Procédures légères

Trente minutes de nourrissage de moustiques sur leur corps anesthésié : 630 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal est infecté par un parasite du paludisme du rongeur, subit un prélèvement sanguin, puis les moustiques se nourrissent de son sang quatre jours après l'infection. L'étude porte sur les gènes qui rendent le moustique résistant au parasite, dans une visée de lutte contre le paludisme humain. Le porteur explique tuer les souris parce que le nourrissage exige un niveau de parasites et un âge précis, ce qui écarte toute réutilisation.

Objectifs

Des études antérieures ont permis d’identifier un gène associé à une résistance vis-à-vis du parasite Plasmodium responsable du paludisme. Des résultats préliminaires montrent que dans certains cas, le moustique utilise différentes formes de ce gène pour se protéger contre le parasite humain et contre le parasite de rongeur. Nous nous intéressons aux mécanismes sous-jacents à cette spécificité de la réponse immunitaire vis-à-vis d’un pathogène avec lequel le moustique a partagé une histoire évolutive ou avec un nouveau pathogène (qu’il n’aurait jamais rencontré) tels que les parasites de rongeurs. L’objectif de ce projet est d’identifier les gènes candidats et régulateurs potentiels présents de ce gène chez ce moustique qui concourent à ce statut réfractaire vis-à-vis de différents parasites. Plus précisément, 10 gènes candidats et 10 candidats « ARN non-codants » régulateurs seront testés. De plus, les moustiques sauvages devenant de plus en plus résistants aux insecticides, nous avons également généré une lignée de moustique résistante à la deltaméthrine (un insecticide très utilisé sur le terrain). Nous aborderons dans ce projet le rôle des 20 candidats dans un fond génétique de moustiques résistants à la deltaméthrine. Enfin, la flore bactérienne des moustiques jouant un rôle sur leur capacité à transmettre le parasite Plasmodium, nous évaluerons si les gènes protecteurs interagissent avec le microbiote bactérien. En effet en piquant un hôte mammifère traité aux antibiotiques, les moustiques seront à leur tour soumis à cet antibiotique susceptible de modifier l’ensemble de leur flore bactérienne. Ce dernier point permet d’aborder et de mimer, sur un modèle murin, l’impact de piqûres du moustique sur des individus traités aux antibiotiques (commune sur le terrain) sur la modulation de la compétence vectorielle des moustiques au parasite Plasmodium, ainsi que sur la réponse immunitaire de ces insectes vis-à-vis du parasite.

Bénéfices attendus

Les moustiques constituent les vecteurs les plus dangereux pour l'humanité, responsables de plus de 700 000 décès annuels selon l'OMS. Ce fardeau sanitaire s'aggrave avec le changement climatique qui favorise l'expansion de ces insectes vers des zones tempérées autrefois épargnées, où des cas autochtones de maladies tropicales émergent désormais. Parallèlement, l'efficacité des stratégies actuelles fondées sur les insecticides est gravement compromise par le développement de résistances généralisées chez les populations de vecteurs. Ce projet propose une approche fondamentale novatrice visant à identifier les composantes moléculaires et génétiques du système immunitaire des moustiques qui permettent à certains individus de bloquer naturellement le développement du parasite du paludisme. Cette compréhension permettra de concevoir des stratégies de lutte biologique consistant à renforcer ces mécanismes de défense naturels au sein des populations de vecteurs. Contrairement aux insecticides chimiques, ces approches cibleraient spécifiquement la capacité de transmission sans éliminer les insectes, préservant la biodiversité et limitant l'impact écologique. Les connaissances acquises sur les interactions complexes entre hôte, parasite et vecteur, nécessitant l'étude du cycle infectieux complet qui justifie ce recours indispensable et strictement limité à l'expérimentation animale, ouvriront la voie à des outils de contrôle génétique ou biologique durables et transférables à d'autres systèmes vectoriels (dengue, zika). Les bénéfices attendus sont majeurs pour la santé publique mondiale, particulièrement pour les populations vulnérables des régions tropicales, et permettront d'anticiper proactivement les risques sanitaires émergents sur le territoire européen.

Procédures

- Injection de parasites responsable du paludisme de rongeur durée quelques secondes (degré de gravité modérée) une fois dans la vie la souris - Injection pour anesthésie, durée de quelques secondes, une seule fois dans la vie de la souris, 4 jours après injection de parasites. - Prélèvement sanguin, veine caudale, durée (moins d’une minute), une seule fois dans la vie de la souris, 4 jours après injection de parasites. - Nourrissage des insectes sur souris anesthésiées, durée : 30 minutes, une seule fois dans vie de la souris, 4 jours après injection de parasites.

Impact sur les animaux

Les souris peuvent ressentir un stress temporaire lié à la manipulation (préhension) et aux injections et prélèvement nécessaires pour le projet. Une douleur légère et ponctuelle de courte durée peut survenir au moment de l’injection. L’injection de parasites entraîne une augmentation de la parasitémie dans le sang, ce qui peut provoquer un état de fatigue de courte durée (3 jours), une locomotion ralentie, une baisse de vivacité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, le nourrissage par les moustiques doit se faire à un niveau de parasites bien déterminé et à un âge de souris bien déterminée. En d’autres termes, nous ne pouvons pas utiliser des souris plus vieilles et chez lesquelles le niveau de parasites dans le sang serait certainement plus élevée ; cela influencerait le niveau et l’efficacité d’infection de nos moustiques.

