Procédures légères

488 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales en sous-cutané ou près du tibia, puis l'injection de traceurs radioactifs pour l'imagerie, avant d'être tuées pour analyser la distribution des molécules. Le porteur reconnaît que la greffe près du tibia peut être douloureuse et gêner le déplacement une fois la tumeur développée. Il affirme qu'une étude in vitro "ne peut représenter la complexité du vivant" pour valider ces traceurs.

Objectifs

Les mutations des gènes de l’Isocitrate Déshydrogénase (mIDH) favorisent la progression tumorale. Ces mutations sont fréquemment identifiées dans des cancers comme le gliome ou le chondrosarcome (CHS), tumeurs solides infiltrantes et invasives, limitant une résection complète et provoquant souvent des récidives ainsi qu’une incapacité progressive des patients. De nouveaux inhibiteurs ciblant mIDH pourraient représenter de nouveaux espoirs de thérapie, mais leur succès repose sur une évaluation préalable de l’expression de mIDH dans ces tumeurs. Cependant, contrairement aux alternatives invasives comme la biopsie, les modalités d’imagerie non invasives pour la quantification de l’expression de mIDH n’ont été que peu étudiées pour ces tumeurs. Ce projet consiste en une approche translationnelle et multimodale de développement de méthodes d’imagerie, via des radiotraceurs marqués au fluor-18 pour l’imagerie par tomographie par émission de positons (TEP). Ces stratégies d’imagerie constitueraient un outil précieux pour une médecine de précision pour ces pathologies cancéreuses.

Bénéfices attendus

Si les résultats de biodistribution sont favorables au transfert et à évaluation clinique de radiotraceurs, la quantification de l’expression de mIDH sera évaluée par autoradiographie sur tissus de tumeurs cérébrales et de CHS issus de patients, afin de conduire pour la première fois à des données quantitatives concernant l’expression de mIDH sur des tumeurs humaines. Si ces résultats sont favorable, cette mutation et son impact métabolique seront également étudiés en clinique par spectroscopies per-opératives de résonance magnétique chez des patients atteints de gliome ou de CHS afin d’évaluer leur intérêt pour estimer plus précisément l’étendue de la résection à réaliser, paramètre impactant fortement le taux de survie. A plus long terme, Ces stratégies d’imagerie constitueraient un outil précieux pour une médecine de précision pour ces pathologies cancéreuses.

Procédures

L’ensemble des animaux recevra une injection sous cutanée ou paratibiale sous anesthésie gazeuse (durée 5min). Pour les animaux des lots 2 à 4, ils recevront également une injection intraveineuse (moins de 1min) en vigile entre 15 jours et 6 semaines après l’injection sous cutanée ou paratibiale.

Impact sur les animaux

L’injection des cellules en paratibiale pourrait entrainer une douleur poste injection (douleur anticiper par l’administration préventive d’antalgique (Rimadyl, 20mg/kg ou Méloxicam 5 mg/kg) en pré et post implantation. Une gêne au déplacement pourra aussi être observé une fois la tumeur ayant atteint un certain stade de développement.

Devenir

Procédure 1 et 2 : Mise à mort Lot 1 pour l’analyse protéique, génomique et histologique des tumeurs Procédure 3 : Mise à mort Lot 2 détermination de la distribution des radiotraceur dans les organes des animaux à différent temps Mise à mort Lot 3 analyses de spécificité de fixation par prélèvement Mise à mort du lot 4 analyses des métabolites sang et urine et tumeur

Remplacement

Suite aux études in vitro, le développement et la validation préclinique de nouveaux radiotraceurs requièrent la détermination de paramètres pharmacocinétiques des molécules candidates sur des modèles animaux adaptés. En effet, la physiologie globale de l’individu entre en jeu et une étude ex vivo ou in vitro ne peut représenter la complexité du vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum tout en permettant l’exploitation des résultats. Ce nombre a été calculé afin de garantir une signification statistique à l'étude menée. De plus, l’étude pilote (étude 1) et les examens d’imagerie (étude 3) permettent également de réduire le nombre d’animaux. Le nombre total d’animaux est de 488 souris maximum sur une période de 5 ans.

Raffinement

Les modèles animaux choisis sont reconnus par la littérature pour reproduire les caractéristiques de la pathologie humaine. Des méthodes sont utilisées afin d’optimiser au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimisées (portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, densité animale – minimum 3 animaux/cage-, enrichissement de milieu avec coton pour la nidification, bâtonnet de bois pour ronger et cabane de cachette). De façon usuelle, les cages (litière, cage, grille, couvercle et biberon) sont changées toutes les semaines. Une surveillance quotidienne des animaux permettra de déceler les premiers signaux de stress, de douleur ou d'inconfort pour l'animal qui pourront être améliorés par l'administration d'antalgiques (Rimadyl, 5mg/kg en sous-cutanée, 1 fois par jours pendant 5 jours maximum) avant l'atteinte des points limites définis (perte de poids supérieure à 20%, du poids maximal observé, prostration, hérissement du poil, volume tumoral, aspect du point d’injection…). Si aucune amélioration n’est observée, l’animal sera euthanasié. De plus, l’étude pilote ainsi que l’étude impliquant des examens d’imagerie permettent de raffiner cette étude en termes de caractérisation du modèle et d’examen non invasif.

