Procédures légères

Maintenues en vie et rendues à leur troupeau à l'issue, 48 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. Pendant sept mois, elles subissent cinq séries de prélèvements de sang, de fèces et de jus de rumen, ce dernier par une sonde passée dans l'œsophage, sous contention. L'objectif déclaré est de mesurer l'effet de compléments alimentaires sur le méthane émis par les vaches, la production de lait et le microbiote du rumen. Jusqu'à 57 millilitres de sang sont prélevés en une fois, l'essai s'inscrivant dans les objectifs de décarbonation de l'élevage bovin.

Objectifs

L'objectif de cette expérimentation, menée chez la vache laitière avec des régimes à base d’ensilage d’herbe, est de mesurer les changements induits par la supplémentation de la ration avec des suppléments alimentaires anti-méthanogènes utilisés seuls ou en combinaison sur les émissions de méthane entérique, l'ingestion, la production laitière, la structure du microbiote ruminal. Un objectif secondaire consistera à confirmer ou identifier des prédicteurs biologiques plasmatiques, fécaux et ruminaux permettant de prédire les émissions de méthane.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de confirmer l'effet anti-méthanogène des 2 ingrédients utilisés seuls et tester l'additivité de leurs effets lorsqu'ils sont utilisés en combinaison sur les émissions de méthane entérique et les performances zootechniques de la vache laitière. Les mécanismes d'action des ingrédients utilisés seuls ou en combinaison sur le microbiote ruminal seront identifiés. Enfin, cet essai permettra d'implémenter des bases de données incluant - des phénotypes (tels que les émissions de méthane entérique) de bovins laitiers difficiles à mesurer sur le terrain avec des méthodes de référence et leurs prédicteurs (microbiens, fécaux, sanguins) issus de différentes matrices biologiques faciles d'accès sur le terrain et prélevées en simultané sur le même animal. Cet essai permettra la mesure simultanée de prédicteurs du méthane entérique sur 3 matrices biologiques disponibles en exploitation.

Procédures

Durant les 7 mois de l'expérimentation, 5 prélèvements de fécès, sang et de jus de rumen auront lieu en semaine 8, 12, 16, 21 et 25. Le volume de sang prélevé sera de 39 mL (semaines 8, 12 et 24) et de 57mL (semaine 16) , celui de fécès de 200 g et celui de jus de rumen de 400 mL.

Impact sur les animaux

Différents prélèvements relevant de procédures légéres (fécès, sang et jus de rumen) sont prévus tout au long de l'essai pour caractériser la réponse physiologique, métabolique et digestive des vaches laitières. Le prélèvement de jus de rumen sera réalisé par prélèvement gastro-oesophagien (PGO) et pourrait engendrer une légère iritation de l'oesophage. La prise de sang sera effectuée à la veine caudale et les prélèvements de fèces par défécation naturelle ou fouille rectale si besoin. Ces prélèvements seront réalisés en cage de contention et sont susceptibles d'induire de l'inconfort léger pendant la manipulation. La fréquence des prélèvements des 3 matrices (fécès, sang et jus de rumen) sera limitée au minimum nécessaire pour mesurer une cinétique d'action des ingrédients testés ainsi que leur effet de rémanence après arrêt de la distribution. Au total, les animaux seront prélevés 4 fois pendant l'essai qui durera 6 mois. La contention de l'animal pour les 4 prélèvements des 3 matrices durera 10 minutes maximum. "AJOUT : la version "MODIFICATION 2" la prolongation de l'expérimentation de 7 semaines implique une journée de prélèvement supplémentaire pour l'ensemble des animaux soit 2 contentions supplémentaires. Les animaux seront ainsi prélevés 5 fois au lieu de 4 durant l'essai."

Devenir

A l'issue de cette expérimentation, les 48 vaches laitières seront maintenues en vie et regagneront le troupeau de production, en vue d'être réutilisés dans d'autres projets si besoin.

Remplacement

La réponse concomittante de l'hôte et du microbiote ruminal aux ingrédients ne peut à ce jour être remplacée par aucune stratégie in vitro ou in sillico. L'un des objectifs du projet est d'identifier et de valider des indicateurs capables de prédire les émissions de méthane entérique. En conséquence, nous avons besoin d'une méthode de référence in-vivo (GreenFeed) pour construire des modèles de prédiction des émissions de méthane à partir de ces prédicteurs. À terme, ces prédicteurs pourront être proposés comme alternative aux méthodes de référence nécessaires en recherche et difficiles à utiliser sur le terrain. L'utilisation des techniques in-vitro pour étudier l'effet de l'additif sur la fermentation ruminale a été déjà réalisé et par conséquent nous avons besoin d'animaux expérimentaux pour confirmer les effets in-vivo.

Réduction

Pour cette expérimentation, 48 vaches laitières seront mobilisées et réparties en 4 lots soit 12 animaux par modalité. Ce chiffre est basé sur les résultats obtenus au préalable par notre équipe chez la vache laitière avec des régimes comparables . En effet, en considérant la variabilité entre animaux des émissions de méthane mesurées au GreenFeed, il faut entre 8 et 14 animaux dans chaque lot.