Remplacement

Pour étudier l’infection des parasites Plasmodium (responsables du paludisme) chez les moustiques, nous avons exploré des méthodes alternatives à l’utilisation d’animaux vivants. Cependant, ces approches présentent des limites majeures pour notre projet. Une première méthode consiste à nourrir les moustiques sur une membrane artificielle chauffée à température corporelle (37°C), contenant du sang infecté. Malheureusement, cette technique ne permet pas aux moustiques de s’infecter de manière suffisamment efficace. Les résultats obtenus sont trop variables pour garantir une analyse fiable des effets étudiés, ce qui rend cette approche incompatible avec nos objectifs scientifiques. Par ailleurs, notre question de recherche exige que les parasites soient transmis aux moustiques dans des conditions aussi proches que possible de leur cycle naturel. En effet, lors d’une infection naturelle, les parasites interagissent avec les composants du sang (comme les anticorps ou les facteurs immunitaires) et évoluent dans un environnement complexe, essentiel à leur développement. Une méthode artificielle ne peut pas reproduire ces interactions, ce qui risquerait de fausser nos observations. Nous avons également envisagé l’utilisation de cellules de moustiques en culture, mais cette solution n’est pas adaptée. Les stades infectieux du parasite ne peuvent pas se développer correctement dans ces cellules, et ce système ignore le rôle clé du microbiote intestinal du moustique, indispensable à la maturation du parasite. Sans ces éléments, les résultats ne refléteraient pas la réalité biologique de l’infection. Ainsi, pour répondre de manière rigoureuse à notre problématique, nous devons recourir à des souris préalablement infectées par Plasmodium. Ces modèles, bien que minimalistes, sont les plus petits mammifères permettant de reproduire fidèlement les mécanismes de l’infection humaine. Ils offrent un compromis éthique et scientifique optimal pour étudier les interactions entre le parasite, le vecteur et l’hôte, tout en limitant le nombre d’animaux utilisés.

Réduction

Le nombre de souris utilisées dans ce projet est strictement limité au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques. Chaque expérience est conçue de manière à optimiser l’utilisation des animaux, avec une seule souris utilisée pour permettre l’infection d’un nombre élevé d’insectes, ce qui limite le recours à des animaux supplémentaires. Par ailleurs, le choix d’utiliser exclusivement des souris femelles permet de réduire la variabilité entre les individus. Les mâles présentent plus fréquemment des comportements agressifs pouvant entraîner du stress ou des blessures, susceptibles d’influencer les résultats expérimentaux. L’utilisation de femelles favorise ainsi des conditions plus homogènes et fiables, ce qui contribue à limiter le nombre total de souris nécessaires au projet, conformément au principe de réduction des 3R.

Raffinement

Pour réduire au maximum la douleur et le stress des souris lors du nourrissage des insectes, les animaux sont placés sous anesthésie générale. Cette mesure empêche que les piqûres des insectes provoquent une souffrance. Les souris sont hébergées dans des conditions optimales à l’animalerie, avec un nombre de souris

Choix des espèces

Les expériences visant à suivre l’évolution de l’infection parasitaire (Plasmodium berghei ou Plasmodium yoelii) chez les insectes ont été développées et optimisées chez la souris. L’utilisation d’une autre espèce de rongeur nécessiterait de refaire entièrement ces travaux de mise au point, sans garantie de succès, ce qui rallongerait considérablement la durée des expériences et pourrait augmenter le nombre d’animaux utilisés. La souris est donc l’espèce la mieux adaptée pour obtenir des résultats fiables tout en limitant le recours à des animaux supplémentaires. Ce stade a été sélectionné sur la base de données de validation expérimentale préalable établissant que la dose infectante de parasites et la cinétique d'évolution de la parasitémie sont caractérisées de manière optimale, et reproductibles chez des animaux de cet âge. L'utilisation de souris plus jeunes (stade juvénile, croissance en cours) ou plus âgées (adultes matures) présenterait une variabilité de la volémie et du poids corporel significative, rendant nécessaire une recalibration complète des quantités de parasites à administrer et une réévaluation de la cinétique de développement parasitaire propre à chaque classe d'âge. Cette standardisation à 4-5 semaines garantit la robustesse méthodologique et la reproductibilité des résultats tout en évitant la multiplication de séries expérimentales préliminaires, ce qui augmenterait le nombre total d'animaux utilisés, conformément au principe de réduction.

Ce projet prévoit 4 896 souris, un effectif parmi les plus élevés du corpus, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Dès l'âge de huit jours, les souriceaux reçoivent des injections de composés pro-inflammatoires, sont séparés de leur mère, subissent des prélèvements de sang et de fèces puis quatre tests comportementaux, avant le prélèvement de leurs tissus. Le modèle vise à relier autophagie, inflammation et troubles du neurodéveloppement, les retombées thérapeutiques étant annoncées comme un simple "point de départ" pour de futurs tests précliniques. Le porteur justifie l'ampleur du dispositif par la combinaison de plusieurs approches sur une même lignée, sans détailler ce qui fonde le total de 4 896 individus.

Objectifs

La complexité des troubles neurodéveloppementaux (TND) suggère l’implication d’une combinaison de type « gènes × environnement ». De plus en plus de données indiquent que ces troubles sont influencés par l’axe microbiote-intestin-cerveau, via des interactions complexes entre l’inflammation, l’autophagie (système de recyclage intracellulaire) et le développement neuronal. La littérature a permis de mettre en évidence le rôle de l’autophagie dans certains de ces troubles. L’autophagie est un mécanisme par lequel les cellules immunitaires cérébrales éliminent les connexions neuronales surnuméraires au cours du développement, et son dysfonctionnement peut influencer la communication entre intestin et cerveau, contribuant aux TND. Par ailleurs, la littérature scientifique indique qu’une exposition précoce à des composants environnementaux pro-inflammatoires est impliquée dans la survenue de TND. Dans ce contexte, et sur la base de résultats préliminaires obtenus sur des populations de patients TND, nous avons choisi de travailler sur l’un des gènes impliqués dans l’autophagie et dans l’inflammation. L’utilisation de modèles murins de déficience du système autophagique a permis de conclure à un lien entre l’autophagie et la survenue d’anomalies comportementales. Le modèle de souris présente des perturbations des réponses inflammatoire et autophagique. Ce modèle est donc pertinent dans l'étude du processus autophagique, de la régulation de l’inflammation et de la susceptibilité génétique aux composés pro-inflammatoires, tout en permettant d’étudier les mécanismes influençant l’axe intestin-cerveau. Ces données originales permettront d’enrichir la caractérisation de la lignée au niveau de l’axe microbiote-intestin-cerveau, un axe central dans lequel l’inflammation et les dysfonctionnements de l’autophagie peuvent contribuer à l’apparition et à la sévérité des TND. Cette approche intégrative permettra d’acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes liant autophagie, inflammation et TND.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie en combinaison avec une exposition précoce à des composés pro-inflammatoires dans le développement du système nerveux central, la survenue de troubles du neurodéveloppement, et l'implication de l'axe intestin-cerveau dans ces troubles, qui sont en constante augmentation dans la population générale. A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant l’autophagie pour réduire la survenue ou atténuer la sévérité de ces troubles.

