Procédures légères
Etude du rôle d’Arhgef18 dans la biologie endothéliale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
420 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. Certaines reçoivent dès la naissance trois injections dans l'estomac ou l'abdomen en trois jours, d'autres, adultes, dix injections abdominales de tamoxifène en deux semaines. Une partie subit ensuite une prise de sang derrière l'œil et des mesures de pression artérielle par brassard sur la queue, après deux semaines d'accoutumance. Le projet doit établir le rôle d'une protéine des vaisseaux, ARHGEF18, et renvoie au long terme les retombées annoncées, de nouveaux médicaments contre l'anévrisme intracrânien. Des souriceaux sont tués à six et à quatorze jours de vie pour l'analyse de leur rétine.
Objectifs
La physiologie vasculaire est fortement influencée par la circulation sanguine qui génère des contraintes mécaniques variables sur la paroi des vaisseaux. Les artères sont principalement soumises à un fort flux sanguin générant de fortes contraintes de cisaillement sur les cellules endothéliales tapissant l’intérieur des vaisseaux. Ces contraintes participent à la production de facteurs vaso-actifs et à la quiescence des cellules endothéliales. Une modification de ces contraintes ou une perte de sensibilité des cellules endothéliales impactent la fonction de ces dernières. Aujourd’hui il est reconnu que les contraintes de cisaillements participent à certains processus développementaux et leur modification ou mauvaise perception par les cellules endothéliales contribue à de nombreuses pathologies cardiovasculaires comme l’athérosclérose ou l’anévrisme intracrânien. Mieux comprendre comment les cellules endothéliales perçoivent ces forces contribue, à terme, à l’identification de nouveaux axes de recherche pour prévenir, détecter et traiter les maladies cardiovasculaires. Grâce au travail réalisé in vitro, nous avons identifié une protéine mécano-sensible, ARHGEF18, contrôlant différentes fonctions endothéliales : l’adhésion, la prolifération et l’inflammation. Maintenant que nous avons déterminé la pertinence d’ARHGEF18 in vitro, nous souhaitons comprendre son rôle dans un système intégré plus complexe. Cela nous permettra de valider son impact sur les fonctions identifiées in vitro et d’identifier sa contribution exacte dans la physiologie vasculaire.
Bénéfices attendus
La rupture d'un anévrisme intracrânien, responsable de ~36 000 cas d'hémorragie sous-arachnoïdienne dans la communauté européenne, est l'une des principales causes de mort subite chez les jeunes sujets "sains" (pic d'âge entre 50 et 60 ans) avec un impact socio-économique considérable. Actuellement, il n'existe pas d'outils diagnostiques permettant de prédire le devenir d'un anévrisme intracrânien chez un individu donné, ni de médicaments permettant de limiter ou de prévenir la croissance de l'anévrisme intracrânien et sa progression vers la rupture. Les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l'initiation, de la croissance et de la rupture d'un anévrisme intracrânien sont encore inconnus. Malheureusement, il n'y a que peu de laboratoires travaillant sur la physiopathologie de l'anévrisme intracrânien. Le projet pour lequel cette saisine est déposée contribuera à répondre au besoin urgent d'améliorer la prise en charge des personnes atteintes d'anévrisme intracrânien. En identifiant le rôle d’ARHGEF18 dans la réponse aux forces mécaniques des artères cérébrales, ce projet facilitera la découverte de cibles thérapeutiques pertinentes pour prévenir la progression de la maladie, diminuer le risque de rupture et optimiser l'évaluation du risque pronostique pour prévenir les hémorragies aiguës. Les résultats obtenus pourront donc avoir un impact spécifique à long terme en ouvrant de nouvelles voies pour le développement de nouveaux médicaments. Une des perspectives de ce projet est le développement de nouveaux modulateurs pharmacologiques ciblant ARHGEF18 ou les voies de signalisation associées. Les résultats générés auront également, à long terme, un impact sociétal. De nos jours, la rupture d'anévrisme intracrânien est redoutée parce qu'elle est une cause de mort subite, et parce qu'elle survient sans symptômes cliniques préalables. La plupart des diagnostics sont faits sur la base de découvertes fortuites suite à une IRM. Les patients diagnostiqués savent qu'ils ne disposent d'aucun traitement préventif et non invasif. Par conséquent, ces patients vivent avec un stress permanent. Faciliter le diagnostic et offrir une perspective de traitement pharmacologique à ces patients soulagera leur anxiété et leur détresse.
Procédures
Procédure 1: injection intra-gastrique ou intra-péritonéale chez le nouveau-né: 3 injections sur 3 jours. Chaque injection dure moins d'une minute par animal. Procédure 2: injection intra-péritonéale chez l'adulte: 5 injections/semaine sur 2 semaines (cad 1injection IP/jour/5j/2semaines, à raison d'une minute par injection et par souris). Procédure 3: prélèvement rétro-orbitaire chez l'adulte. Le prélèvement est réalisé une seule fois et ne dure pas plus de 5 minutes. Procédure 4: prise de pression artérielle systolique chez l'adulte (tail cuff). 2 semaines d'acclimatation + 3 mesures définitives. Chaque cycle de mesures dure en moyenne une vintaine de minutes.
Impact sur les animaux
Les procédures liées à ce projet sont réalisées en routine dans le laboratoire par du personnel qualifié. Nous n'attendons pas, à priori, de nuisances particulières. Toutefois, les risques potentiels sont: Injection de tamoxifen: les injections intrapéritoéales répétées (2x5jours) peuvent entrainer une irritation au site d'injection. C'est pourquoi une alternance Droite/Gauche est prévue, pour palier à ce problème. Prélèvement rétro-orbital: une douleur post-prélèvement peut survenir, c'est pourquoi un analgésique local à base de lidocaïne est appliqué après le prélèvement.
Devenir
Procédure 1: Lot 0: mis à mort après la fin d'entrainement Lot 1 : jusqu’à 6 jours de vie pour analyse de la rétine par immunofluorescence Lot 2 : jusqu’à 14 jours de vie pour analyse de la rétine par immunofluorescence Lot 3 : jusqu’à 10 semaines de vie pour prélèvement d'organes (culture cellulaire) Lot 4 : seront utilisés pour la procédure 3 et 4. Procédure 2: Lot 5 : jusqu’à 10 semaines de vie pour prélèvement d'organes (culture cellulaire). Lot 6 : seront utilisés pour la procédure 3 et 4 Procédure 3: Lot 4 et Lot 6 entièrement pour la procédure 4. Procédure 4: Mise à mort des Lots 4 et 6 pour prélèvement d'organes en vue d'analyse histologique.
Remplacement
Réutilisation : Les mêmes animaux serviront pour la prise de pression et le prélèvement sanguin. Il est impossible de réutiliser les animaux des groupes de prise de pression et de prise de sang pour l’isolation des cellules endothéliales car ces animaux seront trop vieux au moment de leur euthanasie et leur cerveau sera utilisé pour des marquages immunofluorescents. Réduction : Le modèle et les techniques seront mis en place par des personnes ayant déjà plusieurs années d’expérience ce qui permettra la réduction du nombre d’animaux utilisés. Aucune étape de mise au point n’est nécessaire pour les procédures décrites. Raffinement : Toutes les procédures seront réalisées avec les analgésiques adéquates dès que nécessaire.
Réduction
Réutilisation : Les mêmes animaux serviront pour la prise de pression et le prélèvement sanguin. Il est impossible de réutiliser les animaux des groupes de prise de pression et de prise de sang pour l’isolation des cellules endothéliales car ces animaux seront trop vieux au moment de leur euthanasie et leur cerveau sera utilisé pour des marquages immunofluorescents. Réduction : Le modèle et les techniques seront mis en place par des personnes ayant déjà plusieurs années d’expérience ce qui permettra la réduction du nombre d’animaux utilisés. Aucune étape de mise au point n’est nécessaire pour les procédures décrites.
Raffinement
Raffinement : Toutes les procédures seront réalisées avec les analgésiques adéquates dès que nécessaire.
Choix des espèces
Le modèle murin est le seul permettant la délétion inductible et tissu-spécifique de la protéine étudiée ainsi que la complexité nécessaire pour l’étude du rôle de la protéine sur le fonctionnement du système cardiovasculaire. Le but de cette saisine est d’établir le rôle d’ARHGEF18 dans le développement vasculaire et son homéostasie. Par conséquent, la recombinaison chez les animaux sera faite à deux stades : post-natal (procédure 1) ou à l’âge adulte (procédure 2). Pour la partie développementale, les animaux seront utilisés à P6 et P14. Pour la partie homéostasie vasculaire qui s’étudie à l’âge adulte, les souris seront utilisées entre 7 et 13 semaines (procédures 3 et 4).
Cycle hormonal et déficits de reconnaissance chez des souris modèles de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées par dislocation ou par perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde, pour que leur cerveau soit prélevé et analysé, 692 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ces souris portent, à la place de leurs propres gènes, deux gènes humains dont l'un présente deux mutations familiales de la maladie d'Alzheimer. Les femelles subissent des frottis vaginaux, les souris passent des tests de reconnaissance d'objet après 24 heures et d'association objet-place, jusqu'à 60 d'entre elles sont isolées quatre jours en cage individuelle, d'autres sont transportées pour des IRM à 2, 4 et 12 mois. Le porteur affirme que l'étude de ces lignées est "encore indispensable", tout en écrivant que "les souris ne développent pas la MA".
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) est caractérisée par des pertes de mémoire et par la pathologie tau et la pathologie amyloïde qui sont liées respectivement à des formes de la protéine tau et de la protéine amyloïde anormalement aggrégées dans le cerveau. L’APP est la protéine précurseur du peptide amyloïde. Les modèles rongeurs actuels surexpriment des gènes humains de l’APP avec des mutations rares provoquant la MA (formes familiales) et/ou des gènes mutés de tau qui ne sont pas associés à la MA mais qui provoquent une pathologie tau. La présence de pathologies tau et amyloïde chez ces animaux ont permis des progrès dans la compréhension de la MA, mais la surexpression de l’APP et/ou de tau provoque aussi d’autres effets qui ne se retrouvent pas dans la MA. Les souris double knock-in (dKI) AppNL F/MAPT évitent ces effets car elles ont un gène de l’APP humanisé avec deux mutations familiales humaines (Swedish et Iberian : AppNL,F) et le gène humain normal de tau (MAPT) au lieu des mêmes gènes chez la souris. En analysant la mémoire de nos souris dKI de l’âge de 2 à 6 mois, nous avons découvert que les femelles dKI ne parviennent plus à reconnaitre un objet après un délai de 24h (test RO24h) dès l’âge de 2 mois. De plus, elles n’ont pas de bons résultats dans un test de changement de la règle dans un labyrinthe, contrairement aux mâles dKI. Or ces deux tests dépendent du dialogue entre deux structures du cerveau, l’hippocampe (HC) et le cortex préfrontal (CPF). Ces résultats sont cohérents avec une étude montrant une altération de la connectivité HC-CPF plus marquée chez les femmes que chez les hommes en début de MA. Une perturbation des rythmes veille/sommeil, comme celle observée chez le patient, peut perturber le dialogue HC-CPF. A 4 mois, les dKI des deux sexes oublient rapidemment une association objet-place (OiP). Cette forme de mémoire dépend du dialogue HC-cortex entorhinal latéral (CEL). Elle est atteinte chez des personnes âgées des deux sexes et c’est un signe précurseur de la MA. En conclusion, chez les souris dKI de 4 mois, la voie CEL-HC semble affectée chez les deux sexes, tandis que les femelles semblent affectées en plus et plus tôt sur la voie HC-CPF. Les souris dKI sont les premières à montrer une perturbation aussi précoce et aussi proche de celle trouvée en phase préclinique des patientes développant une MA. Le but de ce projet est de comprendre l’origine de cette vulnérabilité féminine dans la pathologie Alzheimer.
Bénéfices attendus
L’objectif du projet est de mieux comprendre l’origine de la vulnérabilité féminine dans les premiers stades de la MA. Il est important d’explorer le rôle des oestrogènes car le développement de la MA a maints fois été attribué à la baisse marquée de production d’œstrogènes privant ainsi le cerveau d’un puissant neuroprotecteur contre les pathologies amyloïde et tau. Ici, nous analyserons chaque étape clé de l’implication des œstrogènes dans les processus de mémoire affectés chez les dKI femelles dès les premiers signes de la pathologie. Si nous découvrons une altération d’une ou plusieurs étapes, cela aidera à la compréhension de cette vulnérabilité féminine et révèlera des cibles intéressantes pour mettre au point des tests de diagnostique précoce et/ou de traitements adaptés à la femme. Cette démarche s’insère dans la statégie actuelle de développement d’une médecine personalisée. Le projet décrit ici ne représente que l’approche fondamentale développée dans un vaste. Ce programme inclue aussi des approches translationnelles en utilisant des techniques applicables à l’Homme : investigations en IRM (IRM fonctionnelle, tractographie, …), en électroencéphalographie à haute densité (EEGhd) et en biologie des rythmes (évaluation comportementale du fonctionnement de l’horloge circadienne). De plus, après adaptation et validation des tests de RO24h et OiP à l’Homme, ils pourront être intégrés dans des évaluations neuropsychologiques pour un dépistage. En conclusion, le programme dans son ensemble aborde certes les cibles neurobiologiques (présente saisine) qui seront utiles à long terme, mais il ouvre également des perspectives à moyen terme pour le développement d’outils de diagnostique par IRM, par EEGhd et par de nouveaux tests neuropsychologiques. Les résultats de notre étude bénéficieront d’abord à l’Homme puisque les souris ne développent pas la MA. Néanmoins, certains animaux de compagnie (chien, octodon) ou sauvages (microcèbe, ours blanc) développent une pathologie rappelant la MA avec pathologie amyloïdes et tau. Au mois deux de ces espèces (octodon ; microcèbe) possèdent un gène de risque génétique majeur pour la MA (APOE4). Chez l’Homme, l’APOE4 peut multiplier par 10 le risque de développer une MA. Il est donc tout à fait envisageable que les progrès réalisés dans le domaine de la MA en termes de dépistage et de traitement pourraient être adaptés à des pathologies proches chez l’animal, puis intégrée dans une approche vétérinaire.