Raffinement

Les conditions de logement des animaux en stabulation répondent aux exigences réglementaires et les bâtiments sont dotés d'équipements pemettant un enrichissement du confort des bovins (brosses) et un suivi fin de leur santé et de leur bien-être (suivi de la température et de l'hygrométrie). Les procédures sont mises en oeuvre par du personnel formé et habilité à effectuer ces prélèvements ce qui assure que ceux-ci se feront dans les conditions mises en places pour le bien-être de l'animal. De plus, les fouilles rectales pour les prélèvements de fecès ne sont réalisées que si les animaux ne défèquent pas naturellement au moment de la collecte des fécès.

Choix des espèces

En France, l’agriculture représente 19% des émissions de gaz à effets de serre, dont près de la moitié provient des élevages bovins lait et viande. Les émissions de méthane entérique, coproduit de la digestion des polysaccharides par les ruminants, représentent environ 50% des émissions de gaz à effets de serre d’une exploitation bovine. Les élevages bovins lait et viande sont ainsi confrontés aux objectifs de décarbonation des activités. Le recours aux bovins laitiers dans cette expérimentation est directement justifié par les objectifs scientifiques du projet : l’étude des effets des inhibiteurs de méthane sur les performances laitières, les émissions entériques de méthane, ainsi que les caractéristiques du microbiote ruminal. Par conséquent, l’utilisation d’une autre espèce animale de ruminant introduirait des biais majeurs et réduirait considérablement la transposabilité et la pertinence des résultats. Les vaches laitières entreront en expérimentation après le pic de lactation (par lot de 8 vaches dès que la dernière d'entre elles aura atteint sa 8ème semaine après vêlage), c'est à dire au moment où les vaches retrouvent une stabilité métabolique après les fortes contraintes du début de lactation. Ceci permet des mesures moins variables des émissions de méthane et du microbiote ruminal, des performances zootechniques et éfficacité alimentaire. Les vaches en post-pic présentent une ingestion plus stable, un bilan énergétique plus équilibré et une production laitière toujours significative, rendant ce stade pertinent pour évaluer les effets de différents ingérdients anti-méthanogènes. De plus, cela permet de limiter les risques pour la santé et le bien-être des animaux, en évitant les périodes de forte mobilisation corporelle. Ce stade est donc scientifiquement pertinent et éthiquement justifié.

Deux millimètres de queue prélevés sur l'animal vigile, sous contention : 12 500 souris vont être utilisées dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. Le RNT présente ce projet comme un gain pour la réduction et le raffinement, après avoir écarté des méthodes non invasives jugées peu fiables. Pourtant l'élevage prévu pour ce seul génotypage porte sur 12 500 animaux. Les souris au génotype non recherché sont tuées, et pour certaines lignées les femelles le sont aussi, seuls les mâles reproducteurs étant gardés.

Objectifs

Les animaux génétiquement modifiés constituent des modèles puissants pour étudier la fonction des gènes et comprendre leur rôle dans le cadre de projets scientifiques au bénéfice de la santé humaine et animale ou de l’environnement. Dans le cadre des projets scientifiques utilisant des animaux à fins scientifiques, des modèles animaux génétiquement modifiés sont développés et élevés. Dans ce but, il est important d’avoir un élevage adapté et des animaux dont les caractéristiques génétiques sont bien déterminées pour constituer les lots expérimentaux et maintenir une production régulière et adaptée aux besoins. Il est donc nécessaire de caractériser les animaux génétiquement modifiés afin de sélectionner les animaux d’intérêt pour les procédures expérimentales de projets autorisés et ceux nécessaires au maintien des lignées. Nous avons testé des prélèvements par 3 méthodes non invasives à partir de follicules pileux, de fécès, ou via un écouvillonnage bucal. Elles ne sont pas adaptées à nos conditions de diagnostics de validation des génotypes, et manquent de fiabilité. Cela peut amener à des erreurs qui compromettraient les résultats obtenus et conduiraient à la nécessité de répéter des prélèvements sur les mêmes animaux ou à en utiliser un plus grand nombre, ce qui est en contradiction avec les principes de raffinement et de réduction. L’objectif de ce projet est une procédure de prélèvement par biopsie utilisée au sein de notre équipe pour la sélection des animaux, qui sera associée à une identification par pose d'une bague auriculaire. Les animaux produits seront utilisés sur des projets concernant la pathophysiologie de l'épilepsie, de la migraine ou de l’autisme.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de sélectionner les animaux pertinents pour les études scientifiques, afin d'optimiser la gestion de l'élevage et de fournir les animaux nécessaires aux projets de l'équipe.

Procédures

Prélèvement de 2 mm de l’extrémité de la queue (durée maximale : 5 secondes), réalisé une seule fois par animal vigile, sous contention.

Impact sur les animaux

Les nuisances engendrées sont le stress léger inhérent à la préhension et à la contention des animaux, la douleur légère lors du prélèvement sur la queue. Un saignement peut aussi apparaître et dans de très rares cas un rejet par la mère.

Devenir

Tous les animaux présentant le génotype d’intérêt et le sexe requis seront maintenus en vie à l’issue de cette procédure unique. Ils pourront être utilisés ultérieurement dans une procédure expérimentale relevant d’un projet autorisé, ou bien destinés au maintien de la lignée. Les animaux ne présentant pas le génotype recherché seront mis à mort. Pour certaines lignées, seuls les mâles reproducteurs seront conservés ; les animaux au génotype non recherché ainsi que les femelles seront mis à mort.