Procédures

Une injection unique de composé pro-inflammatoire (durée du geste d’environ 10 secondes, animaux vigiles) ou deux injections répétées sur un maximum de quatre jours (durée du geste d’environ 5 minutes, sous anesthésie générale). Deux prélèvements sanguins au niveau de la veine mandibulaire pourune partie des animaux (durée du geste environ 10 secondes, animaux vigiles). Deux prélèvements parsemaine des fécès pendant 3 semaines après sevrage lors des pesées (durée du geste environ 1 à 2 minutes, animaux vigiles). Au total, les animaux sont soumis à 4 tests de comportements réalisés tous les deux jours (2 heures maximum au total).

Impact sur les animaux

Des nuisances et effets indésirables classés comme modérés sont attendus, en lien avec notamment la séparation de quelques minutes entre la mère et les petits lors des injections (stress pour la mère), l’anesthésie générale (chute de la température corporelle et détresse respiratoire), le stress induit par les tests de comportement, la réalisation de contention et l'injection de molécules anesthésiques, l’induction d’un état fébrile passager suite aux injections. La manifestation d’une gêne peut se traduire par un animal moins mobile.

Devenir

L’ensemble des 4896 animaux sera euthanasié en fin de projet afin de prélever les tissus d’intérêt pour traitement par biologie molécule ou histologie.

Remplacement

Notre étude a pour but la compréhension des mécanismes impliqués dans les interactions gène x environnement dans l’apparition des troubles neurodéveloppementaux après une exposition précoce à des composés pro-inflammatoires chez une lignée murine déficiente en autophagie. Ces explorations nécessitent une évaluation sur l’individu. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle animal, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.

Réduction

Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 4896 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. De plus, un même animal est utilisé pour différentes études de biologie moléculaire et-ou la réalisation de séries de coupes pour les cerveaux prélevés, ce qui nous permet de réaliser plusieurs marquages différents pour un même cerveau. D'une manière générale, nous avons conçu les lots pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les échantillons prélevés seront envoyés à différentes équipes dans le cadre de collaborations.

Raffinement

Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés plusieurs fois par semaine et à la suite de tout signal d’alerte une grille de suivi est mise en place. Comme défini dans l'agrément de notre établissement, les paramètres environnementaux sont contrôlés conformément à la règlementation en vigueur. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et disposent de matériel de nidification (coton) et d’une maison rouge. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de troubles moteur ou comportements anormaux, les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue pendant 12h, à l’aide d’une grille de suivi. Si l’état général de l’animal atteint les points limites (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), les animaux seront euthanasiés immédiatement. Le stress induit par la séparation maternelle au moment de l’injection des animaux à 8, 10, 13, 14, 15 ou 17 jours est minimisé en réduisant au maximum le temps de séparation avec la mère. Les animaux sont placés sur un tapis chauffant pour éviter tout stress lié à la température. Les animaux seront particulièrement observés après les injections. Afin d’éviter une souffrance, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique est souvent complexe et long à mettre en œuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins notre modèle existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement et ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Les injections de composés pro-inflammatoires seront réalisées à 8, 10, 13 et 14 jours ou 15 et 17 jours de manière à modéliser l’exposition de l’enfant à ses composés, pendant sa première année de vie. Les injections de molécules pro-inflammatoires (modèle classique de stimulation pro-inflammatoire) seront réalisées à 8, 20, 34 et 89 jours, de manière à nous rapprocher des précédents projets mis en place sur cette thématique et à couvrir différents stades de la vie de l’animal : néonatal (injection à 8 jours de vie), jeune (injection à 20 jours de vie), adolescent (injection à 34 jours de vie) et adulte (injection à 89 jours de vie).

Pour caractériser la libération de dopamine dans l'hippocampe, 221 souris subissent une chirurgie cérébrale sous anesthésie générale d'environ quatre-vingt-dix minutes, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. La chirurgie peut provoquer une douleur post-opératoire pendant un à deux jours. 201 animaux sont tués pour analyses histologiques, 20 maintenus en vie et réutilisés dans d'autres projets. Le porteur justifie le recours à la souris par des outils de stimulation neuronale disponibles chez cette seule espèce.

Objectifs

La dopamine joue un rôle essentiel dans les processus d’apprentissage et de mémoire au sein de l’hippocampe. Ce projet a pour objectif de mieux caractériser la libération de dopamine dans l’hippocampe de la souris, afin de mieux comprendre sa fonction dans cette structure cérébrale.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes de la mémoire. Il permettra d’identifier les mécanismes qui font qu’on se souvient de certaines choses et pas d’autres, et à plus long terme de mieux comprendre les troubles de la mémoire.

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie générale, permettant une injection qui durera environ 90 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une chirurgie susceptible d’induire une douleur post-opératoire modérée durant 24 à 48h. Les pesées nécessaires au suivi post-opératoire peuvent entraîner un stress léger. La manipulation des animaux lors des expériences comportementales peut induire un stress léger.

Devenir

201 animaux seront mis à mort à la fin de la procédure en vue d’analyses histologiques. 20 souris seront maintenues en vie et pourront être réutilisées dans d’autres projets.

Remplacement

Le projet vise à caractériser la libération de dopamine dans l’hippocampe. Cette étude nécessite l’intégrité fonctionnelle du cerveau, incluant à la fois les structures hippocampiques et les voies dopaminergiques. Compte tenu de la nécessité d’étudier la libération de dopamine dans un contexte physiologique et comportemental intact, une approche in vivo est indispensable.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé à partir de nos données antérieures de manière à obtenir une puissance statistique a priori de 90%. Sur cette base, un maximum de 15 souris par groupe seront incluses pour notre projet.