Procédures
Procédure 1 modérée: 4 groupes de souris (de génotype et sexe différents, maximum 60 au total) sont mises dans des cages individuelles placées côte à côte sur une étagère munie de détecteur de mouvement (petites cellules de détection) pour mesurer leur activité locomotrice sur 4 jours. Malgré la proximité de leur congénères, cette séparation transitoire pourrait générer un stress modéré, mais transitoire. Les autres procédures sont légères pour les 632 souris restantes. Elles comportent 1) la réalisation de frottis vaginaux sur les femelles (dépôt d’une goutte à l’entrée du vagin puis réaspiration) par une expérimentatrice maitrisant la technique en douceur, 2) la passation d’un ou deux tests d’exploration d’objet (éventuellement à 2, 4 et 12 mois) basés sur l’exploration spontanée de deux objets disposés dans un environnement rendu familier par une habituation (10 min) préalable avec leur groupe social. Le lendemain chaque souris passera seule deux à trois fois dans l’enceinte en présence de 2 ou 4 objets selon le test (10 min environ de pause entre chaque passage de 8-10 min), sauf pour un test où un seul passage/jour est répété sur deux jours et 3) les manipulations préalables à la mise à mort (dislocation ou perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde). Aucune perte de poids, inactivité/mobilité réduite ou expression d’un comportement anormal n’est connu pour ces trois types de manipulations. Enfin, dans la dernière procédure les souris seront transportées (aller-retour dans la journée) en restant dans leur groupe social (2-3 souris/cage) pour effectuer un scan IRM à 2 mois, 4 mois et 12 mois.
Impact sur les animaux
Le suivi de lignée jusqu’à l’âge de 12 mois indique que le phénotype des souris dKI n’est pas dommageable : le succès reproducteur, le poids et l’occurrence d’anomalies comportementales ou physiologiques restent identiques entre les WT et les dKI. Leur fonds génétique C57BL/6J est entretenu par backcross pour éviter une dérive génétique. Par ailleurs, il faut préciser que ces souris ont été caractérisées dans des tests de mémoire et d’anxiété classiques et dans des tests hypersensibles à la pathologie Alzheimer. Les mâles et femelles dKI de 2 à 6 mois réussissent comme leurs témoins les tests classiques (test spatial en labyrinthe de Barnes, tests de reconnaissance d’objet et de place jusqu’à un délai de 3h). Même à 12 mois, il n’y a toujours pas de déficit dans ces tests. Entre 2 et 6 mois, le problème n’apparait que dans des tests hypersensibles : une performance moindre au premier jour du changement de règle dans un labyrinthe, un déficit marqué dans les tests d’association objet-place (test OiP), de mémoire du détail et pour un long délai de rappel (RO24h). En conclusion, les souris dKI présentent des problèmes légers de mémoire qui sont présents chez des personnes âgées déclarées cognitivement normales. Ces déficits ne sont donc pas de nature à affecter le bien-être des souris dKI par rapport à leurs témoins WT. Seules deux procédures pourraient induire un stress transitoire : la procédure 1 pour l’isolement en cage permettant de mesurer l’activité locomotrice individuelle sur 4 jours et la procédure 8 où les souris seront transportées (aller-retour dans la journée) en restant dans leur groupe social (2-3 souris/cage) pour un scan IRM à 2 mois, 4 mois et 12 mois. Les autres procédures sont légères. Elles comportent 1) la réalisation de frottis vaginaux sur les femelles (dépôt d’une goutte à l’entrée du vagin puis réaspiration) par une expérimentatrice maitrisant la technique, 2) la passation de deux tests de reconnaissance d’objet (RO24h et OiP à 2, 4 et 12 mois) basés sur l’exploration spontanée de deux objets disposés dans un environnement rendu familier par une habituation préalable avec leur groupe social et 3) les manipulations préalables à la mise à mort (dislocation ou perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde). Aucune perte de poids, inactivité/mobilité réduite ou expression d’un comportement anormal n’est connu pour ces trois types de manipulations.
Devenir
Le but du projet est de découvrir les altérations neuropathologiques impliquées dans le dimorphisme sexuel face à l’émergence d’une pathologie Alzheimer afin de mieux comprendre les causes de la vulnérabilité du cerveau des souris dKI femelles par rapport aux mâles. Les cerveaux seront systématiquement recueillis et analysés afin de déterminer ces causes.
Remplacement
L'étude des animaux modèles de la MA est encore indispensable pour progresser dans la compréhension de cette pathologie. Il n'est pas encore possible actuellement de modéliser les processus cognitifs de façon fiable et complète dans un modèle in silico ou en culture cellulaire. Il est donc encore nécessaire de recourir à des modèles animaux dont on analyse la relation entre la neuropathologie et les performances cognitives.
Réduction
Pour étudier le lien entre les performances comportementales (mémoire et rythme circadien de l’activité locomotrice) et les données neuropathologiques obtenues par des approches histologiques ou biochimiques (P1 à P6), le nombre d’animaux sera au maximum de 15 animaux par groupe pour assurer l’efficacité des statistiques dans les tests comportementaux. Cet effectif est nécessaire en particulier dans notre modèle car nous testons des souris avec une pathologie débutante et des déficits subtils qui pourraient passer inaperçus si les groupes sont trop petits. La dernière procédure est une étude longitudinale d’animaux destinés à des analyses en IRM. Elle permet donc le suivi d'un même animal à trois âges pour étudier l’émergence et l’évolution de la pathologie ce qui permet une réduction du nombre d'animaux/groupes à inclure. Le nombre de souris sera au maximum de 35 animaux par groupes (4 groupes mâles et femelles des génotypes dKI et témoins WT) afin d’assurer l’efficacité des tests statistiques et donner des résultats statistiquement fiables pour les données IRM et pour des analyses corrélatives avec les données comportementales et histopathologiques obtenues sur les mêmes animaux au sein de notre laboratoire. L’ensemble du projet requiert 692 souris.
Raffinement
Les souris bénéficieront d’éléments d’enrichissement dans leur cage (matériel de construction du nid, un tube refuge et des boulettes de nourriture à manipuler), ainsi qu’un suivi quotidien de leur état général. Elles seront maintenues en groupe sociaux sauf pendant deux périodes de 10 minutes/jours pour chacun des tests de mémoire. Tous ces tests sont basés sur le comportement d’exploration spontanée de la souris dans un milieu adapté à l’espèce (lumière faible de 20 lux maximum et ambiance sonore atténuée à 45 dB). Un suivi spécifique à chaque procédure avec des points limites adaptés est mis en place pour éviter toute souffrance éventuelle. Trois nouvelles techniques de raffinement sont à mettre/mise en place au cours du projet. Elles concernent la manipulation/transport des souris, l’habituation à l’enceinte des tests de mémoire et une méthode non invasive de prélèvement pour le génotypage. Les souris sont d’ores et déjà transportées de la cage à l’enceinte de tests (et vice versa) grâce au tube refuge présent dans leur cage. L’habituation à l’enceinte des tests se fait depuis plus de 6 mois avec l’ensemble du groupe social de chaque cage. Le bien-être qui en résulte se reflète par une plus grande régularité dans la durée d’exploration des objets présents dans l’enceinte au cours des tests de mémoire réalisés ensuite en individuel. Enfin, une nouvelle méthode de prélèvement non invasive pour le génotypage à partir d’une pincée de poils (au lieu du punch d’oreille de 2 mm) est en cours de mise au point pour s’assurer de sa faisabilité/reproductibilité avec les primers utilisés pour les souris dKI et WT.
Choix des espèces
A ce jour, les modèles animaux de la MA ont essentiellement été créés chez la souris, même s'il existe des modèles chez la drosophile et d'autres espèces. Nous avons un modèle de souris qui est en rupture par rapport aux modèles précédents, car il n’a pas les effets secondaires dûs à la surexpression des protéines clé. Il présente une différence entre les deux sexes dans l'apparition des premiers troubles de la mémoire qui ressemble à celle trouvée au stade préclinique de la MA, c'est-à-dire 5 à 10 ans avant le premier diagnostic. Toutes les souris seront sur un fonds génétique C57BL/6J. Dans toutes les procédures sauf une, les souris seront utilisées entre 1 et 4 mois (jeunes adultes) car c’est l’âge où apparaissent les premiers déficits de mémoire dans ce modèle de maladie d’Alzheimer. Dans la dernière procédure les souris atteindront l'âge de 12 mois pour analyser leur neuropathologie lorsqu’elle devient manifeste (plaques amyloïdes notamment).
Origine de Troubles du Spectre Autistique dans un modèle de rat : étude du métabolome et rôle du microbiote intestinal maternel.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
420 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie étant tuée pour prélever les cerveaux et 66 renvoyés vers l'élevage. Des rattes gestantes reçoivent une injection d'acide valproïque pour induire un modèle d'autisme, subissent une greffe de microbiote fécal et une échographie sous anesthésie, et leur descendance passe quatre tests comportementaux comme le labyrinthe en Y et l'enfouissement de billes. Le porteur indique que le valproïque provoque quelques minutes de pelage hérissé, prostration et flancs creusés, et que les tests génèrent un léger stress. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative pour modéliser les troubles du spectre autistique.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment différents facteurs de l’environnement vont avoir un impact sur le microbiote intestinal maternel, et de mieux comprendre comme la modification de microbiote sera liée à un développement cérébral anormal à l’origine des TSAs.
Bénéfices attendus
Mieux comprendre l'implication du microbiote intestinal maternel dans le développement des troubles du spectre de l'autisme chez le rat.
Procédures
Les rattes gestantes fournissant les fèces pour la greffe de microbiote fécal seront massées chaque jour pour la récolter de leur fèces fraiches (sortie du côlon). Les rattes gestantes ayant reçu une greffe de microbiote fécale ainsi que leurs ratons subiront une anesthésie et l'injection d'un produit de contraste pour échographie. Il y aura 4 tests comportementaux: - labyrinthe en Y : 5 min - scorage des stéréotypies motrices : 10 min - enfouissement de billes : 15 min - interaction sociale directe : 10 min
Impact sur les animaux
L'effet de l'injection de l'acide valproïque induit une légère souffrance. Différents symptômes sont observés pendant quelques minutes (pelage hérissé, prostration, et flancs creusés) et tout redevient normal au bout d'environ 10 min. Les tests comportementaux, de par le changement de l'environnement des ratons, peuvent générer un léger stress chez l'animmal, donc une contrainte pour ces derniers.
Devenir
Procédure 1: tous les animaux sont réutilisés car des prélèvements seront effectués à GD19. Procédure 2: tous les animaux sont réutilisés car ils sont concernés par la procédure 3. Procédure 4: tous les animaux sont réutilisés car ils sont concernés par la procédure 5. Procédure 5: tous les animaux sont réutilisés car des tests comportementaux seront réalisés avec les progénitures Procédure 3: mise à mort des animaux concernés par cette procédure et récupération des cerveaux pour des analyses immunihistochimiques.
Remplacement
Il n'existe pas de méthodes alternatives permettant de modéliser les Troubles du Spectre Autistique.
Réduction
Le nombre d'animaux est réduit au maximum tout en permettant de pouvoir observer des différences à un seuil significatif de 0,1 %.
Raffinement
Tout sera mis en oeuvre pour maximiser le bien-être des animaux pendant le protocole. Les animaux seront en cycle inversé pendant l'ensemble du protocole. Les mères seront en présence d'enrichissement Sizzle Nest, bâton en bois, papier absorbant et maison pour une nidification optimum. Les animaux seront observés 2 fois par jour. Toutes les stratégies d'analgésie et de soin seront mises en oeuvre pour réduire au maximum tout incofort qui pourrait être induit par ce modèle.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les espèces les plus adaptées pour pouvoir mener ces études, la taille de leur cerveau est compatible avec la résolution spatiale des caméras du microTEP. De plus, le modèle de rat exposés à l'acide valproïque pendant la gestation est l'un des plus couramment utilisé et décrit pour étudier les TSA. Dans ce projet, certains prélèvements sont réalisés au 19ème jours de gestation. Ce stade a été choisi pour avoir des échantillons prénataux dans le modèle à un stade permettant d’obtenir les quantités nécessaires notamment pour le liquide amniotique nécessaires aux analyses métabolomiques. Ce stade correspond chez l’homme à la fin du second trimestre de grossesse. D’autres prélèvements sont réalisés à 7 jours de vie postnatale. Ce stade correspond chez l’homme à la fin du dernier trimestre de grossesse. Les TSAs sont considérés comme un groupe d’affections prénatales, d’où l’objectif d’avoir des prélèvements à des stades correspondants au développement prénatal chez l’homme. L’étude comportementale et l’imagerie seront réalisées comme classiquement dans le modèle à l’adolescence.
