mieux comprendre et appréhender les disfonctionnements physiologiques, sans que pour autant nos conjugués VHH n'aient, à court termes, d’effets sur la santé et le bien-être animal (3R : raffinement). Malgré ces précautions, une observation comportementale des animaux sera faite de manière quotidienne, à la recherche du moindre signe de souffrance (cf. Procédure, annexe1 MGS), le tout accompagné d'un suivit du poids des animaux entre le début et la fin des cinétiques, afin de s'assurer que les animaux ne perdent pas plus de 10% de poids initial.
Devenir
A l'issue de la procédure (biodistribution) les animaux seront euthanasiés pour réaliser les prélèvements de sang et tissus (Dose létale d'anesthésique en intrapéritonéal ; Kétamine 150 mg/kg ; Xylazine 15 mg/kg). Si des problèmes ou souffrances anormales sont rencontrées en cours de procédure, alors les animaux seront immédiatement sédatés par la même solution d’anesthésique à dose létale, suivit d’un sacrifice par une dislocation des cervicales.
Remplacement
Pour mener à bien nos modèles précliniques après validation in vitro, nous envisageons de réaliser des expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, modèle indispensable pour l’étude des mécanismes in situ (3R : remplacement). Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique. Le modèle vivant, ici la souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres physiologiques, mécanistiques et homéostasiques, indispensables pour étudier une efficacité pharmacologique chez les mammifères. Le principal désavantage concerne donc le recours à l’utilisation d’animaux. Il s’agit pour cela de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus. Les faibles cohortes d'animaux permettront, malgré tout, d’obtenir un maximum de résultats, suffisant pour l’obtention de données statistiques significatives (3R : remplacement et réduction).
Réduction
L’optimisation de nos vecteurs en fonction de la voie d’administration permet d'envisager une médication optimisée et réduite (doses moins importantes), limitant de ce fait les possibles effets secondaires non souhaités (Raffinement), mais aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux se répartit sur de petits groupes de n=4, à raison de 240 souris/an, réparties sur 3 études de 80 individus (10 groupes sur fond C57BL/6J et 10 groupes sur fond mutant hTfr), suffisant pour appréhender un effet de la sélection de conjugués sur les souris des 2 lignées. Cette estimation a été faite d’après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par la société. Pour une analyse statistique, le faible « n » (4 individus) nous orientera vers des modèles non-paramétriques. Sur de l’expérimentation in vivo, tous les paramètres ne sont pas maîtrisés, et sont basés sur des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles. Nous pourrons réaliser un équivalent du test d’homogénéité entre groupes, un test de Kolmogorov-Smirnov ou encore une analyse de variance (N.S one-way ANOVA). En cas d’analyse dite qualitative, on parlera de succès ou d’échec. Pour la partie échantillonnage et prélèvements de tissus en fin de procédure, une liste précise et déclinée sur plusieurs types de post-expérimentations, permettra d'optimiser chacune des souris, de manière qu'il n'y ait pas d'utilisation abusives et inutiles de souris. La réalisation de prélèvements intermédiaires (Prélèvement caudal ≤50 μl) en cours de cinétique permettra d'obtenir des données plasmatiques supplémentaires, ce qui va également dans le sens d'une optimisation et réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
La formation initiale et l’expérience du personnel permettent d’avoir suffisamment de recul pour appréhender tout signe et/ou comportement caractéristique d’une douleur ou gène chez l’animal (voir points limites Annexe 1 MGS), appuyés si besoin par la présence sur site d’un pharmacien et vétérinaire pour exercer dans le respect des 3R. Comme cité dans cette même partie de la procédure, nous porterons une attention particulière à la phase amont de l’expérimentation qui regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux. Au minimum la veille des tests, les souris sont sorties de l’animalerie dans une pièce cyclée (12h/12h), insonorisée, armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont ainsi maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), avec la même cage (taille standard pour portoir ventilé+couvercle à filtre), un maximum de 4 individus par cage, litières (copeaux de bois) et raffinements (maison en carton et Sizzle-Nest). Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Le choix des cinétiques sera également affiné au plus juste pour éviter de longs tests inutiles et de possibles angoisses supplémentaires. De plus, travaillant sur animal sain (C57BL/6J et C57BL/6J hTfr), la simplicité des administrations uniques ou répétées (administration i.v. 5.5ml/kg (Aiguilles 27G (3/4 ; 0.4/19mm)) ; s.c. 10ml/kg (Aiguilles 26G (‘’3/8’’ ; 0.45*10mm)) et i.p. 10ml/kg (Aiguilles 25G (‘5/8’’ ; 0.5*16 mm))) sur animal vigile et le court laps de temps d’exposition des molécules (cinétique de quelques heures à maximum 1 semaine), nous permettent d’éviter toute apparition potentielle de phénotypes dommageables chez les animaux. Dans cette procédure, nous utiliserons des animaux issus d’élevages extérieurs de chez deux fournisseurs différents.