Raffinement

Les animaux seront progressivement entraînés à la manipulation afin de limiter le stress avant les procédures expérimentales. Tout au long du protocole, une surveillance quotidienne sera assurée, avec une attention accrue en période postopératoire. Des mesures spécifiques seront mises en place pour minimiser les effets indésirables sur le bien-être des animaux : maintien de la température corporelle pendant et après la chirurgie et mise à disposition de gel réhydratant et d’aliments faciles d’accès et gestion systématique de la douleur en post opératoire. En cas d’altération de l’état général d’un animal, une évaluation clinique structurée sera réalisée afin de définir la conduite à tenir.

Choix des espèces

Les outils nécessaires pour stimuler spécifiquement les neurones à dopamine avec une précision de l’ordre de la milliseconde sont disponibles uniquement chez la souris. Les structures impliquées dans la mémoire étudiées dans ce projet sont conservées chez la plupart des mammifères. Ce qui nous permet d'extrapoler nos conclusions tirées de cette étude chez l’humain. Les animaux seront inclus dans le protocole à l’âge adulte, entre 2 et 8 mois afin d’éviter des effets du développement ou du vieillissement.

Soumis à des prises de sang répétées, à des ponctions de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie et à l'implantation chirurgicale de cathéters, 315 animaux non-humains sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré : 180 macaques à longue queue, 90 chiens et 45 cochons. Le protocole induit chez eux des états fébriles ou inflammatoires pour mesurer l'effet de candidats médicaments avant les essais chez l'humain. Le porteur classe l'ensemble des animaux en réutilisation, retour à l'élevage ou adoption, tout en indiquant que certaines études imposent des prélèvements terminaux d'organes. Il ajoute que l'adoption est rarement envisagée pour les macaques, plutôt réutilisés dans d'autres laboratoires.

Objectifs

Ce projet regroupe l’ensemble des procédures techniques (administration de substances et prélèvements de matériels biologiques) permettant aux différents axes thérapeutiques d’évaluer et de caractériser les effets pharmacologiques d'un composé chez l'animal et de les relier à leur pharmacocinétique (cinétique d’exposition au produit). Ces informations sont nécessaires pour affiner les stratégies de développement précliniques, puis cliniques chez l'Homme. Pour chaque composé étudié, ces études permettent de déterminer les modifications de biomarqueurs d’efficacité caractéristiques de la cible d’intérêt et de les associer aux expositions à chaque dose et voie d’administration du produit testé (concentrations maximales et temps d'élimination associés). Ces deux informations sont combinées grâce à des analyses de modélisation pour vérifier le potentiel des candidats médicaments, et de déterminer les meilleures doses à tester dans les études de sécurité précliniques, puis la première dose qui pourra être administrée à l'Homme (volontaire sain ou patient). Dans le souci de réduire le nombre d’animaux commandés, des animaux issus d’autres projets ou procédures pourront être utilisés dans ce projet. Ce projet devrait être utilisé pour environ 35 études supportant une quinzaine de projets scientifiques.

Bénéfices attendus

Le projet vise à rassembler les premières informations d’exposition des candidats médicaments après administration sur un animal. Elles permettront de justifier l’espèce non-rongeur choisie pour les tests réglementaires précliniques, la gamme de dose qui devra être considérée dans ces études et les potentiels signes cliniques à anticiper. Combinées aux indicateurs et biomarqueurs d’efficacité disponibles dans la phase préalable de pharmacologie in vitro et in vivo, les données aident à évaluer le potentiel des candidats à activer ou désactiver leur cible biologique dans les études cliniques à venir. Elles permettent donc de vérifier la probabilité de succès du candidat médicament, et de ne tester pour les étapes ultérieures de Toxicologie chez l’animal et de Sécurité chez l’Homme que les candidats les plus prometteurs.

Procédures

La procédure de ce projet associe essentiellement des phases d’administrations de produits et de prélèvements divers. Les modes d’administration sont ajustées à celles prévues chez l’Homme, elles peuvent être multiples et utilisées en parallèle pour déterminer la biodisponibilité du produit ou simplement celle la plus à même d’assurer une bonne exposition au produit d’étude. Les prélèvements répondent aux besoins d’analyse et sont le plus souvent des prélèvements sanguins, mais d’autres matrices comme le liquide céphalo-rachidien, la peau ou d’autres tissus peuvent être nécessaires. Les prélèvements sanguins sont réalisés sur animaux vigiles, sur des durées d’études de 3 à 28 jours selon les produits testés. Le nombre de prélèvements sanguins est de l’ordre de 6 à 8 lors de la première journée de l’étude, puis s’espace avec un rythme de prélèvements quotidiens pendant les trois jours suivants, puis environ deux fois par semaine pour les durées d’études les plus longues. Chaque phase de prélèvement ne dure que quelques minutes sur des animaux vigiles. Les prélèvements de liquide céphalo-rachidien sont réalisés sous anesthésie générale et à raison de 2 prélèvements maximum la première journée, puis un ou deux prélèvements plus espacés à partir du deuxième jour (pas plus d’un par jour). Ils durent environ 15 à 20 minutes. Les prélèvements urinaires sont effectués sur animaux vigiles, en isolant les animaux dans des cages à métabolisme pendant 4 à 16 heures. Ils sont réalisés une fois dans les deux premiers jours de l’étude, avec un ou deux recueils pendant la période d’isolement. Les prélèvements de tissus sont réalisés sous anesthésie et les conditions sont définies par les bonnes pratiques d’anesthésie, d’analgésie et de chirurgie sous la supervision d’un vétérinaire qui assure le protocole le plus approprié. Ces interventions durent entre 30 et 60 minutes. Pour faciliter les prélèvements et les rendre moins stressants, il peut être décidé d’implanter des cathéters veineux ou céphalo-rachidiens, ou des implants permettant d’enregistrer des paramètres physiologiques (fréquence cardiaque ou respiratoire, pression artérielle, température…) au cours d’une opération chirurgicale environ deux semaines avant le début de l’étude, permettant de compléter les soins post-opératoires et la récupération de l’animal. La durée d’intervention sous anesthésie générale-analgésie est alors d’environ une à deux heures.

