Procédures légères

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur décrit l'inoculation sous-cutanée de cellules cancéreuses humaines chez des souris immunodéficientes, suivie de séances d'imagerie IRM sous anesthésie, puis de la mise à mort pour prélever les tumeurs. Il indique que la croissance tumorale peut entraîner perte de poids, nécrose ou infection, une perte de plus de 20 pour cent du poids déclenchant l'euthanasie. Sur le remplacement, il affirme que la validation de cette méthode d'imagerie ne peut être réalisée qu'in vivo.

Objectifs

L’hypoxie (baisse de l’oxygénation du tissu) est une caractéristique du microenvironnement tumoral commune à la plupart des tumeurs solides et constitue une source importante de résistance aux traitements de radiothérapie et de chimiothérapie. Décrite comme fluctuante et inhomogène aussi bien dans son intensité que dans sa distribution spatiale, l’hypoxie évolue au cours de la progression de la tumeur. Elle est responsable de remaniements métaboliques qui associés à la faible perfusion des tumeurs entrainent une accumulation d’ions H+ sera la cause majeure d’acidification du milieu extracellulaire au sein de la tumeur. La répartition hétérogène de l’hypoxie et donc du pH au sein des lésions cancéreuses n’est actuellement pas prise en compte en clinique pour générer une stratification des tumeurs en fonction de leur statut hypoxique ou acide conduisant de ce fait au manque d’efficacité de nouvelles thérapies ciblant l’hypoxie. Ainsi pour ce programme de recherche, nous proposons de réaliser dans un premier temps une étude chez la souris porteuse de xénogreffe visant à montrer la capacité d’une nouvelle technique d’IRM par échange chimique et transfert de saturation (IRM CEST) à cartographier et quantifier l’hétérogénéité de l’hypoxie et du pH intra-tumoral pour en faire un outil de stratification des tumeurs. La validation de la méthode d’IRM CEST sera réalisée par l’implantation d’une sonde pH/pO2 en intra-tumoral afin de corréler les mesures avec les observations réalisées par IRM. Si la méthode est validée, une seconde étude sera réalisée. Elle permettra de juger de la pertinence de l’IRM CEST pour l’évaluation de l’hypoxie et du pH au cours de la croissance tumorale en suivant les souris à plusieurs stades tumoraux.

Bénéfices attendus

Dans ce projet nous souhaitons stratifier les tumeurs en fonction de l’hétérogénéité constatée grâce à l’IRM CEST 3D. Ainsi, la caractérisation l’hypoxie tumorale pourrait offrir une opportunité unique de pouvoir sélectionner les patients éligibles aux traitements ciblant l’hypoxie tumorale.

Procédures

Les animaux auront une inoculation de cellules cancéreuses en sous cutané à l'aide d'une aiguille 26G sous anesthésie gazeuse (durée inférieure à 3min). Les animaux auront une ou plusieurs imageries IRM sous anesthésie gazeuse (non invasif).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus dans cette étude sont principalement liés à la croissance tumorale (perte de poids, altération de l’état général de l’animal, nécrose ou infection de la tumeur).

Devenir

Les animaux seront sacrifiés à l'issue des 2 procédures afin de prélever les tumeurs pour des analyses immunohistochimiques complémentaires.

Remplacement

La validation d’une méthode d’imagerie permettant que caractériser et stratifier le tissu tumoral ne peut être réalisée qu’in vivo. En effet, la physiologie globale de l’individu entre en jeu et une étude ex vivo ou in vitro ne peut représenter la complexité du vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe (n=10) a été réduit au maximum tout en permettant l’exploitation des résultats. Il prend notamment en compte l’hétérogénéité de la prise tumorale (estimée à 80%) afin de garantir un nombre optimal d’animaux permettant une signification statistique à l'étude menée. Le nombre total d’animaux est de 100 souris maximum sur une période de 5 ans. L'étude 1 déterminera la nécessité de faire l'étude 2.

Raffinement

Des méthodes sont utilisés afin d’optimiser au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimisées (portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, densité animale – minimum 3 animaux/cage-, enrichissement de milieu avec coton pour la nidification, bâtonnet de bois pour ronger et cabane de cachette). De façon usuelle, les cages (litière, cage, grille, couvercle et biberon) sont changées toutes les semaines. Une surveillance quotidienne des animaux permettra de déceler les premiers signaux de stress, de douleur ou d'inconfort pour l'animal qui pourront être améliorés par l'administration d'antalgiques (Rimadyl, 5mg/kg en sous-cutanée, 1 fois par jours pendant 5 jours maximum) avant l'atteinte des points limites définis (perte de poids supérieure à 20%, du poids maximal observé, prostration, volume tumoral, aspect du point d’injection……). Si aucune amélioration n’est observée, l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle souris est classiquement utilisé en expérimentation animale dans le domaine de la recherche contre le cancer. De plus, le modèle souris immunodéficientes porteuses de xénogreffe de lignée tumorale humaine est adapté pour les études fondamentales et appliquées de développement et traitements des cancers humains. Des animaux de 5 à 7 semaines sont classiquement utilisés pour ce type de modèles.

