Procédures légères

8 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère. Le porteur les rend immunodéficientes, leur greffe des cellules de patients atteints de leucémie lymphoïde chronique et injecte des anticorps marqués par fluorescence, suivis par quinze séances d'imagerie sous anesthésie gazeuse. Il décrit une étude pilote de deux animaux par groupe sans analyse statistique et sans prélèvement, la mise à mort intervenant à la fin. Sur le remplacement, il se borne à affirmer que l'étude de la distribution des anticorps "impose d'avoir recours à des animaux".

Objectifs

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est une maladie touchant des cellules du sang appelées les lymphocytes B (LB). Elle reste une maladie fréquente avec 4500 nouveaux cas chaque année. Pour les patients, le traitement repose actuellement sur la chimiothérapie et l’immunothérapie notamment par des anticorps. Les anticorps sont des immunoglobulines, protéines de structure complexe, réparties en plusieurs classes et sous-classes avec des activités biologiques spécialisées. Deux nouveaux anticorps monoclonaux ont été developpés, l'un est une immunoglobuline de type G (IgG), l'autre de type M (IgM). Nous souhaitons déterminer par imagerie, la localisation et la distribution des anticorps (marqués par un fluorochrome, la cyanine 7). Cette étude va nous permettre d’évaluer la capacité de ciblage tumoral des anticorps, évaluer s’il y a une liaison tissulaire non spécifique et ainsi déterminer un index thérapeutique correspondant au rapport entre la fixation des anticorps sur la tumeur et celle sur les tissus sains. Nous utiliserons comme modèle, la souris NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ communément appelée NSG (NOD Scid Gamma) qui est immunodéficiente et caractérisée par une absence de lymphocytes T, LB et de cellules tueuses (NK). Cette immunodéficience nous permet de greffer des cellules mononuclées de sang périphérique de patients atteints de LLC.

Bénéfices attendus

L’avantage à court terme de cette étude est de permettre de voir la localisation, la distribution et l'affinité des anticorps chez nos souris greffées avec des cellules mononuclées de sang périphérique de patients atteints de LLC. Le bénéfice à plus long terme de l'étude est la poursuite du développement d'un ou des deux anticorps en clinique humaine.

Procédures

Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux. Les souris seront soumis à des pesées (9 pesées réalisées sur animal vigile), chaque pesée durera moins de 30 secondes. Les autres gestes techniques, une injection sous-cutanée de cellules mononuclées de sang périphérique de patients atteints de LLC et une injection intraveineuse d'anticorps, seront réalisés sous anesthésie gazeuse afin d'éviter du stress et de l'inconfort aux animaux. Les imageries de fluorescence des anticorps, un total de 15 imageries de 5 minutes maximum par souris sur toute la durée de la procédure seront également réalisées sous anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

La procédure expérimentale a été conçue de manière à minimiser les dommages causés aux animaux. Il s'agit d'une procédure de classe légère. Du stress pourra être généré lors de la pesée des animaux, neuf pesées seront réalisées durant le suivi (J0; J1; J2; J3; J4; J7; J9; J11 et J15), chaque pesée durant moins de 30 secondes. Du stress pourra également être généré au moment de l'anesthésie gazeuse, cette dernière dure environ 5 minutes.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure.

Remplacement

L'objectif de ce travail est d’étudier la localisation, la distribution et l'affinité d'anticorps fluorescent chez la souris après une injection intraveineuse, ceci impose d'avoir recours à des animaux pour atteindre les objectifs du projet.

Réduction

Il s'agit d'une étude pilote avec un petit nombre d'animaux, 2 par groupes et il n'y a pas d'analyses statistiques.

Raffinement

Les souris seront acclimatées durant 5-7 jours à l'animalerie avant d'être incluses dans la procédure. La procédure expérimentale a été conçue de manière à minimiser les dommages causés aux animaux. Il s'agit d'une procédure de classe légère, du stress pourra être généré lors des pesées des animaux. La durée de la pesée est rapide moins de 30 secondes par animal. Afin favoriser le bien-être animal conformément à la règle des 3R, les injections de cellules et d'anticorps seront réalisée sous anesthésie gazeuse afin de limiter le stress et de l'inconfort de l'animal. Tout au long de la procédure, les souris sont suivies quotidiennement, le registre de soins complété en se rapportant à la grille de suivi de soins.

Choix des espèces

Les rongeurs, et en particulier la souris, sont des modèles de référence pour l’évaluation des anticorps thérapeutiques pour les études précliniques. Nous utiliserons comme modèle, la souris NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ communément appelée NSG (NOD Scid Gamma). Cette souris est immunodéficiente et caractérisée par une absence de lymphocytes T, lymphocytes B et de cellules tueuses (NK). Cette immunodéficience nous permet de greffer en sous-cutanée les cellules mononuclées de sang périphérique de patients atteints de LLC et ainsi pouvoir mesurer l'index thérapeutique (rapport entre la fixation tumeur/fixation tissus sains). Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines dont le poids varie entre 20-30 grammes. C'est l'âge des souris adultes couramment utilisées dans la littérature lors de la greffe de cellules primaires humaines de LLC.

12 souris vont être utilisées, réutilisées pour des passages d'imagerie répétés tout au long du projet puis mises à mort, dans des procédures classées en souffrance légère. Le porteur développe un dispositif de résonance magnétique qu'il présente comme "strictement non invasif", l'exploration du muscle se faisant sous anesthésie générale sans chirurgie ni capteur implanté. Il souligne que les montages classiques imposent au contraire de sacrifier l'animal après une seule mesure, et met en avant la répétition des examens sur un même individu pour réduire les effectifs. Il affirme qu'aucune alternative ne permet d'explorer la fonction musculaire sans recours à l'animal vivant.

Objectifs

Les techniques de résonance magnétique nucléaire (RMN) ont démontré leur efficacité pour étudier la fonction musculaire in situ. Cependant, en expérimentation animale, le bénéfice de la RMN en termes de non invasivité est perdu étant donné l’utilisation de dispositifs expérimentaux intégrant des systèmes traumatiques pour induire les contractions musculaires (stimulation directe du nerf moteur à l’aide d’une électrode placée sur ce dernier) et pour mesurer la force produite (attachement d’un capteur de force au tendon du muscle étudié) à l’intérieur d’un scanner RMN. En plus des souffrances et angoisses qu’elle peut potentiellement générer, la préparation chirurgicale ainsi requise impose de sacrifier l’animal à la fin de l’expérience, ce qui exclue la possibilité de répéter les explorations plusieurs fois sur le même individu. C’est pour ces raisons que nous avons entrepris de développer une nouvelle approche méthodologique permettant d’explorer la fonction musculaire de manière totalement non invasive chez des souris vivantes anesthésiées. Cette approche, unique au monde, permet de réaliser des enregistrements RMN sur le muscle gastrocnémien de souris en activité en utilisant des méthodes atraumatiques pour induire les contractions musculaires (par électrostimulation transcutanée) et mesurer la force (à l’aide d’un ergomètre semblable à ceux utilisés en clinique chez l’homme), ceci afin d’obtenir des informations sur l’anatomie par imagerie RMN (IRM), sur le métabolisme énergétique par spectrométrie par RMN du phosphore 31 (SRM du P31) et sur les performances mécaniques musculaires. La SRM du P31 offre la possibilité de mesurer in vivo le pH intracellulaire et les concentrations des principaux composés phosphorylés (ATP, phosphocréatine, ADP, phosphate inorganique) impliqués dans le métabolisme énergétique. Nous avons jusqu’à présent mis en œuvre ces méthodologies dans un scanner RMN opérant à 4,7 Tesla, et nous souhaitons maintenant les transférer sur un scanner RMN opérant à plus haut champ. Une augmentation de champ devrait permettre une amélioration de la précision et de la fiabilité des mesures.

Bénéfices attendus

Ce projet original rendra possible pour la première fois au monde l’exploration fonctionnelle non invasive du muscle de souris à très haut champ, ce qui ouvre de nouvelles perspectives d’étude en recherches fondamentale et préclinique.

