Procédures légères

660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie reçoit des injections pour modifier un gène pendant le développement du rein, une autre des greffes de cellules de cancer du rein humain et des injections d'anticorps, avant prélèvement des tissus. Le porteur indique que les tumeurs à croissance lente entraînent une gêne non douloureuse et qu'une perte de poids supérieure à 20 % déclenche la mise à mort. Il affirme que le développement du rein, trop complexe pour être reproduit in vitro, rend l'approche animale "indispensable".

Objectifs

Le rein par sa fonction est un élément central dans la régulation de l'organisme. Les reins ont pour tâche de filtrer le sang et de produire l'urine. En outre, Le rein produit un certain nombre d’hormones capitales dans la régulation de la tension artérielle. Les pathologies renales dont les cancers du rein sont un problème majeur de santé publique avec ~400 000 nouveaux cas par an dans le monde. Le Carcinome à cellules Rénales (RCC) est subdivisé en 3 grands sous-types histologiques et moléculaires : les RCCs à cellules claires (ccRCCs), les RCCs papillaires (pRCCs) et les RCCs chromophobes (chRCCs). Ils représentent respectivement ~75%, ~15% et ~5% des RCCs. Ce projet s’intéresse au rôle d’un facteur de guidage axonal au cours du développement et durant les processus de tumorigenèse. Ce facteur de guidage axonal est principalement connu pour contrôler le développement du cerveau et des organes branchés (poumon, glande mammaire). En outre, de plus en plus de preuves suggèrent que ce facteur de guidage est aussi impliqué dans le cancer. En effet, cette molécule de guidage axonal se comporte comme un facteur de survie pour les cellules cancéreuses. Il a été démontré que l’expression de ce facteur de guidage axonal est gagnée dans les neuroblastomes, les cancers du sein et du poumon. Une étude bioinformatique conduite au laboratoire a mis en évidence une très forte expression de notre facteur de guidage axonal dans un sous type de RCCs : chromophobe RCCs. Des études in vitro réalisé sur une lignée cellulaire de chRCCs, ont montré que ce facteur de guidage axonal favorise la survie des cellules cancéreuses. Afin de tester chez l'animal (in vivo) le rôle facteur de survie de notre molécule de guidage axonal sur les chRCCs, il sera réaliser des expériences de xénogreffes chez la souris « nude » de cellules de lignée chRCCs. En outre, il est intéressant de remarquer que le rein est aussi un organe branché. Le rôle de notre facteur de guidage axonal dans la morphogenèse du rein sera testé à l’aide de modèles murins génétiquement modifiés.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d’une part de mieux comprendre le développement du rein (procédure 1). En effet, si nous voulons mieux comprendre les différentes pathologies touchant le rein, il est indispensable de bien caractériser son développement. La procédure 1 est donc à visée fondamentale et devrait permettre de mieux comprendre les contributions d’un facteur de guidage axonal dans le développement du rein. En revanche, les procédures 2 et 3 sont beaucoup plus appliquées. En effet, les chRCCs sont habituellement traités par une résection du rein malade. Toutefois, il n’existe pas de traitements spécifiques pour les patients métastatiques qui ont un très mauvais pronostique. Aujourd’hui, ces patients reçoivent les traitements conventionnels des ccRCC (les plus fréquents) avec peu de réussite. Dans le cas de résultats positifs avec l’utilisation de notre candidat médicament, nous apporterons la première thérapie spécifique au chRCCs.

Procédures

Dans la procédure 1: Les femelles receoivent une injection de tamoxifen. Cette procédure prend 20 seconde pour être réalisée. Dans la Procédure 2: les animaux sont xénogréffés avec une lignée cellulaire tumorale. Dans la Procédure 3: les animaux sont xénogréffés avec une lignée cellulaire tumorale et reçoivent 3 injections hébdomadaires d'un anticorps. Dans les procédures 2 et 3, la durée des procédures est de l'ordre de 30 secondes (injection de cellules tumorales ou d'anticorps et mesure de la croissance tumorale).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de la procédure 1, il sera utilisé des modèles murins genetiquement modifiés dépendant de l'injection d'un analogue d'hormone. C’est une procédure très courante dans les études développementales afin d’étudier la contribution d’un gène à un mécanisme développemental. Dans les cadres des procédures 2 et 3: il sera réalisé des injections sous-cutanées de cellules de lignée tumorale de cancer du rein. Ces injections n’entraînent pas de nuisance particulière, elle est réalisée par un personnel qualifié qui maîtrise parfaitement le geste. Les tumeurs développées dans ce modèle ont croissance lente qui ne sont pas décrite pour être nécrosantes. Dans la littérature, il faut attendre 70jours pour atteindre le point limite (1500mm3) et aucune métastase n’est observée. Par conséquent, ce modèle peut entrainer une gêne non douloureuse chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car nous préleverons des tissus post-mortem pour analyse ou si un point limite est atteint en cours de procédure. Dans le cadre des procédure 2 et 3: dès lors que l'un groupe ne comporte plus d'individus, les individus de l'autre groupe sont aussi mis à mort, car on considère que c'est la fin de la procédure pour le second groupe.