Choix des espèces
Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières études pré-cliniques. Le développement préclinique nécessite tôt ou tard une première approche in vivo, sur un modèle animal tel que le rongeur, dans notre cas, la souris. C’est le modèle le plus standardisé et utilisé dans la racherche en expérimentation animale, notamment par sa physiologie connue (mammifère) et relativement proche de l’homme. Le modèle rongeur facilite les manipulations, les injections et observations comportementales. Il est aussi plus adapté et intéressant pour la partie pharmacologie (diminution des posologies). En pratique, on l’utilise principalement pour la facilité de mise en place des expérimentations, l’obtention de groupes jusqu’à 6-8 individus sans trop de contraintes de stabulation. Le modèle souris est surtout préférentiel lorsqu’il s’agit de mette en place l'élevage d’une lignée génétiquement modifiée avec une (des) mutation(s) donnée(s), ou encore d'étudier de nombreux modèles de pathologies, plus facilement accessibles. Les animaux seront utilisés pour réaliser des suivis pharmacologiques, des échantillonnages de tissus, organes ou liquides physiologiques, ceci à des fins scientifiques. Pour notre procédure, nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 8 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter individus, qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Ce stade « jeune adulte » présente un poids moyen de 25-27g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).
Efficacité de la Léciréline pour induire l’ovulation chez la jument, et impact sur la survenue d’une gestation à 12 jours
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
40 juments vont être utilisées, puis rendues au troupeau expérimental de l'établissement, dans des procédures déclarées de gravité légère. Chacune subit un suivi gynécologique sur quatre cycles avec échographies transrectales quotidiennes, inséminations, injections d'induction de l'ovulation, collectes d'embryons par lavage utérin et biopsie utérine, pour tester une molécule (léciréline) déclenchant l'ovulation. Le porteur déclare "aucun" impact sur les animaux, alors que les actes répétés touchent l'appareil génital. Le bénéfice annoncé vise la filière d'élevage équin, et le porteur affirme que l'usage de juments de l'espèce de destination est "indispensable".
Objectifs
Tester l'efficacité de la léciréline (molécule analogue de la GNRH) pour l'induction de l'ovulation ainsi que son impact sur la survenue ou non d'une gestation chez la jument. Cette étude se propose de réaliser le suivi gynécologique de 40 juments durant 3 mois (avril, mai, juin), sur 4 ovulations chacunes. Chacune des juments devra subir deux inductions d'ovulation par une injection de Léciréline et deux inductions d'ovulation par une injection de gonadotrophine chorionique humaine (hCG), les ovulations 1 et 3 seront induites sur chaleur délenchée par un traitement lutéolytique (injection de Cloprosténol), tandis que les ovulations 2 et 4 seront induites sur retour en chaleur spontané. On pourra ainsi comparer l'efficacité de la léciréline à celle de la gonadotrophine chorionique humaine sur chaleurs spontanées et sur chaleurs déclenchées par un traitement lutéolytique (cloprosténol) sur 40 juments. Par ailleurs, l'impact de la molécule utilisée pour induire l'ovulation sur le taux de gestation sera évalué grâce à l'exploitation en insémination artificielle (semence fraîche) 24 heures après l'induction d'ovulation des deux cycles spontanés de chaque jument. Suite à des collectes d'embryons à 12 jours post ovulation, les effets de l'âge et de la parité de la jument sur l'embryon seront aussi déterminés.
Bénéfices attendus
Offrir à la filière élevage équin des données d'inocuité et d'efficacité d'une molécule légalement utilisable chez la jument pour l'induction de l'ovulation, selon le principe de la cascade. Améliorer les connaissances liées aux effets du vieillissement de la jument sur l'embryon
Procédures
- échographie ovarienne et utérine par voie transrectale (2 minutes par examen, examen quotidien à biquotidien du début des chaleurs au constat d'ovulation) - insémination artificielle par voie transcervicale (1 minute, 2 fois par jument) - injection intraveineuse d'induction de l'ovulation (5 secondes, 4 fois par jument) - injection intramusculaire de cloprosténol (3 secondes, 2 fois par jument) - collecte d'embryon par lavage utérin par voie transcervicale (15 minutes, 2 fois maximum) - prise de sang (10 secondes, 1 par collecte, 2 fois maximum) - biopsie utérine (5 minutes, 1 fois par jument ayant donné un embryon) - Lavage utérin pour réalisation de cytologies (en même temps que la collecte d'embryon pour les juments avec un diagnostic de gestation positif à 12 jours et 15 minutes, maximum 2 fois par jument pour celles n'ayant pas donné d'embryon).