Étude des effets anxiolytique/sédatif et anticonvulsivant d’un dérivé de la coronaridine : la catharanthine
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
110 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Chaque animal reçoit par injection un dérivé végétal, la catharanthine, seul ou associé à un agent convulsivant, le pentylènetétrazole, puis passe des tests comportementaux de locomotion et de labyrinthe, pour évaluer des effets anxiolytiques et anticonvulsivants. Les souris ayant subi les convulsions chimiques sont tuées aussitôt le test terminé, les autres après une réutilisation dans un second test. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'alternatives" non animales et que le système nerveux central ne s'étudie que in vivo.
Objectifs
Nous cherchons à évaluer les effets anxiolytique et anticonvulsivant de la catharanthine chez la souris. Les benzodiazépines qui sont communément utilisées dans le traitement de l'anxiété peuvent être responsables de nombreux effets indésirables aux conséquences parfois graves. En effet, le rapport en termes d’efficacité/tolérance reste peu satisfaisant. De plus, ils exposent à long terme à un risque de tolérance pharmacologique et un risque de dépendance psychique et physique et de syndrome de sevrage. Ils peuvent induire des troubles de la vigilance et l’altération des fonctions cognitives. Pour tenter de nous s’affranchir de l’ensemble de ces inconvénients associés aux thérapeutiques dont nous disposons actuellement, nous souhaitons étudier les effets de la catharanthine sur l’anxiété chez la souris. Plusieurs travaux suggèrent l'implication des transmissions cholinergiques nicotiniques dans la modulation de l’anxiété. La catharanthine agit justement sur des récepteurs de l’acétylcholine (α3ß4). Le deuxième volet de nos travaux concerne les troubles convulsifs épileptiques. L'épilepsie est un trouble neurologique chronique caractérisé par des crises récurrentes spontanées délétères pour les patients atteints. Elle touche environ 1 % des personnes. La pratique clinique de l'épilepsie reste largement empirique. Bien que la dernière génération des agents pharmacologiques se soit révélée efficace, au moins un tiers des personnes épileptiques restent réfractaires à la thérapie médicale, pour lesquelles l'arsenal thérapeutique est actuellement sévèrement lacunaire. Il a été montré que la diminution des niveaux de GABA était associée à l’apparition des troubles épileptiques. La catharanthine possède également une activité sur les récepteurs GABA A. Les récepteurs GABA A possèdent plusieurs sous-unités qui représentent des cibles moléculaires potentiellement utiles pour une activité anticonvulsivant. Nous cherchons à évaluer si une ou plusieurs de ces sous-unités pourraient être impliquées dans la modulation des troubles épileptiques sous l’effet de la catharanthine. Une attention particulière sera portée au bien-être animal qui passe par des conditions d'hébergement adéquates, un suivi quotidien des animaux, des méthodes utilisées visant à réduire le plus possible toute forme de douleur, souffrance ou stress de l’animal ainsi que l'instauration de points limites pertinents et précoces.
Bénéfices attendus
Les moyens thérapeutiques dans le traitement de l'anxiété dont on dispose présentent des effets indésirables notables, comme l'addiction qui peut s'installer même à des doses thérapeutiques. De plus, ils peuvent induire des altérations des fonctions cognitives comme la mémoire, les performances psychomotrices ainsi que des troubles de la vigilance ce qui limite leur utilisation pour les patients utilisant des engins dangereux et lors de la conduite. L'exploration de nouvelles approches thérapeutiques, comme celles impliquant les récepteurs de l'acétylcholine ou du GABA, pourrait nous permettre une meilleure compréhension de la physiopathologie des états anxieux et épileptiques. Par ailleurs, l’épilepsie est la troisième maladie neurologique la plus fréquente, derrière la migraine et les démences. Elle touche environ 60 000 000 de personnes dans le monde, et environ 600 000 personnes en France, dont près de la moitié sont âgées de moins de 20 ans. Le fonctionnement physiologique du cerveau est basé sur l'interaction réciproque entre différents neurones. Dans les états épileptiques, des réseaux neuronaux distribués à travers le cerveau perturbent l’ensemble de l’activité jusqu’à interrompre, de façon transitoire, le comportement. De nouvelles approches basées sur des investigations détaillées et exhaustives des mécanismes à l'origine des troubles convulsifs sont indispensables pour développer de meilleures options thérapeutiques, qui restent à l’heure actuelle insatisfaisantes pour près d'un tiers des patients. Ces travaux ne font pas l’objet d’un dépôt de brevet, s’ils sont acceptés pour publication dans un journal à comité de lecture, ils seront accessibles à l’ensemble des chercheurs dans ce domaine.
Procédures
Les animaux recevront soit le solvant (une seule injection) , utilisé pour mettre en solution la catharanthine: (DMSO 1% + tween 1% et d’une solution salée à 0,9%)], soit la catharanthine (une seule injection) soit la catharanthine associée au Pentylènetétrazole (2 injections, d'abord la catharanthine suivie du Pentylènetétrazole, 10 minutes après) soit le diazépam seul soit associé au Pentylènetétrazole (2 injections: d'abord le diazépam suivi du Pentylènetétrazole, 10 minutes après). Les animaux seront soumis à des observations pour analyser leurs réponses comportementales. Les injections se feront par voie intrapéritonéale à l'aide de seringue type TERUMO de 1 ml en utilisant des aiguilles fines (aiguille 26G - 0,45 x 13 mm ). Compte tenu du poids moyen (30 grammes) des souris qui seront étudiées, le volume injecté sera de 0,3 ml. Deux tests comportementaux seront réalisés, l'un durera 60 minutes (mesure de l'activité locomotrice) et l'autre durera 5 minutes (le labyrinthe en "O" ). Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux.
Impact sur les animaux
Parmi les effets indésirables attendus sur les animaux, on peut citer celui des injections. On va utiliser des aiguilles les plus fines possibles pour réduire le stress causé par l'introduction d'une aiguille. L’isolement des souris juste avant l'expérimentation pourrait induire du stress, qui au fil du temps s’atténue lorsque l’animal aura exploré le milieu environnant. Cet isolement juste avant l'expérimentation a pour but d'atténuer le stress engendré par la rupture "sociale" des animaux. Cette étape est nécessaire avant la réalisation des tests de comportement, car ce stress, qui apparaît dès les premières secondes et minutes, pourrait interférer avec les effets anxiolytiques recherchés. L'administration du PTZ supprime les fonctions des synapses inhibitrices, ce qui entraîne une augmentation de l'activité neuronale. Cette régulation provoque des crises qui miment une pathologie proche de celle de l'épilepsie chez l’homme. Ce sont bien ces effets que nous cherchons à mettre en évidence et à quantifier afin d'évaluer l'efficacité de l'application de la catharanthine à prévenir ces effets. Les animaux seront placés dans un récipient transparent en plexiglas (diamètre du cylindre = 30 cm), ouverts sur le dessus pour une bonne aération. Le comportement des animaux va ensuite être observé pendant 30 minutes. Nous allons noter le début, l'intensité et le type de phase des crises selon le système de notation suivant: score 0: pas de crises comportementales; score 1: secousses myocloniques (de courtes secousses corporelles involontaires) ; score 2: queue rigide (un maintien rigide de la queue verticalement à la surface) ; score 3: clonus (flexion du membre antérieur avec ou sans perte du réflexe de station debout) ; score 4: extension tonique (contraction tonique des membres postérieurs s'étendant vers l'arrière et parallèlement à la surface) ; et score 5: convulsions généralisées. Dans la littérature, ces effets apparaissent de façon épisodique et sont brefs. Au cours de l'expérimentation, les animaux présentant d'emblée des convulsions généralisées qui durent plus de 4 minutes seront immédiatement exclus de l'expérimentation et mis à mort aussitôt par dislocation cervicale après pré-anesthésie par inhalation d’isoflurane (3% débit de gaz frais 0.8L/min) pour abréger leurs douleurs et souffrances. À l'issue des 30 minutes de l'expérimentation utilisant le PTZ, tous les animaux subiront une mise à mort.
Devenir
Les animaux ayant subi le test de mesure de l'activité locomotrice seront réutilisés dans le test de labyrinthe en "O" après une période de « washout » de 48 heures. À l'issue de ces expérimentations, il sera procédé à la mise à mort de ces animaux. Les animaux ayant subi le test de convulsions chimiques, il sera procédé immédiatement à la fin de l'expérimentation à la mise à mort de ces animaux selon les méthodes autorisées par la législation.
Remplacement
Il n'existe pas d'alternatives non animales disponibles dans le cadre de notre projet. Les données issues des travaux cliniques et des investigations fondamentales dont nous disposons actuellement reposent, pour la plupart, sur l’expérimentation animale. Les études du système nerveux central chez l’homme, mettant en jeu plusieurs interactions neuronales, étant relativement complexes et difficiles, ne peuvent s’étudier que dans les conditions in vivo chez l’animal entier. Les procédures expérimentales prévues dans ce projet, portant sur des tests d’évaluations de l'anxiété et utilisant des molécules potentiellement convulsivantes, ne peuvent être réalisées que sur l’animal vivant et ne sont pas remplaçables par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants. De plus, les mécanismes épileptogènes et de la génération de crises chez les patients épileptiques ne peuvent pas être entièrement clarifiés dans les études cliniques. Par conséquent, un modèle animal approprié est nécessaire pour l'étude du comportement d’anxiété et de l'épilepsie.
Réduction
Par nos expériences passées sur des modèles animaux similaires, il est estimé qu’un groupe de 10 animaux est suffisant pour des études statistiques dans le cadre d’une analyse statistique utilisant un test non paramétrique (test de Wilcoxon ). L'analyse des résultats sera effectuée en utilisant l'analyse de la variance (ANOVA) qui utiliser les moyennes observées sur les échantillons pour conclure à des différences significatives sur les moyennes. Par ailleurs, pour réduire au maximum le nombre des animaux, nous allons utiliser les mêmes animaux dans deux tests différents (mesure de l'activité motrice et le Labyrinthe en "O" en laissant, entre les deux tests, une période de « Wash out » de 48 heures afin d’enregistrer des résultats cohérents. Par ailleurs, des travaux montrent que ni le DMSO ni le Tween n’ont d’effets comportementaux aux taux qui seront utilisés dans notre projet. Une solution contenant ces solvants sera utilisée dans le groupe témoin.
Raffinement
Il sera procédé à une observation étroite des animaux: les animaux seront logés dans des cages de taille réglementaire avec un environnement maîtrisé. Ils bénéficieront d’un environnement enrichi au cours de leur hébergement. L'enrichissement du milieu par des objets simples (exemple un cylindre en carton) permet d'augmenter la complexité d'un environnement captif et améliore le bien-être des animaux en stimulant l'activité et en réduisant les comportements stéréotypés ou anormaux. La surveillance des animaux se fera par le suivi de l'état général des animaux (prise de nourriture, boisson, comportement général) et de leur poids. Lors de l'expérimentation des convulsions induites chimiquement, une surveillance particulièrement minutieuse sera observée. Les animaux présentant d’emblée des convulsions généralisées qui persistent pendant plus 4 minutes devront déclencher le retrait de l'animal concerné de l’expérimentation. Si la douleur ou la souffrance subie par cet animal dépasse le seuil fixé par avance (points limites lors de l'observation des animaux), la mise à mort des animaux sera effectuée immédiatement pour arrêter le plus tôt possible la douleur, la souffrance et l’angoisse de l'animal concerné, sachant que l’ensemble des animaux de cette expérimentation subiront une mise à mort à l’issue des 30 minutes que dure l'expérimentation.
Choix des espèces
Le choix des souris albinos SWISS (SN-SWISS-M) s'est fait sur la base des données de la littérature. Ce sont des souris polyvalentes utilisées dans tous les domaines de la recherche biomédicale. Les procédures envisagées dans ce projet ont déjà été validées chez la souris albinos SWISS. Par ailleurs, elles sont moins sujettes au stress et donc plus susceptibles d’avoir des comportements et traits physiologiques normaux. Il existe une vulnérabilité au penthylènetétrazole en fonction de l'âge des animaux. Comparativement aux souris plus jeunes, les souris plus âgées sont moins vulnérables au PTZ. Nous avons opté pour les sujets au stade adulte pesant en moyenne 30 grammes.