Remplacement

Le développement du rein est très complexe avec plus de 30 sous-types cellulaires. Ces sous-types cellulaires interagissent les uns avec les autres. Il est donc nécessaire d’étudier chez l’animal le de notre facteur de guidage axonal car il est aujourd’hui impossible de reproduire in vitro un tissu si complexe (procédure 1) . Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire pour valider l’observation clinique et analyser les effets du gène d'intérêt (procédure 2 et 3). Ces méthodes sont complémentaires aux expérimentations sur des cellules en culture qui sont largement utilisées en parallèle pour cette étude. L’approche chez l'animal est donc indispensable dans le cadre de cette étude.

Réduction

Une attention particulière sera accordée à la règle des 3R afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires tout en s’assurant de la reproductibilité des résultats. Pour l’étude développementale (procédure 1), nous utiliserons les 2 reins de chaque individu pour des analyses différentes. De la sorte, nous diviserons par 2 le nombre de femelle et embryons/souriceaux nécessaire à cette étude. Concernant les procédures 2-3, le nombre d’animaux a été déterminé afin de ne pas interférer avec l’objectif de la procédure (nombre suffisant d’animaux par condition pour la réalisation des tests statistiques).

Raffinement

Toute manipulation susceptible d’entraîner du stress sera réalisée par un expérimentateur formé aux techniques de contention et de manipulation des animaux. Les animaux seront hébergés avec dômes et boules de coton dans les cages. Les 3 procédures seront réalisées par un expérimentateur habitué à réaliser ces gestes. Dans le cadre de la procédure 1, le contrôle spatial et temporel de l’invalidation du gène étudié permet de restreindre à l'organe étudié la modification génétique, ce qui est un raffinement majeur de la procédure 1. Nous utiliserons aussi un rapporteur fluorescent qui nous permettra de bien visualisé la localisation de la modification génétique. Dans les procédures 2 et 3, si une perte poids supérieure à 20%/semaine du poids maximal (28g) survient, l’animal sera immédiatement mis à mort. Dès lors qu'un groupe ne comporte plus d'individus, les individus de l'autre groupe sont aussi mis à mort, car on considère que c'est la fin de la procédure pour le second groupe. De la sorte, nous éviterons que les animaux restants atteignent un point limite.

Choix des espèces

La souris est un organisme modèle qui partage 98% son patrimoine génétique avec l’homme. Ce modèle permet donc d’étudier les mécanismes biologiques que l’on retrouve chez l’homme. Procédure 1: Le développement du rein et les pathologies associées ne peuvent être abordées que chez l’animal vivant. En effet, le développement du rein est très complexe avec plus de 30 sous-types cellulaires. Ces sous-types cellulaires interagissent les uns avec les autres. Le developpement chez la souris commence à mi-gestation jusqu'à la fin de la première semaine après la naissance. Dans cette procédure les reins seront donc collecter durant cette période afin de comprendre le rôle du gène d'intérêt. Procédure 2-3: La souris immunodéficiente est le modèle le plus approprié pour greffer des cellules cancéreuses humaines afin qu’il n’y ait pas de rejet des cellules. Toutes les xénogreffes seront réalisées sur des souris de 5 à 7 semaines, qui est l'âge optimal d'utilisation des souches de souris immunodéprimées et pour lequels nos modèles de xénogreffes ont été validés lors d'études antérieures.

76 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de foie humain, une inoculation des virus des hépatites B et Delta et des prélèvements sanguins répétés pendant douze semaines, pour identifier des voies de signalisation et des cibles antivirales. Le porteur indique que l'échec de la greffe peut faire perdre du poids aux souris ou entraîner leur mort par insuffisance hépatique. Il décrit la souris au foie humanisé comme une alternative "indispensable", le chimpanzé, seul autre modèle naturellement infectable, étant interdit.