Procédures

Les animaux ne seront soumis à aucune intervention invasive. Les animaux seront soumis à un type d'intervention (passage à l'IRM), dont la durée sera d'environ 45 mins avec une durée maximale d'une heure.

Impact sur les animaux

Sachant que notre activité est non-invasive, seul l’exposition à l’anesthésie pourrait entraîner des contraintes. Cependant, un soin particulier est apporté au suivi de la respiration, de la température de l’animal ainsi qu’à la durée de l’expérimentation pour éviter tout effet néfaste. Un suivi est apporté après chaque expérimentation pour s’assurer d’une sortie normale de l’anesthésie des animaux.

Devenir

Les procédures effectués sont strictement non-invasive et sans douleur. Les animaux seront ré-utilisés pendant l'ensemble du projet jusqu'à atteintes des objectifs.

Remplacement

Les critères métaboliques et fonctionnels que nous allons étudier sont de types physiologiques, et ne sont donc pas reproductibles avec des cultures de cellules musculaires ; c'est pourquoi nous ne pouvons pas remplacer l’étude chez l’animal vivant. Aucune alternative ne permet l’exploration de la fonction musculaire sans être invasif sur les animaux.

Réduction

L’utilisation des techniques de résonance magnétique nucléaire (RMN) permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. En effet, elles permettent d’enregistrer des cinétiques métaboliques chez les mêmes individus, contrairement aux techniques classiques de biochimie qui auraient nécessité de sacrifier des cohortes d’animaux aux différents temps de la cinétique afin de réaliser des dosages métaboliques sur biopsies musculaires. De plus, spécialement dans ce projet, nous pouvons passer les animaux plusieurs fois sans impact négatif attendus sur leur santé. Lors de développement, un nombre important d’animal est généralement utilisé afin d’optimiser une techique. De plus, nous n'utiliserons que le nombre de souris nécessaires pour l'exploitation statistiques des données, à savoir 12 individus

Raffinement

Nos expérimentations seront effectuées sous anesthésie générale, associé à du gel ophtalmique afin d’éviter le dessèchement oculaire. La température de la souris sera gardée stable à l’aide d’une couverture chauffante et observer à l’aide d’une sonde rectale inséré à l’aide de gel lubrifiant. Le réveil des souris sera effectué en cage individuelle sous lampe chauffante avant d'être remis avec ses congénères. Les procédures seront réalisées dans une pièce à l'écart de la salle d'hébergement. De plus, nous avons déterminé des points limites à ne pas franchir pour respecter le bien-être de l’animal : un contrôle quotidien de l'état clinique de nos animaux sera réalisé selon un système d’évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) pour différents critères physiologiques et comportementaux (perte de poids, vocalisation importante, poils hérissés, prostration, blessures, infections cutanées). Le protocole sera arrêté pour tout animal obtenant un score supérieur ou égal à 2 dans deux de ces catégories. Les souris seront hébergées collectivement (4 à 5 animaux par cage) et le milieu sera enrichi par la présence dans chaque cage de matériel de nidation (coton), d’abris en plastique permettant aux animaux de se cacher, et de bûchettes de bois destinées à être rongées. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Le changement des litières aura lieu une fois par semaine.

Choix des espèces

Nous utiliserons un modèle de WT, C57/Bl6 afin de caractériser le fonctionnement musculaire et les variations bioénergétiques normale des souris. Ce modèle est l’un des plus couramment utiliser, son utilisation permettra d’obtenir des résultats qui pourront se comparer avec de multiples études. Les souris seront utilisées entre le 3ème et le 8ème mois, lorsqu’elles présentent une masse musculaire suffisante pour l’obtention de signaux RMN de qualité.

96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère. Le porteur induit chez elles une hypertension artérielle par administration de L-NAME dans l'eau de boisson, puis mesure la pression à la queue deux fois par semaine pendant quatre semaines, pour tester l'effet d'un extrait végétal. À la fin, les souris sont mises à mort pour prélever le cœur et l'aorte et observer le remodelage vasculaire. Il affirme qu'il n'existe pas d'approche in vitro ou ex vivo équivalente et que le recours au modèle animal reste ici "indispensable".

Objectifs

En France, 15 millions de personnes souffrent de troubles de la pression artérielle. Au-delà de 14/9, on parle d’hypertension, un trouble qui expose, s’il n’est pas traité, aux risques de maladies cardio-vasculaires, rénales ou oculaires. Au début, l’HTA ne donne souvent aucun symptôme susceptible d’alerter le patient et la découverte de cette pathologie est souvent fortuite, lors d’un examen de routine. L’HTA est une maladie chronique, caractérisée par une hyperpression du sang sur les parois des artères, qui entraine un vieillissement prématuré des artères et une fatigue plus importante et plus rapide du cœur. L’incidence de cette pathologie augmentant avec l’âge, il est donc primordial de traiter au plus vite l’hypertension pour limiter les effets délétères à long terme sur des organes clés tels que le cœur, le cerveau ou les reins. Les mesures hygiéno-diététiques sont très importantes, et sont même les seules prescrites en cas d'hypertension artérielle faible ou limite : régime peu salé, amaigrissement en cas d’obésité, arrêt de l'alcool et du tabac, activité physique régulière, relaxation...En cas d’hypertension artérielle chronique plus importante, le traitement médicamenteux a pour but de normaliser la pression artérielle afin de prévenir les complications survenant à long terme. Par conséquent, dans la plupart des cas, ce traitement doit être suivi à vie. La recherche de nouvelles pistes thérapeutiques reste donc, à ce jour, un enjeu de santé publique. L’objectif de ce projet est donc d’analyser les effets d'un extrait végétal sur la pression artérielle dans un modèle de souris hypertendues et d'apporter une nouvelle piste thérapeutique pour la prise en charge de l'HTA.

Bénéfices attendus

L’HTA reste la première maladie chronique dans le monde et l’un des principaux facteurs de risque cardio-vasculaire. Diminuer durablement la pression artérielle chez un patient hypertendu permet de réduire, entre autres, le risque d’accidents vasculaires cérébraux, d’infarctus du myocarde ou de démence et de retarder la survenue d’une insuffisance rénale chronique. La prise en charge de l’HTA contribue donc fortement à l’allongement de l’espérance de vie. En France 20% des patients hypertendus ne sont pas traités et 50% des patients hypertendus traités n’atteignent pas les objectifs de pression artérielle contrôlée. L’objectif de ce projet est d’étudier les effets d’un extrait végétal sur la pression artérielle de souris hypertendues. Nous espérons démontrer qu'un apport nutritionnel en extraits végétaux est susceptible de normaliser la pression artérielle des patients ou de limiter l'hypertension artérielle, leur permettant ainsi de gagner en confort de vie. Cette preuve de concept pourrait ouvrir de nouvelles perspectives dans la lutte contre l'hypertension artérielle.

Procédures

Pendant 4 semaines, la pression artérielle systolique des souris hypertendues sera mesurée à la queue. 2 mesures par semaines pendant 4 semaines seront donc réalisées. Chaque cycle de mesures dure en moyenne 20 minutes.

Impact sur les animaux

Nous induisons une hypertension artérielle modérée par L-NAME en eau de boisson. Excepté pour 1 groupe (groupe contrôle), les autres groupes recevront en parallèle un traitement ou apport nutritionnel leur permettant de réguler leur pression artérielle. Nous n'attendons donc pas de nuisances particulières. La seule procédure un peu stressante reste la prise de pression artérielle à la queue. C’est pourquoi, pour limiter tout stress de l’animal, une phase d’acclimatation d’une semaine est effectuée, permettant ainsi de réduire significativement le stress de l’animal et d’obtenir ainsi des mesures de pression artérielle robustes et fiables.

Devenir

L'hypertension artérielle induite chez nos souris va entrainer un remodelage vasculaire c'est-à-dire une modification de structure et de fonction des petites et des grosses artères. Afin de statuer sur l'efficacité ou non des extraits végétaux testés, il est indispensable de regarder, par une approche histologique, l'impact de ce traitement sur la rigidité artérielle (Aorte) ou encore sur l'hypertrophie cardiaque induite par l'HTA. Les animaux seront donc mis à mort pour prélever les tissus (coeur et aorte).