Remplacement

A ce jour, les techniques de prélèvements de tissus non invasives que nous avons testées n'ont pas données des résultats exploitables. Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux modèles génétiquement modifiés pour les différents projets de l'équipe.

Réduction

L’objectif est de produire uniquement le nombre d’animaux strictement nécessaire aux projets de recherche et au maintien des lignées, afin d’éviter toute production inutile. Pour cela : - seules les lignées utilisées sont maintenues en élevage, les autres sont conservées congelées ; l- les croisements sont organisés pour obtenir directement les caractéristiques génétiques recherchées et éviter la naissance d’animaux non utiles ; - lorsque c’est possible, des stratégies sont mises en place pour limiter les prélèvements ; - des réunions régulières permettent d’anticiper les besoins et d’adapter la production.

Raffinement

La méthode utilisée est éprouvée, précise, rapide et standardisée permettant de minimiser les nuisances causées aux animaux par leur manipulation et par le prélèvement lui-même. Une liste de points limites et d'actions correctives est utilisée

Choix des espèces

La souris est un mammifère très proche de l’être humain sur le plan biologique. Ces similitudes permettent de répondre à de nombreuses questions scientifiques et de mieux comprendre certaines maladies comme l’épilepsie, l’autisme ou la migraine. De nombreux outils génétiques ont été développés chez la souris pour étudier ces mécanismes. Les prélèvements à l’extrémité de la queue sont réalisés entre 13 et 28 jours après la naissance. À cet âge, la zone est encore peu développée, ce qui rend le prélèvement rapide, peu douloureux et associé à un risque de saignement très faible.

Réutilisés dans d'autres projets pour la plupart, 80 souris et 80 rats vont être utilisés dans une formation aux gestes techniques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit une contention et des gestes peu invasifs, prélèvement sanguin ou injection de sérum physiologique, avant de rejoindre un autre projet après avis vétérinaire. À chaque session, un rat et une souris sont tués pour un complément d'anatomie. Le porteur justifie le recours à l'animal vivant par le principe "jamais la première fois sur l'animal", après une phase sur mannequin en silicone.

Objectifs

Le projet consiste à former les personnels à la pratique de procédures expérimentales faiblement invasives sur des rongeurs. Il s’agit d’initier ces personnels aux techniques suivantes : Procédure 1 sur rat et souris : - préhension, contention, manipulation adaptées aux différentes procédures de routine ; - administration et prélèvements faiblement invasifs; - anesthésie - mise à mort (2 animaux) ; Procédure 2 sur souris : - démonstration d'imagerie du petit animal ; Procédure 3 sur souris : - démonstration de techniques d'études sur animaux vigiles : tests comportementaux, mesures de constantes biologiques. Les travaux pratiques sont précédés de cours théoriques où les avantages et inconvénients de chaque méthode sont discutés. De plus, sur la base du principe « jamais la première fois sur l’animal », les TP débutent par une approche sur des modèles silicone de rat et de souris avant de passer à l’animal.

Bénéfices attendus

Apprentissage des gestes techniques des personnels devant travailler sur des animaux afin de garantir un respect du bien-être des animaux.

Procédures

Prélèvement sanguin, une seule technique sera appliquée par animal : soit incision de la veine caudale chez la souris, soit ponction de la veine caudale chez le rat. Administration de sérum physiologique (50 µL)selon 3 modalités: sous-cutané, intra-péritonéale ou intraveineise par la veine caudale. 1 seul mode d'administration par abnimal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables peuvent être un stress physique ou thermique de courte durée, et une douleur de courte durée à l’endroit des injections, en effet les temps de manipulation des animaux seront limités à 2 minutes au maximum. De plus, en fonction du type d’administration, ou de prélèvement. Il peut y avoir formation d’oedèmes au niveau de la zone. Et dans le cas de certaine administration (iv caudal, musculaire) il peut y avoir nécrose du tissu. Dans tous les cas, il y a possibilité d’infection au niveau de la zone d’administration ou de prélèvement.

Devenir

Les animaux ne subissent que des procédures de gravité légère, ils sont gardés en vie et réutilisés, après avis du vétérinaire référent, dans d'autres projets. Lors de chaque session de formation 2 animaux, un rat et une souris, sont mis à mort pour permettre des compléments d'anantomie

Remplacement

Ce projet pratiqué sur l'animal ne peut être remplacé par d'autres méthodes expérimentales car ces méthodes de substitution (in vitro ou in silico) ne mimeraient pas les réactions complexes d’un animal vivant ou les résultats de la manipulation de ses tissus. Les gestes à acquérir imposent que l’animal soit vivant pour évaluer les critères de réussite.

Réduction

Le programme de formation a été conçu pour limiter au maximum le nombre d’animaux vivants utilisés, tout en garantissant une acquisition progressive, encadrée et validée des compétences techniques en expérimentation animale. La réduction repose sur une organisation pédagogique rigoureuse, une mutualisation des gestes sur un même animal

Raffinement

Le raffinement est obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, le suivi d’éventuel signes cliniques, l’utilisation d’anesthésiques et d’analgésiques quand nécessaire, la détermination des points limites et le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire. - Stratégie d'expérimentation pour réduire l'angoisse infligée et l'impact environnemental : les animaux bénéficient d'un enrichissement social et physique dans la zone d'hébergement. Les procédures seront réalisées sous des conditions d’anesthésie et d’analgésie adaptées. Le personnel en formation sera toujours sous la supervision d'une personne experte. On distinguera des critères de réussite et des critères de réalisation. • critères de réalisation : ce sont les consignes données que la personne en formation devra suivre pour être guidée dans la réalisation du geste et l’améliorer. • critères de réussite : ils correspondent aux différentes exigences en termes de résultats. Ces critères sont définis pour chaque geste à acquérir et sont validés par le vétérinaire et/ou le responsable de la formation.