234 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur décrit le gavage de souriceaux dès le deuxième jour de vie, une fois par jour pendant sept à dix jours, suivi d'une injection intrapéritonéale, puis la mise à mort pour disséquer les testicules. Il précise que les souriceaux ne prenant pas de poids par rapport aux témoins, un seuil fixé à 20 pour cent de moins, seront tués. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro n'existe pour étudier la méiose et présente la souris comme "indispensable".

Objectifs

La reproduction sexuée, chez les organismes eucaryotes qui incluent les animaux, nécessite la formation de gamètes (ovocytes et spermatozoïdes) auxquels est transmise la moitié du matériel génétique du parent. La fécondation permet, en réunissant les chromosomes des gamètes de chacun des deux parents, de reconstituer des cellules qui possèdent une paire de chaque chromosome, un exemplaire étant fourni par la mère, l’autre par le père. Nous étudions les mécanismes qui permettent la transmission correcte des chromosomes aux gamètes. Nos projets visent à comprendre le rôle de plusieurs protéines dans ce processus, chez le mâle.

Bénéfices attendus

Nous étudions les mécanismes qui permettent la transmission correcte des chromosomes aux gamètes. Nos projets visent à comprendre le rôle de plusieurs protéines dans ce processus, chez le mâle.

Procédures

sur 234 animaux Gavage : souriceaux à jours 2, 1 fois par jour pendant 7 à 10 jours injection intrapéritonéale : 1 injection à jour 7 à 10

Impact sur les animaux

Inconfort sur l’animal suite à des gavages et des injections intrapéritonéales

Devenir

Animaux mis à mort pour une dissection des testicules pour des études biochimiques, moléculaires et génomiques

Remplacement

Le recours aux animaux est indispensable car il n’existe aucun modèle in vitro pour étudier la méiose. Notre projet propose l'utilisation de souris. Ce sont les seuls mammifères sur lesquels nous pouvons développer ces recherches. Le processus fondamental de la méiose est étudié dans d’autres espèces (invertébrés, plantes, unicellulaires) mais ces processus se sont différenciés au cours de l’évolution. Seule la souris permet d’approfondir l’étude de fonction de gènes par la génétique et la transgénèse. Le protocole proposé permettra d’augmenter le nombre de cellules d’intérêt par expérience.

Réduction

Les protocoles sont optimisés pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires. En particulier, les techniques biochimiques sont revues régulièrement pour réduire la quantité de matériel, et donc d’animaux, nécessaire. Nous estimons que 234 souris seront nécessaires pour mener à bien notre projet.

Raffinement

Aucun des animaux utilisés ne souffrira d’un phénotype dommageable dans nos conditions d’élevage et le traitement qui leur est administré dans une fenêtre de temps précise agira seulement sur les gamètes et n’aura aucun effet dommageable sur les animaux. Ces animaux sont pesés quotidiennement pendant les 7 à 10 premiers jours de traitement, s’ils ne prennent pas de poids par rapport aux animaux témoins (plus de 20% de moins que les animaux non traités de la même portée), ils seront mis à mort.

Choix des espèces

- Le contexte des aspects que nous étudions est bien décrit chez la souris - Cette espèce se prête aux études génétiques grâce aux nombreux modèles déjà existants, et grâce à la possibilité de générer de nouveau modèles génétiques. Les connaissances du génome de Mus musculus sont nécessaires pour nos analyses génétiques et génomiques. - Ce modèle, surtout grâce au protocole proposé, permet des études biochimiques, de plus, beaucoup d’outils existent déjà, notamment les anticorps. Jours 2 à Jours 20 après la naissance. Il s’agit de la période où les souris sont traitées, jusqu’à récupération des tissus. Cet période correspond au moment optimal pour obtenir une population de spermatocytes enrichit dans le type cellulaire que nous étudions.

72 brebis laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réintégrées à la production laitière. Le porteur décrit quatre séries de prélèvements sur deux mois, associant une prise de sang à la jugulaire et un prélèvement de jus de rumen par sonde gastro-œsophagienne. Il indique que la répétition de ces prélèvements peut générer un stress, atténué par une habituation à la cage de contention. Sur le remplacement, il affirme qu'étudier le statut énergétique d'un ruminant en début de lactation rend le recours à l'animal inévitable.

Objectifs

L’objectif du projet est de proposer aux éleveurs de brebis laitières des outils de précisions pour améliorer la gestion des moments d’élevage clés du troupeau, et ainsi améliorer la santé des brebis et des agneaux, mieux valoriser l’alimentation et avoir un lait de meilleure qualité pour le consommateur. L’approche innovante est de s’intéresser au début de lactation, moment critique jusque-là peu étudié, et d’identifier grâce à des indicateurs non invasifs, les animaux en situation nutritionnelle difficile. En effet, durant le premier mois après la mise-bas, les brebis laitières sont à la fois allaitantes et traites, puis elles passent en traite exclusive : c’est dans cette période que certaines d’entre elles se retrouvent en déficit énergétique, lorsque leurs besoins énergétiques ne peuvent pas être totalement couverts par les apports alimentaires. Le spectre en Moyen Infra-Rouge (MIR) du lait est un phénotype simple et peu couteux à obtenir : nous proposons de le valoriser durant la phase d’allaitement-traite pour identifier les animaux en déficit énergétique afin que l’éleveur puisse moduler l’alimentation de ceux-ci. Nous nous appuierons sur des brebis divergentes pour le comptage des cellules somatiques (CCS) dans le lait, car il a été montré que ces 2 groupes se différenciaient en termes de bilan énergétiques en début de lactation, et afin de définir le moment le plus propice à la détection des animaux en déficit énergétiques, les analyses du lait via le MIR seront effectuées de façon longitudinale durant les 2 premiers mois de lactation des brebis. Enfin, d’autres biomarqueurs seront recherchés dans le lait, le plasma et le rumen (métabolome) et une étude du microbiote ruminal des brebis sera réalisée.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’obtenir, en situation d’élevage classique et sur un nombre conséquent d’animaux, des profils d’évolution individuel de l’état énergétique des brebis laitières durant la phase clés d’allaitement-traite. L’utilisation synchrone de dosages de références et de mesures non invasives va permettre l’identification de prédicteurs de l’état énergétique dégradé de certaines brebis, utilisables en élevage classique. De plus, le programme de recherche dont fait partie ce projet fait intervenir un second site expérimental où les phénotypages simplifiés seront aussi effectués de façon longitudinale durant cette période d’allaitement-traite ; il est aussi adossé à un programme européen où 8 fermes privées réaliseront un « suivi » type pour valider la faisabilité de cette détection en ferme classique.

Procédures

Les brebis seront soumises à 2 types de prélèvement : - Une prise de sang à la veine jugulaire, - Un prélèvement de jus de rumen par sonde gastro-oesophagienne ; Cela 4 fois durant les 2 mois de l’essai, au maximum à une semaine d’intervalle.

Impact sur les animaux

La répétition à 1 semaine d’intervalle du prélèvement de jus de rumen et de sang pourrait générer un stress sur les brebis : des actions de renforcement positif seront mis en place pour palier à ce possible effet indésirable, notamment en habituant les brebis à la cage de contention. Celle-ci, ainsi que la compétence du personnel réalisant depuis de nombreuses années ce type de prélèvements, assurera un prélèvement efficace, sans lésion et sur un laps de temps très court.

Devenir

Poursuite de la vie productive classique de la brebis laitière en lactation

Remplacement

Il s’agit ici d’étudier le statut énergétique d’un animal. Celui-ci est la résultante de l’alimentation et du fonctionnement global de l’organisme. Le recourt à l’animal ne peut être éviter.

Réduction

Nous avons calculé le nombre optimal d’animaux à utiliser avec une formule statistique : n = (2SD/p)² où n est le nombre d'animaux, SD l'écart-type et p la précision souhaitée pour notre analyse.

Raffinement

Tous les animaux seront hébergés sur une aire paillée en groupe, de manière à exprimer leurs comportements sociaux. Afin de stimuler les brebis, au cours d'une semaine des objets d'enrichissement seront suspendus dans les parcs et alternés (disques, chaines). Au quotidien, lors du paillage, la paille seront mise en tas et ce sont les brebis qui l'étaleront. Afin de limiter le stress de contention, les prélèvements seront réalisés par du personnel qualifié à l’aide de matériel de contention adapté aux ovins et à laquelle les animaux sont habitués. Les prélèvements de lait se feront lors du contrôle laitier, sans manipulation supplémentaire de la brebis. Les prélèvements de sang et de contenu ruminal se feront successivement lors de la même contention, afin de réduire au maximum le temps de contention de chaque animal. Les animaux font l’objet d’une surveillance toute particulière au moment des prélèvements et après ceux-ci. Au moindre problème l’animal est retiré du projet et soigné.

Choix des espèces

Le déficit énergétique que l’on vise à monitorer apparait spécifiquement chez les ruminants, quand la capacité digestive post-mise bas n’est pas suffisante pour ingérer l’énergie permettant de faire face aux besoins de la femelle en début de lactation. Il est donc indispensable de réaliser ce travail sur un ruminant. Par ailleurs, chez les bovins et les caprins laitiers, le petit est très rapidement séparé de sa mère : cette concomitance de l’allaitement du petit et du passage à la traite pour extraire le surplus de lait, n’existe que chez la brebis laitière. Notre étude porte sur le déficit énergétique en début de lactation, donc nos animaux seront à ce stade.

400 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger, pour évaluer l'innocuité de vaccins. Ils reçoivent le vaccin puis subissent des prélèvements variés, sanguins, écouvillons et parfois organes, sur des études allant jusqu'à 28 semaines. Une dizaine de chiens peuvent être réutilisés et une dizaine placés en adoption, les autres étant euthanasiés pour des prélèvements post mortem. Le porteur indique que l'évaluation sur l'espèce cible est une exigence réglementaire.

Objectifs

Le projet a pour but d’évaluer l’innocuité d’un vaccin sur le chien ainsi que sur son environnement (animaux en contact, environnement, humains). Ces études sont encadrées selon les exigences de la Directive Européenne 2010/63/UE, de la Pharmacopée Européenne, de guidelines (dont VICH, EMEA) et d’autres exigences spécifiques à chaque pays.

Bénéfices attendus

Ces études permettent in fine d’assurer le soin des animaux avec des produits présentant un risque minimal. Elles permettent également aux propriétaires de disposer des meilleurs traitements pour leurs animaux.

Procédures

Après l’administration du vaccin, les paramètres cliniques (dont l’état général, examen de la zone d’injection, poids, température rectale) sont suivis et les paramètres biologiques (dont hématologie, biochimie, excrétion virale) peuvent être mesurés à des intervalles définis. En fonction de la bibliographie et des connaissances acquises sur les produits mmunologiques, les conditions d’administration du vaccin (site et voie d’administration, doses, nombre d’injection, et intervalle entre les injections) sont optimisées. Si le produit immunologique étudié est un vaccin vivant atténué, la diffusibilité, persistance et réversion à la virulence peuvent être étudiées. Des prélèvements (prélèvements sanguins, écouvillons buccaux, trachéaux, oculaires, nasaux, rectaux, urine, organes) permettent de constater si l’agent est excrété. Une sédation peut être réalisée pour certains prélèvements. La durée des études est comprise entre 2 et 28 semaines et dépend de l’objectif de l’étude et du type de produit immunologique étudié. Seule la répétition des administrations et des prélèvements sur le long terme peut occasionner une gêne. Si l’opérateur le juge nécessaire, une anesthésie ou d’autres mesures (dont alternance des sites de prélèvement, analgésie de l’animal) peuvent être envisagées pour limiter les contraintes de l’animal. Les actes sont réalisés par des opérateurs hautement qualifiés qui assurent une contention adaptée pour que le geste sur l’animal soit le moins douloureux et traumatisant pour ce dernier.

Impact sur les animaux

La douleur légère liée à l’administration peut être réduite par un massage de la zone ou une injection lente. En cas de prélèvements douloureux ou répétés, une anesthésie et/ou un changement de la zone de prélèvement peuvent être mis en place.

Devenir

Les animaux, sur lesquels des prélèvements post mortem (reins, foie, gonades…) ou une exérèse post-mortem de la zone d’injection est requise, sont euthanasiés. Dans des cas exceptionnels, si les points limites sont atteints, les animaux sont euthanasiés pour raison éthique. Les animaux, n’étant pas réutilisés ou adoptés par la suite, sont euthanasiés

Remplacement

Lorsque cela est possible, une première étape dans le projet de développement d’un produit thérapeutique consiste à tester in vitro différents candidats. Ceci permet une première sélection de ces derniers, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Une série de tests analytiques permet de garantir un certain niveau de sécurité pour les animaux recevant le vaccin. Un recueil d’informations est aussi apporté par la bibliographie lorsque cela est possible. Lorsque les modèles existent, un premier test sur des espèces alternatives (notamment des rongeurs) est réalisé afin de réduire le nombre de chiens utilisés.

Réduction

Pour les études réglementaires, le nombre d’animaux est fixé par les textes. En amont, lors des phases recherche, les effectifs sont évalués au plus juste (analyse statistique, historique, définition des objectifs…) afin de minimiser le nombre de chiens utilisés tout en limitant les études non conclusives. Un animal peut recevoir plusieurs vaccins n’ayant pas d’interactions entre eux, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Lorsque le statut des animaux le permet et que les chiens ont été impliqués dans des procédures de grade léger, ils peuvent être réutilisés dans une nouvelle procédure. La réutilisation permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Seuls les chiens ayant recouvré un état de santé et bien-être complet, attesté par un vétérinaire, sont réutilisables.

Raffinement

Pour chaque étude, une période d’acclimatation systématique des chiens est prévue dans le but de limiter leur stress et de stabiliser leur état physiologique. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Une anesthésie de l’animal peut être envisagée lors de certains actes. Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’espèce et à l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Dans la majorité des cas, tous les animaux sont hébergés en groupe. Les chiens ont à disposition des méthodes d’enrichissement afin de stimuler l’exercice physique et leurs activités cognitives. La Structure du Bien Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.

Choix des espèces

L’évaluation sur espèce cible (chien) est une exigence règlementaire. Le chien est l’espèce cible pour le produit testé. La majorité des chiens utilisés sont des chiots âgés d’environ 8 semaines ou des adultes. En effet, une fois commercialisé, le vaccin pourra être administré à des animaux à partir de 8 semaines d’âge. L’âge minimum dépend de l’objectif de l’étude, du vaccin testé et répond à l’exigence expérimentale d’utilisation du produit mis sur le marché et des exigences des autorités. Dans de rares cas, pour les chiots de moins de 8 semaines, soit avant sevrage des animaux, l’administration du vaccin se fait en présence de la mère sauf lorsqu’un sevrage précoce est réalisé (chiot de 6 semaines minimum). Exceptionnellement, l’étude peut porter sur des mères gestantes. Afin de démontrer de l’innocuité de la fonction reproductrice, il est possible de tester le vaccin sur des femelles durant toutes les étapes de gestation. Dans d’autres cas, il est possible d’importer des mères gestantes dans le but de tester l’innocuité et la diffusibilité du vaccin sur des chiots âgés de 4 à 8 semaines. En effet, le transport des chiots âgés de moins de 8 semaines sans la mère n’est pas autorisé.

2 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Elles sont soumises à des tests d'interaction sociale et isolées jusqu'à quinze jours pour stimuler ces interactions, avant des prélèvements sur animal vigile ou anesthésié. 600 souris sont réutilisées dans d'autres projets, les autres tuées pour prélever organes et fluides. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode de substitution pour évaluer l'effet d'une molécule sur l'ocytocine du cerveau.

Objectifs

Chez l'homme, l'ocytocine est une hormone synthétisée au niveau du cerveau et qui intervient dans de nombreux comportements sociaux: la confiance, l'empathie, la générosité, la sexualité, le lien social, la réactivité au stress. Des études montrent une diminution du taux de cette hormones chez les autistes. Administrée à l'homme, elle permet de diminuer certains symptômes de maladies mentales. Par exemple dans le syndrome d'Asperger, après la prise d'ocytocine, les comportements répétitifs sont diminués et on observe une amélioration de la compréhension des émotions. Chez les patients schizophrènes, la capacité à reconnaitre les émotions est également améliorée avec l'hormone. Le but de ce projet est d'évaluer les effets de divers composés sur l'interaction des souris dans un modèle de reconnaissance sociale ainsi que sur la quantité d'ocytocine dans le cerveau. L'implication de l'ocytocine dans ce test a été démontrée par l'utilisation de souris génétiquement modifiées déficitaires dans la production de cette hormone

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l'identification de composés ayant un effet sur le niveau d'interaction des souris avec leurs congénères ainsi qu'une action sur le taux d'ocytocine dans le cerveau. Ces composés sont développés pour être utilisés dans les traitements de l'autisme (en 2017 120 000 personnes présentaient ce trouble, avec 74 cas pour 10 000 enfants, source santé publique France), ou de la schizophrénie (environ 600 000 personnes touchées en France et 0.7 à 1% de la population mondiale, source Inserm) par exemple. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (souris) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive en fonction de l’objectif scientifique attendus.

Procédures

Les animaux seront soumis aux tests d'interacations sociales, à des prélèvements sur animal vigile et/ou anesthésié à la fin des test.

Impact sur les animaux

Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Ils font donc l’objet d’échanges avec les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place des traitements de potentiels signes cliniques. Les souris mâles et femelles seront isolées pendant l'expérience jusqu'à 15 jours afin de stimuler leurs interactions. Elles seront en contat visuel/olfactif/auditif avec leurs congénères et un sur-enrichissement sera présent afin d'améliorer leur bien-être et la qualité des données recueillies.

Devenir

Sacrifice des animaux pour réaliser des prélèvements d’organes/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal Et/ou Sacrifice des animaux suite aux effets indésirables provoqués par le(s) produit(s)/ modèle chez les animaux Et/ou Réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité léger, modéré ou sans réveil après accord du vétérinaire.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le taux d'ocytocine dans le cerveau, ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 10 / par groupe. L’analyse statistique sera adaptée au modèle.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux,• la présence d'un sur-enrichissement • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • le suivi d’éventuel signes cliniques, • la détermination des points limites, • le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • la réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • la familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets d'un produit sur la quantité d'ocytocine présente dans le cerveau. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

150 xénopes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Les femelles reçoivent des injections hormonales répétées pour provoquer des pontes d'ovocytes, avec des périodes de repos de trois à six mois entre deux prélèvements, et 130 d'entre elles sont réutilisées. Les mâles sont tués pour prélever leurs testicules et préparer des noyaux spermatiques. Le porteur affirme que ces ovocytes fournissent un système d'étude "unique" du fuseau de division, qu'aucune culture cellulaire ne peut remplacer.

Objectifs

La mitose permet la division d’une cellule mère et la répartition fidèle du matériel génétique entre les deux cellules filles. La ségrégation fidèle des chromosomes repose sur le fuseau, une structure bipolaire composée de microtubules. La morphologie du fuseau, et notamment sa taille et son architecture, est essentielle pour sa fonction. Cependant, malgré des décennies d'étude, on ignore encore comment le fuseau adopte une morphologie optimisée pour sa fonction.

Bénéfices attendus

L'étude de l'assemblage et de la fonction du fuseau est particulièrement importante car des défauts de ségrégation des chromosomes sont à la base de diverses maladies humaines.

Procédures

Deux injections hormonales permettent l'obtention des ovocytes nécessaire à ce projet. L’hormone est injectées dans le sac lymphatique dorsal. L'injection se fait avec la plus petite aiguille possible et rapidement (moins d'une minute) pour éviter tout stress à l'animal. Les animaux femelles restent au repos entre les injections. Les animaux mâles, eux, sont sacrifié à la suite des stimulations hormonales afin de prélever les testicules pour réaliser la préparation de noyaux spermatiques.

Impact sur les animaux

Aucune procédure susceptible d'entrainer de la douleur n'est pratiqué dans le cadre de ce projet. La mise à mort des mâles se fait également en suivant la méthode règlementaire. Les points limites décrits ci-dessous sont utilisés dans le cadre du suivi post-manipulation (conséquences éventuelles à l'injection de l'hormone et à la contention des animaux) mais également de l'état sanitaires des animaux de la colonie. Ils sont communs aux espèce X. laevis et X. tropicalis. Points Critiques : amaigrissement d'un individu, dépigmentation, absence de réponse aux stimuli (passage main au-dessus des bacs), absence de pontes de qualité.

Devenir

Les animaux femelles restent au repos entre les injections avec un intervalle d'au moins 6 mois pour X. laevis et d’entre 3 et 4 mois minimum pour X. tropicalis. Les animaux mâles, eux, sont sacrifié à la suite des stimulations hormonales afin de prélever les testicules pour réaliser la préparation de noyaux spermatiques.

Remplacement

L’utilisation du modèle Xénope nous permet d’obtenir les ovocytes servant à la préparation d’extraits cytoplasmiques. Ces extraits sont uniques car ils sont capables de reproduire in vitro les évènements du cycle cellulaire et d’assembler des structures de microtubules, telles que les fuseaux de division, de tailles et de structures différentes. La génération in vitro de tel assemblages microtubulaires ne peut être réalisé qu'avec ces extraits d’ovocytes, de plus ce projet repose sur l'étude comparative entre X. laevis et X. tropicalis. C’est pourquoi aucune autre méthode, y compris les extraits de cellules en culture, ne peut être utilisée comme substitut.

Réduction

Les intervalles de repos entre les ovulations permettent d’obtenir une qualité et quantité d’ovocytes élevées, et ainsi d'utiliser moins d'animaux. De plus, le nombre de grenouilles utilisées par session est strictement adapté aux expériences prévues. Enfin, compte-tenu que les ovocytes de X. laevis génèrent plus d'extrait cytoplasmique par animal que X. tropicalis, ils seront utilisés en priorité pour optimiser les différents protocoles et ainsi minimiser le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Les installations qui héberge les grenouilles sont agréées et tous les efforts (soins optimaux, réservoir, eau, température, etc.) sont faits pour minimiser la souffrance, la détresse potentielle et améliorer le bien-être animal. Les animaux sont maintenus en bacs communautaire d'une vingtaine d'individus maximum dans un local ou la température de l'eau et de l'air est contrôlée et adaptée à l'espèce (18-20°C X. laevis, 23-25°C X. tropicalis). Ils sont maintenus avec une photopériode 12h/12h tamisée. La manipulation des animaux est minimale. Les animaux destinés aux expérimentations sont isolés au calme dans la pièce de stabulation dans des bacs individuels depuis l'injection de prime initiale jusqu'à 24h après le boost.

Choix des espèces

De par son mode de fécondation externe, il est possible de récupérer les ovocytes de Xénope dans le milieu de nage de l’animal, après une simple stimulation hormonale et sans chirurgie ni euthanasie. Ces ovocytes permettent la préparation d’un système d’étude unique, les extraits cytoplasmiques, permettant de reproduire le cycle cellulaire in vitro. Enfin, la possibilité de comparer ces deux espèces ouvre la voie à la compréhension des variations de la taille et de la morphologie du fuseau. En effet, ces deux espèces diffèrent non seulement au niveau de la taille de leurs corps, de leurs cellules et de leurs génomes mais egalement au niveau de la taille et de l’architecture de leurs fuseaux. Les mâles et les femelles utilisés pour les pontes sont des adultes. Un Xénope adulte femelle se conserve environ une dizaine d'année.

525 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger, pour produire du sérum et suivre la réponse immunitaire à des vaccins. Ils reçoivent jusqu'à six injections et des prélèvements sanguins répétés, et pour la production de sérum des prélèvements sanguins terminaux sous anesthésie profonde qui entraînent leur mort. Neuf chiens peuvent être réutilisés dans d'autres projets et neuf placés en adoption, les autres étant euthanasiés. Le porteur affirme que le recours à l'espèce cible est "indispensable" et relève d'une exigence réglementaire.

Objectifs

Le projet a pour but d’évaluer l’efficacité par suivi de la réponse immune d’un vaccin destiné au chien. Les études d’efficacité permettent de connaitre le niveau de réponse immunitaire induit par le produit chez l’animal grâce à des paramètres évalués par des analyses de laboratoires. Le suivi suite à l’administration du vaccin permet de répondre à des exigences réglementaires ou de produire chez le chien une grande quantité d’anticorps dirigés contre une valence spécifique. A la suite de ce projet, les anticorps spécifiques produits sur l’animal peuvent être injectés à d’autres chiens afin de les immuniser de façon passive.

Bénéfices attendus

Le suivi suite à l’administration du vaccin permet de répondre à des exigences réglementaires ou de produire chez le chien une grande quantité d’anticorps dirigés contre une valence spécifique. A la suite de ce projet, les anticorps spécifiques produits sur l’animal peuvent être injectés à d’autres chiens afin de les immuniser de façon passive. Ce projet permet également la production de sérum pour les laboratoires afin qu’il soit utilisé comme réactif. L’intérêt final de ces études est de permettre le soin des animaux avec des produits efficaces et présentant un risque minimal.

Procédures

Pour la procédure d'évaluation de l'efficacité par suivi de la réponse immune, les animaux peuvent recevoir 1 à 5 administrations de vaccin de 2 à 5 semaines d'intervalle en fonction du produit étudié et des modalités d'administration. Des prélèvements sanguins intermédiaires à 24h d'intervalle, ainsi que des écouvillons nasaux et trachéaux peuvent être effectués en fonction de l'objectif scientifique. Dans les cas de douleurs liés à l’administration, ou de prélèvements répétés et/ou invasifs, une anesthésie peut être pratiquée pour soulager l’animal. Les paramètres mesurés lors de cette procédure sont de deux types : - Paramètres cliniques (liste non exhaustive) : poids - température rectale – examen clinique général - Paramètres biologiques (liste non exhaustive): sérologie – immunologie - l’isolement viral pour vérification du statut de l’animal – hématologie/biochimie. Pour ce faire, différents types de prélèvements sont nécessaires. Les études d’efficacité sont de deux types : - Les études d’efficacité immédiate dont la durée maximale est de 20 semaines. - Les études de durée d’immunité dont la durée maximale est de 5 ans. Pour la procédure immunisation pour production de sérum, les animaux peuvent recevoir de 2 à 6 injections. Fréquence de deux fois par semaine jusqu’à toutes les 4 semaines. Des prélèvements sanguins sont réalisés à différents moments de l’étude pour vérifier le niveau de séroconversion des chiens. Si des signes d’inconfort ou de douleur sont détectés, une anesthésie peut être administrée pour soulager l’animal

Impact sur les animaux

La répétition des administrations et des prélèvements sur le long terme peut occasionner un stress chez les animaux. En cas de prélèvements sanguins répétés, une sédation ou un changement de site de prélèvement peuvent être mis en place. Les administrations et les prélèvements sont réalisés par des opérateurs hautement qualifiés qui assurent une contention adaptée pour que l’acte soit le moins douloureux et traumatisant pour l’animal.

Devenir

Pour la procédure expérimentale : Evaluation de l’efficacité d’un vaccin chez le chien par suivi de la réponse immune : Dans des cas exceptionnels, si un des points limite est atteint, l'animal est euthanasié. En fonction des études antérieures et si leur statut le permet, les animaux peuvent être utilisés dans d’autres projets.Si les circonstances le permettent (acquéreur sérieux, bonnes conditions d’accueil après examen du candidat par la SBEA), les chiens peuvent être adoptés. La réutilisation et le placement de l’animal est de la responsabilité du vétérinaire désigné qui évalue le bien-être des animaux à la fin de la procédure expérimentale. Les animaux n’étant pas réutilisés ou adoptés par la suite sont euthanasiés. Pour la procédure expérimentale : Immunisation de chiens pour production de sérum : Après anesthésie profonde, des prélèvements sanguins terminaux sont réalisés sur les animaux. Tous les animaux sont euthanasiés

Remplacement

Lorsque cela est possible une première étape dans le projet de développement d’un vaccin consiste à tester in vitro différents candidats, ce qui permet une première sélection, réduisant ainsi le nombre de candidats à tester in vivo donc le nombre d’animaux utilisés. Un recueil d’informations est aussi apporté par la bibliographie lorsque cela est possible. Lorsque les modèles existent, un premier test sur des espèces alternatives (notamment des rongeurs) est réalisé afin de réduire le nombre de chiens utilisés. Le recours à l’espèce cible est à l’heure actuelle indispensable, les résultats obtenus sur espèces alternatives n’étant pas complètement extrapolables. C’est pourquoi le test sur l’espèce cible est une exigence règlementaire.

Réduction

Pour les études réglementaires, le nombre d’animaux est fixé par les textes. En amont, lors des phases recherche, les effectifs sont évalués au plus juste (analyse statistique, historique, définition des objectifs…) de façon à minimiser le nombre de chiens utilisés en limitant le risque d’études non conclusives. Lorsqu’il s’agit de récolte de sérum, le nombre d’animaux est dépendant du volume de sérum nécessaire.

Raffinement

Les études d’immunisation ont pour objectif de connaitre le taux d’anticorps protecteur pour différents agents pathogènes et donc, in fine, de réduire le nombre d’animaux utilisés dans des procédures sévères. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Une anesthésie peut être réalisée pour les prélèvements sanguins répétés. Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’espèce et à l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Les chiens sont hébergés en groupe et ont à disposition des méthodes d’enrichissement (dont des jouets, changés de manière hebdomadaire, paniers et/ou bancs de couchage) afin de stimuler l’exercice physique et leurs activités cognitives. La SBEA garantit constamment l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.

Choix des espèces

L’évaluation sur espèce cible (chien) est une exigence règlementaire. Lors de la production d’anticorps, il est indispensable qu’ils soient produits dans l’espèce cible. La majorité des chiens utilisés sont des chiots âgés d’environ 8 semaines ou des chiens adultes. En effet, une fois commercialisé, les animaux recevront le vaccin pour la première fois à partir de 8 semaines d’âge. L’âge minimum dépend de l’objectif de l’étude, du vaccin testé et répond à l’exigence expérimentale d’utilisation du produit mis sur le marché et des exigences des autorités. Dans des cas très exceptionnels, il est possible d’importer des mères gestantes dans le but de tester l’efficacité du vaccin sur des chiots âgés de 4 à 8 semaines.