Impact sur les animaux
Aucun
Devenir
Retour au sein du troupeau expérimental de l'établissement utilisateur
Remplacement
L'objectif étant de valider l'inocuité et l'efficacité de la léciréline chez la jument, cet essai clinique impose l'utilisation d'individus vivants de l'espèce de destination (cheval).
Réduction
Exploitation de 4 cycles oestraux sur chaque jument afin de réduire le nombre d'animaux impliqués. Chaque jument sera son propre témoin. Afin de réduire l'utilisation des animaux, une collecte d'embryon sera effectuée au cycle 2 et 4 si un diagnostic de gestation positif est obtenu à J12. Des tests statistiques unilatéraux seront utilisés pour tester l'hypothèse de non-infériorité clinique de la léciréline par rapport au traitement de référence (hCG) sur la survenue de l'ovulation et de la gestation. Après la vérification de la normalité des données, des modèles linéaires à effets mixtes seront effectués à l’aide du logiciel Rstudio pour analyser l’effet de l’âge et de la parité. Si les données ne sont pas normales, des tests de permutations seront effectués pour corriger la p-value.
Raffinement
Les juments utilisées pour ce protocole sont des animaux parfaitement habitués aux examens et manipulations qui leur seront imposés dans le cadre de notre étude (examen gynécologique, insémination artificielle, collecte d'embryon par lavage utérin, injection intramusculaire, injection intraveineuse, prise de sang). Elles resteront dans leur environnement habituel (en groupe) où elles seront manipulées par leurs soigneurs habituels. Les actes de suivi gynécologique seront exclusivement réalisés par un vétérinaire équin expérimenté en suivi de reproduction de la jument. Les actes d'insémination artificielle, de collecte d'embryon, de lavage utérin, de biopsie, d'injections intraveineuse et intramusculaire et de prise de sang seront exclusivement réalisés par des manipulateurs habilités (inséminateurs équins, chefs de centre ou vétérinaire).
Choix des espèces
Il s'agit d'un essai clinique chez la jument d'un médicament vétérinaire disposant d'une autorisation de mise sur le marché pour cette même indication chez la lapine et la vache. L'utilisation d'animaux femelles à maturité sexuelle, de l'espèce de destination est indispensable.
Inhibition de l’accumulation thalamique de fer dans la prévention de la dégénérescence secondaire après infarctus cérébral
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
252 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Après un infarctus cérébral, elles subissent des IRM répétées, des injections dans le nez trois fois par semaine et des tests comportementaux d'apprentissage étalés sur trois jours, pour tester des médicaments réduisant l'accumulation de fer dans le cerveau. Le porteur classe l'ensemble en gravité légère hors la mise à mort finale, alors qu'un infarctus cérébral est induit chez ces animaux. Toutes les souris sont tuées pour prélever leur cerveau et confirmer par histologie ce que l'IRM ne montre pas seule.
Objectifs
L'objectif principal de ce projet est d'apporter des solutions au suivi post-AVC, afin d'éviter des symptomes secondaires suite à l'infarctus cérébral. Pour cela, bous allons tester plusieurs médicaments, pour certains, déjà utilisés dans la pratique médicale courante, dans le but de réduire l'accumulation de fer dans des régions déconnectées par l'AVC.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d'améliorer la prise en charge des patients après un accident vasculaire cérébral, de les suivre de manière adéquate grâce à de nouveaux biomarqueurs et d'apporter de nouvelles solutions thérapeutiques pour diminuer les symptômes secondaires à l'infarctus cérébral. Les bénéfices attendus sont donc ceux-ci, avec une translation à l'Homme rapide (étude clinique déjà en cours de recrutement en parallèle à ce projet, avec un des médicaments testés).
Procédures
Les animaux ne sont soumis a aucune intervention faisant l'objet de procédures dans cette saisine. Seule la procédure 2 implique une manipulation des souris pour des injections en intra-nasal ou per os de médicaments, pouvant être considérée comme une intervention. Toutes les souris de ce projet sont soumises à cette manipulation (252 souris).
Impact sur les animaux
Les animaux ne subiront que des procédures de classe légère durant le projet, en-dehors de la dernière, qui nécessite leur euthanasie afin de récupérer les cerveaux et d'effectuer des analyses post-mortem. Les animaux seront donc suivis et pris en charge sans nuisances, ni effets indésirables attendus, jusqu'à leur euthanasie. La procédure 1 (IRM) dure 1h30 par souris et par IRM, répété toutes les deux semaines. La procédure 2 (injection intra-nasale) dure environ 1 minute par souris et par injection, répété 3 fois par semaine. Enfin, la procédure 3 (analyse comportementale) dure environ 4h par souris, étalées sur trois jours (apprentissage...) et ne sera pas répétée. Pour la dernière procédure (euthanasie et prélèvements), les souris ne sont plus conscientes, la procédure dure environ 20 minutes depuis l'injection d'anesthésiant jusqu'au prélèvement des cerveaux.