Impact sur les animaux

La phase d’administration des produits peut générer une phase d’inconfort léger et transitoire (les doses prévues dans ce projet ne sont pas censées induire des effets indésirables notoires). L’inconfort est limité par le respect des bonnes pratiques d’administration et le soin pris à la sélection des doses et à leur bonne condition de formulation. L’objectif du projet comprenant l’induction d’états mimant les pathologies visées, différents effets peuvent être observés. On peut citer à titre d’exemples : - Induction d’un état fébrile mimant une infection par administration de substances : les signes cliniques observés comprennent une hyperthermie, souvent accompagnée d’une hypoactivité et d’une baisse d’appétit. - Induction d’une réaction inflammatoire par administration de composés mimant les essais d’immunothérapie : les animaux sont soumis à une phase initiale (quelques heures à quelques jours) comportant des épisodes d’hypo ou d’hyperthermie et d’hypotension, reflétées par des baisses d’activité ou d’apathie et une possible perte de poids et d’appétit. Pour certains produits d’origine biologique, des réactions immunitaires peuvent survenir (intolérance, ou réaction allergique). Enfin, les prélèvements de tissus ou les éventuelles implantations de cathéters ou d’autres dispositifs de mesures sont pratiquées en conformité avec les bonnes pratiques chirurgicales. Ces opérations sont susceptibles d’entrainer dans les premiers jours post-opératoires une douleur légère, une baisse d’appétit et une légère baisse d’activité. Pour certaines phases d’études, les animaux peuvent être isolés pour faciliter l’enregistrement de paramètres ou la collection d’urine.

Devenir

Ce type d’étude nécessite parfois des prélèvements terminaux d’organes vitaux (notamment de cerveau et/ou de foie) pour évaluer les atteintes sur l’activité pharmacologique sur les organes et tissus, ainsi que la quantification de l’exposition tissulaire du candidat médicament. C’est seulement lorsque les objectifs de l’étude ne nécessitent pas ces prélèvements que certains animaux pourront être ré-utilisés après approbation du vétérinaire. Le pourcentage est un peu plus élevé chez le chien et le miniporc qui sont rarement exposés à des produits biologiques. Chez le primate non-humain sur lesquels ces produits sont préférentiellement testés, des anticorps contre les produits testés peuvent être induits et viennent compliquer un peu plus la réutilisation. Certains de ces animaux pourront être proposés à l’adoption via des associations et des structures d’accueil spécifiques et en accord avec les autorités compétentes, ces options sont systématiquement évaluées chez le chien et chez le miniporc, mais beaucoup moins chez les primates non-humains qui peuvent plutôt être proposés à la réutilisation dans d’autres laboratoires.

Remplacement

Le principe même de la procédure décrite dans ce projet est de déterminer le devenir et l’impact des candidats médicaments dans un organisme vivant, c’est donc l’objet même des projets utilisant ces procédures que d’utiliser des animaux. Seul l'animal permet d'observer les interactions entre systèmes physiologiques (cardiovasculaire, nerveux, immunitaire, etc.) des candidats médicaments. Cependant, des phases préalables systématiques se déroulent par simulation sur ordinateur (modélisation) ou à l’aide de cultures cellulaires afin de caractériser les produits les plus susceptibles de pouvoir atteindre les phases cliniques. Ces tests préalables permettent aussi de choisir l’espèce non-rongeurs à privilégier pendant la phase d’évaluation de la sécurité préclinique réglementaire. Ils permettent en particulier de limiter l’utilisation des primates non-humains chaque fois qu’une autre espèce non-rongeur peut être utilisée.

Réduction

La première source de réduction du nombre d’animaux intégrés dans ce projet est la limitation du nombre de candidats médicaments testés sur les modèles animaux, suite à la mise en place de cascades de tests de modélisation ou de cultures cellulaires. Ainsi, seules les molécules le plus prometteuses ou permettant de valider les attentes thérapeutiques des projets scientifiques sont testées chez l’animal. Les effectifs des lots expérimentaux sont réduits le plus souvent à trois animaux, minimum garantissant la validité des observations en tenant compte de la variabilité des processus biologiques entre animaux. Ces effectifs sont définis sur la base d’analyses statistiques et garantissent de ne pas devoir reproduire ou compléter des études non conclusives. Le choix d’augmenter le nombre d’animaux dans des lots doit être justifié par une variabilité attendue ou déjà observée sur les paramètres mesurés. La diminution du nombre d’animaux passe aussi par la mise en place de stratégies de réutilisation dans le cadre d’une étude (test de plusieurs doses ou produits chez le même animal) et/ou dans des études différentes après une période d’élimination et un accord vétérinaire garantissant la bonne récupération des animaux. Ces stratégies de réutilisation reposent sur des expertises scientifiques évaluant le risque d’incompatibilité ou d’effets croisés entre les produits testés et sur l’amélioration de la sensibilité des dosages, afin de garantir que les résultats de chaque étude seront bien interprétables et utilisables dans les documentations réglementaires.