Choix des espèces

Le modèle souris est classiquement utilisé en expérimentation animale dans le domaine de la recherche contre le cancer. De plus, les souris immunodéficientes porteuses de greffe de lignée tumorale humaine (xénogreffe) sont adaptés pour les études fondamentales et appliquées de développement de traitements des cancers humains. Des animaux de 5 à 7 semaines sont classiquement utilisés pour ce type de modèle.

4 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent gavages, injections répétées, greffes de moelle osseuse et prélèvements de sang et de fèces, une partie recevant du busulfan qui supprime l'immunité et peut provoquer des hémorragies sévères. Le porteur mène une recherche fondamentale sur des bactéries intestinales et écrit ne prévoir "aucune perte" et juger "négligeable" l'effet de l'hébergement en cage. Il conclut à la nécessité de la souris pour reproduire ces interactions entre hôte et bactéries.

Objectifs

Les bactéries filamentaires segmentées sont des bactéries naturellement présentes dans la flore intestinale de nombreuses espèces dont l’Homme. Ces bactéries sont attachées à la paroi intestinale de manière spécifique à l’espèce hôte. Ces bactéries peuvent entrainer une réponse immunitaire au niveau de l’intestin de leur hôte. Chez la souris, la colonisation par les bactéries filamentaires segmentées protège l’hôte de certaines bactéries infectieuses. Cette colonisation peut également accentuer la gravité de certaines maladies ayant pour cause un dysfonctionnement du système immunitaire de l’hôte. Pour ces raisons les bactéries filamentaires segmentées sont des bactéries clés à la fois dans l’évolution de la santé et de la maladie. Cependant de nombreux impacts de la colonisation d’un hôte par les bactéries filamentaires segmentées restent à définir. Au cours de notre projet nous tenterons de définir les impacts de la colonisation par les bactéries filamentaires segmentées sur l’activation de la réponse immunitaire. Nous étudierons également les mécanismes de détection des bactéries filamentaires segmentées par le système immunitaire de l’hôte. Nous évaluerons ensuite l’impact de la colonisation de l’hôte par les bactéries filamentaires segmentées sur l’évolution de la flore intestinale, mais également lors d’infection par des entéropathogènes.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est une meilleure compréhension des premiers évènements survenant pendant la colonisation des bactéries filamentaires segmentées chez l’hôte. De plus, nous comprendrons mieux comment la colonisation par les bactéries filamentaires segmentées a un impact sur l’évolution de la flore intestinales et la résistance aux infections bactériennes intestinales. Ces connaissances fondamentales constitueront la base d’une application des bactéries filamentaires segmentées dans l’amélioration de la santé intestinale dans le futur.

Procédures

Au cours de notre projet les animaux subiront différentes interventions en fonctions des procédures expérimentales. En ce qui concerne la colonisation et l’inoculation de bactéries, un gavage ponctuel sera réalisé sur 3456 animaux éveillés, 2 gavages ponctuels et distant de 21 jours seront réalisés sur 864 animaux éveillés. En ce qui concerne les traitements par injection, sur une période de 6 jours, 2 injections ponctuelles distantes de 5 jours seront réalisées sur 96 animaux éveillés. Sur une période de 7 jours, 3 injections ponctuelles distantes de 3 jours seront réalisées sur 96 animaux éveillés. Sur une période de 8 jours, 1 injection ponctuelle par jour sera réalisé sur 288 animaux éveillés. Sur une période de 5 jours, 1 injection ponctuelle par jours sera réalisé sur 1728 animaux éveillés. En ce qui concerne la greffe de moelle osseuse, 1 injection ponctuelle sera réalisée sur 1728 animaux sous anesthésie générale. En ce qui concerne le traitement administré par l’eau de boisson, sur une période de 4 jours, une administration en continue sera réalisée sur 24 animaux éveillés. Sur une période de 8 jours, une administration en continue sera réalisée sur 24 animaux éveillés. Sur une période de 22 jours, une administration en continue sera réalisée sur 24 animaux éveillés. En ce qui concerne le prélèvement de fèces, sur une période de 5 jours, 1 prélèvement sera réalisé tous les jours sur 1728 animaux éveillés. Sur une période de 22 jours, 1 prélèvement sera réalisé tous les 2 jours sur 864 animaux éveillés. En ce qui concerne le prélèvement de sang, 2 prélèvements sanguin distant de 60 jours seront réalisés par ponction sur 1728 animaux éveillés.

Impact sur les animaux

Durant notre projet certaines procédures entraineront des nuisances et effets secondaires sur les animaux. La procédure de gavage bien que non douloureuse pour l’animal entrainera une nuisance uniquement lors de la manipulation de l’animal. L’inoculation de bactérie aura pour effets indésirables des troubles gastriques sans gravités dus au changement de la flore intestinale. L’injection entrainera une nuisance uniquement lors de la manipulation. Toutes les substances injectées ou administrées à l’animal à l’exception du busulfan n’auront pas d’effets indésirables sur les animaux. Le traitement au busulfan aura comme effets indésirables attendus une suppression des cellules responsables de l’immunité. Nous pourrons observer également comme effets secondaires, des troubles de la nutrition, diarrhée, inflammation au niveau du site d’injection, ainsi que de manière exceptionnelle des hémorragies sévères dues à une diminution du nombre de plaquettes. En ce qui concerne les prélèvements effectués chez l’animal, seul le prélèvement sanguin entrainera une nuisance après le prélèvement. Cette nuisance se caractérisera par une fatigue transitoire après le prélèvement.