Devenir
Les modifications de signal observées en IRM ne sont pas parfaitement spécifiques et seule une étude histologique (immunofluorescence), génomique (qPCR) et analytique (dosage du fer in situ) combinée permettra de confirmer cette hypothèse et de connaitre la forme sous laquelle l’excès de fer est présente (fer libre ou ferritine notamment) et si elle peut être traitée. Cette analyse histologique nécessite le prélèvement des cerveaux des souris de ce projet, impliquant une euthanasie pour toutes les souris.
Remplacement
Chez l’Homme les modifications thalamiques post-AVC sont compatibles avec une augmentation du fer. Néanmoins, les modifications de signal observées en IRM ne sont pas parfaitement spécifiques et seule une étude histologique combinée permettra de confirmer cette hypothèse et de connaitre la forme sous laquelle l’excès de fer est présente (fer libre ou ferritine notamment). Des analyses histologiques et comportementales permettront également d'éclaircir les mécanismes sous-jacents à la neurodégénérescence observée chez l'Homme. Enfin un premier niveau de preuve d’efficacité des traitements luttant contre l'accumulation de fer et son impact sur la mort cellulaire est nécessaire chez l’animal. La démonstration de leur effet bénéfique thérapeutique avant transposition chez l'homme ne peut se faire que dans un modèle animal proche de la physiopathologie humaine car la culture cellulaire ne peut reproduire la complexité des réseaux qui relient le cortex au thalamus et dont l’interruption est à l’origine des phénomènes de neurodégénérescence à distance.
Réduction
Notre projet a été designé dans le but de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés, afin d'obtenir des statistiques correctes, extrapolables à des cohortes plus nombreuses. Nous avons pris à coeur d'inclure des femelles et des mâles dans nos analyses également afin d'obtenir des résultats fiables pour une translation à l'Homme efficace.
Raffinement
Tous les animaux seront soigneusement suivis au cours de ce projet. Une grille d'évaluation de la douleur a été établie pour permettre un suivi adéquat. Aucune des procédures de cette saisine, en dehors de la dernière qui nécessite la mise à mort des animaux, ne sont de classe moyenne ou sévère, réduisant ainsi au maximum la douleur. En cas de propblème, des protocoles ont été mis en place pour pallier à une éventuelle douleur (détaillés dans cette saisine).
Choix des espèces
Le modèle envisagé a déjà été induit chez la souris et il a été démontré que les AVC étaient de petite taille mais s’accompagnaient de modifications thalamiques via des phénomènes de déconnexion. Une éventuelle accumulation de fer ainsi que sa temporalité n’a néanmoins pas été étudiée. Nous utiliserons des souris adultes mâles et femelles âgées de 6 à 8 semaines au moment de la chirurgie. Les animaux subiront la chirurgie à l'âge adulte, équivalent à un infarctus humain.
Le rôle de PRL2 dans la lymphangiogenèse
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
436 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes, des nouveau-nés et des adultes reçoivent des injections de tamoxifène, et une partie subit une chirurgie de prélèvement d'un fragment de peau du dos, pour étudier le rôle d'une protéine dans la formation des vaisseaux lymphatiques. Le porteur indique une euthanasie immédiate en cas de saignement péritonéal, de mort des embryons dans l'utérus ou de nouveau-nés délaissés. Les animaux sont mis à mort pour prélever plusieurs tissus, le remplacement étant écarté au motif que le développement embryonnaire ne se reproduit pas in vitro.
Objectifs
Le projet vise à caractériser le rôle d'une protéine phosphatase dans la lymphangiogenèse (la formation des vaisseaux lymphatiques) afin de comprendre les mécanismes de la formation des vaisseaux lymphatiques. Ce projet se divise en deux axes : (1) Déterminer si notre protéine d'intérêt est impliquée dans la lymphangiogenèse pendant le développement embryonnaire et à quel stade précisément. (2) Déterminer si cette protéine est impliquée dans la lymphangiogenèse chez l’adulte dans un contexte de cicatrisation de tissue.