Vieillissement cardio-cérébral chez le marmouset: analyses intégrant la protéomique et l’imagerie non invasive
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
58 ouistitis vont être utilisés, puis réutilisés dans d'autres protocoles, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Chaque primate subit une fois par an des séances d'imagerie cérébrale et cardiaque sous anesthésie et un prélèvement sanguin, pour étudier le vieillissement cardio-cérébral. Le porteur présente ces interventions comme non invasives et indique que les animaux peuvent être inclus dans plusieurs protocoles au cours de leur vie. Il justifie le recours au primate par la possibilité d'études longitudinales sur un même individu et par le "besoin" d'un organisme vivant intègre.
Objectifs
Le vieillissement est un processus multifactoriel caractérisé par des modifications physiologiques à l’origine d’un déclin fonctionnel progressif, qui peut être à l’origine de plusieurs maladies chroniques, notamment cardiovasculaires et neurodégénératives. Ces maladies altèrent la qualité de vie et en limitent la durée. L’étude des processus de vieillissement est largement réalisée sur des espèces animales non primates, mais des différences fondamentales dans le processus de vieillissement entre les non-primates et les humains ont entravé la transposition directe des résultats à l'homme. Le marmouset (ouistiti commun, Callithrix jacchus), petit primate non humain (~350 g) à la durée de vie plus courte (~10 ans), a été proposé comme un modèle de vieillissement. Ce singe partage avec l'homme des traits génétiques, physiologiques et comportementaux similaires. Il présente un déclin de la fonction cardiaque, les caractéristiques des maladies neurodégénératives et de la neuroinflammation dans le cerveau, ainsi que des altérations cognitives. Le marmouset constitue un modèle adapté aux études sur le vieillissement: durée de vie compatible avec des analyses longitudinales, accès à un nombre raisonnable d’animaux élevés dans les mêmes conditions environnementales et alimentaires. Notre projet est destiné à intégrer les résultats issus de deux approches chez le marmouset: (1) identifier les signatures protéomiques plasmatiques liées à l'âge et au sexe (2) caractériser les phénotypes cardiaques et cérébraux (phénome cardio-cérébral) liés à l'âge chez les marmousets des deux sexes, afin de déterminer la relation entre le protéome circulant et le phénome cardio-cérébral en fonction de l'âge et du sexe. Etant donné que le concept de différences entre les sexes domine dans les processus de vieillissement chez les humains, il est essential de prendre en considération les mécanismes qui régissent les différences entre le sexe et l'âge pour, à terme, détecter, prévenir, ralentir ou même inverser les phénotypes associés à l'âge. L'IRM multimodale sera utilisée pour évaluer les fonctions ventriculaires cardiaques, mesurer les flux sanguins cérébraux et la perfusion cérébrale. Nous déterminerons la contribution des changements liés à l'âge et au sexe dans les phénotypes cardio-cérébraux, d’une part en comparant différents groupes de singes (vieux vs jeunes; mâles vs femelles), d’autre part en réalisant un suivi longitudinal individuel.
Bénéfices attendus
Des simulations numériques seront développées à partir des données expérimentales anatomiques et physiologiques que nous aurons recueillies chez le marmouset. Les modèles numériques marmouset seront comparés et corrélés au modèle homme que nous avons obtenu dans le cadre d’un autre projet, afin de valider : 1. les hypothèses que nous proposons sur le rôle du système cranio-spinal dans le vieillissement cérébral, 2. la transversalité effective de ce modèle animal à l’homme. Le couplage d’approches in vivo dans le respect de l’éthique animale et d’approches in silico va permettre d’évaluer les compatibilités homme/animal et d’améliorer notre connaissance des mécanismes de maladies neurodégénératives en particulier. De plus les données de l’analyse protéomique du plasma, les images issues des différentes modalités d’imagerie IRM, obtenues à partir d’une large gamme d’âges et pour les deux sexes, chez les marmousets, représentent un vivier considérable d’informations. De plus, les données biochimiques du plasma pourront être utilisées pour différents domaines de la recherche, non limités au système cardio-vasculaire et au cérébral. Les modèles développés seront disponibles en open source pour garantir une diffusion large au sein des communautés scientifiques et médicales. Cette démarche devrait permettre de réduire le nombre d’expérimentations chez l’animal, et potentiellement d’améliorer, voire développer des protocoles cliniques testables in silico en première approche.
Procédures
Les marmousets seront soumis à deux types d’intervention, 1 fois par an: -imagerie IRM sous anesthésie: une imagerie multimodale cérébrale (IRM 3T) d’une durée de 1,5h et une imagerie multimodale cardiaque (IRM7T) d’une durée de 1,5h (procédure 1) -prélèvement sanguin sous anesthésie (veine fémorale) qui nécessite 5 à 10mn (procédure 2) Les prélèvements sanguins seront réalisés autant que faire se peut lors de l’anesthésie des animaux pour une séance d’imagerie.
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales mises en oeuvre (imagerie IRM et prélèvement sanguin sous anesthésie), 2 fois/an ne génèrent pas de douleur et ne causent pas de dommage à l’animal. Les marmousets seront imagés dans la mesure où ils seront aptes à entreprendre le voyage prévu et la séance d’imagerie. Leur état de santé est contrôlé : avec courbe de poids, suivi de comportement de base, surveillance des interactions entre les animaux et de leur état physique par le personnel zootechnique Animalliance en charge de l’animalerie. Les animaux vigiles ne sont jamais soumis à l'isolement et la privation hydrique est limitée au jeûne imposé avant l'anesthésie. Pendant les séances d'imagerie, l'animal est maintenu dans des conditions de température adéquates et sa fréquence respiratoire suivie avec alarmes programmées en cas d’hyper ou d’hypo ventilation. La mise à mort sera pratiquée si des animaux âgés sont en état de souffrance liée à une altération de l’état général très prononcée (procédure valable pour toute l’animalerie marmouset, indépendante de l’étude présente).
Devenir
Les deux procédures expérimentales mises en oeuvre ne génèrent pas de douleur et ne causent pas de dommage à l'animal. Elles ne sont pas invasives et les interventions sur l'animal sont peu fréqentes (2 fois/an). Ainsi au cours même de l'étude, les animaux peuvent être impliqués dans des études comportementales, si ces dernières sont réalisées à intervalles préalablement définis. A la fin de l'étude les animaux peuvent être attribués à d'autres projets.
Remplacement
L’objectif du projet scientifique consiste à chercher, au cours du vieillissement, et en fonction du sexe, des relations entre des modifications dans les flux cérébraux, l'anatomie cérébrale, les fonctions cardiaques et des marqueurs sanguins. L’approche requiert l’intégrité de l’organisme vivant qui fournira à la fois des éléments physiologiques (métabolismes cérébral et cardiaque), anatomiques (taille et forme des structures cérébrales) et biochimiques (marqueurs sanguins). De plus cette étude s’inscrit dans le temps, sur une échelle de plusieurs années au cours desquelles les mêmes animaux seront suivis. Le modèle animal est justifié par la problématique du vieillissement des organes, et de leurs interactions, ainsi que par la nécessité de mesurer des phénomènes dynamiques, tels que les flux sanguins. Le modèle marmouset s’inscrit dans la proximité phylogénétique, anatomique et physiologique avec l’humain. C’est pour l’ensemble de ces raisons que ce projet ne pourrait être réalisé in vitro ou avec un modèle animal rongeur.
Réduction
Le nombre nécessaire et suffisant d’animaux a été établi lors de la conception du protocole expérimental par une approche méthodologique/statistique. L'étude vise à pouvoir exploiter la colonie de marmousets présente au CerCo avec une stratification en fonction de l'âge (jeunes adultes vs adultes âgés) et du sexe. Pour un risque de type I de 0,05 et de type II de 0.10, une modification théorique minimale de 20% des différentes variables avec des déviations standards de 15% nécessite 13 animaux par sous-groupe d'âge (4 sous-groupes : jeunes adultes, adultes, adultes vieillissants et sujets âgés). Si l'erreur de type II est fixée à 0.2 (valeur plus couramment acceptée), 10 animaux par sous-groupe doivent être étudiés. Il faut également considérer l 'éventuelle perte d'animaux. Ainsi, ce nombre est compatible avec la colonie présente dans l'animalerie. Les 4 sous-groupes pourront être regroupés en 2 groupes d’âges (jeunes 6ans). Il faut également considérer que ces animaux, impliqués dans une analyse de type transversal, seront intégrés dans une étude longitudinale, avec une exploration annuelle par imagerie et analyse du protéome sanguin. Les procédures n'étant pas ou peu invasives (prélèvement sanguin sous anesthésie) et à la fréquence d’une fois par an, les marmousets de l'étude pourraient être impliqués en parallèle dans d'autres études non invasives, telles que des études comportementales menées au laboratoire par d’autres chercheurs, dans le respect d’un planning partagé adéquat. De plus à la fin du projet, les animaux pourront être attribués à d'autres études. Les mêmes marmousets contribuent à plusieurs approches : imagerie avec plusieurs séquences d'imagerie et des prélèvements biologiques. Les résultats obtenus à partir des différentes procédures seront analysés séparément mais également fusionnés. Des corrélations seront recherchées entre le phénotype cardio-vasculaire et le protéome sanguin au sein des différents groupes d’âge, en fonction du sexe, afin de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques et neurodégénératifs liés à l’âge, et de l’interaction âge/sexe. En complément de l’analyse catégorielle, la méthode sera étendue à un modèle linéaire généralisé, qui permettra une définition plus fine des variations liées l’âge. Il sera ainsi possible de détecter des âges auxquels des modifications liées au vieillissement normal ou pathologique sont attendues, sans nécessiter une approche expérimentale supplémentaire.
Raffinement
Les interventions sur l’animal sont réduites au minimum (anesthésie), toutes les approches d’imagerie étant non invasives. Les animaux vivent en contact (au moins visuel, olfactif et auditif) avec l’ensemble des congénères de la même pièce. Les durées de séparation (contact physique) avec les congénères de la même cage/volière sont limitées. Les procédures ne génèrent pas d’isolement social ni de douleur. Les déplacements des marmousets entre l’animalerie et les machines IRM sont réalisés avec des animaux anesthésiés (Alfaxan, 0.25ml) pour limiter le stress. Les privations alimentaires et hydriques ne sont appliquées qu’en prévision d’une anesthésie. Les anesthésies (isoflurane ~2% dans O2) sont surveillées (monitoring de la respiration et du rythme cardiaque). Lors des séances IRM, le dispositif dans lequel les animaux anesthésiés sont installés est maintenu à la température de 27.5°C. Le suivi sanitaire des animaux est assuré par le personnel zootechnique : courbe de poids, surveillance de comportement de base et des interactions entre les animaux et de leur état physique. Une vétérinaire peut également être amenée à intervenir si un examen clinique est nécessaire, et décider du maintien de l’animal dans l’étude. En cas de blessures, le traitement consistera en des injections d'antibiotique (Clamoxyl 0.1ml/kg)par animal pendat 5 à 7 j) et d’anti-inflammatoire (Dexadreson ou Diurizone, 0,05 ml/kg soit environ 0,015 ml/animal), qui seront complétées par l’application de pommades antibiotiques (Duphader, Predniderm, Fucidine). Des injections d’un antibiotiqueadapté (metronidazole) et d’antispasmodique (Estocélan 0,1ml/kg soit environ 0,03ml/animal) seront faites aux animaux présentant des problèmes gastriques. En cas de diarrhées, du phosphaluvet est donné (1ml/kg soit environ 0,3ml par animal) sur quelques jours. Un dispositif de protection destiné à réduire le dommage auditif lié au fonctionnement de l’IRM (procédure expérimentale 1) est à l’étude (‘mini-casque’ ou bouchon d’oreilles).
Choix des espèces
Dans le cadre de l’analyse des processus de vieillissement, le marmouset Callithrix jacchus offre la possibilité de réaliser des études longitudinales sur un même animal sur une échelle de temps bien plus courte que chez l’homme (en étant de plus inclus dans plusieurs protocoles d’imagerie). Ce modèle présente l’avantage, en regard d’autres modèles (rongeurs « humanisés », microcèbe), d’une proximité phylogénétique avec l'homme. D'autres travaux au laboratoire s'intéressent aux aptitudes cognitives de ces singes en fonction de l'âge). Ainsi il est possible sur ce modèle de mener des travaux qui permettront d’analyser l’évolution des interactions entre différents biomarqueurs cérébraux, vasculaires, cardiaques et sanguins en corrélation avec les aptitudes cognitives. Une étude comparable en terme de nombre d’animaux, d’espace et de durée de projet relative à la longévité de l’espèce ne peut être envisagée, en conditions de laboratoire, chez le macaque, modèle PNH classique. L'analyse est destinée à définir in fine des marqueurs précoces du vieillissement du système cardio-cérébral. La gamme d’âges devra être suffisamment étendue. Les marmousets inclus dans les études seront des adultes, à partir du stage jeune adulte jusqu'au stade gériatrique. La cohorte participant aux études sera dichotomisée d’une part en adultes jeunes entre 2,5 et 6 ans, et d’autre part en adultes vieillissants et âgés au-delà de 6 ans, puis stratifiée en 4 sous-groupes d’individus: jeunes adultes (2,5-4 ans), adultes (4-6 ans), adultes vieillissants (6-9 ans) et sujets âgés (>9 ans) si la composition de la colonie (âge, sexe, effectif/classe d’âge) de marmousets le permet.