Devenir

A la fin de chaque procédure expérimentale la totalité des animaux sera mise à mort par dislocation cervicale ou inhalation progressive de CO2 dans un système dédié. Nous justifions cela par la nécessité à la fin de chaque procédure de procéder au prélèvement d’organe tel que la rate, le foie, le ccum, le colon ainsi que les ganglions lymphatiques. Ces organes sont des organes vitaux ce qui exclut pour des raisons éthiques leur prélèvement sur animaux éveillés. Les animaux qui ne seront pas prélevés en raison de leur exclusion d’un lot expérimentale afin de ne pas compromettre les résultats d’une expérience seront également mis à mort par dislocation cervical ou inhalation progressive de CO2 dans un système dédié. Nous justifions cela par l’impossibilité de réutiliser, replacer ou adopter ces animaux à la fin de nos procédures expérimentales.

Remplacement

La culture en laboratoire des bactéries filamentaires segmentées reste très difficile et limitée dans le temps. Ceci limite l'utilisation de système artificiel. Les systèmes artificiels seuls ne nous permettrons pas d'atteindre les différents objectifs de recherche décris dans ce projet. Afin de caractériser en détail les interactions complexes entre bactéries filamentaires segmentées et son hôte, nous devons avoir recours à un modèle animal pouvant reproduire ces types d'interactions en laboratoire et ce dans différentes conditions avec des paramètres contrôlés. La souris est la solution que nous avons retenue pour atteindre nos objectifs. La grande variété de modèle disponible pour cet animal et ça similarité anatomique et physiologique avec l'humain en font un modèle adapté pour atteindre les objectifs de notre projet.

Réduction

Dans un principe de réduction nous avons conçu nos expérimentations en réduisant au minimum le nombre de procédure expérimentale. Ainsi chaque procédure expérimentale nous permettra d’atteindre spécifiquement un des objectifs précédemment décrits. Nous nous sommes assurés d’exclure toute répétition et de garantir l’obtention de résultats originaux. Pour l’ensemble de nos procédures et afin d’obtenir des résultats significatifs nous avons fixé un niveau de risque suffisamment faible et une puissance élevée afin d’obtenir avec un minimum d’animaux des résultats expérimentaux incontestables. Les animaux seront hébergés en groupe de 5. Nous ne prenons pas en compte l’effet lié à l’hébergement en cage que nous jugeons négligeable durant nos expériences. Lors de la réalisation de nos expérimentations nous ne prévoyons aucune perte. Nous décidons d’utiliser 12 animaux par groupe. Ce nombre nous permettra d’obtenir lors de nos analyses statistiques des résultats significatifs. Nous utiliserons lors de nos procédures expérimentales des animaux ayant des caractéristiques similaires nous permettant de diminuer la variabilité entre individu et indépendante de nos protocoles expérimentaux.

Raffinement

Dans un principe de raffinement, et afin de limiter l’impact de la vie en captivité, les animaux seront hébergés dans des cages enrichies avec des cylindres de coton, des bâtons à ronger et un tunnel. Les animaux seront hébergés en groupe. Le nombre d’animaux par cage ne pourra être supérieur à 5. En conditions d’hébergement sans microorganisme les animaux seront hébergés dans les mêmes conditions. Nous avons également favorisé aux maximum les procédures non invasives, et limité à l’essentiel les procédures invasives. Les procédures invasives décrites ci-dessous seront réalisées par un personnel correctement formé et limité au maximum dans le temps. Afin de diminuer les désagréments et les douleurs lors de certaines expérimentations les animaux seront anesthésiés. Toutes les expérimentations incluant un traitement avec une substance chimique pouvant potentiellement induire des effets secondaires, ont été conçues afin de réduire au maximum la posologie du traitement tout en garantissant l’induction des effets souhaités chez l’animal. Des points limites généraux et spécifiques à chaque procédure, suffisamment prédictifs ont été mis en place. Si aucun moyen efficace n’est disponible afin de supprimer la souffrance, la douleur et l’angoisse de l’animal sans compromettre les résultats de nos expériences, l’animal sera mis à mort. Le bien-être animal sera une priorité lors de notre projet de recherche et ce dernier sera régulièrement évalué et optimisé au cours de notre projet.

Choix des espèces

Nous avons choisi d'utiliser cette espèce car elle présente de nombreux avantages pour notre projet d'étude. Cette espèce peut nous fournir un grand nombre de modèle génétique et d'individu dépourvus de flore bactérienne nécessaires pour notre projet. Cette espèce possède également une grande similarité anatomique de son système digestif avec l'Homme. Il en est de même du point de vu immunitaire. Cette espèce est également facile à manipuler en laboratoire ce qui participera de limiter les risques liés aux manipulations expérimentales. L’hébergement séparé des mâles et des femelles est également possible. Des souris mâles et femelles de chaque espèce, âgées de 8 à 12 semaines, seront utilisées. Pour cette étude nous avons choisi de travailler avec des souris adultes dont le système immunitaire et la flore intestinale sont pleinement développés. De plus, les procédures de manipulation telles que le gavage et l'injection sont plus faciles à réaliser chez les souris adultes, ce qui minimise les douleurs inutiles dues aux manipulations.