Bénéfices attendus
La lymphangiogenèse est un sujet de recherche relativement récent et bien qu’il y ait des avancées majeures dans la compréhension de ce processus, beaucoup d’aspects restent encore à être étudier, notamment le rôle des régulateurs intracellulaires dans la formation des vaisseaux lymphatiques. Parmi ces régulateurs, nous avons principalement des protéines kinases et des protéines phosphatases. Dans ce projet, nous proposons d’étudier une protéine phosphatase qui a déjà un effet modulateur dans le développement vasculaire sanguin. Le système vasculaire sanguin et lymphatique ayant des mécanismes similaires, nous pensons que cette phosphatase aurait également un rôle régulateur sur la formation des vaisseaux lymphatiques. Les résultats préliminaires in vitro montrent que notre phosphatase d’intérêt a un effet sur la prolifération et la migration des cellules endothéliales lymphatiques, mais également sur la formation de structure tubulaire par ces cellules. Ceci suggère que cette phosphatase pourrait donc avoir un rôle dans la régulation de la lymphangiogenèse. Si cela est aussi observé in vivo, ce projet nous permettra d’ajouter un nouveau régulateur dans le processus et également une meilleure compréhension du rôle des phosphatases dans la lymphangiogenèse. La lymphangiogenèse est un processus important pour le bon fonctionnement de l’organisme et un dérèglement de ce processus entraîne souvent le développement ou l’aggravation d’une pathologie comme par exemple les lymphoedèmes ou les métastases. Ainsi, tout régulateur de la lymphangiogenèse peut devenir une cible thérapeutique pour activer ou inhiber la formation des vaisseaux lymphatiques afin de prévenir ou de guérir les pathologies. Par exemple, dans le cas des cancers avec un risque de métastase, les deux voies les plus probables pour les cellules tumorales sont les vaisseaux sanguins et lymphatiques. Donc, en inhibant la formation de ces vaisseaux à la périphérie de la tumeur, le risque de métastase diminue. Ainsi, l’utilisation d’un inhibiteur de lymphangiogenèse comme adjuvant, comme les anti-angiogéniques, pourrait améliorer le traitement des cancers. Or, pour inhiber la lymphangiogenèse, il est nécessaire de comprendre le mécanisme de formation des vaisseaux pour pouvoir cibler les régulateurs. Dans notre cas, notre phosphatase d’intérêt pourrait devenir une cible pour inhiber la formation des vaisseaux lymphatiques.
Procédures
Un total de 108 femelles gestantes recevront deux injections intrapéritonéales d’hydroxytamoxifen sur deux jours consécutifs (E9-E10, E11-E12 ou E13-E14) et seront euthanasiées à E18. Un total de 208 nouveaux-nés recevront également 2 injections intrapéritonéales d’hydroxytamoxifen à P1 et P3 et seront anesthésiés à P7. 120 souris entre 8 et 10 semaines recevront 3 injections intrapéritonéales de tamoxifen par semaine pendant 2 semaines. Chaque injection intrapéritonéale prend moins d'une minute par souris. Les souris injectées avec du tamoxifen subiront par la suite une chirurgie de 5 minutes pour un prélèvement de peau de 8 mm de diamètre sur le dos. Durant la chirurgie, elles seront sous anesthésie générale (isoflurane), sous anesthésie locale cutanée (crème Anesderm 5%) et sous analgésique (buprénorphine). Ces souris recevront ensuite une application quotidienne de vaseline (moins d'une minute par application) et seront ensuite suivies pendant une vingtaine de jours avant d’être euthanasiées. Les injections d'hydroxytamoxifen et de tamoxifen servent à induire l'extinction d'expression de notre protéines d'intérêt dans les cellules composant les vaisseaux lymphatiques.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, nous croiserons deux lignées de souris différentes afin d'obtenir une nouvelle lignée de souris avec une délétion spécifique de notre protéine phosphatase dans les cellules endothéliales lymphatiques. Au laboratoire, nous travaillons également avec une lignée de souris ayant une délétion ubiquitaire d'expression de notre protéine phosphatase et également une lignée de souris ayant une délétion spécifique de notre protéine phosphatase au niveau des vaisseaux sanguins et lymphatiques. Aucun phénotype délétère n’a été observé chez ces deux lignées lors de l'extinction d'expression de la protéine. De ce fait, la lignée de souris que nous établirons pour projet ne devrait pas présenter de phénotype dommageable. Cependant, l’apparence et le comportement des animaux seront tout de même observés pour prévenir d’un quelconque phénotype dommageable. En cas de cachexie, de prostration, de tremblements ou d’autre comportement anormal, l’animal sera immédiatement sacrifié. La création de cette lignée de souris sera suivie et validée par la SBEA.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus nécessaires aux analyses visant à déterminer la formation des vaisseaux lymphatiques. Les vaisseaux lymphatiques forment un réseau vasculaire dans le corps entier des animaux. Ainsi plusieurs tissus seront récupérés sur l'animal (oreille, diaphragme, mésentère et peau).
