Procédures légères

1 400 rats et 350 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Dans le cadre de prestations réglementaires pour des laboratoires, ils reçoivent des substances dont l'innocuité est en cours d'étude, subissent des prélèvements sanguins répétés, puis sont mis à mort pour prélever moelle osseuse et côlon en vue de tests de génotoxicité. Le porteur déclare des impacts "néant" et présente ces tests comme un préalable prédictif d'une activité cancérogène avant des études plus longues. Le choix des rongeurs est renvoyé aux lignes directrices de l'OCDE.

Objectifs

Dans le cadre de ses activités de prestation, le laboratoire de toxicologie réalise des tests de toxicologie sous Bonnes Pratiques de Laboratoire pour le compte de laboratoires pharmaceutiques, chimiques… Ces études sont réalisées dans le cadre de l’évaluation du risque toxicologique des substances. Les résultats sont destinés à compléter les dossiers de demande d’autorisation.

Bénéfices attendus

Ces études sont réalisées dans le cadre de l’évaluation du risque toxicologique des substances. Les résultats sont destinés à compléter les dossiers de demande d’autorisation.

Procédures

Le prélèvement des hématies et réticulocytes circulants est réalisé avant tout traitement (taux basal) puis 28 et/ou 45 jours après le dernier traitement au niveau de la veine caudale ou au sinus retro-orbital après anesthésie à l’isoflurane. Jusque 100 μL de sang sont prélevés à chaque prélèvement

Impact sur les animaux

Néant

Devenir

Animaux mis à mort en fin de traitmeent pour le prélèvement des organes d'intérêt tets du micronoyau au niveau de la moelle ossseuse et du colon ou test des comètes. Animaux traités par un produit dont l'inocuité est en cours d'étude

Remplacement

Génération de données sur le produit à étudier avant d’entreprendre des études de toxicologie (plus longues et nécessitants plus d’animaux) obligatoires, les tests de génotoxicité étant des tests à court-terme prédictifs d’une activité cancérogène. Peuvent-être intégrés dans les dossiers de demande d’autorisation à fournir aux autorités d’enregistrement. Peuvent-être utilisés dans le cadre d’activité de recherche.

Réduction

Les tests peuvent être coiplés entre eux afin d'étudier plusieurs end-points à la fois (mutation géniques, chromosomiques et lésions primaires de l'ADN), sur les même animaux, et ce afin de réduite le nombre d'animaux utilisés

Raffinement

Les animaux montrant des signes de souffrances liéesà l'action du produit à étudier sont mis à mort.

Choix des espèces

Le Test du micronoyau et le test des comètes ont une ligne directrice OCDE (respectivement, 474 et 489) chez le rongeur. Le test de mutation au niveau du gène Pig-A n’a pas de ligne directrice finalisée de l'OCDE, mais un SPSF (standard project submisson form) est en cours. Le test du micronoyau au niveau du colon n'a pas de ligne directrice, mais il suit la publication de Vanhauwaert et al. 2001. 5-7 semaines selon les recommandations de l'OCDE 474 et 489

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Porteuses d'une mutation reproduisant la sclérose latérale amyotrophique, elles sont suivies par IRM et spectroscopie sous anesthésie à différents stades de la maladie, puis mises à mort par inhalation de CO2 pour prélever cerveau et moelle épinière. Le porteur qualifie l'imagerie de "totalement non invasive et atraumatique" et affirme qu'aucun modèle in vitro ou informatique ne peut remplacer l'animal entier. Le modèle est décrit comme un phénotype dommageable encore peu caractérisé, dont ce projet vise surtout la description.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) ou maladie de Charcot est une maladie neurodégénérative fréquente, dont la prévalence est de 4 à 6/100 000. Elle est caractérisée par la mort progressive et sélective des motoneurones dans le cerveau et la moelle épinière, ce qui provoque une paralysie fatale. L’évolution naturelle aboutit au décès, avec une médiane de survie de 40 mois. Il a été mis en évidence une agrégation anormale de la protéine TDP-43, dans certaines régions du système nerveux central ainsi qu’une mutation du gène codant pour cette protéine. Il existe un modèle transgénique de souris TDP-43-A315T qui possède une mutation du gène codant pour la protéine TDP43. Par contre, ce modèle est très peu caractérisé à ce jour. Il s’agit d’un modèle à phénotype dommageable.Le but de ce projet est de caractériser le modèle de façon non invasive in vivo par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) et Spectroscopie par Résonance Magnétique (SRM) tout au long du développement de la pathologie. L’IRM (Imagerie par Résonance Magnétique) et la SRM (Spectroscopie par Résonance Magnétique) sont deux techniques d’imagerie et de spectroscopie particulièrement adaptées à l’étude du cerveau et de la moelle épinière. L’imagerie va fournir des images qui peuvent être analysées pour en extraire des paramètres tissulaires ou morphologiques, et la SRM fournit des spectres permettant de quantifier plusieurs métabolites cérébraux (choline, créatine, NAA, inositol, glutamate, glutamine).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont une meilleur compréhension du développement de la pathologie pour laquelle il n'existe pas de médicament mise à part les antidouleurs