Toutes tuées à la fin de chaque procédure, 3 350 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour évaluer des candidats vaccins et des virus de la rougeole modifiés contre le cancer. Une partie est infectée par des virus humains ou par le parasite du paludisme des rongeurs Plasmodium berghei, une infection qui peut entraîner selon le porteur fièvre, prostration, perte de poids et paralysie, avec une mise à mort dès le score 2 de sa grille de douleur. D'autres reçoivent une greffe de cellules tumorales, avec des tumeurs qui peuvent s'infecter ou s'ulcérer, et des injections de vaccins une à deux fois par semaine pendant dix semaines au plus. Pour la virothérapie des cancers, le porteur invoque un "besoin médical" et un "marché" qu'il dit "également immenses".

Objectifs

L’objectif du projet est l’évaluation préclinique chez la souris de l’immunogénicité et de l’efficacité des différents candidats vaccins développés au laboratoire. Les capacités anticancéreuses de virus de la rougeole modifiés seront aussi évaluées dans des modèles de greffes de tumeurs syngéniques. Ces objectifs sont justifiés du point de vue scientifique car ils permettent de démontrer la fonctionnalité des candidats vaccins ou thérapeutiques. Le but ultime de ce projet est la mise à disposition de vaccins préventifs contre plusieurs pathologies infectieuses graves, ainsi qu’un possible traitement contre certains cancers, deux domaines d’impact majeur en santé publique.

Bénéfices attendus

Les candidats vaccins développés dans le laboratoire sont destinés à être évalués par la suite dans des essais cliniques. Leur évaluation préalable dans un modèle murin permet de démontrer leur efficacité et leur sûreté préclinique et de définir les doses et schémas vaccinaux. Le but ultime de ce projet est la mise à disposition de vaccins préventifs contre plusieurs pathologies infectieuses graves pour lesquelles le besoin médical est immense, ainsi qu’un traitement viro-thérapeutique contre certains cancers pour lesquels le besoin médical et le marché sont également immenses.

Procédures

Les animaux sont immunisés par voie intrapéritonéale, intramusculaire, intradermique, intraveineuse ou orale selon l'agent pathogène ciblé (quelques secondes par animal). Les prélèvements sanguins à la veine rétro-mandibulaire sont effectués à J0 - J7 - J28 - J60 après la vaccination (quelques secondes par animal). Pour évaluer l'efficacité des vaccins, certaines souris seront confrontées à des épreuves infectieuses (quelques secondes par animal) par des virus humains pathogènes ou non-pathogènes chez les souris contrôles ou par le parasite du paludisme Plasmodium berghei, pathogène. Le suivi du challenge est effectué sur une goutte de sang récupérée à la queue de chaque animal à J1, J2, J3, J5, J7, J10 (quelques secondes par animal). Pour évaluer les propriétés immuno-oncolytiques des vaccins, les souris seront greffées avec des cellules tumorales (quelques minutes par animal). Le traitement des tumeurs est effectué par des injections intratumorales, intrapéritonéales, intramusculaires, intradermiques ou intraveineuses de vaccins recombinants contre la rougeole (quelques secondes par animal). Les vaccins candidats sont inoculés (quelques secondes par animal) une ou deux fois par semaine pendant un maximum de 10 semaines.

Impact sur les animaux

Pour évaluer l'efficacité des vaccins recombinants, certaines souris seront confrontées à des épreuves infectieuses par des virus humains pathogènes ou non chez les souris contrôles, ainsi que par le parasite du paludisme murin Plasmodium berghei, également pathogène. Selon l'agent testé, l'infection peut entraîner une souffrance (fièvre, prostration, perte de poids, paralysie) qui précédera la mort de l'animal. Pour évaluer les propriétés anticancéreuses des candidats vaccins, les souris seront greffées avec des cellules tumorales syngéniques qui peuvent entrainer des effets indésirables. En effet, la croissance des tumeurs chez la souris peut provoquer une gêne ou affecter le comportement ou la locomotion. La tumeur peut s'infecter ou s'ulcérer.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.

Remplacement

Il n'existe pas d'alternatives non-animales dans le domaine de la recherche préclinique sur les vaccins recombinants. En absence de telles alternatives, l'utilisation d'animaux vivants dans les procédures expérimentales est prévue pour atteindre les objectifs du projet. L'étude des réponses immunitaires des candidats vaccins nécessite l'utilisation d'un organisme vivant entier avec un système immunitaire développé. Le virus de la rougeole (sauvage ou vaccinal) n’infecte que les primates, dont l’homme. Dans ce contexte et en premier choix, nous avons opté pour un modèle non-primate, mais présentant une organisation tissulaire et du système immunitaire proche de l’homme. Ainsi, un modèle de souris IFNAR ou hCD46/IFNAR permissif pour la rougeole est utilisé pour étudier les réponses immunitaires aux candidats vaccins.

Réduction

Pour appliquer le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés, nous composons les groupes d’animaux « contrôles » de 4 souris et les groupes « test » de 6 souris. Ainsi deux souris sont épargnées à chaque test. Par la suite nous pourrons diminuer le nombre d’animaux à 4 dans les groupes « contrôle négatif » car, d’une expérience à l’autre, ces animaux contrôles reçoivent systématiquement le vaccin rougeole standard Schwarz et que la réponse des souris à l’immunisation est relativement homogène d’un animal à l’autre. Les groupes « test » sont composés de 6 souris, le nombre minimal d’animaux pour que les résultats soient statistiquement significatifs, comme validés par un bioinformaticien en interne. Le nombre de souris utilisées par groupe représente la moitié des normes utilisées dans l’industrie du vaccin. Nous pouvons appliquer cette réduction car nous observons des effets forts : réponses immunitaires présentes ou absentes ; protection d’épreuves infectieuses efficace ou non. Ces observations sont basées sur notre longue expérience (67 publications dans ce domaine).