Raffinement

L’un des objectifs principaux des procédures du projet étant de collecter des échantillons de fluides ou de tissus biologiques, un grand soin est pris à améliorer et optimiser les techniques de prélèvements. Pendant les études, les mesures suivantes font partie des procédures opératoires : -Habituation des animaux aux conditions expérimentales (gavage, bruit de la tondeuse, mise en hamac ou en chaise de contention, salle de procédure, table d’examens…) -Administration sur un premier animal décalé pour un produit ou une dose testée pour la première fois -Réduction du nombre de prélèvements et des volumes prélevés -Utilisation de protocole d’anesthésies très courts (flash) -Mise en place de vidéo-monitoring ou d’enregistrement continue de paramètres (télémétrie) pour identifier précisément et rapidement les effets indésirables Chaque manipulation est associée à un renforcement positif sous forme de récompenses physiques (caresses, encouragements vocaux) et/ou alimentaires, selon la compatibilité avec le protocole. En complément de leur alimentation quotidienne, les animaux reçoivent des enrichissements alimentaires spécifiques. Pour les primates non humains, ces enrichissements sont distribués individuellement à la main, dès leur arrivée afin de favoriser l'établissement d'une relation de confiance entre l'animal et l'expérimentateur. Pour les administrations, et sauf à ce que la dose administrée ait déjà été testée dans une autre étude, un animal sera traité avant les autres pour vérifier qu’aucun effet indésirable n’apparait avant de traiter les autres animaux (décalage du premier animal). Les prélèvements sanguins et urinaires peuvent nécessiter des isolements temporaires hors du groupe afin de respecter les temps de prélèvements. Ces isolements sont limités au strict minimum et les animaux sont conservés en contact visuel et olfactif. Les prélèvements de liquide céphalo-rachidien ou les biopsies (peau, muscle, moelle osseuse, ganglion …) sont réalisés sous anesthésie la plus courte possible. Des points limites, supervisés conjointement par le scientifique et le Vétérinaire clinicien, sont établis pour garantir que les animaux ne subissent pas de contrainte supérieure à un niveau modéré.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce se base sur la nécessité d’expression de la cible thérapeutique, qui doit être vérifiée ou identifiée dans la littérature avant de lancer les études. Pour la partie des effets indésirables, la législation oriente les choix de façon assez précise puisqu’il faut disposer d’informations au moins sur une espèce non-rongeur. Le choix se base sur la bonne expression de la cible thérapeutique et la compatibilité du produit à administrer dans l’espèce. Le chien ou le miniporc doivent être privilégiés et les primates non-humains utilisés uniquement en dernier recours et sur justification scientifique particulière. Pour les produits biologiques, comme les anticorps ou dérivés des anticorps, la proximité des systèmes immunitaires de l’homme et du primate non humain fait de cette espèce un choix préférentiel. Des animaux génétiquement altérés peuvent être utilisés afin de bénéficier de l’inactivation ou de la surexpression de gènes d’intérêt dans certains modèles scientifiques. Le stade de développement des animaux doit être pertinent pour une comparaison aux personnes qui seront incluses dans les essais cliniques, et les animaux sont donc généralement de jeunes adultes.

Deux instillations par jour d'un conservateur de collyre abrasif pendant une semaine, un inducteur de colite dans l'eau de boisson, quatre semaines d'antibiotiques : 2 832 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. L'objectif est de relier un déséquilibre du microbiote intestinal en début de vie à l'apparition de douleurs oculaires chroniques. Les souris reproductrices, qui ne font l'objet d'aucun prélèvement, sont elles aussi tuées faute de pouvoir être réutilisées. Les pistes thérapeutiques annoncées pour les patients restent renvoyées au long terme.

Objectifs

Après la naissance, le système immunitaire apprend progressivement à faire la différence entre ce qui est inoffensif et ce qui peut etre dangereux pour l’organisme. Cet apprentissage dépend en grande partie du microbiote intestinal, c’est-à-dire l’ensemble des bactéries qui vivent naturellement dans l’intestin. Un moment clé de cette maturation est le sevrage, lorsque l’alimentation du nourrisson se diversifie. A cette période, le système immunitaire s’active afin de s’adapter aux nouvelles bactéries présentes dans l’intestin. Cette étape est essentielle pour installer une tolérance immunitaire, qui permet d’éviter des réactions excessives ou dirigées contre les propres tissus du corps. Si le microbiote est perturbé à ce moment critique, par exemple après la prise d’antibiotiques ou en cas de déséquilibre des bactéries intestinales, cet apprentissage peut être altéré. Le système immunitaire devient alors plus susceptible de réagir de manière inappropriée, augmentant le risque de maladies inflammatoires ou auto-immunes plus tard dans la vie. Des travaux récents ont également mis en évidence un lien étroit entre l’intestin, le cerveau et l’œil, appelé axe intestin cerveau œil. Une perturbation précoce du microbiote peut interférer avec le développement normal de la cornée, la surface transparente de l’œil, ainsi que de ses nerfs. Cela peut rendre l’œil plus vulnérable à l’inflammation, qui, lorsqu’elle devient chronique, peut entraîner des douleurs oculaires ou une sécheresse oculaire. Ce projet vise à comprendre comment un microbiote déséquilibré en début de vie perturbe le système immunitaire et favorise l’apparition de douleurs oculaires. A terme, ces connaissances pourraient ouvrir la voie à de nouveaux traitements permettant de mieux prévenir et soulager ces troubles, et d’améliorer la qualité de vie des personnes concernées.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment le système immunitaire (les mécanismes de défense du corps) agit au niveau de la cornée, la surface transparente de l’œil. En identifiant précisément ces mécanismes, il permettra de mettre en évidence de nouvelles pistes pour développer des traitements plus efficaces. Le projet s’intéresse également au role du microbiote intestinal, l’ensemble des micro organismes vivant dans l’intestin, en particulier lorsqu’il est perturbé très tôt dans la vie. Ces perturbations précoces peuvent avoir des effets durables sur la santé, y compris en dehors de l’intestin. L’objectif est de comprendre comment elles influencent la santé de la surface de l’œil, favorisent l’inflammation et peuvent conduire à des douleurs cornéennes chroniques ou à une sécheresse oculaire. À plus long terme, ces travaux pourraient ouvrir la voie à des stratégies thérapeutiques innovantes, visant à rétablir un bon équilibre des réponses immunitaires, à soulager durablement la douleur et la sécheresse oculaire, voire à prévenir leur apparition. En ciblant les interactions entre le système immunitaire et les nerfs impliqués dans la douleur, ce projet ambitionne d’améliorer significativement la qualité de vie des patients souffrant de douleurs oculaires chroniques ou de maladies inflammatoires associées.