Procédures

Les séquences d'IRM et de SRM sont d'une durée maximale de 2h et seront réalisées 1 fois. pour chaque stade

Impact sur les animaux

les séances d'imagerie IRM sont totalement non invasives et atruamatiques. Le seules "nuisances" possibles sont celles liées à la piqure d'aiguille lors de l'injection de l'agent de contraste. L'agent de contraste dotarem est celui utilisé en routine clinique donc sans effet secondaire

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à chaque stade après les acquisitions IRM et SRM par inhalation de CO2. Le cerveau ainsi que la moelle épinière seront prélevés.

Remplacement

La compréhension du modèle chez l'animal est indispensable avant de pouvoir envisager de passer chez l'Homme. Les mammifères sont des animaux proches de l’Homme au niveau du fonctionnement de l'organisme. Aucun modèle expérimental in vitro ou aucune modélisation informatique n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier la mise en place de la SLA.

Réduction

le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles.

Raffinement

Raffinement: Les animaux seront suivis quotidiennement. Ils sont anesthésiés pour les actes IRM et SRM qui sont deux techniques d’imagerie non invasives. Les animaux seront hébergés 5 par cage et en portoir ventilé. Un enrichissement est mis en place avec des tubes, du côté et des petites maisonnettes en plastique.

Choix des espèces

Cette étude sera réalisée sur des souris mutantes TDP-43-A315T Les souris auront entre 2 et 3 mois, les premiers symptômes de la maladie apparaissant vers 3-4 mois

108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent des gavages et des prélèvements de selles quotidiens pour étudier la translocation intestinale de la bactérie Klebsiella, un mélange d'antibiotiques leur étant administré. Le porteur indique un point limite fixé à 20 % de perte de poids, au-delà duquel les animaux sont tués, et décrit un suivi des signes de douleur avec administration de paracétamol si besoin. Il affirme que l'analyse in vitro reste insuffisante et qu'il est impossible de reproduire in vitro le microbiote complexe et l'inflammation de l'hôte.

Objectifs

L’objectif principal est de caractériser le processus physiopathologique des infections à Klebsiella chez des patients de réanimation impliquant potentiellement leur translocation de l’intestin vers la circulation sanguine et les poumons. Ces mécanismes peuvent être multifactoriels et peuvent impliquer des facteurs de risques des patients (notamment une inflammation intestinale bas bruit et la prise d’antibiotiques). L’utilisation de modèles murins et la seule approche permettant de comprendre au mieux cette physiopathologie afin de penser de futures stratégies prophylactiques des infections.