Remplacement
Le projet vise à caractériser le rôle d'une protéine phosphatase dans la lymphangiogenèse (formation des vaisseaux lymphatiques), autant au niveau développemental que chez l’adulte. Ceci nécessite donc l’utilisation d’un modèle in vivo car il n’est pas possible de reproduire les conditions de développement embryonnaire et de cicatrisation in vitro. Le développement embryonnaire est un processus complexe où chaque étape est importante pour que la suivante puisse commencer. La formation des vaisseaux lymphatiques suit également cette logique et chaque étape importante a déjà été lié à un stade de développement particulier chez l'embryon de souris. Ainsi, le modèle murin nous permet d'étudier le rôle de notre protéine à des étapes précises de la formation des vaisseaux lymphatiques. La formation des vaisseaux lymphatiques implique également des interactions complexes avec d'autres cellules de l'organisme, comme les cellules immunitaires dans le cas d'une cicatrisation. Or ces interactions celulle-cellule sont difficile à reproduire car tous les mécanismes ne sont pas encore décrit.
Réduction
Pour être statistiquement significatif et scientifiquement irréprochables, nous utiliserons 10 souris de chaque génotype/expérience. Expériences répétées 4 fois (1 expérience pour ajuster les protocoles et 3 expériences pour prouver la reproductibilité des résultats). Nos génotypes d’intérêt premier sont les souris avec une délétion inductible de notre protéine et les souris sans délétion inductible. Nous aurons aussi des animaux contrôle secondaire pour vérifier que le gène d'induction de la délétion n'a pas d'effet seul. Si aucun effet n’est observé lors des 2 premières expériences, nous exclurons ces souris par la suite pour réduire le nombre d’animaux. Nous avons optimisé nos croisements pour n’obtenir que les génotypes d’intérêt à chaque portée, ce qui est d’autant plus important lors de nos expériences au stade embryonnaire et post-natal, où le génotype n'est pas connu, pour limiter le nombre d’animaux. Nous ferons des croisements séparés pour les souris contrôle secondaire, afin de pouvoir les exclure facilement si nécessaire. Nombre maximal d’animaux estimé = 436. Les études statistiques seront réalisées grâce à un test ANOVA afin de comparer les différents groupes génotypiques entre eux dans chaque expérience.
Raffinement
Une surveillance d’une grande attention sera faite après chaque geste expérimental. Pour les injections intrapéritonéales, 10 minutes d’observation et une vérification 1h après. En cas d’inconfort ou de souffrance, l’animal sera tout de suite pris en charge par les soigneurs et sacrifié si son état est trop grave. En cas de saignement au niveau de la cavité péritonéale, l’animal sera immédiatement sacrifié. Pour les femelles gestantes, en cas de mort intra-utérine des embryons la femelle sera immédiatement euthanasiée. Pour les nouveaux-nés, s’ils ne se nourrissent plus ou sont mis à l’écart, ils seront euthanasiés. Dans le cas des tests de cicatrisation, un analgésique et un anesthésiant local seront utilisés en plus de l’anesthésie générale lors de la chirurgie et les souris seront placées sur un tapis chauffant. Suite à la chirurgie, de la vaseline sera appliquée quotidiennement pour couvrir la plaie et la maintenir humide. Pour ne pas influencer les résultats, l’utilisation d’un désinfectant ne se fera qu’en cas d’infection ou de suppuration. Si l’état de l’animal s’aggrave et sans amélioration après traitement, il sera sacrifié. Les cages seront enrichies en accord avec la procédure expérimentale. Des tunnels seront présents dans chaque cage. Pour les femelles gestantes ou avec des petits, il y aura un enrichissement de la litière en copeaux et des accessoires de nidification. Pour les animaux en cicatrisation, les cages seront aménagées pour que chaque animal soit isolé, mais avec un contact visuel et olfactif avec son congénère. Pour toutes les procédures expérimentales, il y aura un suivi quotidien des animaux et chaque changement physique ou comportemental sera noté sur une fiche de suivi hebdomadaire. Tout comportement anormal grave comme la prostration ou des tremblements entraînera l’euthanasie immédiate de l’animal. Pour des changements plus légers, l’avis d’un vétérinaire sera demandé et une décision sera prise en concertation avec le vétérinaire, les soigneurs et le responsable du projet pour définir la meilleure prise en charge de l’animal. Les soins seront toujours effectués par les mêmes expérimentateurs pour réduire le stress des animaux et tout le personnel de l’animalerie impliqué dans ce projet a les compétences et l’expérience nécessaire pour la partie expérimentale. Au cours du projet, nous nous maintiendrons informer des possibles améliorations de raffinement adaptables à nos procédures.