Mise au point chez le rat et la souris du traitement EUK-LPR de thérapie génique synthétique non-virale non-intégrative pour la prévention de l’insuffisance hépatocellulaire post-hépatectomie
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 150
750 animaux, 600 souris et 150 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger à modéré. Les rats subissent une laparotomie avec injection intraportale, les souris des injections et prélèvements intraveineux hebdomadaires pendant jusqu'à trois mois, pour mettre au point un traitement de thérapie génique du foie développé par une société commanditaire. Tous les animaux sont mis à mort en fin d'étude pour analyser le sang et les organes. Le porteur situe la demande dans le prolongement d'un programme antérieur mené d'abord sur cellules puis sur l'animal.
Objectifs
La présente demande fait suite à celle soumise le 22/07/2015 au Comité d’Ethique en Expérimentation Animale des Pays-de-la-Loire et approuvée le 29/09/2015 (EU0164 – SCAHU-Angers), ainsi que par le Ministère de la Recherche le 4/12/2015. La précédente étude a été réalisée au Service Commun d’Animalerie du CHU d’Angers (SCAHU) entre le 01/02/2016 et le 30/09/2019. Cette demande est relative à un traitement de thérapie génique synthétique, est un nouveau procédé thérapeutique non-viral non-intégratif qui est développé par la société Eukarÿs, le sponsor de cette étude. La thérapie génique repose sur l’administration par voie intravasculaire d'ADN synthétique produit in vitro, mais de structure chimique tout à fait conventionnelle. La structure de cet ADN synthétique est conçue pour prévenir son éventuelle intégration génomique et donc de modification du génome. Cet ADN synthétique permet l’expression sous contrôle du système C3P3, technologie développée par la société Eukarÿs, lequel permet la synthèse autonome d’ARN messager (ARNm) cible in vivo. La thérapie génique synthétique est donc un traitement non-viral et non-intégratif. Plusieurs étapes de ce protocole (procédures 1 à 3) sont d’ailleurs réalisées avec un gène rapporteur pour faciliter la mise au point de cette technologie. Le traitement de thérapie génique synthétique EUK-LPR qui fait l’objet de la présente demande est destiné à prévenir une insuffisance hépatique en cas de résection chirurgicale majeure du foie. Cette intervention chirurgicale est réalisée pour des indications tumorales (par exemple pour métastases hépatiques ou hépatocarcinome) ou non-tumorale (par exemple pour kyste hydatique) chez environ 10.000 malades/an en France. L’insuffisance hépatique qui fait suite à une hépatectomie majeure constitue le principal risque de cette intervention chirurgicale invasive, puisqu’elle conduit au décès post-opératoire de 5%-20% des patients. EUK-LPR vise donc à réduire la mortalité de cette invention chirurgicale en induisant sélectivement la prolifération hépatocytaire avant la résection chirurgicale hépatique, de manière à en augmenter la masse fonctionnelle. Les études antérieures ont permis de tester et d’optimiser un gène artificiel permettant la croissance hépatique. Ce protocole décrit les études requises pour la poursuite développement d’EUK-LPR avec deux types d’études selon le mode d’administration par voie intraveineuse ou intraportale.
Bénéfices attendus
Cette demande est relative à aux études non-réglementaires requises pour le développement du traitement de thérapie génique synthétique EUK-LPR. Ce traitement est destiné à prévenir une insuffisance hépatique secondaire à une résection chirurgicale majeure du foie qui constitue le principal risque de cette intervention chirurgicale, puisqu’elle conduit au décès post-opératoire de 5%-20% des patients. EUK-LPR vise donc à réduire la mortalité de cette invention chirurgicale en induisant sélectivement la prolifération hépatocytaire avant la résection chirurgicale hépatique, de manière à en augmenter la masse fonctionnelle.
Procédures
Tous les animaux des procédures 1 à 7 seront soumis à des prélèvements intraveineux hebdomadaires (600 souris et 150 rats). La durée des études est variable et peut aller jusqu’à 3 mois. Les animaux des procédures 1-2-3-6-7 seront soumis à des injections intraveineuses hebdomadaires (600 souris). La durée des études est variable et peut aller jusqu’à 3 mois. Les animaux des procédures 4-5 seront soumis à une injection intraportale unique après laparotomie (150 rats). La durée des études est variable et peut aller jusqu’à 28 jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont les suivantes : 1°) maintien en captivité des animaux, les modalités de stabulation étant décrites plus loin dans le texte, 2°) prélèvements sanguins uniques ou répétés selon les procédures, 3°) pour les animaux testés aux procédures 1-3 et 6-7, injection intraveineuse périphérique unique ou répétées, 3°) pour les animaux testés aux procédures 4 et 5, laparotomie et injection intraportale, 4°) pour tous les animaux, mise à mort à la fin de l’ étude, dont les modalités sont décrites plus loin dans le texte.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chacunes des études de la présente demande, le sang/plasma, ainsi que les organes de ces animaux devant être analysés.
Remplacement
Les phases préliminaires de ce programme réalisées le cadre de la précédente demande APAFiS ont été effectuées successivement dans des cellules en culture, puis chez l’animal. Ces études ont permis de tester et d’optimiser un gène artificiel permettant la croissance hépatique qui, administré par injection intravasculaire intra-portale chez le rat, permet d’augmenter de 18% la masse hépatique en 4 jours. Ce gène sera utilisé pour les études décrites dans la présente demande (procédures 4 à 7). Les prochaines étapes portent sur la réalisation d’études précliniques non-réglementaires chez l’animal pour lequel il n’existe pas de solution de remplacement satisfaisante et sont requises pour les futures études cliniques chez l’homme.
Réduction
Ce protocole a été conçu de manière séquentielle avec analyse des résultats pas-à-pas de manière à éviter la mise à mort inutile d’animaux. Les phases exploratoires pourront être interrompues prématurément en cas d’efficacité insuffisante ou de mauvaise tolérance du traitement, dans le but de réduire le nombre d'animaux. De plus, selon l’effet observé, la taille des groupes sera si possible réduite. Les études de cette demande étant exploratoires, la taille des groupes (n=10) ne repose donc pas sur des hypothèses statistiques préalables, mais sur l’usage courant en recherche animale. Ce protocole est cependant conçu de manière séquentielle avec analyse des résultats pas-à-pas, ce qui permettra si possible de réduire la taille des groupes afin éviter la mise à mort inutile d’animaux. L’analyse statistique des principales variables à l’état basal et sous traitement seront décrites au moyen de méthodes descriptives standard (moyenne, SD, médiane). Pour les variables de distribution ordinale, les comparaisons entre groupes se feront par test du χ-2 (n>5) ou test exact de Fisher (n≤5). Pour les variables quantitatives continues de distribution normale, éventuellement après log-transformation, les comparaisons statistiques entre groupes seront réalisées par t-test de Student (comparaison de deux groupes) ou ANOVA éventuellement avec ajustement de Dunnett (comparaison de plus de deux groupes par rapport à un groupe contrôle). En cas de variable quantitative continue de distribution non-normale, la comparaison sera réalisée par des tests non-paramétriques : U de Mann-Whitney ou W Wilcoxon (comparaison de deux groupes entre eux) ou H de Kruskall-Wallis (comparaison de plus de 2 groupes).
Raffinement
La souffrance des animaux sera réduite par une prise en charge de la douleur appropriée. Les animaux seront examinés et pesés une fois par jour, ce qui permettra de déterminer d’évaluer précisément un score de douleur et d’angoisse de l’animal. Ce score permettra de statuer sur la continuité du protocole en cours et les actions à mener, jusqu’au stade éventuel d’atteinte du point limite entrainant la mise à mort immédiate de l’animal (cf. Annexe). Un calcul du score de la douleur sera réalisé comme suit pour décider de l’action à mener : 1 point si symptômes modérés (lésion sans effraction cutanée, agitation/agressivité, hypomotilité/hyporéactivité, incoordination modérée, stéréotypies, poil piqué, zone anogénitale souillée, persistance du pli cutané, coloration jaune ou bleue des muqueuses), 3 points si symptômes majeurs (difficulté/impossibilité de mobilisation, difficultés respiratoires, incoordination marquée, gonflement abdominal, voussure du dos/ dos cambré), 5 points si symptômes indiquant l’atteinte d’un point limite (lésion sévère (automutilation, plaie suintante, masse ulcérée…), tremblements généralisés, convulsions, perte de poids supérieure à 10% en 24 heures). Ce score permet de définir l’action à mener : Score=0 : aucune douleur ; score 1≤Score
Choix des espèces
EUK-LPR est conçu pour être injecté par deux voies vasculaires : intra-portale principalement pour les indications tumorales de résection hépatique, ou intraveineuse périphérique pour les indications non-tumorales. Ces deux modes d’administration seront étudiés chez des animaux de laboratoire dans le but de générer des résultats aussi fiables que possible. La souris est l’espèce privilégiée pour la réalisation des études de ce protocole en raison du plus faible espace requis pour leur élevage. Les études nécessitant une administration voie intra-veineuse, les études seront donc réalisées chez la souris de laboratoire. Cependant, les études réalisées par voie intra-portale ne peuvent être facilement réalisées chez la souris en raison de la taille réduite du tronc porte. Ces études seront donc réalisées chez les rats de laboratoire, le diamètre du tronc porte permettant un cathétérisme facile. Il est d’ailleurs à noter que les études antérieures réalisées par voie intra-portale l’ont été dans cette espèce. Les études seront réalisées chez des animaux adultes, le traitement EUK-LPR étant développé - au moins initialement - pour patients adultes. A noter qu'il est vraisemblable que des études complémentaires seront réalisées chez animaux plus jeunes, en vue d’études cliniques chez l’enfant ou l’adolescent.
Validation d’une molécule ciblant un récepteur membranaire pour l’imagerie des tumeurs neuroendocrines 2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
1 728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal subit des greffes tumorales, dont une par chirurgie intrasplénique après laparotomie, des anesthésies répétées et des injections, pour valider une molécule d'imagerie des tumeurs neuroendocrines. Toutes les souris sont mises à mort à l'issue de chaque procédure pour analyser les tumeurs et les organes. Le porteur affirme que le recours à "l'organisme entier" est "indispensable" pour évaluer la toxicité de la molécule.
Objectifs
Les Tumeurs NeuroEndocrines (TNE) sont des tumeurs rares et hétérogènes dans leur présentation anatomopathologique et clinique. Cela rend leur diagnostic, leur pronostic et la prise en charge thérapeutique particulièrement difficiles. L’approche théranostique (utilisation de l’imagerie pour cartographier les cellules cancéreuses et les traiter de manière ciblée) est particulièrement développée pour ce type de tumeurs. Celle-ci utilise en effet la présence d’une molécule particulière à la surface des cellules tumorales (le récepteur à la somatostatine). Cette stratégie thérapeutique est actuellement la plus efficace pour le traitement des TNE mais elle comporte quelques limites. En effet, le récepteur à la somatostatine n’est pas toujours présent, notamment dans les tumeurs les plus agressives. Nous savons qu’il existe un autre récepteur présent dans ces tumeurs, le récepteur X, et nous souhaitons l’utiliser pour développer une nouvelle approche théranostique. Cela nous permettrait de proposer un nouvel outil pour l’imagerie, et à plus long terme pour la thérapie. Cette stratégie pourrait s’avérer profitable dans d’autres pathologies tumorales puisque ce récepteur existe dans d’autres types de cancers. Dans ce projet, nous proposons de cibler le récepteur X grâce à une petite molécule appelée aptamère, qui est facile à produire. Notre agent ciblant le récepteur X sera dans un premier temps couplé à une molécule fluorescente, puis à un élément radioactif. Nous souhaitons démontrer que l’aptamère peut être utilisé en imagerie des TNE grâce à deux modèles murins de progression tumorale que nous maîtrisons au laboratoire.
Bénéfices attendus
En cas de réussite, ce projet appuiera la transition de notre stratégie de l’imagerie vers la thérapie. Pour cela, il suffira de modifier le couplage de l’aptamère en utilisant un composé radioactif adapté aux traitements anticancéreux. Cela constituera une stratégie thérapeutique complémentaire à celle déjà existante pour le traitement des TNE. Les retombées potentielles de ce projet pourront également concerner d’autres cancers. En effet, le récepteur X est présent dans de nombreux types de tumeurs.
Procédures
- Anesthésies répétées (pour chirurgie et imagerie) - Injections sous-cutanées - Injections intraveineuses - Procédure chirurgicale : greffe intrasplénique (10 minutes depuis le début de l’anesthésie jusqu’à la suture de la laparotomie) dans 3 procédures (2, 4 et 6) - Pousse tumorale limitée (taille inférieure à 1500mm3 pour le modèle sous-cutané, nodules hépatiques millimétriques dans le modèle intrasplénique)
Impact sur les animaux
La xénogreffe par injection sous-cutanée est réalisée sur animal vigile. Les tumeurs développées dans ce modèle sont de petite taille. Elles n’entraînent pas de gêne chez les animaux. Aucune métastase n’est observée. La xénogreffe par injection intrasplénique implique une petite chirurgie sous anesthésie générale avec un risque de douleur au réveil. L'imagerie implique également une petite anesthésie générale.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux à l’issue de chaque procédure pour analyse des tumeurs développées et des organes prélevés.