Choix des espèces

La formation proposée est spécialisée rongeurs. Dans la mesure ou les souris et les rats représentent les modèles les plus utilisés en expérimentation animale, notre choix c'est porté sur ces 2 espèces. Les animaux utilisés sont tous adultes, en bonne santé, et sans maladie. Ce choix est important : les animaux adultes sont plus faciles à manipuler, leur taille permet de bien voir les gestes à effectuer, et cela correspond aux conditions réelles dans lesquelles les chercheurs travaillent. Souris adultes de 6 à 8 semaines (20-30g) afin d'avoir des animaux de taille suffisante pour faciliter la manipulation Rats adults de 6 à 8 semaines (150-200g) afin d'avoir des animaux de taille suffisante pour faciliter la manipulation

Pour maintenir neuf lignées de souris transgéniques, 11 040 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, avec une biopsie de la queue et un tatouage des coussinets réalisés sur l'animal vigile. L'objectif déclaré est de disposer d'assez d'animaux au bon génotype pour étudier des cellules embryonnaires liées à des maladies humaines. Le RNT ne précise pas comment ce chiffre de 11 040 se répartit entre les neuf lignées. Les souris au génotype recherché rejoignent d'autres projets, celles au génotype non voulu ou ayant servi à la reproduction sont tuées.

Objectifs

Ce projet a pour objectif le maintien des lignées de souris transgéniques permettant de mieux comprendre les mécanismes qui contrôlent le développement de tissus ou types cellulaires formés à partir d’une structure embryonnaire transitoire nommée la crête neurale. Des anomalies de développement ou de maintien de ces cellules conduisent à un certain de nombre de pathologies chez l’homme, dont les bases génétiques et physiopathologiques sont incomplètement caractérisées. Le maintien de neuf lignées transgéniques différentes permettra d’obtenir un nombre suffisant d’animaux d’intérêt pour mieux comprendre les bases génétiques de ces maladies et améliorer le diagnostic chez les patients.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est d’avoir un nombre suffisant d’animaux d’intérêt pour augmenter la connaissance scientifique sur la formation de tissus ou types cellulaires dérivés d’une structure appelée la crête neurale en condition physiologique ou pathologique.

Procédures

Les souriceaux seront identifiés par tatouage aux coussinets digitaux réalisé avec un système de micro-tatouage. La biopsie sera réalisée sur animaux vigiles en même temps que le tatouage (procédure qui dure moins de 30 secondes).

Impact sur les animaux

La contention, la biopsie et le tatouage peuvent provoquer un stress chez l’animal. La biopsie et la piqure du coussinet lors du tatouage peuvent provoquer une douleur légère de courte durée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort si leur génotype n’est pas celui attendu ou après accouplement, les autres seront utilisés dans des projets scientifiques.

Remplacement

Le recours à l’utilisation d’un modèle animal est indispensable afin de comprendre comment les mutations d’intérêts impactent le développement, le maintien des cellules et leurs interactions dans chaque organe.

Réduction

Les stratégies d’accouplements ont été calculées selon nos expériences antérieures pour générer un nombre suffisant d’animaux pour réaliser au mieux nos expériences.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans des cages contenant des enrichissements et en groupe social. Les souriceaux sont séparés de leur mère pendant 5 minutes maximum et sont surveillés après l’intervention pour vérifier qu’ils sont bien acceptés par leur mère.

Choix des espèces

Les mécanismes analysés sont très conservés entre l'homme et la souris. Le modèle animal permet donc d'étudier la fonction de chacun des gènes d'intérêt au cours du développement et dans des organes de choix (nerf sciatique, peau, intestin). De plus, il existe un ensemble d’outils qui ont été développés quasiment exclusivement chez la souris. Le tatouage des coussinets des phalanges est réalisé sur des souriceaux entre 7 et 10 jours. Le prélèvement caudal est fait en même temps pour permettre un génotypage avant le sevrage.

Toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes, 5 chèvres laitières de race Alpine chamoisée, séparées de leur petit avant leur arrivée au laboratoire, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Pour mesurer l'élimination de trois polluants agricoles ou industriels et leur passage dans le lait, chacune reçoit une injection initiale puis subit en 14 semaines 33 prises de sang, dont 18 par un cathéter laissé 24 heures, une sonde urinaire pendant 96 heures et une couche en tissu vidée toutes les 3 heures pendant 24 heures. La traite du matin et du soir, qui recueille le lait analysé, est présentée par le porteur comme "un soin aux animaux" plutôt qu'un geste expérimental. Les doses sont 20 à 162 fois inférieures aux limites toxiques selon les molécules et le porteur n'attend aucun effet toxique, mais il juge leur retour "dans le circuit de production" impossible et invoque le prélèvement d'organes pour justifier leur mise à mort.