Choix des espèces
Le projet vise à caractériser le rôle d'une protéine phosphatase dans la lymphangiogenèse, autant au niveau développemental que chez l’adulte. Ceci nécessite donc l’utilisation d’un modèle in vivo car il n’est pas possible de reproduire ces conditions in vitro. Par des tests fonctionnels in vitro, nous avons déjà établi que la diminution d’expression de notre protéine dans les cellules endothéliales lymphatiques formant les vaisseaux impacte les processus biologiques essentiels à la lymphangiogenèse. Afin de confirmer l’importance de cette protéine phosphatase dans la formation des vaisseaux lymphatiques, nous voulons donc passer à un modèle murin avec une délétion spécifique de la protéine dans les cellules endothéliales lymphatiques. La lignée de souris de notre projet sera obtenue par le croisement de deux lignées déjà existantes et cette lignée permettra de déléter spécifiquement notre protéine phosphatase au niveau des vaisseaux lymphatiques. Ce modèle nous permettra ainsi d’étudier le rôle de notre protéine dans la formation des vaisseaux lymphatiques, aussi bien au niveau développemental que chez l’adulte. Les procédures au niveau dévelopemental impliquent 2 injections d’hydroxytamoxifen à des femelles gestantes au stade embryonnaire E9-E10, E11-E12 ou E13-E14. Ces stades de développement correspondent à différentes étapes importantes de la formation du système vasculaire lymphatique : formation des sacs lymphatiques, développement des vaisseaux collecteurs et formation des valves. Les embryons seront récupérés à E18 pour analyse du réseau lymphatique. Pour le développement vasculaire lymphatique post-natal, des nouveaux-nés recevront 2 injections d’hydroxytamoxifen, à P1 et à P3, et seront sacrifiés à P7. Pour définir le rôle de notre protéine phosphatase dans la lymphangiogenèse chez l’adulte, nous utiliserons des souris âgées entre 8 et 10 semaines pour les expériences de cicatrisation. Cela nous assure une cicatrisation optimale de la plaie avec un système immunitaire performant pouvant induire la lymphangiogenèse.
Un modèle murin d’étude de la réparation de l’ADN dans le développement du cerveau
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
522 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes subissent sous anesthésie une chirurgie de 30 à 45 minutes pour introduire un marqueur fluorescent dans les embryons par électroporation, afin d'étudier des lésions programmées de l'ADN dans le cerveau en développement. Le porteur indique des injections d'analgésiques avant et après l'opération et une surveillance quotidienne, avec euthanasie en cas d'atteinte de points limites. Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement d'organes, et le porteur affirme que ces questions ne peuvent s'étudier que sur le mammifère "in toto".
Objectifs
Les cassures de l’ADN sont des lésions génomiques très toxiques qui interviennent lors du développement du système nerveux central. Des mécanismes puissants de réparation de ces lésions évitent l’instabilité génétique qu’elles pourraient engendrer. La mauvaise réparation de ces lésions est à la base de nombreuses pathologies chez l’homme comme certaines maladies neurodégénératives, des déficits immunitaires sévères et le développement de cancers. Chez l’animal, les formes les plus sévères de déficit de réparation des lésions de l'ADN se traduisent par une létalité embryonnaire tardive consécutive à la mort des neurones. Plusieurs facteurs impliqués dans diverses voies de réparation des dommages à l'ADN ont été identifiés à partir de l’analyse de situations pathologiques chez l’homme et analysés dans des modèles animaux d’invalidation génique afin d’en mieux comprendre la fonction. L'objectif du présent projet est d'identifier les raisons de la létalité embryonnaire de certaines lignées de souris déficientes en voie de réparation de l'ADN. Nous émettons l'hypothèse que certains dommages programmés de l'ADN dans le cerveau en développement sont à la base du phénotype. Nous projetons de générer une lignée de souris mutantes incapables de générer ces lésions et d'évaluer si ce fonds génétique peut sauver la létalité embryonnaire des animaux déficients en réparation de l'ADN. De plus nous produirons une souris reportrice pour suivre les cellules dans lesquelles interviennent ces lésions programmées.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est la détermination de la fonction des lésions programmées de l’ADN dans les phases précoces du développement du cerveau. Cette fonction est jusqu'à présent inconnue. Cette étude nous permettra alors de mieux comprendre la mort cellulaire neuronale et la létalité embryonnaire qui en découle chez les animaux porteurs d'anomalies de la réparation de l'ADN. In fine, cette étude participera à la compréhension de maladies génétiques de l'enfant caractérisées par des anomalie du développement, l'existence de microcéphalies ainsi que le développement de tumeurs cérébrales et les mécanismes de vieillissement accéléré.