Raffinement

Les animaux soumis à des procédures qui produisent une douleur ou une détresse minimale/transitoire seront suivis par une observation quotidienne. Lorsque les animaux subiront des épreuves infectieuses, ils seront également contrôlés quotidiennement. En effet, selon le pathogène utilisé, l’infection pourra entraîner une souffrance (fièvre, prostration, perte de poids, paralysie) qui précèdera la mort de l’animal. La mort des animaux comme point limite est strictement évitée. Les animaux seront surveillés quotidiennement et une grille évaluation douleur stress inconfort sera utilisée pour noter la douleur et la détresse qui peuvent survenir chez les animaux exposés à des agents pathogènes connus pour provoquer des effets graves. Nous suivrons : 1) L'apparence générale (poil luisant/terne, hérissé, état d'embonpoint, perte de poids, rétrécissement des orbites oculaires, renflement du nez, changement de position des vibrisses. 2) Signes cliniques : respiration, posture, activité, fèces, pli cutané. 3) Comportement : comportement normal/agitation, mobilité, mâchonnement des barres, déplacement en cercle, saut arrière. Pour éviter au maximum la douleur et la détresse nous suivrons les recommandations suivantes : mise à mort en cas de score 2 et observation quotidienne si score >0. Un aliment enrichi sera ajouté et l'enrichissement de l’environnement sera amélioré dès le début des procédures des épreuves infectieuses.

Choix des espèces

Le virus de la rougeole (sauvage ou vaccinal) n’infecte que les primates, dont l’homme. Dans ce contexte et en premier choix, nous avons opté pour un modèle non-primate, mais présentant une organisation tissulaire et du système immunitaire proche de l’homme. Ainsi, un modèle de souris permissif pour la rougeole est utilisé pour étudier les réponses immunitaires aux candidats vaccins. Nous utilisons ces souris depuis de nombreuses années et avons publié un grand nombre d’articles décrivant leurs propriétés et leurs qualités dans ce contexte. Pour étudier les propriétés immuno-oncolytiques du virus de la rougeole, des modèles de greffe de tumeurs sont utilisés. Age moyen des animaux : 11 semaines +/- 4 semaines. Les animaux doivent être matures au plan immunologique. Par ailleurs les jeunes individus répondent mieux que les plus vieux. Enfin, il est inutile de laisser vieillir les animaux avant utilisation.

2 907 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des bactéries par voie intratrachéale sous anesthésie, par voie intranasale et par gavage, puis sont euthanasiées pour prélèvement d'organes. Le porteur indique une perte de poids transitoire et modérée après l'infection respiratoire. Il affirme que les paramètres étudiés ne peuvent aujourd'hui être "remplacés par des procédures in vitro" et que le recours au modèle animal est "indispensable".

Objectifs

Les BGN comme Escherichia coli ou Pseudomonas aeruginosa sont fréquemment responsables de pneumopathies en Réanimation et l’évolution très préoccupante des résistances aux antibiotiques chez ces bactéries complique la prise en charge de ces infections.Elles peuvent conduire à des situations d'impasse thérapeutique, rendant nécessaire le développement de nouveaux traitements curatifs et/ou préventifs. La présence de certaines espèces au niveau pulmonaire (streptocoques, bactéries anaérobies) pourrait avoir un effet protecteur contre le développement de pneumopathies, mais les interférences entre cet écosystème et les bactéries pathogènes ont été peu explorées et les effets de ce microbiote sur la muqueuse pulmonaire et les défenses immunitaires locales ne sont pas encore bien compris. Notre projet vise à étudier dans un modèle murin, les effets de streptocoques oraux commensaux (S. mitis, S. oralis, S. salivarius) sur la muqueuse pulmonaire et les populations cellulaires résidentes, et à analyser les conséquences d’une colonisation pulmonaire par streptocoque sur l’implantation/infection secondaire àBGN.

Bénéfices attendus

Notre travail devrait permettre de décrire les effets de streptocoques oraux sur la muqueuse pulmonaire, l’immunité locale, et la prolifération pulmonaire de BGN pathogènes. De récentes études cliniques rapportent que l'administration de probiotiques (Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus) chez des patients de réanimation, serait associée à une diminution du risque de pneumopathie. Cependant, les niveaux de preuve actuels ne permettent aucune recommandation. Le travail que nous proposons devrait fournir un rationnel pour leur utilisation ou non.

Procédures

Tous les animaux (mis à part les controles) seront soumis à une administration intra-trachéale de streptocoques en probiotique ou de PBS sous anesthésie générale par inhalation en continu d’isoflurane (3% débit de gaz frais0.8L/min). Le geste de l’injection intratrachéale, en tant que tel, dure au maximum 1 minute et le réveil est presque instantané Procédures 2, 3 et 4 : Tous les animaux de ces procédures (sauf les animaux contrôles) recevont une ou plusieurs adminitrations de supsensions bactériennes ou de PBS par voies intra-nasale et orale (gavage). Ces gestes durent quelques minutes et sont réalisés sur animaux vigiles. Procédure 4 : Tous les animaux de cette procédure (sauf les animaux contrôles) recevont une 2eme adminitration de supsensions bactériennes ou de PBS par voie intra-trachéale sous anesthésie. En fonction de l’état général des souris (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections SC de 30µl de buprénorphine (0.05 – 1 mg/kg) pourraient être réalisées.