Procédures

Perturbation du microbiote intestinal précoce : Le microbiote intestinal sera perturbé par l’administration d’antibiotiques dans l’eau de boisson pendant 4 semaines, associée à un régime alimentaire dépourvu de fibres. Modèle d’inflammation intestinale (colites) : Un agent inducteur de colite sera administré dans l’eau de boisson pendant 14 jours au total, selon deux cycles successifs de 7 jours. Les instillations nécessiteront une contention de quelques secondes chez l’animal vigile. Les tests comportementaux, réalisés chez des animaux vigiles, impliqueront également des contentions brèves : test d’anxiété (2 sessions de 10 minutes par animal), test de sensibilité mécanique cornéenne (4 sessions de 30 secondes) et test de sensibilité chimique cornéenne (1 session de 30 secondes). Les sessions d’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale (4 sessions de 5 minutes), et une euthanasie règlementaire sera effectuée après injection d’anesthésiques et d’antalgiques. Modèle de douleur inflammatoire par instillation d’un conservateur de collyre : La douleur inflammatoire sera induite par des instillations d’un conservateur de collyre abrasif, réalisées deux fois par jour pendant 7 jours, suivies d’instillations biquotidiennes d’un agent pharmacologique (2 fois par jour espacées de 4 heures pendant 7 jours). Les instillations et tests comportementaux nécessiteront des contentions de quelques secondes chez l’animal vigile, selon les mêmes modalités que précédemment (tests d’anxiété et de sensibilité cornéenne). Les sessions d’imagerie (4 × 5 minutes) et l’euthanasie règlementaire seront effectuées après injection d’anesthésiques et d’antalgiques. Thérapie par instillations oculaires : Les traitements topiques (agent pharmacologique ou solvant) seront administrés par instillations oculaires deux fois par jour pendant 7 jours, espacées de 4 heures, une heure après l’instillation d’un conservateur de collyre abrasif chez l’animal vigile. Les modalités de contention, de tests comportementaux et d’anesthésie pour l’imagerie et l’euthanasie seront identiques à celles décrites ci-dessus.

Impact sur les animaux

Les antibiotiques et l’alimentation pauvre en fibres peuvent parfois provoquer une légère perte de poils sur le dos et un ralentissement modéré de la prise de poids. Les substances utilisées pour provoquer une inflammation peuvent entraîner une irritation de l’intestin ou de l’œil, une perte de poids et, plus rarement, la présence de sang dans les selles. Les animaux sont manipulés régulièrement pour l’administration de gouttes dans les yeux, ce qui peut générer un léger stress. Les injections d’anesthésiques ou d’antalgiques peuvent aussi provoquer une gêne brève au point d’injection. L’anesthésie générale comporte un faible risque (ralentissement cardiaque ou respiratoire, baisse de la température corporelle) et, très rarement, un décès. Des réactions locales au site d’injection (rougeur, douleur, petite infection) peuvent apparaître mais restent peu fréquentes. Les examens d’imagerie de l’œil nécessitent une anesthésie générale, ce qui représente un risque léger. Les tests comportementaux peuvent entraîner un stress passager (fatigue ou modification temporaire du comportement). Les traitements testés sont destinés à soulager l’inflammation oculaire. Leur administration est généralement indolore, mais une légère irritation transitoire peut parfois être observée. Les animaux sont surveillés attentivement afin de détecter et limiter tout inconfort.

Devenir

Des prélèvements et analyses post-mortem sont nécessaires, impliquant l’euthanasie des animaux par une procédure réglementaire à l’issue de chaque procédure expérimentale. Tous les animaux inclus dans le champ du projet et soumis aux procédures expérimentales feront l’objet de prélèvements post-mortem et seront euthanasiés. Les femelles reproductrices ne font pas l’objet de prélèvements mais, ne pouvant être réutilisées, sont néanmoins euthanasiées conformément à la réglementation en vigueur.

Remplacement

L’induction et l’étude de la douleur oculaire nécessite un organisme entier. A ce jour, il n’existe aucun système ex vivo ou in vitro permettant d’évaluer la douleur qui est une expérience sensorielle et émotionnelle. Ce projet vise à explorer et comprendre les interactions complexes, dans le temps, entre les cellules du système immunitaire, le microbiote et l’activation des voies nociceptives cornéennes. Il est donc impossible de modéliser de telles interactions in vitro ou in silico. Le modèle de choix est la souris, qui se prête idéalement aux expériences concernant le système immunitaire, le système nerveux et le microbiote intestinal. Bien que les questions soulevées par ce projet visent à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques mis en jeu au cours de cette pathologie, il est d’abord nécessaire d’élucider ces points clés à travers l’utilisation d’un modèle rongeur.

Réduction

Afin de limiter au maximum le recours aux animaux, le nombre d’animaux inclus dans ce projet a été strictement calculé et optimisé. Sur une durée totale de 5 ans, le projet impliquera au maximum 2 832 souris utilisées dans les procédures expérimentales. Le nombre d’animaux a été déterminé à partir d’études précédentes et de calculs statistiques, afin d’utiliser le minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Ces calculs montrent qu’il faut au moins 10 animaux analysables par groupe expérimental. Dans nos expériences, les petits d’une même mère sont considérés comme appartenant à une même “portée”. Comme les frères et sœurs se ressemblent biologiquement, on tient compte de cette particularité dans le calcul du nombre total d’animaux. Le total inclut donc aussi les femelles reproductrices nécessaires pour obtenir suffisamment de petits par groupe. En moyenne, une mère donne naissance à environ 5 souriceaux. Ainsi, pour disposer de 10 animaux réellement analysables dans un groupe, environ 12 animaux sont nécessaires au total. Cela explique pourquoi le nombre final d’animaux n’est pas toujours un multiple exact de 10. Afin de réduire encore le nombre total d’animaux utilisés, plusieurs tissus sont prélevés sur chaque animal après euthanasie (œil, nerfs, cerveau, intestin, organes immunitaires). Cette approche permet de réaliser plusieurs analyses complémentaires à partir d’un même animal, sans multiplier les expérimentations. Enfin, les résultats obtenus seront analysés à l’aide de tests statistiques adaptés, afin de garantir une interprétation fiable et objective. Ces analyses permettent de déterminer si les différences observées sont réelles ou dues au hasard, selon des critères reconnus par la communauté scientifique.

Raffinement

Les animaux importes observeront une periode d acclimatation de 5 jours minimum avant le debut des experimentations ainsi que des temps de repos etablis entre les differents actes experimentaux. Les animaux seront heberges dans des cages ventilees en stabulation standard avec enrichissement maison en carton avec nourriture et eau ad libitum. Nous limiterons le nombre de 5 souris maximum par cage et nous eviterons tant que possible l hebergement individuel des animaux. Les conditions d hebergement sont conformes a la reglementation en vigueur. Des points limites ont ete definis et les animaux seront examines quotidiennement par le personnel qualifie de l animalerie et ou les experimentateurs. Toute observation anormale ou point limite atteint sera note dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l echelle decisionnelle definie par notre structure du bien etre animal SBEA pouvant mener a l administration d un traitement a decaler dans le temps les actes prevus ou a euthanasier l animal si cela est necessaire. Lors de la gestation et ce jusqu a la fin du sevrage les meres sont placees au nombre de 2 par cage et restent avec les nouveaux nes. La nourriture et l eau de boisson sont fournies ad libitum. La temperature de la zone d hebergement est maintenue a 22 plus ou moins 2 et suit un cycle d eclairage non inverse 12h jour 12h nuit hygrometrie 55 pourcent plus ou moins 10 pourcent. Un systeme d etiquetage associe a des pastilles visuelles permettra d assurer un suivi rigoureux du bien etre des animaux. Pour eviter toute souffrance les procedures chirurgicales se feront sous anesthesie generale associee a un protocole analgesique en pre per et post operatoire. Aucun acte ne sera entrepris avant que l animal ne soit stabilise pour ces differentes constantes. Si un animal anesthesie presentait une detresse respiratoire ou cardiaque ou s il se trouve en hypothermie nous procederons a un arret immediat du protocole en cours et en l absence de retablissement selon le temps defini pour respecter le bien etre animal l euthanasie de l animal sera envisagee. Les tests de la lampe a fente et l imagerie confocale in vivo qui peuvent induire un leger stress et necessitent que l animal soit immobile seront realises sous anesthesie generale.

Choix des espèces

Pour comprendre comment le systeme immunitaire et les bacteries de l intestin (microbiote) interagissent, nous utilisons des souris commerciales non transgeniques. Ces souris sont bien adaptees pour ce type d etude car leur biologie et leur developpement sont proches de ceux de l homme, et les connaissances acquises sont utiles pour mieux comprendre la sante humaine. Elles sont egalement un modele reconnu pour l etude de la douleur oculaire, car leurs yeux et leur cerveau sont similaires a ceux de l homme. Nous utiliserons des souris a differentes etapes de la vie, de la naissance a l age adulte, pour etudier comment les changements du microbiote precoce peuvent influencer les reactions du systeme immunitaire plus tard. Chaque experience durera 14 a 16 semaines maximum, et aucun animal ne depassera l age de 16 semaines. Les stades choisis sont bases sur les connaissances scientifiques, afin de suivre le developpement des animaux sur la duree et comprendre les effets des perturbations du microbiote sur la sante des yeux et du systeme immunitaire a l age adulte.

Génétiquement modifiées pour ne plus maintenir correctement la gaine de myéline de leurs nerfs, 1 088 souris développent un trouble neurologique progressif, avec perte de poids, posture anormale et difficulté à s'alimenter. Elles subissent une biopsie, quatre injections, la pose d'électrodes d'électromyographie et des tests de locomotion, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées pour prélever leurs tissus. Le porteur affirme que le modèle murin est "indispensable" et teste au passage une molécule censée corriger ces anomalies.

Objectifs

Le projet étudie la formation et le maintien de la myéline, la gaine qui entoure et protège les nerfs. Cette gaine est essentielle pour que les signaux nerveux circulent rapidement. Quand elle est altérée, cela peut provoquer des problèmes de mouvements. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées pour comprendre comment une modification de l’ARN, influence le maintien de la myéline, la conduction nerveuse et le comportement moteur. Nous testerons également une molécule qui pourrait corriger ces anomalies. A terme, ces études permettront de proposer de nouvelles approches thérapeutiques chez les patients porteurs de mutation du gène étudié.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer les conséquences fonctionnelles d’une invalidation d’un gène sur le maintien de la gaine de myéline du système nerveux périphérique. A terme, ces études permettront d'améliorer le diagnostic chez les patients et améliorer les approches de thérapie.

Procédures

Plusieurs contentions, une biopsie (quelques secondes), 4 injections (environ 5 sec), ainsi que la pose d’électrode pour l’électromyographie seront réalisés. Des tests de locomotion seront également effectués, avec un entrainement au préalable.

Impact sur les animaux

La contention et la biopsie peuvent provoquer un stress chez l’animal. Les différentes injections et la pose d’électrode pour l’électromyographie entraineront un stress et une douleur légère au point d’injection (environ 5 sec). Après injections, les souris présentent un phénotype neurologique progressif lié à des anomalies centrales et périphériques accompagné d’une perte de poids, une posture anormale, et une difficulté à s’alimenter. Ces paramètres seront surveillés régulièrement.

Devenir

Chaque animal sera mis à mort afin de prélever des tissus pour différentes études (transcriptomique, microscopie, immunohistochimie…).

Remplacement

Le recours à l’utilisation d’un modèle animal est indispensable afin de comprendre comment le gène d’intérêt impacte le maintien de la gaine de myéline du système nerveux périphérique et la fonctionnalité des neurones. L’étude des mécanismes impliqués ne peut pas être réalisée uniquement in vitro car elle nécessite des interactions entre les différents types cellulaires et doivent être mesurées in vivo.

Réduction

Le nombre de souris est réduit à son minimum. Les données seront donc analysées avec des tests adaptés aux petits effectifs. Des tissus seront collectés après mise à mort afin d’approfondir les études au niveau du gène et de la cellule. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations.

Raffinement

Les points limites définis dans le projet seront strictement appliqués et la douleur sera limitée à son maximum. Une grille de score adaptée à la procédure sera mise en place. L’accès à l’eau et à la nourriture sera facilité, avec la nourriture placée directement dans la cage pour limiter le stress. Les animaux auront des séances de training (entrainement) pour les préparer aux différents tests comportementaux (test d’agrippement, rotarod, test de la poutre et test de la tige verticale).

Choix des espèces

Les mécanismes impliqués dans la formation et le maintien de la gaine de myéline sont très conservés entre l'homme et la souris. En particulier, les phénotypes observés après délétion d’un grand nombre de gènes sont très similaires dans les deux espèces. De plus, il existe un ensemble d’outils qui ont été développés quasiment exclusivement chez la souris. Les souris sont injectées entre 4 à 5 semaines lorsque la gaine de myéline est mature.