Bénéfices attendus

L’analyse comparative des souches isolées dans les différents sites cliniques d’un même patient à partir d’hémocultures et la détermination de leurs capacités à moduler les jonctions serrées in vitro, permettront de mieux comprendre le processus physiopathologique des infections à Klebsiella spp. en lien avec le réservoir intestinal de ce genre bactérien. Les modèles in vitro puis in vivo* proposés apporteront des réponses sur le comportement de cette bactérie au contact de cellules eucaryotes et permettront de répondre clairement à des questions souvent évoquées dans la littérature : Des souches de Klebsiella spp. sont-elles capables d’emprunter une voie endogène pour générer une infection et quels sont les mécanismes mis en jeu au niveau de l’épithélium intestinal ou respiratoire ? Ce projet transversal vise à fournir des réponses fondamentales et des pistes de réflexion face au problème des infections liées à Klebsiella spp. Les résultats obtenus permettront d’orienter des mesures pour prévenir ces infections. Ce travail servira de preuve de concept afin d’initier un projet sur un modèle animal pour confirmer ces résultats. Cette étape est nécessaire avant d’envisager une modulation du microbiote intestinale pour prévenir la translocation intestinale à Klebsiella spp.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à des prélèvements de selles quotidiens et des gavages (2 par animal).

Impact sur les animaux

Quotidiennement, les animaux seront pesés pour détecter une possible perte de poids, et observés (comportement général de l’animal, apparence) pour repérer les signes de stress et de douleur (activité, locomotion, prise d’eau et de nourriture, état du poil, prostration, vocalise,…). L’animalier ou l’expérimentateur contrôlera quotidiennement la présence d’eau et de nourriture pour chaque cage. Toute observation anormale sera transmise à l’expérimentateur. Si des signes de douleur sont observés, du paracétamol sera administré par voie orale à l’animal concerné (2 gavages quotidiens, 200mg/kg). Les animaux présentant des signes de déshydratation seront réhydratés par injection sous-cutanée de sérum physiologique. Ces animaux seront surveillés 3 fois par jour mais resteront cependant avec leurs congénères car un l’isolement serait un facteur de stress pouvant impacter fortement les résultats. Les animaux présentant une perte de poids supérieure à 20% seront euthanasiés immédiatement. Pour ce projet, plusieurs critères ont été définis sur la base de l’évaluation des points limites proposés par Morton et Griffiths (1985). Ces critères sont les suivants : -Poids : perte de poids supérieure à 20%, depuis le début de l’expérience (J0). -Activité : diminution marquée de la motricité spontanée, diminution des activités de toilettage ou motrice après stimulation. -Apparence physique externe : poils hérissés, couleurs du pelage terne, posture voutée, vocalisation -Fèces : Présence de sang dans les fèces pendant plus d’une semaine.

Devenir

Les animaux de la procèdure 1 seront inclus dans la 2 puis dans la 3. En fin d'expérimentation, tous les animaux sont euthanasiés.

Remplacement

Notre approche expérimentale inclut une analyse in vitro mimant les épithélia, mais elle reste insuffisante pour analyser le pouvoir pathogène de Klebsiella lors des étapes initiales de colonisation de niches écologiques et de translocation intestinale. Il est impossible de reproduire in vitro les paramètres inflammatoires de l’hôte ainsi que la présence d’un microbiote complexe.

Réduction

Le nombre d'animaux sera réduit au minimum dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs du projet. Les animaux seront exploités au maximum : prélèvement d’un maximum d’organes, réalisation de lavages broncho-alvéolaires,… Le nombre d’animaux utilisés est défini selon la puissance statistique et la variabilité des paramètres étudiés. L’analyse statistique se fera par les tests habituels de comparaison de médianes (Mann-Whitney, Wilcoxon, Kruskall-Wallis, Friedmann suivant le nombre de groupe à comparer et l’appariement ou non des données).

Raffinement

Quotidiennement, les animaux seront pesés et observés pour repérer les signes de stress et de douleur (perte de poids, activité, locomotion, état du poil, prostration, vocalise,…). La présence d’eau et de nourriture pour chaque cage seront contrôlées quotidiennement. Toute observation anormale sera notée et transmise à l’expérimentateur. Un enrichissement est apporté à tous les animaux dans les cages (refuges rouges pour souris).

Choix des espèces

Les animaux utilisés seront des souris C57BL/6. Le choix de cette lignée est lié à plusieurs paramètres essentiels : - des publications internationales montrent que cette lignée est parfaitement adaptée pour étudier la virulence de Klebsiella. - le fond génétique C57BL/6 est préférable pour l’étude de l’immunité régulant l’infection. - des outils moléculaires sont disponibles pour cette espèce. Les expériences seront débutées sur des souris âgées de 6 semaines et qui pèseront environ 20g. Les expériences prendront 14 jours maximum après le début de l’expérience, avant euthanasie des animaux. L’utilisation de jeunes adultes permet de limiter les biais liés à des différences pouvant se développer au cours de la vie de l’animal. La réduction de la variabilité inter-individus permet ainsi de réduire le nombre d’animaux à expérimenter.