Procédures
Pour l'analyse in vivo des lésions programmées de l’ADN, des embryons à E12.5 ou 14.5 recevront par électroporation in utero (en une seule intervention et sous anesthésie générale) des souris femelles gestantes un marqueurs fluorescent de ces dommages . La chirurgie dure entre 30 et 45 min selon le nombre d’embryons avec 45 min comme durée maximum.
Impact sur les animaux
Les souris avec un défaut de réparation de l'ADN ont un phénotype dommageable connu ; une létalité embryonnaire. Nous n’envisageons pas de phénotype dommageable des deux lignées mutantes faisant l’objet de ce dossier. L’analyse des lésions de l’ADN dans le cerveau par l'introduction intra-embryonnaire d'un marqueur fluorescent peut présenter quelques nuisances liées à l'expérimentation. Afin de minimiser ces nuisances, les souris placées sur une plaque chauffante reçoivent une anesthésie générale ainsi que des injections sous-cutanées d'analgésiques en pré- et post-opératoire. Un gel ophtalmique est également utilisé pour éviter un dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance. Une grille d'évaluation des animaux est mise en place. Une injection d'analgésique ou l'euthanasie de l'animal sont envisagées en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure pour prélèvement d'organes et analyses phénotypiques
Remplacement
Les questions scientifiques que nous posons ne peuvent être étudiées qu’in vivo ou ex vivo, sur des cerveaux prélevés sur des embryons. Il s’agit ici d’études sur le développement du cortex cérébral, qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère in toto. En effet, le développement du cortex des mammifères et son fonctionnement ultérieur sont de mieux en mieux caractérisés chez la souris et aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de ces processus dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part.
Réduction
Notre expérience préalable sur ce type de modèles animaux avec défaut de réparation de l'ADN nous montre que les phénotypes, lorsqu’ils sont dommageables (létalité́ embryonnaire, baisse de viabilité́ avant sevrage ou déficit immunitaire), sont en général suffisamment importants et homogènes pour être statistiquement significatifs sur de faibles cohortes. Selon le calcul de puissance effectué sous G*Power (puissance de 0.8 et une p-value de ≤0.05), l'évaluation du caractère dommageable nécessite 65 animaux pour la lignée Pgbd5 KO, 289 animaux pour les croisements de Pgbd5 sur fonds génétiques XRCC4 ou PAXX/Xlf KO et 65 animaux pour la lignée reportrice. L’analyse statistique sera réalisée par un test non-paramétrique Mann-Whitney de comparaison de fréquences.
Raffinement
Un des phénotypes dommageables possible des animaux par ailleurs viables étant un déficit immunitaire plus ou moins sévère, ils seront obtenus et maintenus en portoirs ventilés, en zone EOPS afin de minimiser leur exposition à des agents pathogènes. Un suivi quotidien permettra de s’assurer que les animaux ne développent pas de signes cliniques d’infection. Devant un état moribond du pelage, une voussure ou prostration sévère ou un amaigrissement important laissant supposer une telle infection ou un mal-être général, les animaux seront systématiquement euthanasiés. Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (coton, bâton, tunnel) avec eau et nourriture ad libitum et en groupe social avant et après la procédure. Lors de la procédure #2 la litière utilisée dans la cage est spécifique pour les animaux opérés et permet de diminuer le risque d'infection de la cicatrice. La nourriture ainsi qu’un gel hydrique sont placés directement dans la litière pour une meilleure accessibilité. Lors des actes chirurgicaux, les souris placées sur une plaque chauffante sont anesthésiées (Isoflurane, induction : 3%, maintien : 2%) et reçoivent des injections sous-cutanées (seringues 27G, volume injecté de 5µl/g) d'analgésiques en pré́- (Buprenorphine 0,05μg/g) et post-opératoire (Kétoprofène 5μg/g). La couverture antalgique du kétofene dure 36h post opération. Un gel ophtalmique est également utilisé pour éviter un dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance. Une grille d'évaluation des animaux est mise en place. Une injection d'analgésique ou l'euthanasie de l'animal sont envisagées en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle pour mener les études sur le développement du cerveau, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme. En effet, seuls les Mammifères présentent un néocortex organisé en couches inversées. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce pour la réalisation du projet tels que des anticorps pour les immuno-marquages. L'analyse des phénotypes dommageables éventuels se fait sur des femelles gestantes pour la létalité embryonnaire et sur des animaux nouveau-nés de la naissance jusqu'au sevrage pour la baisse de viabilité. L'analyse in vivo des lésions programmées de l’ADN est effectuée sur des embryons à E12.5 et E14.5. Les embryons sont ensuite analysés à E16.5 et E18.5 après activation du marqueur fluorescent.