Impact sur les animaux

Les modèles d’inflammation respiratoires aigues (partie 3) sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3jours) et modérée (< 10%) est observée, sans perte de motricité. Après J2, les souris reprennent une courbe de poids normale. Pour les autres parties du projet, suite à la colonisation bactérienne en IT, les animaux pourraient présenter, au cours des 24 premières heures du protocole, les effets indésirables suivants : Poils hérissés et perte de poids.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications immunologiques.

Remplacement

Les paramètres étudiés dans ce travail ne peuvent être aujourd’hui remplacés par des procédures in vitro et le recours à l’utilisation de modèles animaux est indipensable

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au minimum (n=8) afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Lesvariables seront considérées comme non-paramétriques. Elles seront exprimées en médiane et comparéesen utilisant le test de Mann-Whitney. Une valeur de p

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux dans des cages enrichies en frisottis, de taille suffisante et dont la litière est changée une fois par semaine. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation des points limites a été mis en place (annexe 2). Les procédures sont de courtes durées et n’entrainent pas de douleur résiduelle. Pour chaque procédure nécessitant une anesthésie générale, le réveil complet des souris s’effectue en cage sous surveillance jusqu’à reprise d’un comportement normal. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage de 24G est préalablement enduite de lidocaïne (1mg/kg) afin d’anesthésier localement la trachée.

Choix des espèces

Les modèles murins de pneumonie est un modèle bien caractérisé, reproductible, et parfaitement adapté pour tous les types d’analyses prévus pour cette étude. 7-14 semaines de vie. A ce stade le système immunitaire est mature

3 640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une insuffisance rénale aiguë leur est provoquée par ischémie-reperfusion ou par injection d'agents néphrotoxiques, avec un taux de mortalité de 20 à 30 % lié à cette induction, puis des traitements sont testés pour bloquer la fibrose du rein. Le porteur affirme que cette pathologie complexe est "impossible à reproduire sur des modèles in vitro simplifiés". Il indique retenir la souris comme celle "la moins susceptible de ressentir de la douleur", formulation générique accompagnant le choix de l'espèce.

Objectifs

Etudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de l’insuffisance rénale aiguë (IRA) induite par des agents néphro-toxiques et sa progression vers l’insuffisance rénale chronique.

Bénéfices attendus

Meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques mis en jeu lors d'une agression rénale aigue et recheche d'acteurs potentiels dans la mise en place de fibrose rénale.

Procédures

L'IRA sera induite par ischémie-reperfusion ou injection d'agents néphrotoxiques (glycérol ou PHZ). Après caractérisation des modèles, les souris seront exposées à des traitements pharmacologiques ou moléculaires susceptibles de bloquer la fibrose rénale. Avant leur sacrifice, les animaux seront soumis à des investigations in vivo pour évaluer la fonction rénale (diurèse, débit de filtration glomérulaire). Des prélèvements de quelques gouttes de sang au niveau de l'artère caudale (volume inférieur à 50µl) pourront être effectués à H6 (Rhabdomyolyse) et J2 après l'induction d'IRA pour évaluer la fonction rénale.

Impact sur les animaux

Procédure #1: stress transitoire lié à la chirurgie, apparition progressive d'une insuffisance rénale Procédure #2: stress transitoire lié à l'injection du glycerol, apparition progressive d'une insuffisance rénale Procédure #3: apparition progressive d'une insuffisance rénale Procédure #4: léger stress transitoire lié à l'irradiation Procédure #5: léger stress transitoire lié à l'installation des capateurs Procédure #6: léger stress transitoire lié aux cages métaboliques

Devenir

Procédures #1, #2 et #3 : gardés en vie en vue de leur utilisation dans les procédures 5 à 7. Procédure #4 : gardés en vie en vue de leur utilisation dans les procédures 1 à 3 puis 5 à 7.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation sur des animaux est justifié par le fait qu’une insuffisance rénale aiguë est une pathologie complexe, impliquant différents compartiments cellulaires (épithélium, vaisseaux, cellules immunitaires…), impossible à reproduire sur des modèles in vitro simplifiés. (ex : cultures cellulaires).

Réduction

Les effectifs des cohortes sont réduits au maximum dans la limite de l’outil statistique. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons sont extraits de l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de matériel biologique.

Raffinement

Tous les animaux sont hébergés dans un service de zootechnie agréé par le ministère dans un environnement enrichi (ajout de papier essuie tout pour la nidification). Pendant toute la durée de nos études, les animaux sont suivis quotidiennement, pesés au moins une fois par semaine afin d’identifier une potentielle souffrance. Compte tenu du risque de mortalité (environ 20-30%) lié à l'induction d'IRA (ischémie reperfusion ou l'injection d'agents nephrotoxiques (glycerol ou PHZ)), 5-6 animaux par groupe avec 3 à 4 protocoles seront suffisants. Les comparaisons entre groupes traités et non traités seront réalisées en utilisant un test de Mann-Whitney ou Kruskal-Wallis

Choix des espèces

L’espèce utilisée permet d'utiliser le moins d'animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons le plus souvent la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. adultes de 8-20 semaines

5 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Greffées avec des cellules humaines, elles subissent une irradiation sublétale, des prélèvements de sang, des chirurgies puis une infection par des virus comme le VIH ou les hépatites B et C, pour étudier ces infections et tester des traitements. Le porteur indique que certaines souris présentent un poids réduit lié à une déficience hépatique et peuvent développer une dermatite, avec mise à mort si le score de souffrance atteint le point limite. Il présente ce modèle comme le "seul" permettant ces infections et comme une alternative au recours aux primates non-humains.