Remplacement

Il n’existe malheureusement pas, à ce jour, d’approches expérimentales in vitro ou ex vivo apportant le même degré et la même qualité d’informations scientifiques nécessaires pour savoir si l’extrait testé aura des effets bénéfiques ou non sur l’hypertension artérielle. De plus, les souris développant une hypertension artérielle présentent des signes cliniques proches de ceux retrouvés chez l’homme. Le recours au modèle animal reste donc ici indispensable.

Réduction

Pour cette étude, 48 souris au maximum seront utilisées pour tester chaque extrait végétal, soit 12 souris par groupe. Pour observer un réel effet de l’extrait testé à différentes doses, il est difficile de diminuer le nombre d’animaux par groupe sans biaiser l’analyse statistique. Pour analyser l’impact de notre traitement sur l’hypertension artérielle induite, une analyse de variance sera réalisée (ANOVA mesures répétées avec un post-test comparaison multiple (Tukey)).

Raffinement

Les manipulations se dérouleront dans le strict respect du bien-être des animaux. Les souris seront stabulées par groupe de 4. La seule procédure un peu stressante reste la prise de pression artérielle à la queue. C’est pourquoi, pour limiter tout stress de l’animal, une phase d’acclimatation d’une semaine est effectuée, permettant ainsi de réduire significativement le stress de l’animal et d’obtenir ainsi des mesures de pression artérielle robustes et fiables.

Choix des espèces

Il n’existe malheureusement pas, à ce jour, d’approches expérimentales in vitro ou ex vivo apportant le même degré et la même qualité d’informations scientifiques nécessaires pour savoir si l’extrait testé aura des effets bénéfiques ou non sur l’hypertension artérielle. De plus, les souris développant une hypertension artérielle présentent des signes cliniques proches de ceux retrouvés chez l’homme. Le recours au modèle animal reste donc ici indispensable. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (8 semaines).

960 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les animaux reçoivent une à deux injections de ghréline et de ligands, avec une à trois gouttes de sang prélevées à la queue, pour caractériser l'effet de ces molécules sur l'hormone de croissance, la prise alimentaire et la glycémie. Le porteur indique que les nuisances se limitent au stress de la contention et des piqûres. Quarante-huit souris servant à la mise au point sont d'abord réutilisées, puis tous les animaux sont euthanasiés.

Objectifs

La Ghréline ou hormone de la faim stimule l'appêtit en signalant au cerveau qu'il est l'heure de manger. Elle contribue également à la régulation du glucose et de l'insuline et donc maintien l'équilibre du métabolisme. Elle stimule également la sécrétion de l'hormone de croissance. Ce projet vise à apporter une vision intégrée de la chimie, de la pharmacologie in vitro des ligands du récepteur et leurs effets biologiques in vivo. Plusieurs résultats remarquables sont issus de cette approche dont notamment la mise sur le marché aux USA et en Europe de la macimoréline pour le diagnostic des déficits de sécrétion de l'hormone de croissance. La découverte de nouveaux ligands pourrait conduire à de nouveaux médicaments permettant également de réguler les dysfonctionnements alimentaires chez l'homme.

Bénéfices attendus

L’activité des molécules agonistes sera caractérisée pour leur capacité à induire la sécrétion d'hormone de croissance, augmenter la prise alimentaire, diminuer la tolérance au glucose et augmenter la glycémie à jeun ou non à jeun. L’activité des molécules antagonistes sera caractérisée par leur capacité à bloquer l’induction d'hormone de croissance, l’augmentation de la prise alimentaire, la diminution de la tolérance au glucose et l’augmentation de la glycémie à jeun et non à jeun induites par la ghréline.

Procédures

Un analgésique local sera appliqué sur la queue de l'animal une heure avant le prélèvement de sang. Les animaux seront soumis à 1 ou 2 injections intrapéritonéales ou sous cutanées (injection de la ghréline et du ligand à 10 mn d'intervalle). Un à 3 prélèvements d'une goutte de sang au niveau de la veine caudale seront réalisés à 15 min d'intervalle (selon les procédures 1,3,4,5) . Les injections intrapéritonéales prennent moins de 3 minutes et le prélèvement d'1 goutte de sang 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir un stress du à la contention pour l'injection (piqure de l'aiguille au niveau de l'abdomen ou en sous cutanée) et lors de la prise d'une goutte de sang au niveau de la veine caudale

Devenir

48 souris utilisées dans la mise au point des conditions d’administration de la ghréline (procédure 1) seront gardées en vie pour être réutilisées dans les autres procédures (2 à 5) pour la mise au point des conditions d’administration de la ghréline . Ensuite tous les animaux de l'étude seront euthanasiés.

Remplacement

L’objectif de ce projet est de réaliser une preuve de concept in vivo de l’activité de ligands de synthèse du récepteur à la ghréline. Il n’existe pas de méthode alternative permettant de répondre à cet objectif.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux, seuls les ligands les plus actifs in vitro seront évalués in vivo (sélectionnés vis-à-vis de leurs affinités et activités sur des cellules en culture). A chaque fois que cela sera possible, nous réaliserons des co-administrations afin de limiter à une seule injection l’administration des ligands testés en association avec la ghréline.

Raffinement

Les animaux seront habitués à la contention plusieurs jours avant le début de la procédure afin de limiter leur stress. Une crème anesthésiante (EMLA® lidocaïne, prilocaïne) sera appliquée sur la queue de l’animal au moins une heure avant l’expérimentation sur la région où sera prélevé le sang. Les traitements seront effectués en aigu (c'est à dire sur une courte durée) limitant les complications potentielles liées à des administrations chroniques.

Choix des espèces

Dans la littérature les tests d’activité in vivo des ligands du récepteur à la ghréline sont réalisés majoritairement chez le jeune rat et la souris. Aussi, la preuve de concept de l’activité des ligands synthétiques sur la sécrétion d'hormone de croissance chez 2 modèles d’études (rat et souris) est essentielle afin d’écarter une éventuelle sélectivité d’espèces. En effet, des études menées au laboratoire sur des modèles cellulaires alternatifs in vitro montrent que l’affinité et la puissance de certains ligands varient en fonction de la séquence du récepteur (humain / rat). Enfin, les faibles rendements de synthèse de certains ligands nécessitent plutôt l’utilisation de souris afin de réduire la quantité de produit à administrer. Lors des expériences, les rats seront âgés de 3 à 5 semaines. A cet âge, les niveaux de sécrétion d’hormone de croissance plasmatique sont relativement élevés et cette sécrétion est plus sensible aux agonistes du récepteur de la ghréline. Les souris seront âgées de 1 à 2 mois conformément aux données de la littérature.

205 poulets de chair vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont infectés par voie orale avec les bactéries Campylobacter et Salmonella, seules ou combinées, pour étudier leur effet sur le microbiote intestinal. Le porteur affirme que ces bactéries sont asymptomatiques chez le poulet et qu'aucun effet indésirable n'est attendu. Tous les animaux sont pourtant tués, par dislocation cervicale pour les poussins et par électronarcose puis saignée pour les plus âgés, afin de prélever leurs organes.

Objectifs

Campylobacter et Salmonella sont responsables des deux zoonoses bactériennes d’origine alimentaire majoritaires en Europe, avec respectivement, 220 682 et 87 923 cas humains en 2019 et la viande de volaille est identifiée comme principale source de contamination. Par ailleurs, au cours d’un précédent travail mené par le laboratoire, il a été montré in vitro que la présence de Salmonella permettait d'améliorer la survie de Campylobacter en condition aérobie. A notre connaissance, l'impact de la présence simultanée des deux bactéries n'a jamais été évalué chez le poulet de chair. Par ailleurs, si le microbiote gastro-intestinal est modifié lors de la contamination des poulets par l’une de ces deux bactéries, aucune étude n’a décrit sa modulation au cours d’une co-infection Salmonella / Campylobacter. Plusieurs études ont aussi démontré des modifications au niveau de l’ensemble des métabolites (petites molécules) présents dans le sérum de l’hôte à la suite d’une infection intestinale, en partie causées par l’altération du microbiote, mais aucune donnée n'est disponible pour le poulet de chair lors d'une infection ou co-infection par ces bactéries. Les objectifs de ce projet sont donc : (1) d'étudier si une interaction peut exister entre ces deux bactéries dans le tube digestif des poulets, et impacter les niveaux de colonisation de chacune d'elles ; (2) d'étudier l'effet d'une co-infection sur la composition et la structure du microbiote intestinal ; (3) explorer les modifications d’expression l’ensemble des métabolites présents dans le sérum de l’hôte en réponse à ces bactéries seules ou en co-infection.