12 rats Zucker obèses vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont suivis jusqu'à vingt semaines par échocardiographie hebdomadaire sous anesthésie et par imagerie nucléaire, avec des prélèvements sanguins, avant une ponction cardiaque terminale et la mise à mort. Le porteur affirme que ces procédures d'imagerie n'entraînent ni douleur ni angoisse et présente cette étude pilote comme visant à valider le modèle du rat obèse pour de futurs travaux. Il indique qu'aucune méthode alternative n'est disponible et qualifie les expériences d'"absolument indispensables".

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires sont responsables d’un tiers des décès dans le monde. La maladie ischémique, définie par un apport sanguin insuffisant au muscle cardiaque, représente la moitié des décès d’origine cardiovasculaire. Elle peut être d’origine macrovasculaire et impacter les gros vaisseaux via le développement de plaques d’athérome. De récentes avancées ont mis en évidence qu’une dysfonction coronarienne microvasculaire (DCM), à savoir une dysfonction des petits vaisseaux composant le système vasculaire cardiaque [pré-artérioles (500-100 μm), artérioles (

Bénéfices attendus

Cette étude pilote permettra de valider le modèle de rat Zucker obèse pour l’étude de la dysfonction coronarienne microvasculaire dans le contexte du laboratoire.

Procédures

Les animaux seront tous soumis à la procédure 1 (Imagerie échographique cardiaque chez le petit animal) une fois par semaine jusqu'à 20 semaines maximum, afin d’évaluer les changements morphologiques et fonctionnels cardiovasculaires liés au développement de la maladie métabolique. Cette procédure dure moins de 45 min. Une fois toutes les deux semaines jusqu' à 20 semaines maximum, leur glycémie sera mesurée à jeun. Une fois après la période de stabulation et une fois avant euthanasie, les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin pour mesure de l’insulinémie. Dès qu’une différence significative sera observée entre les groupes en termes de changement morphologique et/ou fonctionnel lors de la procédure 1 d’échocardiographie, les animaux seront soumis à la procédure 2 (imagerie TEMP pour la mesure de la réserve coronaire). Cette procédure sans réveil dure moins de 45 min. En ce qui concerne la mesure de la réserve coronaire lors des procédures 1 et 2, les animaux seront soumis à une injection d'agent pharmacologique permettant de mimer une situation d'effort. A l'issue de la session d'imagerie (procédure 2), les animaux seront profondément anesthésiés sous anesthésie volatile et subiront une ponction intracardiaque dans le but de mesurer leur insulinémie et seront ensuite euthanasiés par surdose létale d'un anesthésique liquide.

Impact sur les animaux

Les protocoles d’imagerie qui seront mis en œuvre dans cette étude n’entraîneront pas de douleur, souffrance ou angoisse. Ils impliqueront une anesthésie générale et une injection intrapéritonéale (procédure expérimentale #1) avant réveil ou une anesthésie générale volatile rapidement réversible, une cathétérisation veineuse et une ponction cardiaque sous anesthésie profonde avant mise à mort (procédure expérimentale #2). Ils ne sont pas susceptibles de générer des effets indésirables. De plus, aucune drogue ou médicament ne sera utilisé dans cette étude, exception faite de l'agent pharmacologique permettant de mimer une situation d'effort pour la mesure de la réserve coronaire, qui a un effet transitoire. Enfin, une prise de poids est attendue chez les animaux Zucker, mais elle ne constitue pas non plus un effet indésirable.

Devenir

Les animaux (n=6 OZR et n=6 ZL) seront gardés vivants pour un suivi temporel de leurs fonctions et morphologies cardiovasculaire sur 20 semaines maximum. Suite à la procédure 1 et à la fin de la procédure 2 (imagerie TEMP) les animaux seront euthanasiés pour des analyses ex vivo (réactivité vasculaire et immunohistochimie) afin d’évaluer les différences de densité capillaire et de réactivité vasculaire entre les deux groupes.