Objectifs

Ce projet utilise le seul modèle murin expérimental qui permet de suivre la progression in vivo des infections par des virus à tropisme restreint aux humains et aux primates non-humains. Dans ce projet, nous souhaitons étudier la physiopathologie induite par l’infection des virus de l’immunodéficience humaine (VIH), d’Epstein-Barr (EBV), de l’hépatite B (VHB), et de l’hépatite C (VHC) en suivant les réponses immunitaires, et évaluer l’impact des nouvelles approches antivirales ou vaccinales. Ce type d’expérimentation ne peut pas être mené chez l’hôte naturel de ces virus pathogènes (l’homme) et s’avère de plus en plus difficile à mettre en place chez des primates non-humains. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces virus, des modèles de souris humanisés pour le système immunitaire (souris HIS), ou pour le foie avec l'ajout d'hépatocytes humains (souris HUHEP), ont été développés au cours des deux dernières décennies. Comme premier modèle, nous avons généré des souris immunodéficientes (BRGS), par l’invalidation fonctionnelle des gènes codant pour certaines protéines. Les principaux mécanismes de rejet de greffe sont absents chez ces souris ce qui permet l’établissement d’une xénogreffe hématopoïétique humaine après injection de cellules souches hématopoïétiques humaines (HSC). Des études précédentes ont montré que les souris HIS étaient susceptibles aux infections par les virus HIV ou EBV, et modélisaient les réponses immunitaires humaines. Un second modèle murin immunodéficient porte en plus un gène urokinase plasminogen activateur (uPA) qui est toxique pour les hépatocytes dans le foie, ce qui induit une déficience hépatique. Ces souris sont greffées avec des hépatocytes humains adultes sains qui participent à la régénération du foie et constituent le modèle HUHEP. Des études précédentes ont montré que les hépatocytes humains pouvaient être infectées par les virus VHB et VHC ainsi que par le parasite de la malaria (Plasmodium falciparum) chez ces souris HUHEP. La combinaison des deux modèles ci-dessus, dite HIS-HUHEP permet une étude approfondie des interactions entre le système immunitaire et le foie dans le cadre d’infections hépatiques (VHB, VHC, P. falciparum). Celui-ci permet de décortiquer les mécanismes d’infection et de mieux comprendre la pathogénèse complexe induite par ces microbes invasifs.

Bénéfices attendus

Ces modèles animaux permettront de mieux caractériser les mécanismes d'infection et de réplication des virus (VIH, EBV, VHB, VHC), le rôle du système immunitaire dans l'évolution des pathologies, ainsi que de tester des nouvelles stratégies thérapeutiques et vaccinales. Bien que des traitements thérapeutiques existent pour les patients atteints de VIH, un vaccin thérapeutique permettrait de contrôler les infections de manière pérenne. Il n’existe pas de vaccin préventif pour le VIH et le VHC, ainsi des millions de nouvelles infections surviennent par an, ne permettant pas d’éliminer ces virus de la population globale. Bien qu’un vaccin sûr et efficace existe pour le VHB, plus de 260 millions de personnes sont actuellement infectées et seul 1% de ces patients ont accès aux traitement thérapeutiques, le VHB induit des hépatocarcinomes à mauvais pronostique. Ces traitements, comme celui pour le VIH, doivent être pris à vie, induisant un coût élevé pour la société et un risque de survenu d’échappement virologique. Ainsi, les recherches se poursuivent pour développer des vaccins, ou des traitements curatifs, pour ces pathologies. L’interaction entre la réponse immunitaire et le virus est essentiel dans la progression de la pathologie, comprendre ces mécanismes d’action est une clé de voute pour développer des nouveaux concepts de traitements à visé thérapeutiques, ou des vaccins. Or, les modèles animaux qui permettent d’étudier ces interactions sont rares étant donné que ces virus n’infectent que des cellules humaines ou de chimpanzés. Afin de modéliser ces questions, nous avons développé des modèles de souris greffées avec des cellules humaines qui sont susceptibles à ces virus, permettant d’étudier les réponses immunitaires antivirales humaines. L’ensemble de ces études participe à comprendre la physiopathologie induite par ces virus chez l’humain, et à développer des nouveaux traitements thérapeutiques et des stratégies vaccinales afin d’éliminer ces maladies.

Procédures

Les procédures expérimentales décrites prévoient les interventions suivantes : irradiation avec des doses sous-létales (une fois par vie, 1-3 minutes), prélèvements sanguins en retro-mandibulaire (chaque prélèvement dure quelques secondes et est réalisé tous les 15 jours au maximum), anesthésie et procédures chirurgicales (une fois par vie, environ une heure et demi par animal), infection par des virus (une fois par vie, chaque infection dure quelques secondes).