Bénéfices attendus

Ce travail permettra de générer des données sur le comportement de Campylobacter et Salmonella en co-infection et leur impact sur le microbiote intestinal et l’ensemble des métabolites présent dans le serum du poulet de chair. Ces données n’ont jusqu’alors jamais été décrites, mais sont nécéssaires pour l’acquisition de connaissance sur leur comportement dans un système complexe prenant en compte leur niche écologique, afin d’adapter ou donner lieu au développement de nouveaux moyens de lutte. Plus précisément, les données nouvelles porteront sur : - le comportement de Salmonella et Campylobacter en co-infection chez le poulet de chair, et leur potentielle interaction. - la modulation du microbiote intestinal ainsi que les modifications de l’ensemble des métabolites sériques induites par une co-infection de Salmonella et Campylobacter chez le poulet de chair. - l’analyse conjointe des données hétérogènes issues de l’analyse du microbiote intestinal et des métabolites présents dans le sérum dans ce contexte de co-infection. -l'identification de potentiels biomarqueurs spécifiques aux infections par Salmonella et Campylobacter mais aussi à leur co-infection chez le poulet de chair

Procédures

Inoculation (per os) de Campylobacter jejuni contenu dans 100 µl de trypsone-sel pour le lot 1 à J1 Inoculation (per os) de Salmonella thyphimurium contenu dans 100 µl de trypsone-sel pour le lot 2 à J1 Inoculation (per os) de Salmonella typhimurium et Campylobacter jejuni contenus dans 100 µl de trypsone-sel pour le lot 3 à J1 Administration per os 100 µl de tryptone-sel pour le lot 4 à J1

Impact sur les animaux

Chez le poulet, Campylobacter jejuni est considérée comme une bactérie commensale, et est à ce titre asymptomatique. Il en est de même pour la souche de Salmonella typhimurium selectionnée. Par ailleurs, ces deux souches ont déjà fait l’objet de plusieurs essais in vivo au sein de notre laboratoire et aucun effet indésirable n’a jusqu’alors été observé. Afin de limiter les gestes invasifs et le stress chez les animaux, nous limiterons la manipulation d’animaux vigiles en réalisant les prélèvements de sang lors d’une saignée à la veine jugulaire après mise à mort. Il n’est donc attendu aucun effet indésirable tout au long de l’essai.

Devenir

Les prélèvements d’organes nécessitent la mise à mort des animaux. C’est pourquoi tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, par dislocation cervicale les jeunes poussins (poids < 250 g) et pour les poussins plus âgés et les poulets adultes après une anesthésie par électronarcose suivie d’une saignée à la veine jugulaire.

Remplacement

La volaille et notamment le poulet de chair représente la source majeure de campylobactériose et de salmonellose pour l’homme. Afin de lutter au mieux contre ces zoonoses, il est indispensable de mieux comprendre leur interaction avec les bactéries du microbiote intestinal et leur conséquence sur l’ensemble des métabolites (petites molécules dosées dans le sang) produits par l’hôte. Dans ce contexte, et en l’absence de lignée cellulaire ou d’organoïdes pouvant mimer l’intéraction des bactéries de la flore commensale aviaire avec Campylobacter et Salmonella, et leur impact sur l’ensemble des métabolites produits par l’hôte, l’utilisation de test in vitro ou in silico n’est pas possible. C’est pourquoi il est nécessaire de travailler sur un modèle intégré que seule le modèle in vivo permet. Afin de se rapprocher au maximum des conditions du terrain il convient de réaliser cette étude sur le poulet de chair qui est le premier réservoir de Salmonella et Campylobacter. Le poulet de chair est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de notre procédure.

Réduction

Les animaux seront utilisés au seuil de la pertinence scientifique et statistique. En raison de la variabilité interindividuelle importante du microbiote intestinale, et afin d’évaluer au mieux l’évolution de ce microbiote caecal au cours du temps, il a été déterminé qu’un minimum de 10 animaux par groupe était nécessaire pour chaque temps donné. Des tests de comparaison de moyennes seront effectués pour analyser les résultats des différents lots à chaque date de prélèvement. Des tests paramétriques (Student ou Anova) seront utilisés lorsque les critères de normalité et d’homogénéité des variances seront réunis. Sinon des tests non paramétriques (Kolgomorov-Smirnov ou Kruskall Wallis) seront utilisés.

Raffinement

Dans nos expériences précédentes, d’inoculation avec ces souches de Campylobacter jejuni et Salmonella Typhimurium utilisées, aucun symptôme ou effet indésirable n’a été détecté chez les animaux étudiés. Le protocole a été établi pour limiter au maximum le nombre de manipulation vigile. Ainsi l’inoculation des bactéries à la pipette par voie orale et les pesées seront réalisées par le personnel expérimenté qui apportera la même attention à chaque inoculation de sorte à éviter/limiter les inconforts au moment de l’administration. Afin de limiter les gestes invasifs et le stress chez les animaux, les prélèvements de sang auront lieu lors de la saignée à la veine jugulaire après mise à mort des animaux et non sur animaux vivants. Aucun effet indésirable n’est donc attendu au cours de cet essai. Néanmoins, les animaux seront observés quotidiennement. Si toutefois, une altération de l’état de santé était observée quelle que soit la raison, les animaux concernés seront mis à mort en cas d’atteinte des points limites suivants : blessure grave, prostration, absence de réaction après sollicitation (absence de réponse à des stimuli tactiles et visuels), anorexie ou impossibilité de s’abreuver ou de s’alimenter. Le raffinement des conditions d’hébergement visera à assurer des conditions d’hébergement limitant l’inconfort potentiel des animaux. Quatre animaleries de type A2 seront utilisées en dépression (légère ou moyenne). Chaque lot de poulets sera installé dans des parcs au sol de 4 m² entourés par des panneaux grillagés en inox de 1 m de haut. La litière sera composée de copeaux de bois (qui sert d’enrichissement du milieu puisque les animaux grattent et picorent cette litière). Les paramètres d’ambiance utilisés sont préconisés pour les élevages de poulets de chair. Les installations sont équipées de lumières électriques programmables, d'un chauffage électrique automatisé et d'une ventilation. Les animaux recevront à volonté, de l’eau et de l’aliment réservé aux poulets de chair spécifiques à leur âge. Afin de stimuler les poussins à s’alimenter dans leurs premières heures de vie, des alvéoles en carton de plateaux d’oeufs seront disposés sur les copeaux de bois avec de l’aliment et des cartons seront apposés sous les mangeoires. Les alvéoles en cartons servent également d’éléments de grattage et de picotage. L’évolution pondérale sera obtenue par des pesées individuelles à l'installation des animaux dans les animaleries, et au moment des mises à mort.

Choix des espèces

La volaille et notamment le poulet de chair représente la source majeure de campylobactériose et de salmonellose pour l’homme. Afin de lutter au mieux contre ces zoonoses, il est indispensable de mieux comprendre leur interaction avec le microbiote intestinal et leur conséquence sur les métabolites sériques produits par l’hôte. Afin de se rapprocher au maximum des conditions du terrain il convient de réaliser cette étude sur le poulet de chair qui est le premier réservoir de Salmonella et Campylobacter. Des poussins de 1 jour seront utilisés et élevés jusqu’à 35 jours (âge d’abattage des poulets de chair pour la consommation). Le but est de suivre la modulation du microbiote et l’influence sur le métabolome à la suite d’une infection à J1 par Campylobacter, par Salmonella ou d’un coinfection Campylobacter + Salmonella

224 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la plupart tuées à l'issue et une partie conservée pour la reproduction de la lignée. Elles reçoivent une injection intraveineuse d'un vecteur AAV censé rétablir la protéine spastine, avec des prélèvements de muscles et de sang sous anesthésie, pour caractériser un modèle de paraplégie spastique héréditaire. Le porteur indique que l'injection n'est pas censée nuire, mais qu'une bulle d'air pourrait provoquer une mort instantanée et que l'effet des vecteurs reste mal connu. Les animaux sont ensuite tués par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque pour les analyses.

Objectifs

Les paraplégies spastiques héréditaires (PSH) sont un groupe de maladies neurodégénératives caractérisées par une spasticité et une faiblesse des membres inférieurs. Ce groupe de maladies, a une prévalence dans le monde de 5 pour 100 000 personnes et est lié à des mutations sur plus de 90 gènes qui peuvent avoir de fonctions et localisations différentes au sein de la cellule. La majorité des cas (40%) de PSH à transmission autosomique dominante sont dû à des mutations d’un gène nommé SPG4 qui code pour la protéine spastine dont la fonction principale est de couper les microtubules. Le gène SPG4 grâce à deux codons d’initiation, code pour deux isoformes de la protéine : une forme longue et une forme courte avec différentes localisations subcellulaires. Les défauts d’expression de la spastine, dus à ses mutations, se traduisent par une axonopathie des motoneurones supérieurs au niveau de la moelle épinière qui cause la pathologie. Bien que le mécanisme moléculaire de la spastine soit bien documenté les véritables causes qui amènent à la pathologie ne sont pas connues. A ce jour, aucun traitement curatif n’est disponible. Le but de ce projet est de développer une approche de thérapie génique afin de rétablir l’expression d’une protéine spastine fonctionnelle qui permettrait de corriger les symptômes de la maladie.

Bénéfices attendus

A ce jour, aucun traitement n’existe pour les paraplégies spastiques héréditaires. Les objectifs ainsi que les bénéfices de ce projet sont multiples : tout d’abord éclaircir sur l’implications d’autres protéines partenaires de spastine dans l’évolution de la maladie. En absence d’un traitement efficace pour corriger les symptômes, le deuxième objectif est de développer une stratégie thérapeutique qui rétablirait une expression de la spastine fonctionnelle à l’aide d’un vecteur AAV. Le bénéfice pourrait se traduire par l’amélioration des signes pathologiques chez le modèle murin SPG4-KO ce qui apporterait une preuve de l’efficacité de cette approche pour traiter des patients et améliorer leurs conditions de vie.

Procédures

Dans la PE1: mise à mort par dislocation cervicale. Dans la PE2: une seule injection intraveineuse d’AAV via la veine caudale. Au cours de la PE2 des prélèvements ante-mortem des muscles et du sang seront effectués sous effet anesthésique de la souris. Mise à mort par dislocation cervicale pour les analyses biochimiques et moléculaires et perfusion intracardiaque à l'aide d'une pompe pour les analyses histochimiques.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux lors du projet sont liés à l’acte de l’injection nécessaire pour administrer la thérapie mais cette procédure n’est pas censée induire d’effets négatifs. Néanmoins, dans le cas où l’injection comporte l’introduction imprévue d’un bulle d’air comme effet indésirable, il pourrait y avoir une mort instantanée de l’animal. Un autre effet indésirable pourrait être causée par l’expression de la protéine spastine par le biais des deux vecteurs administrés dont nous n’avons pas des informations.

Devenir

A l’issue de la procédure 1, les animaux seront gardés pour d’autres accouplements ou mis à mort si les accouplements ne sont plus nécessaires. A la fin de la procédure 2, tous les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque à l'aide d'une pompe afin d’effectuer les prélèvements des organes et faire les analyses post-mortem.

Remplacement

Il n’existe pas de moyen de remplacer l’utilisation d’animaux pour l’étude d’une stratégie thérapeutique dont l’administration ne peut faire que par voie systémique et qui peut avoir des conséquences sur son efficacité à traiter correctement les symptômes. Une étude sur des cultures primaires de neurones issus de souris SPG4-KO ou d’autres modèles cellulaires déficient en spastine, peuvent permettre uniquement une meilleure compréhension de la physiopathologie et la confirmation/identification de certains marqueurs moléculaires pour cette pathologie. Ces marqueurs ont été préalablement identifiés à la fois dans des modèles cellulaires d’origine humaine ou la protéine spastine a été réduite/supprimée par siRNA et ainsi que dans le cerveau et la moelle épinière des modèles murins.

Réduction

Les souris hétérozygotes (SPG4-HE) issues des croisements seront utilisées pour les croisements nécessaires au maintien de l’élevage. Les paraplégies spastiques héréditaires affectent indifféremment les hommes et les femmes : des souris des deux sexes seront donc utilisées. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés par groupe, le nombre de souris nécessaire a été estimé à 224 souris par une étude statistiques prédictive (test paramétrique unilatéral de comparaison des moyennes) suite à la compilation des données en littérature avec des expériences précliniques issues de notre équipe. Des tests in vitro ont été préalablement réalisés afin de tester plusieurs cassettes d’expression et de n’en sélectionner que 2 pour l’application in vivo. A notre connaissance, notre étude serait la première à tester la piste thérapeutique avec AAV pour les PSH-SPG4 et permettrait non seulement de valider la stratégie de thérapie génique mais aussi de vérifier l’absence d’effets secondaires inattendus. Nous avons aussi décider de réduire à deux temps d’analyses notre étude afin de regarder les effets à court terme (3 mois post injection) et à plus long terme (11 mois post injection).

Raffinement

Raffinement pour les animaux injectés avec des vecteurs viraux. Les procédures ne sont pas censées induire d’effets négatifs. Cependant, c’est la première fois qu’une injection de vecteurs pour remplacer l’expression de la protéine Spastine sera faite dans ce modèle. C’est pourquoi l’observation et le suivi de poids sera effectué deux fois par semaine pendant 15 jours post-injection puis une fois par semaine. Concernant les prélèvements de muscles et de sang dans la PE2 , les prélèvements seront anticipés par l’administration d’une anesthésie et la profondeur de l’anesthésie sera contrôlée avec le début de l’acte chirurgical (absence de réflexe palpébral, absence de réflexe de retrait ou pincement de la queue et présence d’une respiration affaiblit (fréquence respiratoire 55-65/min) et essentiellement abdominale). Pour l’infusion cardiaque, elle sera précédée d’une injection par voie sous-cutanée d’un mélange de deux anesthésiques à raison de 100µl/20g de poids: la kétamine (aux propriétés anesthésiques et analgésiques (100 mg/kg,Virbac, Carros)) et la xylazine (aux propriétés anesthésiques, sédatives, myorelaxantes et analgésiques (10 mg/kg, Rompun® 2%, Bayer)). La profondeur de l’anesthésie sera contrôlée avec le début de l’acte chirurgical (absence de réflexe palpébral, absence de réflexe de retrait ou pincement de la queue et présence d’une respiration affaiblit (fréquence respiratoire 55-65/min) et essentiellement abdominale). Nous estimons qu’il faut environ 2 minutes pour l’installation de l’animal sur le plan de travail. Puis le temps passé entre l’ouverture de la cage thoracique et le début de la perfusion est estimé à 1 minute suivi par une perfusion intracardiaque d’une solution au PBS puis du fixateur au PFA, qui sera réalisée dans les 5 minutes selon la taille de la souris. L’opérateur pourra suivre l’efficacité de la procédure via l’observation de l’animal : la correcte fixation de l’aldéhyde aux nerf et aux muscles sera évidente par un tremblement des extrémités. Pour l’ensemble de la PE2: avant toute anesthésie, un examen préopératoire sera effectué pour vérifier l’état de l’animal qui sera ensuite pesé afin de calculer la dose exacte d’anesthésiant/analgésique à injecter. De plus le stress des animaux en attente sera évité car ces procédures seront réalisées dans une pièce à part.

Choix des espèces

Le modèle murin SPG4-KO reproduit des phénotypes pathologiques spécifiques qui ont été aussi observés chez l’homme. Ce modèle ainsi que d’autres, selon les données en littérature disponibles à ce jour, reproduisent des signes tels que l’apparition des dilatations axonales au niveau de la moelle épinière, des défauts de comportement moteurs ainsi qu’une augmentation de nombre de cellules gliales dans le cortex. La correction de l’ensemble ou d’une partie des défauts pathologiques pourra être utile pour estimer l’avantage de ce type d’approche thérapeutique pour le traitement de paraplégies spastiques liées au gène SPG4. Dans la première procédure expérimentale nous allons mettre en accouplement des souris hétérozygotes pour SPG4 (SPG4-HE). Les souris seront mises en accouplement entre l’âge de 6 semaines et de 6 mois. Il n’y a pas de point limite à prendre en compte car les souris SPG4-HE ne présentent pas de phénotype dommageable. Dans la deuxième procédure expérimentale nous allons utiliser des souris SPG4-KO âgées de quatre semaines, avant l’apparition des premières manifestations pathologiques (4 mois) afin d’étudier l’expression de la protéine spastine, leur bio-distribution et le niveau d’expression de la protéine SPG4 dans les tissus d’intérêt mais aussi sélectionner la dose optimale des vecteurs afin d’avoir un niveau d’expression physiologique de la protéine d’intérêt. Le phénotype de ces animaux n’est pas dommageable mais les points limites seront surveillés dans le cadre des injections.

20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent trois injections intraveineuses de deux anticorps sous anesthésie gazeuse, avec des pesées, puis un prélèvement sanguin terminal, pour confirmer in vivo un bénéfice thérapeutique contre la leucémie lymphoïde chronique. Le porteur indique que les nuisances se limitent au stress des pesées et de l'injection d'anesthésiques. Les bénéfices annoncés pour les patients sont renvoyés au long terme et à la poursuite du développement de l'anticorps en clinique.

Objectifs

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est une maladie touchant des cellules du sang appelées les lymphocytes B (LB). Comme toutes les cellules, les lymphocytes B ont normalement une durée de vie limitée, de l’ordre de quelques jours à quelques mois. Au cours de la LLC, une partie des LB ne meurt plus. Leur cycle de vie est en quelque sorte bloqué lorsqu’ils parviennent à maturité. Comme leur production se poursuit, ces LB finissent par s’accumuler dans le sang, dans les ganglions, la rate et la moelle osseuse. La LLC reste une maladie fréquente avec 4500 nouveaux cas chaque année. Pour les patients, le traitement repose actuellement sur la chimiothérapie et l’immunothérapie notamment par des anticorps monoclonaux anti-CD20. En effet, l’antigène CD20, qui est exprimé sur les cellules B normales et malignes, s'est avéré être une cible utile pour les approches immunothérapeutiques de la LLC. Actuellement plusieurs anticorps, dont l'Obinutuzumab, sont utilisés comme traitements thérapeutiques pour soigner la LLC. Certains patients ne répondent pas au traitement initial et d’autres rechutent après l'administration des anticorps. Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques est donc nécessaire pour pallier aux mécanismes d'échec et ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour les patients. Nos études préliminaires in vitro sur cellules de patients ont montré que l'association d'un nouvel anticorps à l'Obinutuzumab renforce l'activité cytotoxique direct de l'Obinutuzumab. Ce projet a pour objectif de montrer que la combinaison de l'Obinutuzumab à un nouvel anticorps thérapeutique améliore l'activité cytotoxique directe de l'Obinutuzumab. Pour tester cette hypothèse, nous utiliserons la souris NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ communément appelée NSG (NOD Scid Gamma) comme modèle. Cette souris est immunodéficiente et caractérisée par une absence de lymphocytes T, LB et de cellules tueuses (NK). Cette immunodéficience nous permet de greffer des cellules primaires de patients atteints de LLC chez la souris pour modéliser cette pathologie. Nous évaluerons à J5 la maladie résiduelle (nombre de cellules malignes persistant après traitement et qui est le critère le plus puissant pour prédire la rémission ou la rechute après traitement). Les résultats permettront de savoir si la combinaison des deux anticorps permet de détruire plus efficacement les cellules de LLC.

Bénéfices attendus

A cours terme, la réalisation de ce projet permettra de recueillir des données in vivo et confirmer que l'injection des deux anticorps confère un bénéfice thérapeutique pour le traitement de la LLC, synergie observée in vitro. A long terme, ce projet va permettre la poursuite du développement de l'anticorps en clinique humaine. Ce dernier pourra venir renforcer l'activité de l'Obinutuzumab déjà utilisé en clinique chez l'homme mais qui présente des limites d'efficacité.

Procédures

Les souris seront soumis à 3 pesées (réalisées sur animal vigile), à 3 injections intraveineuses réalisées sous anesthésie gazeuse (l'anesthésie dure maximum 5 minutes) puis elles seront repositionnés dans leur cage. La récupération après l’anesthésie est très rapide, en moins de 2 minutes les souris retrouvent le réflexe de marche dans la cage. A la fin de la procédure, un prélèvement sanguin unique et terminal sera réalisé sur animaux anesthésiés et analgésiés, ce prélèvement dure maximum 5 minutes.

Impact sur les animaux

Il s'agit d'une procédure de classe légère, du stress pourra être généré lors de la pesée des animaux, trois pesées seront réalisées durant le suivi (J0; J2 et J5). La durée de la pesée est de 30 secondes par animal. Du stress pourra également être généré lors de l'injection intrapéritonéale d'anesthésiques/analgésiques nécessaire pour le prélèvement sanguin terminal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure. Afin de réaliser les analyses histologiques et de cytométrie en flux, des prélèvements d’organes et de sang terminaux seront effectués sur les souris.

Remplacement

La LLC est une maladie multifactorielle impliquant les cellules circulantes et les organes lymphoïdes secondaires. L’étude des mécanismes qui provoquent ou contribuent à l'activité des anticorps thérapeutiques nécessitent la mise en place de protocoles in vivo car il n’est pas possible aujourd'hui de reproduire la LLC par l’utilisation de modèles in vitro. Cependant, l'activité des anticorps a été au préalable évaluée in vitro sur des cellules cancéreuses, sur cellules primaires de LLC de patients et sur cellules saines. Nos études préliminaires in vitro sur cellules de patients ont montré que l'association de notre anticorps à l'Obinutuzumab renforce l'activité cytotoxique direct de l'Obinutuzumab. De plus, ces études ont permis de déterminer les posologies optimales qui seront utilisées dans le projet in vivo chez la souris.

Réduction

Il s'agit d'une étude pilote avec un petit nombre d'animaux, 5 par groupes. Nous vérifierons que les moyennes suivent la loi normale par un test de Bartlett puis les moyennes des 4 groupes seront ensuite analysés par un test ANOVA.

Raffinement

Les souris seront acclimatées durant 5-7 jours à l'animalerie avant d'être incluses dans la procédure. La procédure expérimentale a été conçue de manière à minimiser les dommages causés aux animaux. Il s'agit d'une procédure de classe légère, du stress pourra être généré lors de la pesée des animaux, trois pesées seront réalisées durant le suivi (J0; J2 et J5). La durée de la pesée est rapide moins de 30 secondes par animal. Les injections intraveineuses sur animal vigile pouvant générer du stress et de l'inconfort, nous avons fait le choix de les réaliser sous anesthésie gazeuse afin de favoriser le bien-être animal conformément à la règle des 3R. Tout au long de la procédure, les souris sont suivies quotidiennement, le registre de soins est complété en se rapportant à la grille de suivi de soins.

Choix des espèces

Nous utiliserons comme modèle, la souris NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ communément appelée NSG (NOD Scid Gamma). Cette souris est immunodéficiente et caractérisée par une absence de lymphocytes T, lymphocytes B et de cellules tueuses (NK). Cette immunodéficience nous permet de greffer des cellules humaines primaires de LLC et modéliser cette pathologie. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines dont le poids varie entre 20-30 grammes. C'est l'âge des souris adultes couramment utilisées dans la littérature lors de la greffe de cellules primaires humaines de LLC.

8 chevaux vont être utilisés dans une procédure impliquant un niveau de souffrance léger, puis proposés à l'adoption. Un membre antérieur est partiellement immobilisé pendant quatre mois et les chevaux subissent des prélèvements sanguins mensuels, des radiographies et des examens scanner sous anesthésie générale, pour tester un complément alimentaire censé limiter la perte osseuse liée à l'immobilité. Le porteur indique que l'immobilisation peut provoquer des troubles digestifs ou des plaies cutanées et rappelle que l'anesthésie générale comporte un risque de mortalité supérieur à 1 %. Le complément est présenté comme une alternative possible aux traitements médicamenteux existants.

Objectifs

Les affections de l’appareil locomoteur sont fréquentes chez le cheval. Malheureusement certaines d’entre elles, telles que les tendinites ou les fractures peuvent nécessiter des périodes d’immobilisation de plusieurs semaines des chevaux. Or plusieurs études ont pu montrer que l’immobilisation induisait une diminution de la densité osseuse. Ainsi le cheval lors de sa phase de rééducation est plus exposé du fait de cette fragilité squelettique acquise pendant la période de repos à développer de nouvelles lésions squelettiques. Cette période de rééducation est donc une phase critique. Actuellement les seules thérapies disponibles permettant d’essayer de lutter contre la perte de densité osseuse liée à l'immobilisation sont médicamenteuses. Cependant elles présentent, comme de nombreux médicaments des effets secondaires potentiels et ne peuvent être utilisées avant l’âge de 2 ans. De plus elles sont interdites jusqu’à 4 ans pour les chevaux de course. Le présent projet est né d’une collaboration avec une société française, spécialisée dans la production de nouveaux ingrédients fonctionnels totalement naturels et éco-responsables. Il a pour objectifs d’une part de valider la bonne tolérance et d’autre part d’obtenir une première évaluation de l’effet d’un complément alimentaire développé par cette société, pour lutter contre la déminéralisation osseuse liée à l’inactivité. Il pourrait donc représenter une alternative à l’emploi de substances médicamenteuses.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est d’observer que le complément alimentaire, est bien toléré par le cheval et qu’il permet de limiter la déminéralisation osseuse liée à l’inactivité chez le cheval et ainsi de diminuer la fragilité osseuse associée. Il représenterait alors une alternative à la thérapie médicamenteuse pour lutter contre cette perte de densité osseuse lorsqu’un cheval doit être immobilisé et ainsi limiter le risque pour lui de développer de nouvelles lésions du squelette lors de sa rééducation (remise en charge du squelette).

Procédures

Les chevaux du protocole seront soumis à : - une immobilisation partielle d’un antérieur par mise en place d’un bandage contentif souple et d’une bottine surélevée en talons afin de diminuer l’appui sur ce membre. Cet acte est réalisé sur animal vigile et n’est pas douloureux. Cependant en cas de stress de l’animal il est possible de lui administrer une légère sédanalgésie à base de détomidine (DétogésicND à la posologie de 5 µg/kg). - un prélèvement sanguin à la vein jugulaire alternativement droite et gauche à raison d’un prélèvement par mois pendant les 4 mois du protocole (dosage des marqueurs sanguins du métabolisme osseux) - un examen radiographique des 2 doigts antérieurs (2 clichés radiographiques par membre), sur cheval vigile. Acte sans douleur mais en cas de stress de l’animal une légère sédanalgésie pourra être mise en place à base de détomidine (DétogésicND à la posologie de 5 µg/kg). - un examen scanner des 2 doigts antérieurs le premier et deuxième mois d’immobilisation, réalisé sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Il n’est pas attendu de dommage spécifique si ce n’est ceux inhérents : - à toute immobilisation chez le cheval, comme dans de rare cas des troubles digestifs transitoires liés à un potentiel ralentissement du transit, qui seront limités par une alimentation adaptée (fourrage à volonté) et au besoin l’administration d’antispasmodique ; ou ceux liés à l’application de bandages contentifs, pouvant dans quelques cas induire des échauffements ou plaies cutanés. Pour éviter ces complications un suivi rapproché biquotidien du bandage et des changements réguliers de ces derniers sont prévus. - à l’anesthésie générale (mortalité>1%, arrêt cardio-repiratoire, lésions musculaires, coliques). Ces risques, déjà faibles, sont minorés par le fait que le temps de l’anesthésie est cours (30 minutes environ) et qu’elle est réalisée sur de jeunes chevaux en bonne santé. Le protocole autorisant l’administration d’anti-inflammatoires en cas de signes de coliques post-anesthésiques les chevaux feront l’objet d’administration d’antispasmodiques et au besoin d’administration de paraffine. Enfin pendant 2 mois du protocole les chevaux sont maintenus en box donc en activité réduite. Cette réduction d’activité est généralement bien tolérée chez le cheval. Il est tout de même prévu pour limiter tout stress de leur assurer un contact visuel entre congénères et d’enrichir leur environnement avec la présence de ballon suspendu dans le box et la diffusion de musique en journée. Enfin au besoin en cas de forte agitation l’administration ponctuelle de sédatif est aussi possible.

Devenir

Le protocole compte une seule procédure de classe légère qui n’affecte pas l’intégrité physique des chevaux. Aucun n'examen post-mortem n'est recquis par l'étude donc l’ensemble des chevaux sont donc gardés en vie. Ils sont en bonne santé en fin de protocole et seront donc proposés à l’adoption.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative non animale pour répondre aux objectifs du projet. Il n’est donc pas possible dans la présente étude de s’affranchir de l’animal pour évaluer la tolérance et l’effet du complément alimentaire étudié pour lutter contre la déminéralisation osseuse d’inactivité chez le cheval.

Réduction

Le nombre de chevaux a été limité en menant les 2 objectifs (tolérance et première évaluation d’effet) du projet sur un même lot. Le nombre de 8 chevaux est calqué sur celui recommandé par l'Agence européenne du médicament, comme étant le minimum, pour démontrerla tolérance d’une substance médicamenteuse chezle cheval. Les variables mesurées afin d’évaluer la tolérance et l’effet seront quantitatives. Etant donné le faible nombre d’échantillons, des tests non paramétriques de comparaison seront utilisées notamment le test de Mann-Whitney pour échantillons indépendants pour les données quantitatives.

Raffinement

Même si les actes pratiqués sont de classe légère et non invasifs, pour limiter le stress des chevaux ils seront au besoin légèrement sédatés pour la mise en place des bandages contentifs et la réalisation des examens radiographiques. Toujours dans l’objectif de limiter leur stress ils seront toujours manipulés par lot de 2. De plus pour l’immobilisation partielle du membre le choix a été fait d’un bandage contentif avec une cale plutôt que de la mise en place d’un plâtre plus contraignant pour l’animal et surtout beaucoup plus à risque pour le développement de lésions d’escarrres. Par ailleurs les chevaux seront hébergés soit en groupe au paddock avec abris (environnement proche du milieu naturel) ou dans de grands boxes (3x4 mètres) pendant la période de repos avec un visuel sur l’extérieur d’une part et entre eux d’autre part. Il est également prévu d’enrichir leur milieu avec la mise en place de ballon suspendu au box, ainsi qu’avec une diffusion de musique en journée.

Choix des espèces

Il est nécessaire pour ce projet d’avoir recours au cheval. En effet les résultats obtenus sur d’autres espèces ne pourraient être transposables directement à l’espèce cible, puisqu’il existe des spécificités d’espèce notamment sur l’appareil digestif (le produit évalué étant administré par voie orale, l’assimilation dépend de l’appareil digestif) et sur le métabolisme osseux (contraintes biomécaniques supérieure chez le cheval influant sur le métabolisme osseux). Il est donc nécessaire dans le cadre de cette étude de travailler avec l’espèce cible du produit à évaluer. Les chevaux utilisés sont des adultes (≥ 3 ans) avec une homogénéité d’âge (entre 3 et 5 ans) car c’est un facteur pouvant influer sur le métabolisme osseux il est donc essentiel d’avoir une population homogène en âge. Le traitement étudié étant destiné à être utilisé chez l’adulte il est préférable pour cette étude de choisir des animaux de l’âge cible. De plus pour limiter le stress lors des manipulations il est nécessaire d’avoir des chevaux débourrés (c'est-à-dire déjà bien domestiqués).

14 brebis vont être utilisées, opérées sous anesthésie et mises à mort avant tout réveil, dans des procédures pourtant classées de souffrance légère. Sous une anesthésie de trois heures, chaque animal subit une incision derrière l'oreille et un fraisage de l'os pour accéder à l'oreille interne, dont le prélèvement de liquide entraîne une surdité définitive des deux oreilles. Le porteur indique mettre à mort les brebis par surdosage d'anesthésique parce que cette surdité et d'éventuels vertiges compromettraient leur vie quotidienne. L'objectif est de vérifier qu'une technique de diffusion de médicaments vers l'oreille interne n'est pas toxique.

Objectifs

Les objectifs de notre travail sont doubles : - Vérifier l'absence d'ototoxicité de la sonoporation sur l'oreille interne. - Evaluer la concentration en stéroïdes au niveau des liquides de l'oreille interne suite à la sonoporation et l'administration locale trans-tympanique.

Bénéfices attendus

Si l'absence de toxicité de la sonoporation est démontrée ainsi que la possibilité d'augmenter la concentration de corticoïdes au sein de la périlymphe, cela permettrait de proposer un nouveau mode de diffusion de molécules thérapeutiques à l'oreille interne. Cette méthode permettrait d'atteindre des concentrations plus élevées que l'administration des mêmes molécules par voie systémique. Actuellement, les molécules les plus utilisées par cette voie sont les corticoïdes et la gentamicine à but thérapeutique, ainsi que le gadolinium pour l'imagerie de l'oreille interne. Cette voie de diffusion de molécules à l'oreille interne pourrait avoir un rôle thérapeutique à jouer, notamment pour agir dans la régénération de nouvelles cellules ciliées fonctionnelles, qui vieillissent et meurent, suite à l'âge et l'exposition au bruit. L'autre intérêt de pouvoir faire parvenir des molécules telles que des corticoïdes à l’oreille interne serait d’obtenir une réduction de la fibrose suite à une implantation cochléaire.

Procédures

L'ensemble des prélèvements auront lieu lors de l'anesthésie générale ainsi que la procédure chirurgicale et la sonoporation. Il sera prélevé un tube de sang et de périlymphe. La durée totale de l'anesthésie générale est de 3H, au cours de cette anesthésie générales, les 3 procédures seront effectuées.

Impact sur les animaux

Les brebis incluses subiront une anesthésie générale durant laquelle aura lieu l'ensemble de l'expérimentation. Lors de cette anesthésie générale, il sera effectué une incision rétro-auriculaire puis un fraisage de l'os mastoïdien pour accéder à l'oreille interne. Une fois l'oreille interne repérée, le prélèvement de périlymphe sera réalisé pour l'ensemble des groupes. Ce prélèvement entraine une surdité irréversible. Les animaux seront atteints d'une surdité bilatérale compte tenu du protocole. De plus, ils peuvent être atteints de vertiges incoercibles en cas de réveils suite à l'anesthésie générale et de paralysie faciale périphérique en fonction de la position du nerf facial par rapport à la fenêtre ronde, cela pourrait avec des repercussions sur les possibilités d'alimentation des animaux. D'où la mise à mort par surdosage d'anesthésiques lors de l'anesthésie générale, suite aux 3 procédures décrites.

Devenir

Les 3 procédures auront lieu lors de la même anesthésie générale. Suite au prélèvement de périlymphe de la procédure 3, les brebis présenteront une surdité définitive bilatérale, irréversible du fait du prélèvement de liquide de l'oreille interne aura été prélevé. Elles pourraient aussi en cas de réveils présentés des vertiges empêchant une mobilité normale. Cette perte de la fonction auditive et de l'équilibre pourraient avoir un retentissement majeur dans la vie quotidienne des brebis, ainsi il sera effectué une euthanasie par surdosage médicamenteux suite à la procédure 3.

Remplacement

Une étude pré-clinique chez l'animal est nécessaire afin de s'assurer de l'absence d'ototoxicité de la sonoporation et pour comparer le liquide de l'oreille interne (périlymphe). Cette étude permettra de définir si un tel concept est réalisable et permet d’obtenir une diffusion des molécules thérapeutiques à l’oreille interne (corticoïdes) supérieure à la diffusion par injection locale. Le modèle animal ne peut être substitué par un modèle in-vitro ou in silico

Réduction

Sur la base d'une analyse statistique et bibliographique, notre étude nécessite l’inclusion de 12 animaux. Afin de réduire le nombre d'animaux, chaque brebis sera son propre témoin sur le statut normo-entendant/sonoporation pour l'étude de l'ototoxicité et sur le statut injection locale/sonoporation pour vérifier l’existence d’une meilleure diffusion par la sonoporation comparée aux injections locales transtympaniques. Un test de Wilcoxon en rangs signés sera utilisé pour comparer les valeurs quantitatives des paramètres étudiés (seuils auditifs, concentration de corticoïde). Des analyses uni- et multivariées seront effectuées sur les profils métabolomiques de la périlymphe. En métabolomique, il n’existe pas de recommandation sur le nombre minimum de sujets. Cependant, nos précédentes études effectuées à ont montré que le nombre de 6 sujets avait permis de faire ressortir des groupes statistiquement différents en utilisant les analyses statistiques multi et univariées en métabolomique qui comportent notamment le Partial Least Squares (PLS) qui est une méthode supervisée utilisant des techniques de régression multivariée pour extraire, par combinaison linéaire de variables originales (X), l’information qui peut prédire l’appartenance à une classe (Y). Notre expérience, sur le prélèvement de périlymphe, nous a permis de le réaliser systématiquement sur une oreille normale jamais opérée. La principale contrainte est le faible volume prélevé qui ne dépasse jamais quelques microlitres. Ainsi, nous estimons que 6 brebis par groupe serait raisonnable pour ne pas augmenter les animaux, tout en ayant des résultats si nos hypothèses se vérifient.

Raffinement

Le monitoring des constantes sera effectué lors de l'anesthésie générale afin de détecter une douleur per-opératoire nécessitant une adaptation de l'analgésie et/ou de la profondeur de l'anesthésie. Une augmentation de la fréquence cardiaque, de la tension artérielle ou une hyperventilation avec augmentation de pression des voies aériennes feront partie des paramètres monitorés. Des signes cliniques tels que un larmoiement, une grimace, ou une tentative de mouvement feront partie des points limites surveillés et s' ils apparaissaient des mesures thérapeutiques seraient alors initiées. Le stress sera minimisé avant la chirurgie avec un hébergement en groupe, les cases seront paillées et la nourriture sera la même que dans l’élevage. Une injection de buprénorphine sera effectuée avant la chirurgie pour prendre éviter les douleurs per-opératoires ainsi qu'une anesthésie locale. Ces injections pourront être renouvelées si le monitorage des constantes suggère une douleur de l'animal en per-opératoire. Les 3 procédures auront lieu lors de la même anesthésie générale et une table chauffante sera utilisée pour éviter l'hypothermie. Il sera considéré comme point limite tous signes clinique et hémodynamique en faveur d'un choc hemorragique nécessitant l'arrêt des souffrances par euthanasie.

Choix des espèces

Ce modèle a l'avantage d'avoir une anatomie de l'oreille interne (Trinh et al, 2021) et un spectre auditif comparable à l'homme. Des études ont montré la comparabilité anatomique entre l'oreille interne de la brebis et celle de l'homme, avec une cochlée réalisant 2 tours 1/2 de spire et des proportions morphologiques équivalentes à celles de l'homme (Seibel et al. 2006). Les animaux seront âgés de plus d'un an car à partir de cet âge ils ont atteint la maturité du cortex auditif. Afin de constituer un groupe homogène, les brebis seront âgées de 2 à 3 ans.