Remplacement
Notre projet vise à développer un nouvel outil permettant l’imagerie in vivo des tumeurs neuroendocrines grâce au récepteur X, puis de développer un agent thérapeutique. L’utilisation d’un organisme entier est donc indispensable car il faut évaluer la toxicité éventuelle de notre molécule au niveau des différents organes. La molécule a été au préalable testée sur des cultures de cellules tumorales afin de remplacer une partie des travaux chez la souris.
Réduction
Quatre aptamères différents ont été testés sur des cultures de cellules tumorales. Seuls deux de ces aptamères seront testés chez la souris. De plus, le nombre d'animaux par groupe a été réduit au minimum tout en générant des résultats valables sur le plan statistique. A chaque étape du projet, nous sélectionnerons la meilleure molécule et le meilleur modèle, ce qui permettra de réduire également le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec dômes et boules de coton dans les cages. Ils seront pesés deux fois par semaine. Si des signes de souffrance sont identifiés après la chirurgie (prostration, difficulté de déplacement), une analgésie pourra être maintenue (par exemple par ajout de Doliprane dans l’eau de boisson). Si une perte de poids supérieure à 20% du poids maximal (28g) survient, l’animal sera immédiatement mis à mort. La xenogreffe souscutanée est réalisée par le personnel de la plateforme qui maîtrise parfaitement le geste. Les animaux reçoivent des analgésiques (buprénorphine 0.05 mg/kg, et lidocaïne en crème 5% au niveau de la zone de la laparotomie) avant la chirurgie afin de prévenir toute souffrance. La petite laparotomie nécessaire à l’injection est suturée à l’aide de fil chirurgical résorbable, ce qui améliore considérablement le confort des animaux.
Choix des espèces
Pour acquérir les données nécessaires à la validation de nos séquences aptamères pour l’imagerie des TNE, nous avons besoin d’utiliser des modèles mimant au mieux la pathologie. Nos modèles de xénogreffes sur souris ont été validés lors d’études antérieures et sont bien caractérisés et maîtrisés. La souris est relativement proche de l’homme. De, plus l'utilisation de souris immunodéficientes facilite la prise tumorale. Toutes les xénogreffes seront réalisées sur des souris Athymic nude ou Swiss nude de 5 à 7 semaines, qui est l'âge optimal d'utilisation des souches de souris immunodéprimées et pour lequel nos modèles de xénogreffes ont été validés lors d'études antérieures.
Développement de modèles précliniques d’étude de la résistance thérapeutique dans les leucémies aigues myéloïdes et validation de nouvelles cibles thérapeutiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
24 150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées à tous les niveaux de souffrance, du sans réveil au sévère. Chaque animal reçoit une injection de cellules leucémiques, des prélèvements sanguins sous anesthésie, parfois une ponction osseuse, puis un traitement de une à quatre semaines, pour étudier la résistance thérapeutique des leucémies aiguës myéloïdes. Le porteur signale des pertes de poids et une gêne possibles, et les souris sont tuées à l'issue de chaque étude, certaines sans réveil après un prélèvement de sang intracardiaque. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer fidèlement la tumeur dans son microenvironnement.
Objectifs
Ce projet a pour objectif la compréhension des mécanismes de résistance thérapeutique des patients atteints de leucémie aigue myéloïde et la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques, en continuant de développer des modèles de LAM in vivo et de nouveaux modèles de prédiction de sensibilité aux traitements connus.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait ouvrir à la découverte de nouvelles combinaisons thérapeutiques avec des thérapies existantes, ou bien de nouvelles drogues en ciblant de manière différente les cellules chimiorésistantes (types inhibiteurs). Nous pourrions également établir différents groupes de patients selon les caractéristiques moléculaires de la maladie, et ainsi prédire la réponse à la chimiothérapie puis orienter les types de patients vers un autre type de thérapie ciblée.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection unique de cellules leucémiques par voie intraveineuse, puis à des prélèvements de sang sous anesthésie espacés de plusieurs semaines afin d'évaluer la prise tumorale et de récolter du matériel biologique (plasma) pour des analyses ultérieures. En cas de non-diffusion des cellules leucémiques, nous ferons une ponction osseuse de cellules sous anesthésie et analgésie adaptée. Une fois l'invasion des cellules établie, les animaux vigiles recevront un traitement de durée variable selon le type de thérapie, allant de une à quatre semaines, par voie orale ou intrapéritonéale. Les animaux seront soumis à une présence humaine quotidienne afin d'observer leur état de bien-être, et manipulés de façon hebdomadaire pour un suivi pondéral.
Impact sur les animaux
Les animaux pourraient être confrontés à des effets indésirables tels que du stress, une perte de poids, une gêne physique en cas d'administration orale quotidienne par exemple. De manière plus exceptionnelle en cas de ponction osseuse, les animaux peuvent ressentir une gêne temporaire au niveau de la mobilité même si la douleur est inhibée avec l'analgésie. En revanche, tout signe de douleur observé mettra fin à l'experimentation pour l'animal concerné.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issu de chaque étude contenant plusieurs procédures. Pour les procédures suivantes, injection intraveineuse, intrapéritonéale, orale ainsi que le prélèvement sanguin mandibulaire et jugulaire, les animaux seront gardés en vie pour continuer l'étude. Pour la procédure de prélèvement de sang par voie intracardiaque sous anesthésie, les animaux seront euthanasiés sans réveil après la procédure.
Remplacement
Dans le but d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques, des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèle in vitro pouvant remplacer de façon fidèle la tumeur dans son microenvironnement ainsi que son évolution au sein d’un organisme vivant. Bien que certains modèles permettent d’effectuer un premier criblage des molécules testées, ils ne sont pas suffisants. En effet, nous avons montré une absence de corrélation entre la réponse in vitro et in vivo à l’AraC rendant nécessaire l’utilisation d’animaux. Aussi, afin de passer au stade clinique de développement des molécules, il est indispensable d’avoir des preuves de l’efficacité et de la toxicité in vivo. Nous développons également des projets collaboratifs afin de développer des modèles prédictifs (animal-free).
Réduction
Les effectifs des cohortes seront calculés et limités par un logiciel de simulation et l’outil statistique (test de Mann-Whitney). Les études antérieurement effectuées permettront d’optimiser le nombre d’animaux et le nombre d’échantillons issu de l’animal.
Raffinement
L’expérimentation fait l’objet d’une procédure de suivi du bien-être des animaux adaptée au modèle et aux potentiels effets indésirables des procédures : les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l’animal, en optimisant le mode et le volume d'injection et la durée de traitement. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée s'il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à la procédure. De plus, les études antérieures ont permis de mieux appréhender les points limites. La plupart des procédures décrites dans ce projet ont déjà obtenu l’accord d’un comité d’éthique pour l’expérimentation animale.
Choix des espèces
Le modèle murin est caractérisé dans la compréhension des pathologies cancéreuses et la recherche biomédicale. Il est très utilisé dans le criblage de nouvelles molécules du fait de sa similitude de nombreux gènes avec ceux de l’humain, ce qui permet d’étudier la résistance des cellules aux traitements. Il présente aussi des avantages pratiques tels qu’une reproduction et une croissance rapide, et une facilité de manipulation et d’adaptation aux conditions expérimentales ainsi qu’un cout peu élevé. Dans l’étude de la LAM, nous utilisons des souris immunodéficientes de type NSG pour permettre l'établissement de la maladie in vivo. Nous pourrons aussi utiliser d'autres souches immunodéprimées développées par les laboratoires de production afin d'optimiser nos modèles. Les animaux seront âgés de 6 à 8 semaines approximativement car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent ainsi une meilleure prise de greffe leucémique. De plus, les souris de cet âge sont plus résistantes et donc moins susceptibles de ressentir une angoisse ou une douleur.
Utilisation de faibles doses d’IL2 dans un modèle murin d’autisme médié par une MIA
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
275 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit jusqu'à cinq injections sous-cutanées, un prélèvement sanguin et des tests comportementaux nommés, mesure des vocalisations, test d'enfouissement et test des trois chambres, dans un modèle d'autisme induit par activation immunitaire de la mère pendant la gestation. Les souris sont ensuite tuées par dislocation cervicale pour prélever le sang et les organes. Le porteur juge "nécessaire" d'étudier le comportement sur l'animal, les modèles cellulaires ne venant selon lui qu'après la caractérisation comportementale.
Objectifs
Les troubles du spectre autistique (TSA) touchent une personne sur 100. Il s’agit d’un trouble neuro-développemental caractérisé par des anomalies de la communication sociale ainsi que des comportements stéréotypés et des intérêts restreints. Cependant, derrière cette définition générale se trouve un spectre clinique large et hétérogène. Récemment, la piste d’une activation du système immunitaire de la mère durant la grossesse (MIA) a été suspectée par des études épidémiologiques puis confirmée par des modèles animaux. Grâce à une collaboration étroite entre psychiatres et immunologistes, des données cliniques combinées avec des modèles animaux, nous permettrons de mieux comprendre les toubles autistiques des patients. En effet, dans notre projet, nous allons développer des modèles murins d’autisme liés à une MIA afin de mieux comprendre et de caractériser expérimentalement les conséquences de ces modifications neuro-immunologiques in vitro et in vivo. Nous examinerons également le comportement de ces modèles animaux. Nous explorerons donc, sous des angles très divers, les relations entre immunologie et susceptibilité aux troubles du spectre autistique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont multiples: 1- Permettre une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques en lien avec l'immunité dans le champ de l'autisme 2- Identifier des sous-groupes homogènes de patients à l'aide de biomarqueurs diagnostiques 3- Développer une prise en charge thérapeutique spécifique pour ces patients
Procédures
Les animaux seront soumis à: 1- des analyses comportementales (vocalisation (5 minutes), test d'enfouissement (20 minutes), test des 3 chambres (20 minutes). Chaque animal ne sera soumis à chaque test qu'une seule fois. 2- une injection sous-cutanée de produits pharmaceutiques non iatrogènes, répétée au maximum 5 fois et un prélèvement sanguin qui ne sera réalisé qu'une seule fois.
Impact sur les animaux
Dans notre projet, les animaux subissent soit des injections sous-cutanées et un prélévement sanguin, soit des tests comportementaux. Dans le cas des injections sous-cutanées et du prélévement sanguin, une attention particulière sera portée à la surveillance des potentielles infections et/ou signes d'inflammation au niveau des sites d'injection. Par expérience, nous savons que les produits utilisés dans notre projet sur les groupes d'animaux ne présentent aucun effet dommageable sur les souris. Pour réduire au maximum les effets indésirables de nos procédures sur les animaux, les manipulations seront réalisées par du personnel expérimenté et compétent. Cela permettra de diminuer la douleur mais aussi le stress généré aux animaux. Enfin un suivi quotidien des animaux sera réalisé afin de veiller au bon état de santé de ces derniers. L'application de la surveillance des points limites décrits dans chaque procédure sera utilisée pour détecter au plus vite le moindre problème chez les animaux.
Devenir
Euthanasie par dislocation cervicale afin de récuperer le sang et les organes et de réaliser des analyses immunologiques.
Remplacement
Les marqueurs de l’autisme sont comportementaux (anomalies de la communication sociale et comportements stéréotypés). Il est donc nécessaire d’étudier le comportement des modèles afin d’identifier clairement les mécanismes liés aux MIA (activation du système immunitaire de la mère durant la grossesse). Les modèles cellulaires ne pourront être utilisés qu’une fois que les anomalies comportementales auront été caractérisées chez les modèles murins. Par ailleurs, aucun modèle alternatif et aucune approche in vitro satisfaisante n’existe et ne peut être utilisé pour répondre aux questions posées. Seul le modèle animal permet d’évaluer l’efficacité́ des approches thérapeutiques. Nous avons choisi d’utiliser un modèle murin, qui permet de répondre aux questions scientifiques posées et pour lequel nous avons toute l’expertise et les outils nécessaires.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés, nous avons calculé le nombre nécessaire en fonction de la puissance nécessaire. Afin de palier à la variabilité inhérente aux tests comportementaux (vocalisation, test d'enfouissement, 3 chambres), il est nécessaire de tester 15 souris par groupe pour obtenir des résulats robustes, dans le respect de la règle des 3R. Pour comparer les différents groupes et utilisant 15 souris par groupes, nous utiliserons donc des tests statistiques adaptés limitant le nombre d'individus.
Raffinement
Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et accès illimté à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie seront controlées et stables. Le cycle d'éclairage sera de 12h/jour. Les animaux seront hebergés ensemble et l'isolement sera limité aux conditions expérimentales décrites. Dans le cas d'isolement, un enrichissement avec du coton et un maison en carton sera apporté et le temps d'isolement sera limité au maximum. Les animaux seront surveillés quotidiennement et un soin particulier sera apporté à la surveillance des points limites des souris isolées (comportements répétitifs, automutilation, perturbation de l'activité motrice).
Choix des espèces
La souris est un modèle important en immunologie et particulièrement dans les modèles de pathologies psychiatriques tels que l'autisme. En effet, la souris est un animal spontannément social et ses comportements normaux commencent à être de mieux en mieux connus, La souris a donc été choisie car elle permet d'analyser les symptômes cores de l'autisme c'est-à-dire (i) les anomalies précoces de la communication par l’évaluation des vocalisations ultrasoniques dès 7 jours de vie, (ii) les comportements répétitifs par le test d'enfouissement et (iii) la perte d'appétence sociale par le tests des 3 chambres. Ces deux dernières évaluations seront réalisées sur des souris adultes entre 7 et 9 semaines de vie.
Dentaire
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
Chiens : 108
216 animaux, 108 chats et 108 chiens, vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, puis réutilisés dans d'autres protocoles. Chaque animal subit trois anesthésies à un mois d'intervalle pour quantifier la plaque dentaire et évaluer l'effet d'un aliment sur le tartre, dans une démarche de recherche et développement de l'industrie de l'alimentation animale. Le porteur indique que les animaux seront réutilisés dans des protocoles d'appétence et de digestibilité. Il affirme qu'aucune autre étude ne peut servir d'alternative au protocole en place.
Objectifs
Pour évaluer l’efficacité d’un aliment sur le développement de la plaque dentaire et du tartre chez le chat et le chien, il est nécessaire de procéder à des évaluations : -Capacité du produit à induire un croquage et à brosser la surface dentaire, -Evaluation des formes, tailles et textures des aliments (secs ou humides) sur le comportement masticatoire (préhension, mastication et déglutition), -Evaluation des formes, tailles et textures des compléments alimentaires (barres à mâcher ou récompenses) sur le comportement masticatoire (préhension, mastication et déglutition). -Quantification de la plaque dentaire sur chien et chat sous anesthésie.
Bénéfices attendus
La validation des produits développés avant mise sur le marché et diffusion à grande échelle (réseau élevage, réseau clinique, magasins spécialisés), -La reformulation de ces produits pour améliorer leur efficacité sur la plaque dentaire et sur le tartre et garantir une meilleure santé bucco-dentaire aux chats et aux chiens, -La mise en place de protocoles de recherches pour trouver de nouvelles solutions nutritionnelles limitant le développement de la maladie parodontale, -La justification scientifique des claims dentaires apposés sur les packagings, -La création d’un certain nombre de documents pour l’interne et à destination des différentes filiales.
Procédures
3 anesthésies seront réalisées avec 1 mois d’intervalle.
Impact sur les animaux
Les animaux seront sous anesthésie. L'anesthésie et l'utilization de analsésiques réduiront la douleur et la souffrance de l'animal. Les animaux ne souffriront pas pendant ce protocole et pourront se réveiller de manière contrôlée et sûre. Le risque d'anesthésie sera minimisé grâce à un schéma thérapeutique adéquat ainsi qu'à une surveillance constante de la fréquence cardiaque, de la fréquence respiratoire et d'aures signes vitaux par une équipe vétérinaire expérimentée et formée.
Devenir
Les animaux seront reutilisés dans autres protocoles appetance, Digestibilité RSS.
Remplacement
Le protocole et les procédures utilisés sont conformes aux standards AAFCO et suivent le processus normal d’évaluation des projets R&D. De plus, aucune autre étude ne peut être utilisée comme alternative à celle actuellement en place.
Réduction
Le projet prévoit 8 à 10 animaux validés à la fin de l’étude avec une possibilité d’exclusion de 2 individus maximum. Aucune douleur, ni souffrance mentale ou physique n’est causée aux animaux au cours de ces tests. Et une attention permanente est portée à chaque animal durant la journée, leur lieu de vie étant à côté de celui des animaliers.
Raffinement
La douleur chez l'animal sera limitée par l'utilisation adéquate d'analgésiques pendant et aprés les tests, ainsi que d'une anesthésie volatile fournie avec de l'oxygène qui permettra de réaliser le protocole en toute sécurité et sans souffrance physique ou mentale pour l'animal. Et une attention permanente est portée à chaque animal durant la journée, leur lieu de vie étant à côté de celui des animaliers. Conditions d’hébergement des chats: Les chats vivent par groupes de 12 au maximum, dans des pièces collectives conformes à la réglementation en vigueur : propres, sécuritaires, éclairées par la lumière du jour et suffisamment grandes pour dissocier les zones d’alimentation, des zones de défécation/miction, ainsi que des zones de jeux. Une litière, changée quotidiennement, est à disposition des animaux et les pièces sont nettoyées tous les jours. Du matériel permettant aux chats de se cacher, des coussins, des perchoirs et des griffoirs sont installés dans chaque pièce. Enfin, des passages réguliers sont opérés par les animaliers en charge des animaux. De plus, chaque animal sort régulièrement de sa pièce et se promène dans les parcs extérieurs (minimum 25 minutes par jour). Conditions d’hébergement des chiens: Les petits chiens vivent par groupes de 8, dans des pièces collectives conformes à la réglementation en vigueur : propres (nettoyage quotidien), sécuritaires, éclairées par la lumière du jour et suffisamment grandes. Ces pièces comprennent une partie intérieure et extérieure. De plus, chaque animal sort régulièrement de son box et se promène au sein des animaliers ou dans les parcs extérieurs (minimum 4 heures). Les moyens et grands chiens vivent en box individuels conformes à la réglementation en vigueur : propres (nettoyage quotidien), sécuritaires, éclairés par la lumière du jour et suffisamment grands. Chaque box comprend une partie intérieure et extérieure, et communique avec un box voisin où vit également un chien, pour favoriser la sociabilisation. De plus, chaque animal sort quotidiennement dans les parcs extérieurs (minimum 4 heures).
Choix des espèces
Chaque espèce animale possède ses propres caractéristiques dentaires et dans le cas du chien, il existe de grandes variations de morphologies bucco-dentaires. Il est donc important d’utiliser les espèces auxquelles les aliments sont destinés. De plus, il n’existe pas à ce jour de modèle qui puisse approcher la digestion, l’absorption et la métabolisation d’un aliment complet ou complément alimentaire chez ces espèces. Il faut donc passer par des essais in vivo au cours desquels les chats et chiens reçoivent la formulation de l’aliment à évaluer. Enfin, des études in vitro n’apporteraient aucune information pertinente. Chats et chiens femelles et mâles âgés de 2 mois à 8 ans.
Etude de la cryoconservation des spermatozoïdes aviaires pour la gestion de la biodiversité
- Conservation des espèces
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Autres oiseaux : 138
346 oiseaux, 208 poules et 138 cailles, vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Les interventions se limitent à des collectes de semence et des inséminations, mais les mâles sont maintenus en cage individuelle en raison de leur agressivité, pour une étude sur la cryoconservation du sperme aviaire au service de la filière volaille et de la biodiversité. Le porteur indique que les animaux sont gardés vivants puis proposés à d'autres expérimentations à la fin du projet. Il affirme qu'aucune alternative in vitro n'existe pour produire des spermatozoïdes fécondants chez ces espèces.
Objectifs
A l’échelle mondiale, le maintien de la diversité génétique des espèces animales est un enjeu majeur, notamment pour les espèces de rente comme les volailles représentant la première source de protéines animales pour l’alimentation humaine. Actuellement, la sélection des races basées sur des critères de croissance s’accompagne d’une réduction majeure de la diversité génétique. La conservation des ressources génétiques est donc cruciale pour protéger la biodiversité, restaurer des espèces ou races menacées et contrer les épidémies ou les accidents de reproduction. De nos jours, la cryoconservation des spermatozoïdes est l'approche la plus répandue car elle se base sur la collecte de grandes quantités de cellules, le respect du bien-être animal (prélèvement non-invasif) et la possibilité d’un stockage long. Cependant chez les espèces aviaires, ces protocoles sont longs et fastidieux, dépendants de la fertilité des animaux, ainsi que des espèces et races considérées. De plus, les taux de fertilité après décongélation sont plus faibles que ceux obtenus avec de la semence fraiche. Des optimisations sont donc encore nécessaires afin de tendre vers un protocole applicable à toutes les espèces et races aviaires, notamment celles présentant une faible fertilité des mâles. L’amélioration de ces protocoles passe nécessairement par la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans les capacités fécondantes des spermazotoïdes. Ces mécanismes connus, il est alors possible d’identifier des leviers d’amélioration de la conservation de la semence aviaire. Ainsi, les objectifs de ce projet sont multiples. Tout d’abord, nous souhaitons mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à la fécondance d’un spermatozoïde, dans deux espèces aviaires d’interêts agronomique et scientifique, la caille et la poule, en comparant de façon individuelle la qualité des spermatozoïdes d'animaux de haute fertilité à ceux d'animaux de basse fertilité. Ces données nous permettrons dans un second temps d'améliorer les protocoles déjà existants de cryoconservation de la semence pour les espèces et races domestiques françaises. Ce projet, finance par le CRB anim (ANR-11-INBS-0003), a débuté en 2016 et se finit fin juin 2022, sous la DAP APAFIS#4026-2016021015509521 qui se termine en février 2022. La présente DAP a pour objet de poursuivre les expérimentations déjà débutées (animaux déjà présents) sur la période de février à juin 2022.
Bénéfices attendus
Les protocoles de cryoconservation de la semence aviaire actuellement disponibles présentent certaines failles. En effet, seuls les individus ayant une bonne fertilité au départ présentent une bonne capacité de cryoconservation avec une bonne fertilité observable après décongélation. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la fécondance du spermatozoïde aviaire, en comparant des animaux présentant un haut et un faible taux de fertilité, pour identifier des leviers d'amélioration de la cryoconservation de la semence aviaire. De plus, le protocole actuellement le plus répandu utilise comme cryoprotectant (agent de protection des cellules contre les dommages de la congélation), le glycérol. Or cette substance est associée à une forte réduction de la fertilité des animaux lorsqu'elle subsiste dans les échantillons de semence inséminés. Aujourd’hui, il est donc nécessaire de supprimer le glycérol par des moyens longs et complexes. Nous avons pour objetif de développer de nouvelles approches pour retirer cette substance, reposant notamment sur un gel colloïdal. Enfin, sur la base de nos données obtenues chez la poule, nous travaillons également à l’élaboration d’un protocole de cryoconservation de la semence de caille, procédure jusqu’à présent non décrite.
Procédures
Les seules interventions prévues sont la collecte de semence chez les mâles et les inséminations des femelles. Ces deux interventions sont non invasives et couramment menées en élevage. La seule procédure est l'hébergement des mâles en cage individuelle (entre 30 et 60 semaines d'âge) car les mâles sexuellement matures sont agressifs les uns envers les autres et il est impossible de les mettre avec les femelles pour éviter les inséminations non contrôlées. L’hergement en cage individuelle est donc la seule solution pour éviter les accidents d’élevage (agressivité) et certifier la justesse des données (insémination des femelles non contrôlées).
Impact sur les animaux
Le prélèvement de semence est un acte non invasif chez les espèces caille et poule. Cependant, afin de limiter le stress lié à la manipulation, seuls trois prélèvements seront effectués par semaine. Les inséminations artificielles sont des procédures classiquement développées en élevage sans stress pour les animaux. Nous limitons cependant le nombre d’insémination à cinq par mois afin de limiter tout stress lié à la manipulation excessive des individus. L’hébergement des mâles en cage individuelle (nécessaire car les mâles sexuellement matures sont agressifs les uns envers les autres) mais également la présence de différents individus dans les cages des femelles (mise en place de hiérarchie) peuvent être source d’inconfort et de stress. En cas d’arrêt de ponte, d’un mâle ne donnant plus de semence, de diarrhée, de prostration, de l’absence de chant ou de caquètement, ou de tout autre signe de maladie même bénigne, l’intervention d’un vétérinaire est prévue. Après traitement, la décision que l’animal réintègre ou non l’expérimentation se fera en fonction de son état de santé.
Devenir
Les animaux sont maintenus en vie tout au long du projet. Les animaux seront proposés pour d'autres expérimentations à la fin du projet auprès de l'unité expérimentale.
Remplacement
Ce projet concerne la reproduction d’espèces aviaires. A l’heure actuelle, aucune alternative in vitro n’existe pour la production de spermatozïdes fécondants ou de fécondation in vitro chez ces espèces.
Réduction
Nous travaillons actuellement sur 48 coqs et 66 cailles mâles. D’après notre expérience, ces chiffres nous permettent de constituer des groupes de mâles de faible fertilité entre 5 et 10 individus, permettant des analyses statistiques concluantes sur les taux de fertilité (évalués sur les nombres d’œufs fertilisés par chi2). Pour déterminer précisement la fertilité d’un mâle, l’insémination de 8 ou de 4 femelles par mâle pour respectivement les espèces poule et caille est généralement préconisée. Afin de limiter le nombre d’animaux, nous n’étudions pas la fertilité de tous les mâles en même temps. En effet, nous effectuons plusieurs campagnes d'analyse de la fertilité (4 pour les cailles et 3 pour les poules) durant lesquelles la fertilité individuelle de maximum 18 mâles cailles et 20 coqs est étudiée sur respectivement 72 et de 160 femelles. La fertilité des individus se maintenant généralement dans le temps, les groupes ainsi identifiés de bons et mauvais reproducteurs peuvent ainsi être constitués pour l’ensemble du protocole. Ainsi, ce projet concerne 48 coqs et 160 poules (soit 208 poules) mais également 66 cailles mâles et 72 cailles femelles (soit 138 cailles), soit 346 animaux au total. L'analyse de la fertilité des mâles actuellement en expérimentation (APAFIS#4026-2016021015509521 ) est aujourd'hui en cours.
Raffinement
Aucune douleur particulière n'est attentue avec ce protocole. De plus, les mâles sont entrainés au moins deux fois par semaine au prélèvement de semence par massage dorsal depuis l’âge de 30 semaines afin de limiter tout stress lié à la manipulation. Cependant, tout signe de stress accru notamment lié aux manipulations répétitives est fortement surveillé. En cas d’arrêt de ponte, d’un mâle ne donnant plus de semence, de diarrhée, de prostration, de l’absence de chant ou de caquètement, ou de tout autre signe de maladie même bénigne, l’intervention d’un vétérinaire est prévue. Après traitement, la décision que l’animal réintègre ou non l’expérimentation se fera en fonction de son état de santé.
Choix des espèces
La caille et la poule sont deux espèces à fort interêt agronomique mais également des espèces modèles pour les autres espèces aviaires. En effet, la cryoconservation de la semence de ces deux espèces est un enjeu important pour la filière volaille (maintien des lignées/races à fort potentiel) mais les protocoles développés pour ces deux espèces serviront également de base pour la cryoconservation de la semence d'autres espèces aviaires. Les animaux doivent être matures sexuellement afin d’étudier leur reproduction, soit entre 30 et 60 semaines d’âge.
Etude du rôle de la métalloprotéase matricielle-11 dans la fonction musculaire
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Chaque animal subit jusqu'à six interventions, dont une injection intramusculaire de cardiotoxine, une toxine tirée de venin de serpent qui provoque une nécrose du muscle, pour étudier le rôle de la métalloprotéase MMP11 dans la régénération musculaire. Vingt souris sont tuées dès l'étape de présélection après biopsie de la queue, les quatre-vingts autres dix-sept jours après l'injection, pour prélever le muscle. Le porteur affirme que travailler sur "l'organisme entier" est "nécessaire" car le système immunitaire ne peut pas être reproduit in vitro.
Objectifs
Dans ce projet, nous allons étudier le rôle de la métalloprotéase matricielle-11 (MMP11) dans l’homéostasie et la régénération musculaire ainsi que les mécanismes moléculaires impliqués. Nous avons récemment identifié un rôle important de cette enzyme dans la régulation du métabolisme énergétique de l’organisme. Dans des modèles de souris génétiquement modifiées, nous avons montré que l’expression de la MMP11 dans le tissu adipeux est importante puisque son absence se traduit par un surpoids des souris avec une augmentation significative de la taille des adipocytes et une altération du métabolisme du glucose et des lipides conduisant à un diabète de type 2. Des résultats miroirs ont été obtenus lorsque la MMP11 est surexprimée. Des données préliminaires ont montré que les souris invalidées pour le gène de la MMP11 ont une taille de fibres musculaires significativement inférieure à celle des souris sauvages. Des résultats miroirs ont été obtenus lorsque la MMP11 est surexprimée. Nous avons démontré que la diminution du diamètre des fibres était liée à une augmentation de l’expression de la protéine atrogine-1, un marqueur de l’atrophie musculaire. De plus, il existe une augmentation du stress oxydant dans le muscle squelettique des souris qui surexpriment la MMP11. Cette augmentation a déjà été observée dans le tissu adipeux brun de ces souris avec une altération d’une partie des mitochondries. Les muscles squelettiques sont naturellement dotés de défenses antioxydantes qui neutralisent les espèces réactives de l’oxygène (ROS) mais influencent la régénération musculaire à différents niveaux (viabilité et prolifération des cellules satellites, stimulation de l'angiogenèse, etc.).
Bénéfices attendus
Le corps humain est composé de 639 muscles dont 570 striés (autres que les muscles lisses et le muscle cardiaque) qui ont tous des fonctions bien définies dans l'organisme. Ils permettent notamment la posture, la mobilité, la mastication, et la respiration (muscle du diaphragme) entre autres fonctions. Les muscles squelettiques sont dotés d'une capacité de régénération remarquable après une lésion (déchirure, morsure, cytolyse musculaire due à une toxine, etc...). Les mécanismes de cette régénération commencent à être relativement bien élucidés même si beaucoup de travail reste à faire pour arriver à soigner des maladies dégénératives génétiques qui peuvent atteindre nos muscles comme les myopathies (ex. Myopathie de Duchenne). Pour faire avancer les recherches, nous nous intéressons donc à la fonction du gène de la MMP11 dont le rôle dans le muscle n'est pas bien connu. Des données préliminaires ont montré l'impact de la MMP11 sur la fonction musculaire et sur la croissance des fibres musculaires. Par conséquent, nous avons établi un projet de recherche fondamental dont le but est d'étudier également la fonction potentielle de ce gène dans la régénération musculaire. Selon notre hypothèse, les animaux surexprimant la MMP11 présenteront une régénération musculaire plus rapide que les souris contrôles après lésion musculaire alors que les souris MMP11KO auront une régénération musculaire plus lente.
Procédures
Lors de ce projet, les souris seront soumises à un total de 6 interventions réalisées par le manipulateur. 1. Une biopsie de la queue sera réalisée sur les 40 souris K14-MMP11Tg (durée : 5 secondes par souris) pour déterminer par qpcr le niveau d'expression de la MMP11 et ainsi sélectionner les 20 souris avec une expression de la MMP11 qui est la plus forte et surtout la plus homogène possible entre les souris. 2. Le protocole d'administration de cardiotoxine nécessitera d'endormir dans un premier temps les souris grâce à un mélange d'isolflurane et d'oxygène dans une boîte à induction en plexiglas (durée : 1 minute 30 à 2 minutes selon la souris) puis de maintenir cette anesthésie à l'aide d'un masque à anesthésie gazeuse durant la procédure expérimentale (durée : 2 minutes maximum par souris). Ensuite, les souris recevront une injection d'analgésique, le metacam, par voie sous-cutanée pour limiter la douleur liée à l'injection de cardiotoxine (durée : 5 secondes par souris). 3. Les souris seront également rasées au niveau du muscle tibial antérieur sur une surface de 1cm² (durée : environ 15 secondes par patte). 4. Après désinfection du site d'injection, 50µL d'une solution de cardiotoxine à 10µM sera injectée dans le muscle tibial antérieur d'une des deux pattes, et le muscle tibial antérieur controlatéral sera injecté avec le même volume de PBS (durée : environ 10 secondes par patte) . 5. Après le réveil des souris et dans les jours qui suivront, une seconde dose d'analgésique pourra être injectée aux souris en cas d'observation de signes de douleur (durée : 5 secondes). 6. Pour finir, les souris seront mises à mort par dislocation cervicale par une personne habilitée (durée : 5 secondes) ou par inhalation de CO2 (durée : 5 minutes), afin de prélever le muscle tibial antérieur.
Impact sur les animaux
La cardiotoxine est une toxine cytolytique obtenue à partir du venin de serpent et qui lorsqu’injectée dans le muscle produit une dépolarisation suivie d’une nécrose myofibrillaire aboutissant à une dégénérescence musculaire suivie d’une régénération au bout de 15 jours après lésion. Un défaut de régénération du muscle est caractérisée par l’accumulation anormale de cellules mononuclées dans l’espace interstitiel qui persiste au-delà de 15 jours après induction de la lésion. Suite au traitement à la cardiotoxine, une attention particulière sera donc accordée à la démarche de la souris afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, inactivité…). La zone d'injection de la cardiotoxine sera également analysée pour éliminer tout risque d'infection (pas d'inflammation, pas de pus).
Devenir
Lors de l'étape de présélection des souris, après avoir vérifié le niveau d'expression de la MMP11 dans 40 souris K14-MMP11Tg par qpcr, les 20 souris qui ont l'expression de la MMP11 la plus faible et la plus hétérogène par rapport aux autres souris seront sacrifiées. Les 80 animaux utilisées pour la partie expérimentale seront ensuite sacrifiés au terme des 17 jours suivant l'injection de cardiotoxine, afin de prélever et d'étudier le muscle tibial antérieur. Aucun animal sera donc maintenu en vie au terme de ce projet.
Remplacement
L'utilisation de modèles animaux est nécessaire pour mimer le plus fidèlement possible la dégénérescence et/ou la régénération fibrillaire, et observer les effets sur l'organisme entier, notamment du fait de la présence du système immunitaire qu'il est impossible de récapituler in vitro. C'est pourquoi nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel le processus de régénération musculaire est semblable à celui de l'Homme et pour lequel nous disposons de tous les outils moléculaires nécessaires pour mener à bien cette étude. De plus, les modèles de souris génétiquement modifiées dont nous avons besoin ont été utilisés pour d'autres études et sont donc déjà disponibles au laboratoire.
Réduction
Des données préliminaires ont déjà montré que la MMP11 avait un impact sur le diamètre des fibres musculaires, cela permet donc la réduction du nombre d’animaux utilisés au strict minimum, afin d'étudier l’impact de la MMP11 dans la régénération musculaire après une atteinte musculaire induite par la cardiotoxine. De plus, d'après l'expérience d'une équipe de notre institut (étude de la régénération musculaire après injection de cardiotoxine dans le muscle TA), il a été déterminé que 10 souris par paramètre à analyser était un nombre optimal pour assurer la puissance statistique tout en réduisant le nombre d'animaux au strict minimum. Ce nombre est d'autant plus optimisé, que le facteur de variabilité est retiré avant le début du protocole. En effet, les souris qui surexpriment la MMP11 (K14-MMP11Tg) présentent une hétérogénéité d'expression de la MMP11, ce qui constitue un facteur de variabilité impactant les résultats obtenus. Ainsi, une biopsie (queue) sera réalisée sur 40 souris K14-MMP11Tg pour déterminer par qpcr le niveau d'expression de la MMP11 et ainsi sélectionner les 20 souris avec une expression de la MMP11 qui est la plus forte et surtout la plus homogène possible entre les souris. Pour chaque souris, une patte est injectée avec le composé induisant un dommage musculaire et la patte controlatérale est systématiquement injectée avec le même volume de PBS (véhicule) pour servir de contrôle. Au lieu d'injecter un lot de souris avec le composé induisant un dommage musculaire et un autre lot témoin avec du PBS, l'utilisation systématique de la patte controlatérale en tant que contrôle permet ainsi de réduire de moitié le nombre d'animaux requis. En revanche, la blessure induite par la cardiotoxine étant très localisée, chaque souris ne sera utilisée que pour un type d'analyse (ARN ou histologie). Vu que nous travaillons avec des lots de 10 souris seulement par paramètre à analyser, nous utilisons soit un test paramétrique (test de student) ou un test non paramétrique (Mann-Whitney) de comparaison entre deux groupes (souris contrôles et mutantes) avec le logiciel PRISM qui s'appliquent aux petits échantillons (n
Raffinement
Les animaux seront placés dans des cages leur assurant un bien-être avec de la sciure de bois comme litière. Celle-ci est remplacée de manière hebdomadaire pour une hygiène optimale. Le stress est diminué au maximum en hébergeant les souris dans des cages transparentes permettant la visualisation des autres souris et en les habituant à la vue de l'opérateur expérimental qualifié pour les procédures liées à l'expérimentation animale. L'utilisation d'analgésique permettra de limiter la douleur de la lésion musculaire déclenchée par l’injection de cardiotoxine. La taille de l'aiguille permettant l'injection du produit sera adaptée au poids de l'animal afin de réduire le risque de lésion induite par l'aiguille. Les souris seront placées sur un support chauffant afin d’éviter toute déperdition de chaleur causée par l’anesthésie. Elles seront ensuite suivies dans les heures suivant l'injection. Des visites quotidiennes seront effectuées afin de vérifier le niveau d'inconfort et les signes de douleur des animaux dans la cage (diminution des comportements d'exploration, diminution de la prise de boisson et/ou de nourriture, perte de poids, posture voutée, etc...). Ainsi, l'occurence de blessure éventuelle et le risque d'infection au niveau de la zone d'administration du composé induisant un dommage musculaire seront pris en considération. Etant donné que le projet cible les muscles squelettiques, la démarche de la souris sera examinée afin de s'assurer qu'elle ne présente pas de difficultés à se déplacer. En cas de souffrance visible ou de douleur apparente des animaux, un avis vétérinaire sera sollicité pour décider de la continuité ou de l'arrêt de l'expérience.
Choix des espèces
Le modèle de souris a été retenu car c'est le seul pour lequel il est possible de manipuler le niveau d’expression de la MMP11 en employant des souris transgéniques déficientes et surexprimant la MMP11 de manière tissu-spécifique. Ces modèles permettent de répondre directement à notre objectif. A notre connaissance, il n’existe pas un autre modèle animal plus simple permettant de répondre à la problématique inhérente à ce projet. Les souris utilisées pour ce projet seront âgées de 10 semaines au moment de l’expérimentation de manière à étudier la régénération musculaire sur un organe différencié et fonctionnel.