Impact sur les animaux

Le degré de gravité des procédures est considéré comme léger (injections et prélèvements) ou modéré (conséquences potentielles à long terme de l’irradiation sous létale ou chirurgie). Les animaux portant le transgène uPA ont un poids réduit (autour de 10% en dessous du poids normal) du à leur déficience hépatique qui entraîne des défauts métaboliques. Ce poids diminué n’affecte pas le comportement des animaux, n’entraîne pas de souffrances, ni de stress, d’après nos observations sur plusieurs années d’expérimentation. Les animaux humanisés pour le système immunitaire et exprimant le transgène TSLP peuvent développer une dermatite. Afin de soulager la dermatite, les animaux seront traités avec une solution antiseptique (bétadine) avec un anesthésiant locale (lidocaine) et ils pourront être hébergés sur une litière de cellulose plus adaptée aux peaux sensibles. Leur phénotype est suivi toutes les semaines selon les critères et les points limites suivants : 1. Apparence global de l’animal score 0 : normal score 1: poils ébouriffés, rougeur de peau ou perte de poils sur moins de 50% du corps, expression faciale modérée, animal en mouvement score 2: dos voûté, perte de poils sur plus de 50% du corps, expression faciale sévère, absence de mouvement, prostration. 2. Conditions corporelles (cachexie) score 0: BCS (Body Condition Scoring) 3: L’animal est bien conditionné. La colonne vertébrale est continue. Vertèbres palpables seulement avec une pression ferme. score 1: BCS 2: L’animal est sous-conditionné. Segmentation de la colonne vertébrale évidente. Les os du bassin dorsal sont facilement palpables. score 2: BCS 1 : L’animal est amaigri. Structure squelettique extrêmement visible et peu ou pas couverte par la chair. Vertèbres distinctement segmentées 3. Poids score 1: perte de plus de 10% du poids score 2: perte de plus de 20% du poids Le point limite est défini par la détection d’un score =2 Si un score > 0 est observé, les animaux auront une surveillance renforcée. Si un score = 2 est observé, les animaux seront mis à mort.

Devenir

A l’issu de la procédure expérimentale #1 les animaux seront mises en expériences suivant les procédures expérimentales # 2, 3, 4 et 6. A la fin de ces procédures expérimentales les animaux seront mis à mort pour être analysés afin de caractériser la physiopathologie et la réponse immunitaire induite par les virus VIH, VHB, VHC, EBV. A l’issu de la procédure expérimentale #5 les animaux seront mis en accouplement.

Remplacement

Ce projet nécessite un modèle expérimental soutenant l’ensemble des mécanismes de la physiopathologie induite par une/des infection(s) virale(s). Or, de nombreux exemples démontrent que les tests d’efficacité de thérapies antivirales in vitro ne se confirment pas systématiquement in vivo en phase clinique chez l’Homme du fait des dynamiques complexes mises en jeu dans l’organisme (cinétique de l’infection; distributions cellulaires ; bio-distribution des composés; réponse immunitaire). Historiquement, les modèles infectieux de choix restent le macaque pour le VIH (avec le virus simien apparenté VIS ou l’hybride SHIV) et le chimpanzé pour le VHC et le VHB. En proposant comme modèle alternatif la souris humanisée pour le système immunitaire et/ou le foie, nous appliquons de manière relative le principe de remplacement en écartant l’utilisation de primates non-humains, avec l’avantage supplémentaire d’utiliser un modèle expérimental directement adapté au pathogène humain natif. A ce titre, les souris HIS et HIS-HUHEP sont le seul modèle expérimental correspondant à ces critères (mis à part l’Homme lui-même, chez lequel il est éthiquement inacceptable de tester directement de nouvelles stratégies préventives ou thérapeutiques).

Réduction

Le plan d’étude bénéficie de nos connaissances antérieures obtenues avec des souris humanisées sur l’infection par le VIH et le VHB. De plus, nous utilisons un modèle de souris HIS qui est à la pointe du domaine, ce modèle est sans cesse optimisé pour une meilleure prise de la xénogreffe humaine, ce qui diminue la variabilité intrinsèque au modèle et réduit d’autant le nombre d’animaux requis par expérience. Il sera essentiel de compter un minimum de 10 animaux par groupe, du fait de cette variabilité intrinsèque, et d’inclure l’ensemble des groupes contrôles pour valider les conclusions de chaque étude. La planification des expériences en amont et la concertation entre les membres de l’équipe seront des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux.

Raffinement

Les cages d’hébergement sont enrichies avec un coton dentaire permettant une nidification, et avec des refuges en forme de dômes en cellulose dans les cages de croisements. Par ailleurs, le stress des animaux est largement diminué par l’utilisation d’analgésiques et d’antalgiques lors de la majorité des procédures. L’isoflurane par voie respiratoire présente l’avantage d’être un anesthésiant permettant des séquences d’endormissement courtes et répétées. Les soins post-opératoires tels que des pansements, du gel oculaire, une réhydratation par voie sous-cutanée, et une alimentation hydratante (DietGel) sont inclus dans nos protocoles expérimentaux.

Choix des espèces

La souris HIS est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale soutenant une infection productive par le VIH. La souris HUHEP greffée avec des hépatocytes humains est permissive aux infections hepatotropiques (VHB, VHC, P. falciparum). Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. Les souris humanisées pour le système immunitaire (HIS) sont générées par injection de cellules souches hématopoïétiques humaines CD34+ dans des souriceaux nouveau-nés (