Remplacement

Nous limitons le projet aux seules expériences considérées comme absolument indispensables chez l’animal. Au total 12 rats seront utilisés. Il s’agit du minimum d’animaux nécessaire afin de pouvoir obtenir des résultats exploitables durant le protocole prévu. Tout au long des études in vivo, nous respecterons la règle des 3R en tenant compte du fait qu’aucune méthode alternative n’est disponible pour le remplacement. Les animaux seront hébergés par groupe de deux ou trois selon leur poids, en cages avec enrichissement du milieu de vie. Les animaux seront suivis quotidiennement afin de contrôler leur bien-être.

Réduction

Cette étude pilote permet dans un premier temps d'utiliser un nombre minimum d'animaux afin que ceux qui seront éventuellement commandés plus tard pour une étude complémentaire soient utilisés à bon escient. Au total 12 rats seront utilisés ici. Il s’agit du minimum d’animaux nécessaire afin de pouvoir obtenir des résultats exploitables durant le protocole prévu.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe de deux ou trois selon leur poids et disposeront d’enrichissement de milieu de vie (bâton en bois, tunnels, etc…) Les expérimentations prévues lors de cette étude sont des procédures non invasives (imagerie échocardiographie et imagerie nucléaire TEMP). Lors de ces procédures, les animaux sont sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane. Aucun test douloureux causant une souffrance animale n’a été prévu. Il n’y a donc pas de nécessité de point limite spécifique. En revanche, des critères classiques d’observation (apparence physique et comportement) seront utilisés pendant le temps d’hébergement et entre deux procédures. Des scores seront calculés selon une grille d’évaluation (voir ci-dessous). Aucune anomalie cardiaque n’a été jusqu’ici observée et l’effet de la Dobutamine est transitoire, mais une grille de surveillance sera toutefois ajoutée pour la surveillance respiratoire des rats. Un score total supérieur ou égal à 3 sera considéré comme un point limite et l’animal sera euthanasié. I. Apparence physique Normale : 0 Manque de toilettage, poil ébouriffé : 1 Poil très ébouriffé, posture anormale : 2 II. Comportement Normal : 0 Changements mineurs : 1 Anormal, mobilité et activité réduites : 2 Animal très agité ou immobile, isolé, agressif : 3 III. Respiration Normal : 0 Essoufflement : 1 Hyperventilation : 2 Anormale, tremblement : 3 Les animaux seront euthanasiés selon une méthode appropriée, à savoir après injection intraveineuse d’exagon (60mg/kg) Les résultats expérimentaux seront analysés en utilisant des tests statistiques pour valeurs non appariés (tests Wilcoxon) pour comparer les valeurs obtenues entre les deux groupes.

Choix des espèces

L’évaluation expérimentale in vivo du développement d’une pathologie telle que l’atteinte microvasculaire coronarienne est indispensable à la compréhension de la pathologie clinique. Les atteintes microvasculaires sont la conséquence de désordres métaboliques et physiologiques qui sont à l'heure actuelle impossible à reproduire in vitro et qui nécessitent donc l’utilisation d’un modèle animal. Le rat Zucker imite le syndrome métabolique humain (insulinorésistant, hypertendu, hyperlipidémique, obésité) et représente un outil important pour la compréhension de la physiopathologie des complications cardiovasculaires. De plus, la caméra TEMP utilisée ainsi que les sondes d’échographie étant destinées au petit animal, le choix d’un modèle chez le rat est particulièrement adapté aux caractéristiques techniques du matériel. Les animaux seront accueillis à l’âge de 10 semaines et hébergés dans des conditions standards pendant deux semaines avant inclusion dans le protocole. Cet âge correspond, d’après la littérature, au stade initial du syndrome métabolique (obésité, insulinorésistance, hyperlipidémie) développé par ces animaux.

116 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur irradie une partie des souris, greffe des cellules souches, en infecte d'autres par le virus de la vaccine, pour valider une nouvelle lignée destinée aux expériences de transfert de cellules immunitaires. Il indique attendre peu de douleur, les manipulations étant faites sous anesthésie, et n'avoir jusqu'ici associé aucun signe clinique à l'infection virale. Il présente cette lignée comme supprimant un biais des lignées existantes, avant une mise à mort pour prélever les organes.