Objectifs

L’alimentation animale est régie par des textes de loi encadrant les niveaux de polluants acceptables en vue de protéger la santé des animaux et la santé des humains consommant les produits animaux issus de ces élevages. Certaines molécules réglementées sont connues et étudiées mais le devenir de toutes les molécules n’est pas connu pour toutes les espèces concernées par les textes de loi. Dans ce cas le principe de précaution tend à utiliser des seuils de sécurité basés sur les connaissances acquises chez d’autres espèces ou à estimer certains paramètres inconnus depuis les paramètres physico-chimiques des molécules. Parmi ces molécules figurent des polluants agricoles ou industriels pouvant contaminer l’alimentation des chèvres laitières. Dans le cadre de la sécurisation de la chaîne alimentaire, le présent projet vise à évaluer le devenir de trois polluants agricoles ou industriels, à doses très faibles et démontrées comme non toxiques, dans l’organisme de chèvres laitières. En effet, la réglementation actuelle repose sur des données scientifiques adaptées d’études menées sur des rongeurs pour définir la vitesse d’élimination de ces composés. L’évaluation du risque d’exposition des animaux par l’ingestion d’aliments contaminés ne prend donc en compte ni les spécificités digestives et métaboliques des ruminants, ni la production de lait. De plus, le niveau de transfert vers le lait repose sur une estimation non étayée par des données expérimentales. L’évaluation du devenir des polluants dans l’organisme des animaux, de leurs excrétions dans l’urine et les fèces et du taux de transfert vers le lait chez l’espèce cible, la chèvre, permettrait d’actualiser et d’argumenter les recommandations réglementaires actuelles tout en sécurisant la consommation des produits animaux issus de cette filière (viande, lait et produits laitiers).

Bénéfices attendus

Les résultats attendus permettront d’obtenir des données réelles, permettant de comprendre le devenir de trois polluants agricoles et industriels chez la chèvre, ainsi que des indicateurs du niveau de transfert vers le lait. Ces connaissances seront donc obtenues pour des molécules et des animaux rarement étudiés ensemble alors même que les seuils réglementaires des dites molécules sont appliquées au lait issu de ces animaux. En d’autres termes, les données générées seront de nature inédite et permettront de faire le point sur le devenir de trois molécules présentant des limites maximales de résidus (LMR, calculant le niveau maximal de polluant admissible pour assurer la sécurité des consommateurs des produits animaux) fixées pour les produits issus des petits ruminants sur la base de données, actuellement principalement obtenues chez des animaux monogastriques (pouvant grandement différer des petits ruminants sur le plan physiologique). Les données obtenues permettront de confirmer les estimations théoriques du transfert de ces molécules vers des produits animaux pris en compte dans le calcul des LMR.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux types de gestes techniques : - Les injections et prélèvements nécessitant d’utiliser une aiguille (1 injection et 33 prélèvements répartis sur les 14 semaines de procédure). Les prélèvements ne durent pas plus d’une trentaine de seconde et se pratiquent sur les animaux vigiles habitués. La pose d’un cathéter sur une durée de 24 heures sera réalisée afin de limiter le nombre de piqûres requises sur une courte période. L’injection initiale et les 18 premiers prélèvements seront réalisés avec une seule piqure, faite pour poser le cathéter qui restera en place sur une durée de 24 heures. Par la suite, 15 autres prises de sang, réparties sur le restant de la durée de la procédure, seront réalisées avec une aiguille sur une durée d’une trentaine de seconde par prise de sang. - Les prélèvements d’urines seront réalisés par la pose de sondes urinaires sur une durée de 96h. La récupération des fèces sur une durée de 24h sera réalisée par la pose de couches en tissu vidées périodiquement toutes les 3h. Le lait sera récolté lors de la traite, réalisée matin et soir, ne constituant pas à proprement un geste technique expérimental mais plutôt un soin aux animaux permettant également l’obtention de données de recherche.

Impact sur les animaux

Trois nuisances et stress ont été identifiés comme possibles durant l’expérimentation : - La douleur (celle d’une piqûre par une aiguille) : suite à la ponction par aiguilles pour les prélèvements sanguins sur animal vigile (cathéter ou prise de sang). - Le stress : lié à la manipulation et la contention lors des différents prélèvements (sang, urine, fèces), - La gêne occasionnée par la pose et le port d’une sonde urinaire et d’une couche en tissu. En revanche, la dose de chaque contaminant employée est calculée pour être très en deçà des seuils de toxicité reconnus. Aucun effet toxique, effet indésirable ou altération comportementale ne sont donc attendus suite à l’exposition des animaux aux polluants organiques étudiés.

Devenir

La mise à mort des animaux est ici justifiée pour l’étude de paramètres nécessitant de récupérer des organes après la phase expérimentale. Les animaux ayant, de plus, été exposés à des polluants même 20 à 162 fois inférieures aux limites toxiques en fonction des molécules, leur réhabilitation dans le circuit de production n’est pas possible.

Remplacement

La contamination (et décontamination) des chèvres laitières et le transfert des polluants vers le lait est un champ d’étude qui est encore peu étudié aujourd’hui et dont l’approche est rendue complexe en raison des spécificités de la physiologie des ruminants et des pratiques d’élevage mises en œuvre. Ces interactions « ruminants-polluants » doivent être abordées chez l’animal dans la mesure où (i) nous ne connaissons pas le devenir spécifique des 3 molécules cibles chez les chèvres laitières (ii) nous ne disposons pas de modèle cellulaire ou informatique validé chez ces animaux et (iii) il n’existe pas à ce jour de modèle mathématique adéquat permettant de simuler le devenir des contaminants dans l’organisme chez ce type d'animal. Cependant, les résultats de ce projet permettront de collecter des données susceptibles de mener à la création d’un modèle de transfert de trois molécules chez la chèvre laitière, ce qui permettra à termes de remplacer l’utilisation d’animaux dans ce type d’étude en cas, par exemple, d’un changement de dose ou de fréquence d’exposition. Cela pourra également donner lieu à d’éventuelles applications pour d’autres ruminants tel que la brebis laitière.

Réduction

Les animaux en expérimentation seront réduits au stricte nécessaire (n = 5). Cet effectif est suffisant pour obtenir des données fiables dans la mesure ou nous souhaitons prendre en compte la variabilité biologique de l’espèce. De plus, la nature des analyses menées et la très faible dose des composés utilisés permet de garder les mêmes animaux pour les différentes phases de recherche, réduisant donc de quatre fois l’effectif total d’animaux utilisés tout en permettant une analyse plus fine des données obtenues.

Raffinement

Les interventions sur les animaux seront limitées à des prises de sang de volumes réduit, à une pose de sonde urinaire et à des collectes ponctuelles de fèces. Les animaux, ayant un comportement social, seront hébergés en groupe dans une même pièce. Ils pourront donc se toucher, se voir, se sentir et s'entendre. Des filets de foin seront positionnés dans le box pour favoriser la recherche de nourriture et enrichir le milieu. Un nœud de corde de chanvre en guise de jouet (type balle) sera mis à disposition dans le box. Les animaux seront habitués à la présence quotidienne des expérimentateurs pour développer une relation sociale routinière avec l’Homme, et entraînés progressivement aux gestes techniques pratiqués afin de limiter leur stress. Leur comportement sera suivi quotidiennement pour détecter d’éventuels signes de stress excessif et le poids des animaux sera suivi de manière hebdomadaire afin de contrôler l’état corporel des animaux par des données quantifiables en supplément des observations directes.

Choix des espèces

Ce projet concerne des molécules retrouvées dans l’alimentation de caprins, pour qui des données spécifiques ne sont pas disponibles, les données existantes ayants été obtenues chez des espèces monogastriques. Ainsi les paramètres pharmacocinétiques (permettant de caractériser la distributiondes composés dans l’organisme, leur stockage dans différents tissus et leur élimination vers les selles ou les urines) et le taux de transfert vers le lait des trois polluants agricoles ou industriels visés ne peuvent être fiables qu’avec une observation des molécules chez l’espèce cible concernée. La race Alpine chamoisée (laitière) a été choisie en raison de son potentiel de production et de sa représentativité des élevages laitiers français. Le projet met en œuvre des animaux en lactation (arrivés au laboratoire après séparation du petit). Ces animaux seront donc des femelles adultes avec un poids pouvant varier de 60 à 75 kg.

Pour savoir si une exposition à des fongicides agricoles pendant la grossesse altère le développement du cerveau des descendants et les organes des mères, des souris gestantes sont gavées une fois par jour pendant 7 semaines. 180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses de leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. 72 souris reçoivent à l'âge de 7 semaines une puce sous la peau, sous anesthésie, puis enchaînent des tests d'anxiété, de fonctions sensori-motrices, de coordination, de force et d'interactions sociales, 32 heures d'enregistrement de leur activité circadienne et jusqu'à deux semaines de tests quotidiens d'apprentissage et de mémoire, et certaines subissent une ou deux prises de sang éveillées. Le fongicide n'est pas nommé, la dose n'est pas précisée, et les tests ne sont désignés que par la fonction qu'ils évaluent.

Objectifs

Ce projet cherche à comprendre comment l’exposition à des fongicides (utilisés dans le milieu agricole) pendant la grossesse pourrait affecter le développement du cerveau des descendants et les différents organes des mères. Pour cela, nous utiliserons des femelles gestantes et leurs descendants et nous étudierons leur comportement, leur motricité et leurs capacités cognitives, tout en analysant les modifications biologiques observées dans les zones du cerveau concernées.

Bénéfices attendus

L'objectif est de comprendre comment l'exposition à ces fongicides peut causer des problèmes de comportement, de motricité et de cognition, dans un modèle murin qui reproduit/mime fidèlement les effets potentiels chez l'Homme. Ces résultats pourraient permettre d'améliorer les tests de sécurité avant que ces fongicides ne soient commercialisés.

Procédures

Des femelles gestantes seront soumises à des gavages pendant 7 semaines (30 secondes par gavage 1 fois par jour). 72 animaux seront soumis à une chirurgie mini-invasive à l’âge de 7 semaines pour l'insertion d’une puce radio-fréquence sous la peau (5 min sous anesthésie gazeuse avec un anti-douleur local). Ces animaux seront également soumis à des tests comportementaux permettant d’évaluer l’anxiété (5 minutes, deux fois par animal), les fonctions sensori-motrices (30 minutes, deux fois par animal), la coordination motrice (deux tests de 5 minutes chacun, deux fois par animal), l’apprentissage et la mémoire (un test de 30 minutes, une fois par animal, ainsi qu’un test de moins d’une heure par jour pendant deux semaines), la force musculaire (5 minutes, une fois par animal), l’activité circadienne (32 heures, une fois par animal) et les interactions sociales (50 minutes, une fois par animal). MODIFICATION 2 : Dans le cadre de cette procédure, un ou deux prélèvements de sang, selon le groupe d’animaux, seront réalisés sur certains animaux au plus tôt à 7 semaines d'âges et jusqu’à 18 semaines. Ce geste dure environ une minute.

Impact sur les animaux

Le gavage par contention peut entrainer un léger stress et une irritation de l'oesophage. La chirurgie mini-invasive entrainera une légère douleur. L'accumulation des tests de comportement pourrait induire un stress léger. MODIFICATION 2 : Le prélèvement sanguin sera réalisé sur un animal vigile, ce qui pourrait induire un stress.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Le projet vise à évaluer l'impact d'une exposition périnatale à un fongicide sur le développement embryonnaire et neurodéveloppemental. Ceci n'est modélisable que dans un organisme complet à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologiques de régulations. Il n'existe actuellement pas de méthode alternative pour modéliser les analyses effectuées dans ce projet. Bien que des études aient été réalisées au préalable dans d’autres modèles animaux (poisson zèbre, xénope, ver C. elegans), le modèle murin est idéal pour étudier l’impact d’un fongicide sur le neurodéveloppement chez les mammifères en raison de leur similarité biologique avec l’humain et de leur développement rapide.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été determiné au fur et à mesure de notre expérience. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 12 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction du nombre d'animaux utilisés. Durant cette étude, nous allons générer des données qui seront analysées à l'aide de tests statistiques. Nous avons aussi conçu notre protocole afin d'utiliser une seule cohorte d'animaux qui suivra un ensemble de tests, afin de réduire autant que possible les animaux employés pour répondre à notre problématique scientifique.

Raffinement

Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe), ce qui permettra de réduire le stress et de limiter au maximum la souffrance animale. Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Une surveillance quotidienne de l'état des animaux, une pesée quotidienne lors du gavage et hebdomadaire pour les animaux expérimentaux ainsi que la mise en place d'un suivi régulier de l'état général des animaux seront mis en place afin de s'assurer de la bonne santé de ceux-ci. Des points limites adaptés ainsi qu'un arbre décisionnel d'arrêt des souffrances a été mis en place. Lors de la pose de puce radiofréquence nécessaire au suivi des animaux, une anesthésie et une analgésie seront mises en place pour prévenir tout stress et douleur. MODIFICATION : De plus, nous avons ajouté une étude pilote (PE3) dans le but de vérifier que le gavage pendant la gestation et la lactation n'affecte pas la gestation ni la survie des portées, et que l'administration du fongicide permet une gestation normale ainsi qu'une bonne survie des portées. Si nous devions constater un impact important sur cette étude pilote, le projet serait suspendu afin d’adapter la suite des procédures expérimentales (PE1 et PE2). MODIFICATION 2 : Dans la cadre d’un prélèvement de sang, les dispositions suivantes seront prises pour améliorer la récupération : un temps de récupération sur plaque chauffante, une injection de NaCl 0,9% (sérum physiologique) chauffé à la température de 37°C du volume équivalent au volume de sang prélevé sera réalisée.

Choix des espèces

Les souris sont un modèle idéal pour étudier l’impact d’un fongicide sur le neurodéveloppement en raison de leur similarité biologique avec l’humain et de leur développement rapide. Leur homogénéité génétique permet des résultats fiables, et leur utilisation facilite le contrôle des expositions à différentes phases critiques. De plus, elles offrent des réponses physiologiques et comportementales pertinentes pour évaluer la toxicité. Une partie des animaux seront traités lors de la gestation et de la lactation et seront utilisés à 8 semaines. Les souris issues de cette gestation seront analysés à partir de 3 semaines d'âge jusqu'a 18 semaines.

Pour valider des aliments amaigrissants avant leur commercialisation, 54 chiens sont utilisés dans une étude de comportement alimentaire d'un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent pendant deux à trois semaines des produits dont certaines formulations peuvent provoquer diarrhées, vomissements ou inconfort digestif. Chaque chien peut être utilisé jusqu'à dix fois sur cinq ans, avant d'être adopté à l'âge de la retraite fixé à huit ans. Le porteur indique que ces essais servent aussi à justifier les allégations de bénéfices apposées sur les emballages des produits.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de valider de nouveaux aliments dont le but est de rassasier (effet de satiété) des chiens qui sont en surpoids ou obèses. Ces nouveaux aliments seront prescrits pour entrainer une perte de poids, afin que le chien retourne à son poids de forme. Pour développer ces aliments, nous avons besoin d’identifier les critères de satiété afin d'assurer la validation des produits développés avant leur mise sur le marché ainsi que la formulation de ces produits pour répondre au plus près aux préférences alimentaires des chiens. Ce projet permet donc la mise en place de protocoles de recherches pour trouver de nouveaux facteurs de satiété mais aussi pour justifier scientifiquement les bénéfices produits qui sont apposés sur les emballages.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra (i) d'augmenter nos connaissances sur les besoins nutritionnels et le comportement alimentaire des chiens, (ii) de formuler des produits au plus près des besoins des chiens et (iii) d'identifier de nouvelles solutions nutritionnelles à effet rassasiant pour aider à lutter contre l'obésité, ceci via l'évaluation de nouvelles formules, de nouveaux ingrédients ou la validation de nouveaux fournisseurs. Ce projet nous permettra également de générer des données nécessaires à l'enregistrement de ces produits dans certains pays.

Procédures

Ce projet concerne uniquement des mesures de consommation et l'étude du comportement alimentaire. Selon le nombre de produits alimentaires testé (2 ou 3), la participation des chiens sera de 2 semaines pour 2 produits testés ou 3 semaines pour 3 produits testés. Un animal pourra être utilisé au maximum 2 fois la même année. Donc sur une durée de 5 ans, le nombre d'interventions sur un même animal ne pourra pas dépasser le nombre de 10. 

Impact sur les animaux

Les aliments à évaluer sont formulés pour ne pas être mauvais pour la santé des animaux, mais il est possible que certaines formulations entraînent des symptômes digestifs modérés (diarrhée, vomissements, inconfort digestif) ainsi qu'une prise de poids rapide. Il s'agit soit de produits commerciaux conformes à la réglementation sur la sécurité alimentaire, soit de prototypes dont les matières premières et les doses sont évaluées par des formulateurs, des nutritionnistes et des toxicologues pour s'assurer que les doses utilisées ne sont pas toxiques. Avant d'être donnés aux animaux, des analyses complètes nutritionnelles et bactériologiques sont effectuées sur les aliments après chaque fabrication.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie et recevront un suivi vétérinaire et des soins adaptés à leur état de santé. Les animaux ne sont pas adoptés directement à la fin de ce projet et comme décrit plus haut, sont utilisés dans d’autres projets, ou pour des observations de comportement alimentaire n’entrant pas dans le cadre de saisine. Ils sont par contre tous adoptés une fois l’âge de la retraite atteint, soit 8 ans.

Remplacement

Chaque espèce animale possède son propre métabolisme, il est donc important d’utiliser les espèces auxquelles les aliments sont destinés. A ce jour il n'existe pas de modèle qui puisse tester le fait qu'un aliment permette de rassasier le chien. Il faut donc passer par des essais in vivo au cours desquels les chiens reçoivent l’aliment à évaluer. Une connaissance approfondie de nos formules et de nos matières premières nous permet d'anticiper la performance de certaines formules ce qui permet de limiter le nombre d'essais animaux à effectuer.

Réduction

Le nombre minimum de chiens requis pour évaluer de façon fiable l'effet rassasiant d'un aliment est de 10 animaux par aliment à tester. Ce nombre, qui est issu de nos données internes, correspond également au minimum imposé par les autorités de certains pays pour valider l’enregistrement de produits. En dessous de ce nombre (n=10 par groupe), les résultats peuvent être incertains et ne permettraient pas de conclure avec certitude sur les résultats obtenus.

Raffinement

Ce protocole pourrait entrainer de légers inconforts sur le plan digestif mais les animaux bénéficient d'un plan de suivi vétérinaire optimal (examens réguliers, vétérinaire sur site), sont examinés quotidiennement par les techniciens animaliers, et ont des sorties quotidiennes d'exercice et de socialisation. Selon leur taille, les chiens vivent soit dans leur pièce collective (petits chiens) soit dans leur box individuel (moyens et grands chiens). Ces pièces comprennent une partie intérieure et extérieure. De plus, les animaux reçoivent une formation qui comporte une partie centrée sur l’habituation au système de nourrissage (blocs-balances) afin de minimiser le stress. Un suivi comportemental est également effectué par des observations quotidiennes et une évaluation semestrielle. Tout ceci permet de minimiser toute douleur ou souffrance qui pourrait être liées au protocole. Pour s'assurer que les aliments évalués ne sont pas mauvais pour la santé des animaux, nous leur distribuons soit des aliments commerciaux conformes aux normes de sécurité alimentaire, soit des prototypes validés par des formulateurs, nutritionnistes et toxicologues. Des analyses nutritionnelles et bactériologiques sont réalisées après chaque fabrication pour s'assurer de la conformité des aliments distribués. Dans le cas où certaines formulations entraînent des symptômes digestifs modérés (diarrhée, vomissements), l'intensité de ces symptômes pourra entraîner une exclusion des animaux concernés (qui recevront des soins vétérinaires) voire un arrêt de la procédure si les points limites sont atteints. De même, dans le cas où un animal prendrait du poids suite à ce protocole, un régime adapté serait mis en place dès sa sortie du protocole pour qu'il puisse retrouver son poids de forme.

Choix des espèces

Chaque espèce animale possède son propre métabolisme, ses propres performances digestives, ainsi que ses propres préférences alimentaires pour un aliment donné. Il est donc important d’utiliser les espèces auxquelles les aliments sont destinés. A ce jour il n'existe pas de modèle qui puisse tester le fait qu'un aliment permette de rassasier le chien ou même d'en prédire sa bonne consommation. Il faut donc passer par des essais in vivo au cours desquels les chiens reçoivent la formulation à évaluer. Pour ce projet, nous sélectionnons des animaux au stade adulte car les aliments formulés pour un effet rassasiant et à visée de perte de poids ne sont pas adaptés à des animaux en croissance.