Objectifs

Le virus de l’hépatite Delta (VHD) est un virus satellite qui repose sur la présence du virus de l’hépatite B (VHB) pour sa multiplication. Les co-infections VHD-VHB représentent la forme la plus sévère des hépatites virales entraînant une accélération la progression de la fibrose hépatique vers la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire (CHC) ou cancer du foie. La progression de la maladie hépatique implique une dérégulation des voies de signalisation cellulaires avec des conséquences sur l’inflammation et sur l’environnement entrainant le développement du cancer. Le but de ce projet est d’identifier les voies de signalisation dérégulées par le VHD et le VHB dans les hépatocytes, ou cellules du foie, afin de découvrir de nouvelles protéines conduisant à la progression de la maladie et de mettre au point de nouvelles molécules antivirales permettant de prévenir la progression de la maladie hépatique et le développement du cancer du foie.

Bénéfices attendus

Afin d’identifier les voies cellulaires dérégulées lors de co-infections VHB-VHD, nous souhaitons établir un atlas des changements cellulaires induits lors des infection VHB et VHD au sein des hépatocytes, ce dans le but d’identifier les voies de signalisation pertinentes pour les virus et la maladie ainsi que leurs régulateurs. Nous pensons ainsi pouvoir découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques antivirales ainsi que des candidats-médicaments pour un futur développement préclinique de nouveaux antiviraux et concepts de chimio-prévention.

Procédures

Les animaux recevront tout d’abord une injection intraveineuse afin d’améliorer la prise de greffe. Cette injection est réalisée sur animaux anesthésiés et ayant reçu une analgésie locale. Les animaux seront ensuite soumis à une petite chirurgie permettant la greffe de cellules de foie humain susceptibles à l’infection par le VHB et le VHD. L’injection de cellules de foie humain est réalisée dans la rate des animaux. L’infection par le VHB et le VHD sera réalisée par inoculation des virus par une injection unique dans le péritoine sur animaux vigiles après désinfection à l’alcool de la zone à piquer. Les animaux seront également soumis à un prélèvement de sang une fois toutes les 2 semaines pendant 12 semaines, soit un prélèvement avant l’inoculation et 5 prélèvements après l’inoculation, soit un total de 6 prélèvements. Les prélèvements sont réalisés sur animaux anesthésiés et ayant reçu une analgésie locale.

Impact sur les animaux

Nous utilisons et maîtrisons ce modèle murin depuis plus de 6 ans et la procédure de greffe depuis plus de 10 ans. La greffe de cellules de foie humain est réalisée suite à une petite chirurgie nécessitant une exposition de la rate Cette chirurgie n’induit pas d’effets indésirables chez les animaux. Il est néanmoins possible que la greffe soit inefficace et que les cellules de foie humain transplantées ne repeuplent pas le foie des souris. Dans ce cas, les animaux vont perdre du poids et peuvent mourir d’hépatodéficience aigüe. Suite à la greffe, les animaux ont recouvré un état de santé et de bien-être compatible avec leur utilisation dans ce projet. Les infections par le VHB et le VHD n’entraînent pas de phénotype particulier ni de douleur ou souffrance chez l’animal. Les animaux infectés peuvent vivre plusieurs mois sans problème.

Devenir

Les animaux de la colonie de reproducteurs seront mis à mort lorsque la qualité de reproduction déclinera. Les 2 animaux d’un couple sont mis à mort si aucune portée n’est obtenues depuis plus de 3 mois. Les animaux greffés chez qui la prise de greffe n’est pas efficace seront mis à mort car ils ne pourront pas être utilisés pour d’autre procédures. Les animaux inoculés avec les virus de l’hépatite B et Delta ainsi que les animaux contrôles non infectés sont mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever le foie et le sang qui nous permettront de réaliser les différentes analyses nécessaires à ce projet.

Remplacement

Afin de remplacer l’utilisation d’animaux, une majorité d’expériences sont menées en amont, in vitro sur des lignées cellulaires et sur des hépatocytes primaires humains afin de nous assurer de la réelle nécessité de poursuivre sur ces modèles animaux greffés avec des hépatocytes humains. Il est toutefois nécessaire d’utiliser des animaux pour ce projet car les lignées cellulaires sont dérivées de cellules cancéreuses avec un phosho-protéome fortement altéré par rapport à des cellules primaires. De plus l’utilisation d’hépatocytes primaire nécessiterait un nombre très élevé de cellules fraichement isolées, les cellules congelées étant très difficiles à infecter in vitro. L’utilisation de biopsies humaines n’est également pas envisageable car les patients diagnostiqués avec une infection VHD sont très rares, et leur condition de conservation n’est pas compatible avec nos besoins permettant d’analyser le phospho-protéome. Dès lors, notre modèle de souris au foie humanisé est une alternative indispensable à l’identification de nouvelles voies dérégulées par les virus et potentiellement cibles thérapeutiques.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, seul le nombre requis de souris seront greffées pour ce projet. Nous avons déterminé au préalable le nombre d’animaux nécessaire à ce projet sur la base de 2 critères principaux à savoir le taux de repeuplement du foie par les hépatocytes humains greffés, déterminés par dosage de l’albumine humaine sérique, et les charges virales VHB et VHD qui peuvent être très variables. Nos études de corrélation charge virale/albumine humaine montrent une corrélation positive pour VBH, mais pas de corrélation pour VHD. De plus la co-infection VHB-VHD réduit significativement la charge virale VHB, le VHD interférant avec le cycle viral du VHB. Nous avons donc estimé qu’un nombre de 8 souris par groupe est le minimum requis afin d’obtenir des résultats intra et inter-groupes comparables et interprétables.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tube de coton pour nidifier et des briques de tremble pour ronger, les animaux sont maintenus en groupe de 3 minimum afin d’éviter tout stress de l’animal isolé, les souris greffées auront un suivi quotidien adapté et tous les moyens nécessaires seront mis en œuvre pour éviter tout stress ou douleurs des procédures expérimentales (anesthésie, analgésie), des points limites adaptés et précoces ont été établis afin de soustraire les animaux à toute forme de souffrance inutile.

Choix des espèces

Seul le chimpanzé peut-être naturellement infecté, comme l’homme, par les virus VHB et VHD. L’utilisation du chimpanzé étant interdite depuis la nouvelle directive européenne relative à l’utilisation d’animaux en expérimentation animale, l’étude de ces virus in vivo est donc restreinte. Seuls les modèles de souris chimériques au foie humanisé peuvent maintenant être utilisés. De plus ces souris au foie humanisé permettent d’étudier précisément l’impact des maladies hépatiques et virales sur les hépatocytes humains et de tester des approches thérapeutiques pertinentes pour les patients. Les animaux seront utilisés à un âge adulte d’environ 8 semaines pour la greffe d’hépatocytes et un âge d’environ 20 semaines au moment de l’inoculation des virus.

280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal subit une chirurgie créant un défaut osseux dans la mandibule avec section du nerf alvéolaire inférieur, suivie de séances d'imagerie sur deux mois, pour tester des biomatériaux de régénération osseuse. Le porteur reconnaît de possibles difficultés de mastication et prévoit une nourriture molle les premiers jours. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'étudier ensemble formation osseuse, vascularisation et innervation dans la complexité d'un être vivant.

Objectifs

En ingénierie tissulaire pour la réparation osseuse, l’utilisation de scaffolds tridimensionnels a pour but d’offrir une alternative à la greffe pour combler des défauts osseux de taille critique. Ces scaffolds sont principalement des biomatériaux possédant des propriétés d’ostéoinduction et d’ostéoconduction grâce à leur composition. Cependant, les biomatériaux favorisant la vascularisation pour la réparation osseuse sont rares, et ceux prenant en compte le processus d’innervation sont quasiment inexistants. Même si le rôle de la vascularisation dans l’os est connu depuis longtemps, celui de l’innervation n’a été montré que récemment dans des études de dénervation de l’os, ce qui explique le manque de biomatériaux qui prennent en compte ce processus dans la régénération osseuse. Pour pouvoir d’une part confirmer le rôle de l’innervation dans la réparation osseuse ainsi que la formation de nouveaux vaisseaux sanguins, et d’autre part tester le potentiel de régénération osseuse de différents biomatériaux fabriqués au laboratoire, il est donc nécessaire de passer à un modèle de petit animal. La fabrication de ces biomatériaux dans le laboratoire se fait dans le cadre du projet SPARK qui vise au développement de nouvelles matrices tridimensionnelles pour des applications en ingénierie tissulaire osseuse. Ce projet a donc pour but de développer un modèle permettant d’étudier le rôle de l’innervation dans la réparation de l’os et de tester le potentiel de différents biomatériaux dans la régénération osseuse, notamment dans les processus d’innervation et de vascularisation.

Bénéfices attendus

La reconstruction de défauts osseux critiques est l’un des défis majeurs dans le domaine clinique, en particulier dans le cas de lésions osseuses dues à des traumatismes, cancers, ou autres maladies induisant des pertes de tissu osseux telles que les pseudarthroses ou l’ostéoporose. Ce projet a pour but de tester le potentiel de régénération osseuse, de vascularisation et d'innervation de nouveaux biomatériaux pour le comblement osseux. Il pourra ainsi permettre de sélectionner des matériaux intéressants pour la réparation osseuse dans un contexte clinique.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à la chirurgie du défaut osseux circulaire dans la mandibule, couplé à la résection du nerf alvéolaire inférieur. Ils seront également tous soumis à la microtomographie aux rayons X aux temps 15 jours, 1 mois et 2 mois. Enfin, après la dernière série d'acquisition d'imagerie aux rayons X, les animaux seront euthanasiés par inhalation de dioxyde de carbone.

Impact sur les animaux

La réalisation du défaut osseux circulaire dans la mandibule de rat pourrait entrainer des difficultés de mastication et donc de nutrition des animaux après la chirurgie. C'est pour cette raison que les animaux recevront de la nourriture molle et enrichie pendant les 2 à 3 premiers jours après la chirurgie.

Devenir

A l'issue de la première procédure (chirurgie du défaut osseux et résection du nerf alvéolaire inférieur), les animaux seront maintenus en vie pour pouvoir réaliser la seconde procédure (imagerie aux rayons X) aux temps 15 jours, 1 mois et 2 mois. A l'issue de la dernière acquisition (2 mois), tous les animaux seront euthanasiés pour pouvoir réaliser ensuite des analyses histologiques et immunohistochimiques au niveau du défaut osseux.

Remplacement

Aucune méthode in vitro ne permet d’étudier simultanément la formation osseuse, la vascularisation et l’innervation induites par des biomatériaux tout en prenant en compte la complexité d’un être vivant (système immunitaire, flux sanguin…).

Réduction

L’utilisation de méthodes d’imagerie in vivo pour le suivi à differents temps de la reconstruction osseuse permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés pour ces expérimentations. Le nombre d’animaux par groupe est également calculé pour utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats exploitables de manière statistique.

Raffinement

La chirurgie sera effectuée sous anesthésie générale et une analgésie adaptée sera appliquée en post-opératoire pour limiter la douleur. Les conditions de stabulation des animaux seront également adaptées avec isolement des animaux après l’opération pour limiter les risques de réouverture de l’incision. Les rats seront ensuite regroupés 5 jours plus tard de façon à favoriser les interactions sociales importantes pour le bien-être animal. Les conditions d’hébergement et le milieu d’enrichissement seront également pensés pour favoriser le bien-être des animaux (litière avec copeaux, tuyaux pour jouer et se cacher…).

Choix des espèces

Le rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l’animal de matériaux destinés au traitement de défauts osseux. Sa taille plus grande que la souris permet de réaliser des lésions circulaires de diamètre suffisant dans l’os de la mandibule. Les rats utilisés seront des rats Wistar adultes de 10 à 12 semaines. En effet, ils devront avoir achevé leur croissance pour éliminer le biais induit par le développement sur la régénération osseuse. De plus, la taille plus importante de la mandibule chez les adultes facilitera l’opération.

198 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent cinq injections de tamoxifène, et pour 108 d'entre elles une injection de cardiotoxine dans un muscle de la patte afin de provoquer une lésion, pour étudier la régénération musculaire par les cellules souches. Le porteur affirme que l'anesthésie et l'analgésie "garantissent l'absence de douleur" et que les souris reprennent leurs activités dès le réveil. Il conclut qu'aucune méthode ne peut se substituer à l'animal, ce processus reposant selon lui sur des interactions entre tissus lésés impossibles à reproduire in vitro.

Objectifs

Les muscles squelettiques composent près de la moitié de la masse totale d’un individu et permettent la motricité du corps. Ils sont principalement composés de fibres musculaires, de vaisseaux sanguins, de nerfs et de tissu conjonctif. Suite à une blessure, les cellules souches résidentes du tissu musculaire s’activent, prolifèrent et réparent le tissu musculaire lésé. Ce processus implique une communication avec les cellules voisines afin de reconstruire les fibres musculaires de façon optimale. Le projet de recherche consiste à étudier la réparation musculaire en identifiant les signaux de communication importants, déployés spécifiquement par les cellules souches musculaires au cours de la régénération musculaire. Nous développerons deux approches, la première consistera à isoler des cellules souches d’animaux modèles et de former des muscles in vitro pour étudier des voies de régulation spécifiques au cours de la régénération musculaire. La deuxième approche nous permettra d’évaluer la régénération du tissu musculaire, mais cette fois-ci in vivo, à partir de ces mêmes modèles de souris transgéniques. Dans le contexte de régénération musculaire, ce projet de recherche nous permettra d’identifier les voies de communication entre cellules qui sont essentielles à la réparation musculaire. Ce projet utilisera au total 198 souris, ceci correspondant à la réduction optimale du nombre de souris nous permettant d’obtenir des résultats statistiquement interprétables.

Bénéfices attendus

Cette approche permettra d’identifier les signaux extracellulaires reçus par les cellules souches musculaires au cours de la régénération du muscle. En plus d’augmenter les connaissances des mécanismes fondamentaux qui régulent la fonction des cellules souches musculaires du muscle squelettique, ces résultats permettront de concevoir de nouvelles stratégies de médecine régénérative.

Procédures

5 injections intrapéritonéales d'huile contenant ou non du tamoxifène sur animaux vigiles (198 animaux). Chaque injection prend 5 minutes. Une injection intramusculaire de cardiotoxine dans le muscle releveur de la patte sur animaux anesthésiés (108 animaux). Cette intervention dure 15 minutes.

Impact sur les animaux

Les trois modèles conditionnels et inductibles de souris transgéniques, qui seront utilisés dans le projet, ne présentent pas de phénotype dommageable à l’état basal. Les injections intrapéritonéales de tamoxifène (procédure n°1 et 2) n'ont pas été rapportées comme provoquant des effets indésirables chez l'animal, aux doses et fréquences utilisées. L’utilisation d’analgésique et d'anesthésique au cours de la procédure n°2 de lésion musculaire garantit l’absence de douleur chez l'animal. Les expériences précédemment menées avec cette procédure confirment que les souris reprennent leurs activités dès le réveil et qu’elles ne montrent pas de signes de douleur pendant les jours suivants.

Devenir

Les animaux sont mis à mort et les muscles sont prélevés.

Remplacement

Aucune autre méthode alternative ne peut se substituer à l’utilisation d’animaux pour l’étude de la régénération du muscle via l’activation des cellules souches musculaires. Ce processus repose sur des interactions complexes entres les tissus lésés et sur la coordination efficace de multiples types cellulaires. Ces résultats n'auraient pas pu être obtenus par l'usage de lignées cellulaires, ce qui justifie la poursuite de notre projet utilisant des modèles transgéniques murins.

Réduction

L'utilisation des animaux sera réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales et contrôlé à l'aide d’analyses statistiques adaptées (T-Test ou ANOVA). De plus, les résultats de la procédure n°1 conditionneront la mise en œuvre de la procédure n°2, ceci permettant de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Avant le début de chaque procédure, les animaux suivront une période d’acclimatation d’au moins une semaine. Au cours de la procédure n°1, les animaux seront pesés quotidiennement dès le premier jour de l’injection et ce jusqu’à la dernière injection, puis une fois par semaine jusqu’à leur mise à mort. Anesthésiques et analgésiques sont utilisés au cours de la procédure n°2 afin de prévenir au maximum le stress et la souffrance des animaux. En plus de la surveillance quotidienne des animaux par le personnel animalier, les animaux seront observés au moins 1 fois par semaine afin de contrôler leur posture, leur mobilité, leur comportement et leur niveau d’interaction sociale, tout changement pourrait refléter souffrance, douleur ou stress, même minime, chez l’animal. Si ces changements sont relevés pendant plus de 48h, des mesures adéquates seront prises en accord avec le personnel animalier afin d’améliorer les conditions de vie de l’animal et d’éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Le tissu musculaire de la souris est extrêmement proche du tissu musculaire de l’Homme, aussi bien dans sa composition cellulaire que dans son fonctionnement. La souris représente donc un modèle de choix pour l’analyse exploratoire des gènes impliqués dans la régulation du muscle. De plus, la souris permet l'utilisation de modèles transgéniques conditionnels et inductibles, permettant la délétion d’un gène d’intérêt dans un type cellulaire et à un temps donné. Les expériences menées sur ces modèles ont permis d’obtenir des résultats fondamentaux et novateurs qui n'auraient clairement pas pu être établis à l'aide de lignées cellulaires. Les expériences seront principalement réalisées sur des souris âgées de 8 semaines. L'âge choisi est le plus adapté à l'étude de la régénération du muscle squelettique. Plus jeune, le tissu est encore en croissance. Plus âgé, une fibrose peut se développer et perturber le processus de régénération.