Objectifs

Le transfert adoptif de cellules donneuses dans un animal hôte est fréquemment utilisé pour l’étude du système immunitaire. Une expérience classique consiste à transférer des cellules issues d’animaux sauvages ou mutés pour un gène donné dans un animal hôte et de suivre le devenir de ces cellules (circulation, fonction …). Ceci nécessite l’expression par les animaux donneurs et receveurs de marqueurs permettant de les distinguer. L’un des marqueurs les plus classiquement utilisé est le CD45. CD45 est une protéine exprimée à la surface de toutes les cellules immunitaires existant sous deux formes : CD45.1 et CD45.2. Des outils ont été développés permettant la distinction de ces deux formes par cytométrie de flux. Les cellules donneuses sont ainsi issues de souris de lignées B6.SJL ou B6 exprimant respectivement les formes CD45.1 et CD45.2. Or de récentes études ont montré que plusieurs gènes sont exprimés différemment entre ces deux lignées, indépendemment de toute expérimentation ou modification génétique. Notamment, les cellules souches issues de souris de lignées B6.SJL ont une capacité de greffe réduite en comparaison à celles issues de souris B6. De plus, ces deux lignées n’ont pas la même capacité de réponse à une infection par un virus, ce qui introduit un biais expérimental. Pour pallier à ça, nous avons créer une nouvelle lignée de souris B6 exprimant le CD45.1, appelée B6-CD45.1. Cette lignée souris vise à remplacer la lignée B6.SJL et est supposée strictement identique à la souris B6 sur le plan génétique à l’exception de la forme de CD45 exprimée. L’objectif de cette procédure est de démontrer que cette nouvelle lignée ne présente pas de différence en termes de greffe de cellules souches et de réponse immunitaire antivirale comparé à la B6, et qu'elle peut ainsi être utilisée comme modèle dans les expériences de transfert adoptif.

Bénéfices attendus

Le modèle actuel de transfert adoptif de cellules utilisant les lignées B6.SJL et B6 présente un biais puisque plusieurs gènes sont exprimés différemment entre ces deux lignées, indépendemment de toute expérimentation ou modification génétique. Ceci entraîne notamment des différences au niveau de la réponse immunitaire et de la capacité de greffe des CSH de ces deux lignées. La nouvelle lignée B6-CD45.1 qui nous avons générée et que nous souhaitons caractériser dans ce projet, est supposée génétiquement identique à la B6 à l’exception de la forme de CD45 exprimée. Ainsi, on s’attend à une réponse immunitaire et une capacité de greffe de cellules souches hématopoietique strictement identique entre ces deux lignées. Cette nouvelle lignée permet d’abroger les biais précédemment cités et représente une réelle plus-value en comparaison à la lignée B6.SJL pour tous les scientifiques pratiquant le transfert adoptif de cellules.

Procédures

L’irradiation par rayon X (10 minutes) et l’infection intranasale par VV sont réalisés sous anesthésie générale profonde injection intra-péritonéale de Ketamine/Xylazine (respectivement 70 mg/kg et 9 mg/kg ). Les transfert de cellules par voie intraveineuse et les prélèvements de sang au sinus retro-orbital sont réalisés sous brève anesthésie à l’isofluorane (4% dans une chambre à oxygène). Fréquence : x irradiation : une seule fois/animal x infection : une seule fois/animal x transfert de cellules : une seule fois/animal x prélèvement de sang : une (procédure 2) ou deux fois (procédure 1)/animal

Impact sur les animaux

Peu de douleur est attendue au cours de la procédure d’irradiation qui est réalisée sur animaux anesthésiés. Peu de douleur également attendue au cours de l’injection de cellules par voie intraveineuse et des prélèvements de sang au sinus retro-orbital, réalisés sur animaux anesthésiés Infection par le virus de la Vaccine (VV-NP68) : Le laboratoire bénéficie d’une longue expérience de manipulation du virus VV-NP68 in vivo (10 ans). Nous infectons avec un titre viral modéré suffisant pour induire une réponse CD8 sans causer de pathologie détectable. En effet, aucun signe clinique (fièvre, perte de poids…) n’a jusque-là pu être associé à l’infection par VV-NP68.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvements des organes.

Remplacement

La procédure 1 consiste à étudier la capacité de greffe de CSH chez un hôte irradié. Les cellules souches greffées vont se différencier en différentes cellules de la lignée hématopoïétique (erythrocytes, lymphocytes …) qui vont coloniser les différents organes de l’hôte. La réponse immunitaire antivirale (procédure 2) est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires dans différentes localisations (poumons, ganglions drainants, rate …). Ces deux procédures ne peuvent être reproduites in vitro.

Réduction

Nous utiliserons 5 animaux par groupe expérimental, analysés individuellement. Un test de Mann-Whitney sera réalisé́ car la comparaison porte sur 2 groupes avec un faible nombre d’échantillons, et aucune hypothèse n'est présupposée. En considérant des différences de moyenne d'au moins 20% avec une déviation standard inférieure à 5% et un seuil minimal du risque alpha à 5%, un groupe de 5 animaux permet d’obtenir une puissance de test d'environ 0.8. Les expériences seront répétées une fois pour vérifier la reproductibilité́ et la validité des résultats. La procédure 1 sera réalisée avec des mâles et des femelles car un effect sexe dans les expériences de transfert de CSH a été rapportée par différentes études.

Raffinement

Une semaine d'acclimatation sera réalisée avant la mise en place de chaque procédure. A la réception, des groupes seront réalisés et maintenus tout au long de la procédure pour créer des groupes sociaux et éviter le stress dû à l'isolement. Tous les traitements/prélèvements sont administrés sous PSM II afin de prévenir tout risque d’infection opportuniste. Précautions particulières : x Irradiation : réalisée sur des animaux anesthésiés (Ketamine/xylazine), avec peu de douleur attendue. Le déssèchement des yeux lié à l’anesthésie sera prévenu par application d'ocrygel. Après irradiation, les souris seront placées en armoire chauffante jusqu'à leur réveil. Une surveillance sera réalisée dans les minutes qui suivent la greffe, le lendemain, puis chaque semaine afin de s’assurer qu’aucun signe de souffrance ne soit observé. x Injection de cellules et prélèvements de sang : un collyre anesthésique (tetracaine) est appliqué à l’œil avant la procédure pour réduire toute douleur. L’injection et le prélèvement de sang sont réalisés sous brève anesthésie à l’isofluorane. Dans le cas où l'œil montrerait des signes d'inflammation après l’injection, il sera soigné par l'application d'une pommade vétérinaire ophtalmique associant un corticostéroïde et un antibiotique (Fradexam). x Infection par le virus de la Vaccine (VV-NP68) : Les infections intranasales sont réalisées sur animaux anesthésiés (Ketamine/xylazine). Durant la phase de réveil, les 5 souris de la cage sont positionnées les unes à côté des autres afin de réduire les risques d’hypothermie. Le laboratoire bénéficie d’une longue expérience de manipulation du virus VV-NP68 in vivo (10 ans). Nous infectons avec un titre viral modéré suffisant pour induire une réponse CD8 sans causer de pathologie détectable. Aucun signe clinique (fièvre, perte de poids…) n’a jusque-là pu être associé à l’infection. Les animaux feront néanmoins l’objet d’une surveillance dans les minutes qui suivent l’infection, le lendemain, puis chaque semaine afin de s’assurer qu’aucun signe de souffrance ne soit observé. Si une souris présente des signes de souffrance tel que le pelage hérissé, la prostration ou l'absence de réponse aux stimuli extérieurs, elle sera exclue de la procédure et immédiatement mise à mort par dislocation cervicale.

Choix des espèces

Le projet vise à caractériser une lignée de souris, seul ce modèle sera utilisé dans ce projet. Les souris receveuses de la procédure 1 qui vont subir l’irradiation seront âgées de plus de 9 semaines. En effet, les souris plus jeunes supportent moins bien l’irradiation. Les souris donneuses de moelle osseuse de la procédure 1 et les souris de la procédure 2 seront âgées de 8-12 semaines, le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant.