Procédures légères

12 720 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 7 020 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un infarctus est provoqué chirurgicalement sur le cœur, suivi de biopsies et de six prises d'image par animal sous anesthésie, le porteur annonçant une baisse d'activité ou d'appétit après l'opération. L'espoir de stratégies pour régénérer les tissus humains est renvoyé au long terme, l'objet immédiat étant d'identifier les séquences d'ADN qui activent la régénération du cœur du poisson, une partie des animaux étant aussi utilisée pour la formation de personnels. Le porteur affirme que les cultures de cellules et les modèles informatiques ne reproduisent pas ce qui se passe dans un cœur vivant, et justifie l'effectif par des stratégies d'accouplement calculées d'après des expériences antérieures, sans donner de chiffre.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment certains tissus peuvent se régénérer après une lésion chez le poisson zèbre. Ce petit poisson est utilisé comme modèle scientifique car il possède une capacité naturelle à reconstruire des organes endommagés, comme la nageoire ou le cœur. Pour atteindre cet objectif, les approches suivantes seront adaptées : 1. Identifier les séquences d'ADN responsables de l'activation des programmes de régénération cardiaque. 2. Évaluer l’impact de l’inhibition pharmacologique ou de la délétion génique de ces éléments sur la régénération cardiaque. En étudiant ces mécanismes, nous espérons identifier des processus biologiques communs qui pourraient, à long terme, aider la recherche médicale à développer de nouvelles stratégies pour favoriser la régénération des tissus chez l’être humain, par exemple après un accident ou une maladie.

Bénéfices attendus

Le poisson zèbre permet d’étudier comment le cœur peut se réparer après un infarctus. En comprenant comment les gènes s’activent pour régénérer le cœur chez le poisson, nous pourrons mieux comprendre pourquoi le cœur humain a plus de difficultés à se réparer. Ces connaissances pourraient ensuite aider à développer de nouvelles stratégies pour améliorer la récupération du cœur après une attaque cardiaque.

Procédures

Biopsie: réalisée une seule fois sous anesthésie générale et analgésie, durée

Impact sur les animaux

LLes effets indésirables prévus sur les animaux : • Biopsie: sous anesthésie générale et analgésique peut induire une gêne très brève de quelques secondes. • Chirurgie cardiaque : sous anesthésie générale et analgésique peut induire une douleur modérée de courte durée après l’infarctus expérimental, pouvant s’accompagner d’une baisse d’activité ou d’appétit. •Imagerie : réalisée sur animaux anesthésiés, 6 photos par animal, chaque photo prenant environ 1 minute.

Devenir

L'ensemble des poissons de ce projet seront mis à mort à la fin de ce projet car l’ensemble des analyses auront été́ réalisées soit au court des procédures soit seront réalisées en post mortem.

Remplacement

Dans ce projet, l'utilisation d'animaux est nécessaire pour comprendre comment le cœur peut se réparer naturellement après une blessure. Ce phénomène de régénération implique des mécanismes très complexes qui concernent l’ensemble du corps, comme la circulation du sang, les réactions du système immunitaire ou encore les échanges entre différents types de tissus. Aujourd’hui, les expériences sur des cellules cultivées en laboratoire ou des modèles informatiques ne permettent pas de reproduire avec précision ce qui se passe dans un cœur vivant. Le poisson zèbre, un petit poisson dont le cœur a une grande capacité naturelle de régénération, est utilisé dans ce projet. Il constitue un modèle reconnu et précieux pour mieux comprendre les mécanismes qui pourraient un jour aider à réparer un cœur humain malade.

Réduction

Les stratégies d’accouplements ont été calculées selon les expériences antérieures pour générer un nombre suffisant d’animaux pour mener à bien ce projet et effectuer les tests statistiques nécessaires à l'analyses des données.

Raffinement

Les poissons utilisés dans ce projet sont élevés dans de bonnes conditions (eau propre, température adaptée, éclairage approprié) et leur comportement est observé chaque jour. Toutes les interventions sont réalisées avec le plus grand soin et sous anesthésie, avec des traitements pour limiter la douleur. Des points limites stricts et spécifiques au projet sont appliqués afin de réduire au maximum tout inconfort pour les animaux. Après chaque intervention, les poissons sont surveillés et, si leur état se dégrade, une mise à mort sans douleur est pratiquée immédiatement.

Choix des espèces

Le poisson zèbre (zebrafish) est un animal largement utilisé en recherche biomédicale car il partage environ 70 % de son génome avec l’être humain, et son système cardiovasculaire fonctionne de manière très similaire au nôtre. Pendant le développement, ses embryons se forment à l’extérieur de la mère et sont transparents, ce qui permet d’observer en détail la formation du cœur et des vaisseaux, sans chirurgie ni extraction. Notre étude se fera chez l’adulte, ce poisson possède une capacité remarquable de régénération : il peut réparer entièrement une partie de son cœur après une blessure. Cette aptitude exceptionnelle en fait un modèle idéal pour étudier la régénération des organes et mieux comprendre les mécanismes qui pourraient un jour inspirer la médecine humaine.

Une lignée est créée porteuse d'une mutation du collagène qui provoque une myopathie dégénérative, avec des difficultés à se déplacer ou à respirer. 1 800 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 900 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une biopsie de nageoire et un isolement de sept à dix jours le temps du génotypage, que le porteur reconnaît stressant, pour que les différences de structure du muscle soient observées de la naissance à un an. Aucun ne sortira vivant du laboratoire, le porteur indiquant que l'adoption d'animaux génétiquement modifiés est interdite par la loi.

Objectifs

Les myopathies dégénératives sont des maladies incapacitantes dont les symptômes s'aggravent avec l'âge. Diverses pathologies ont été répertoriées chez l'homme. Ces myopathies sont généralement des maladies génétiques et nombre de ces pathologies sont liées à des mutations du collagène identifiées chez les humains. Une grande partie de ces pathologies sont des maladies dites 'orphelines' pour lesquelles il n'existe aucun traitement à l'heure actuelle. Les atteintes musculaires sont généralement multiples et couvrent un champ étendu de la physiologie musculaire qui mènent à la dégénérescence musculaire. Chez les malades, la progression de la maladie reste relativement imprédictible. Une même modification génétique peut aboutir à une évolution des symptômes très différents d'un individu à l'autre. Cette diversité est due au contexte génétique et physiologique propre à chaque individu et certainement à des causes environnementales ou comportementales, lié au parcours personnel des malades. L'étude de la mécanistique de progression de ces maladies chez les humains est impossible car elle nécessiterait de réaliser des analyses invasives et incapacitantes. Aussi, afin de mieux appréhender ces pathologies, les symptômes des myopathie nécessitent d'être étudiés à l'échelle physiologique. L'objet de cette étude implique de créer deux lignées de poissons-zèbres porteuses d'un marqueur fluorescent observable in vivo. L'une de ces lignées reproduit une myopathie dégénérative due à une mutation génétique et l'autre est normale. Le but du projet est d'observer les différences structurelles du muscle apparaissant chez la lignée mutante au cours du temps (entre la naissance et un an) par des techniques d'imageries in vivo chez la larve et sur des muscles fixés chez les adultes.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mieux comprendre le mécanisme de dépôt du collagène dans le muscle dans un contexte normal et pathologique et améliorera la compréhension des mécanismes en jeux dans les myopathies dégénératives, ouvrant éventuellement la voie à de nouvelles pistes pour le développement de traitement.

Procédures

Une partie des animaux seront soumis à une unique biopsie de nageoire caudale réalisée sous anesthésie d'une durée d'environ 5 minutes. Il n'y a pas d'autre intervention prévue sur les animaux vivants.

Impact sur les animaux

Les animaux porteurs de la mutation du collagène sont susceptibles de développer une myopathie dégénérative qui peut entraîner des difficultés de déplacement ou respiratoires. Certains animaux subiront une biopsie de nageoire qui peut entrainer une douleur temporaire. La recherche des modifications génétiques implique de conserver les animaux testés en isolement pendant 7 à 10 jours ce qui peut entrainer du stress.

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mis à mort. Les animaux utilisés dans toutes les procédures sont des animaux génétiquement modifiés dont l'adoption est interdite par la loi.

Remplacement

Pour comprendre la mise en place de la pathologie étudiée, il est nécessaire d'étudier sa mise en place dans l'organisme entier et par conséquent nécessite le recours à l'animal.

Réduction

Le nombre de poissons a été réduit au minimum nécessaire afin d'assurer la pérennité de chaque lignée. Le faible taux de succès attendu lors du protocole de création de lignées génétiquement modifiées impose d'utiliser un nombre important d'animaux pour générer la modification désirée. Les étapes de sélection des animaux sont réalisées sur les stades embryo-larvaires transparents ce qui permet de réduire le nombre d'animaux mis en élevage. Le nombre d'animaux mis en élevage est calculé à partir des constantes d'élevage de l'animalerie (taux de survie à l'issue de l'alevinage, ratio mâle/femelle, ...). L'ensemble des analyses in vivo sont réalisées sur des formes embryo-larvaires afin de limiter le nombre d'animaux mis en élevage.

Raffinement

Les lignées sont maintenue en bac de 20 à 30 poissons ce qui permet de maintenir une sociabilisation adéquat. Des artémies vivantes sont utilisées de manière journalière comme nourriture afin de solliciter l'instinct de prédation des poissons. Les accouplements sont réalisés dans un environnement d'image de flore aquatique pour limiter au maximum le stress. Une minorité des poissons élevés sera génétiquement testée. Des points limites adaptés ont été définis pour permettre le suivi des animaux soumis à ces tests. Chez les animaux porteurs de la mutation, nous rechercherons avec attention l'apparition de signes annonciateurs de myopathie afin d'éviter toute souffrance inutile. Lorsqu'il sera nécessaire d'isoler des animaux, ceux-ci seront placés dans des bacs aux cloisons transparents qui permettent de maintenir un contact visuel et olfactif avec leurs congénères afin de permettre une poursuite des interactions sociales et limiter le stress. Des points limites prédictifs adaptés au modèle utilisé ont été établis et seront utilisés pour évaluer le bien-être des animaux en expérimentation.

Choix des espèces

L'utilisation du poisson-zèbre facilite l'observation des stades les plus précoces de la pathologie en permettant un accès aux embryons sans avoir recours à des protocoles invasifs. De plus, si les muscles des poissons zèbres porteurs de mutation dans le gène collagène montrent des atteintes cellulaires similaires à celles observées chez les mammifères, les conséquences en terme de comportement sont réduites, la nage étant moins impactée que la marche par les atteintes musculaires. Ainsi lorsque l'on observe la nage spontanée, les poissons porteurs de la mutation sont capables de se déplacer de façon normale. Certains animaux seront soumis à un test génétique entre 3 et 6 mois, les animaux plus jeunes étant plus fragiles. Les animaux porteurs de mutations seront suivis tout au long de la vie pour surveiller l'éventuelle apparition de symptômes.

Pour valider un test in vitro normalisé, 1 410 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 290 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent dix jours en cage à diurèse, sur grille, sans litière ni coton de nidification, ce que le porteur décrit comme un "inconfort constant". Leurs croquettes sont élaborées avec des échantillons de sols contaminés au chrome et au nickel, ce qui réduit la prise alimentaire et empêche l'usure normale des dents, et leurs reins sont prélevés après la mise à mort. Le test ainsi validé est une norme ISO d'évaluation des risques liés aux sols pollués, le porteur présentant le passage du porcelet à la souris comme un gain d'information.

Objectifs

L’objectif principal de ce projet est de valider le test in vitro "Unified Barge Method" (Norme International Organization for Standardization 17924:2019) pour l’évaluation de la bioaccessibilité des métaux lourds, tels que le chrome et le nickel, en s’appuyant sur le modèle souris, en établissant des corrélations in vitro-in vivo fiables au regard des critères de validation entre bioaccessibilité et biodisponibilité relative, afin d’améliorer l’évaluation des risques sanitaires liés à l’exposition aux sols contaminés.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de confirmer les résultats obtenus sur le modèle porcelet, mais également d’apporter de nouveaux résultats, tels que la mesure des métaux dans les urines sur le modèle murin. L’établissement de relations dose-réponse linéaires pour les matrices de référence de métaux lourds (Nickel, Chrome II et Chrome VI) constitue une étape fondamentale pour évaluer la biodisponibilité relative des sols contaminés. Cette linéarité, qui suppose une proportionnalité entre la dose administrée et l’accumulation dans les matrices biologiques cibles, est essentielle pour comparer de manière fiable les sols aux références. Il s’agira plus spécifiquement de surmonter les limites rencontrées avec le modèle porcelet, notamment la difficulté de collecter les urines, en utilisant la souris pour faciliter la collecte des matrices biologiques, en particulier des urines et des reins (organes principaux d’accumulation pour Chrome et Nickel). Les bénéfices attendus de la troisième procédure sont également une confirmation des résultats déjà obtenus in vitro.

Procédures

Mesure de l'acceptation de la nourriture supplémentée avec de la terre. Les animaux seront placées en cages à diurèse pendant 10 jours consécutifs

Impact sur les animaux

L'utilisation des cages à diurèse sur une durée prolongée (10 jours) entraîne un inconfort constant (grille, absence de litière, de coton de nidification). L'alimentation AIN-93G peut induire une diminution de la prise alimentaire et limite l'usure de dents réalisée avec les croquettes classiques.

Devenir

À la fin de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés. Cette étape est nécessaire afin de prélever différents organes, notamment les reins, afin de mesurer la biodisponibilité des métaux lourds et d’effectuer les analyses biologiques prévues dans le protocole expérimental.

Remplacement

L'objectif est de valider le test in vitro "Unified Barge Method" (Norme International Organization for Standardization 17924:2019) pour l’évaluation de la biodisponibilité relative des métaux lourds, tels que le chrome et le nickel, des sols contaminés. Le remplacement du modèle porcelet par la souris permettra d'obtenir des informations supplémentaires, notamment grâce à la collecte des urines en cages à diurèse. L'utilisation d'un modèle animal pour déterminer la bioaccumulation dans les tissus reste, à ce jour, indispensable.

Réduction

La réalisation des tests sur un seul des deux sexes, en fonction des résultats obtenus, permet de diviser le nombre d’animaux par deux. Dans la littérature, les expérimentations étant généralement réalisées sur des souris femelles, cependant, elle sera réalisée afin de considérer les deux sexes pour justement les comparer (car pas ou peu fait dans la littérature) et voir quel sexe serait le plus pertinent pour n’en sélectionner qu’un (et donc réduire le nombre d’animaux). La mesure de l'acceptation de l'alimentation ne sera réalisée qu'une seule fois si les matrices testées sont identiques, ce qui limite les répétitions inutiles. De plus, le nombre de souris sera réduit si une même matrice est testée lors d’une deuxième session. Enfin, si des animaux issus de procédures non invasives sont disponibles, le choix se portera sur l'utilisation de ces animaux afin d’éviter la commande de nouveaux animaux. Le principe de réduction a été appliqué dans la définition des effectifs, avec un minimum de 6 animaux par groupe , ce qui représente le seuil nécessaire pour garantir la robustesse des analyses statistiques, tout en tenant compte des éventuelles variations individuelles de croissance. Enfin, après euthanasie, les prélèvements collectés seront divisés en aliquotes pour réaliser plusieurs analyses sur un même individu. Cette approche maximise l’exploitation des données et contribue à une réduction significative du nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Dès leur réception, les animaux seront placés par 6 dans les cages durant les phases (acclimatation, la mesure de l'acceptation de l'alimentation et avant la mise dans les cages à diurèse). Les souris ne seront pas isolées, elles seront hébergées par deux dans les cages à diurèse pour ne pas induire de stress lié à l’isolement. Toutes les cages seront équipées d’éléments d’enrichissement environnemental : tunnels ou maisons rouges, litière, coton de nidification et rondins de bois. Les urines, fèces et reins des 2 animaux seront donc respectivement poolées par cage et il est prévu d’avoir pour chaque condition 3 cages, ce qui permettra d’évaluer la répétabilité. Afin de diminuer le stress induit par les différentes procédures, un entraînement préalable sera mis en place pour habituer les animaux à la contention et aux cages à diurèse. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne lors des phases d’acclimatation et de l’étude préliminaire et seront observés attentivement. Pour les souris hébergées en cages à diurèse, une évaluation systématique de l’état de santé sera réalisée deux fois par jour à l’aide d'une grille de score. Un arbre décisionnel sera également appliqué pour garantir une prise de décision rapide et appropriée en cas de signes de détresse. Pour améliorer le confort des souris, les grilles des cages à diurèse, seront remplacées par des plaques avec des trous, et des maisons rouges ou tunnels y seront installés afin d’offrir aux animaux un espace où se cacher. Un rondin de bois suspendu sur le côté des cages (afin d’éviter que les souris urinent dessus) sera également ajouté. Il permettra de compenser le fait que les croquettes (élaborées avec les différents échantillons de sol) seront proposées sous forme de pâtée, en offrant aux souris la possibilité d’exprimer leur comportement de rongeur. La conception des plaques perforées a été pensée dans un objectif d’amélioration du bien-être animal. Toutefois, afin d’éviter ou de limiter la stagnation des selles et des urines, les plaques seront légèrement inclinées vers le centre. Les plaques seront fabriquées à façon (fabricarium, Polytech) et des essais seront réalisés pour vérifier l’absence de stagnation avant que la totalité des plaques ne soit fabriquée. Une alternative serait, en cas d’observation d’une stagnation, un remplacement quotidien des plaques perforées, permettant ainsi leur nettoyage et leur séchage.

Choix des espèces

La souris a été choisie pour compléter les résultats obtenus lors d'une première étude réalisée sur le porcelet. En effet, la collecte des urines n'avait pas été possible chez le porcelet, alors que les métaux lourds, tels que le nickel et le chrome se retrouvent en partie dans les urines. Le choix de la souris se justifie également par la disponibilité des cages à diurèse adaptées à cette espèce, permettant la collecte optimale des urines nécessaires à l’analyse de la biodisponibilité des métaux. Les animaux utilisés seront adultes (âgés de plus de 9 semaines). À ce stade, leur poids est stabilisé et le facteur croissance n’impactera pas la prise alimentaire.

Des injections répétées d'antigène associé à un adjuvant, suivies de prélèvements sanguins répétés, provoquent chez les souris des rougeurs et des irritations locales au point d'injection. 1 500 souris vont être utilisées, toutes tuées pour que soient prélevés leurs organes du système immunitaire, dont 300 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce 150 études sur la durée du projet et des points limites "stricts et spécifiques" sans indiquer lesquels, ni combien d'animaux par étude. L'objet réel est de fournir à un laboratoire pharmaceutique dix à cinquante anticorps monoclonaux candidats, le porteur revendiquant par ailleurs une réduction de moitié du nombre d'animaux par rapport au projet précédent.

Objectifs

Au sein de notre département de recherche, l'utilisation des technologies de laboratoire sans animaux (plateformes in vitro) s'est largement développée ces dernières années, s'inscrivant dans une démarche de réduction de l'expérimentation animale. Le but de ce projet est de générer des anticorps monoclonaux chez la souris dirigée contre un antigène cible spécifique impliqué dans des maladies humaines. Ces anticorps, une fois produits, seront testés dans des modèles de laboratoire sans animaux pour valider leur potentiel thérapeutique. Les anticorps développés dans le cadre de ce projet sont destinés à des approches d'immunothérapie pour traiter des patients atteints de cancers (tumeurs solides et cancers du sang) et de maladies auto-immunes et inflammatoires (polyarthrite rhumatoïde, lupus, maladies inflammatoires de l'intestin) Ce projet vise à générer environ 10 à 50 anticorps monoclonaux candidats les plus prometteurs. Nous anticipons 150 études sur la durée totale du projet. Les anticorps générés constitueront des outils biologiques précieux pour mieux comprendre les mécanismes des maladies ciblées, développer de nouveaux traitements plus efficaces et mieux tolérés et offrir des alternatives thérapeutiques aux patients en échec avec les traitements actuels. Cette approche s'inscrit dans la mission de notre laboratoire : développer des médicaments innovants pour améliorer la vie des patients atteints de maladies graves pour lesquelles les options thérapeutiques restent limitées.

Bénéfices attendus

Bénéfices à court terme (1-2 ans) Le bénéfice immédiat de ce projet est la découverte et la caractérisation d'anticorps monoclonaux hautement spécifiques dirigés contre un antigène d'intérêt thérapeutique. Ces anticorps constitueront des candidats médicaments prometteurs pour les phases de développement ultérieures. Bénéfices à long terme pour les patients (5-10 ans) À plus long terme, ce projet vise à mettre à disposition de nouveaux traitements thérapeutiques sous forme d'anticorps pour des patients souffrant de maladies graves. En oncologie, cancers du poumon résistants aux chimiothérapies conventionnelles, cancers du sein triple-négatifs, particulièrement agressifs… En maladies auto-immunes et inflammatoires, polyarthrite rhumatoïde résistante aux traitements de fond, lupus érythémateux systémique, maladie chronique aux options thérapeutiques limitées… En maladies du système nerveux central, maladie d'Alzheimer, sclérose en plaques progressive, maladie de Parkinson, maladies neuro-inflammatoires rares sans solution thérapeutique… Ces nouveaux anticorps thérapeutiques offriront aux patients de nouveaux espoirs de guérison pour des maladies actuellement incurables, des traitements mieux tolérés avec moins d'effets secondaires que les thérapies conventionnelles et une amélioration de la qualité de vie grâce à un contrôle plus efficace de leur maladie. Au-delà des bénéfices directs pour les patients, ce projet contribuera à l'avancement des connaissances sur les mécanismes des maladies ciblées, le développement de nouvelles approches thérapeutiques en immunothérapie et la validation de nouvelles cibles pour le développement de futurs médicaments.

Procédures

Les animaux reçoivent 3 à 6 injections d'une préparation contenant l'antigène et un adjuvant pour stimuler leur système immunitaire. Les injections sont espacées de 15 à 21 jours pour permettre au système immunitaire de répondre de manière optimale. Pour la plupart des injections, l’animal est vigile. Pour d’autres type d’injections plus rare, l’animal anesthésié pour réduire l'inconfort. La durée de l'intervention est de quelques secondes par injection. Un prélèvement sanguin intermédiaire, sur animal vigile et l’intervention dure moins d'une minute.

Impact sur les animaux

La manipulation répétée des animaux pour les injections ainsi que pour le prélèvement sanguin entraîne un inconfort léger et de courte durée, comparable à celui ressenti lors d'une prise de sang chez l'homme. Les injections répétées de la préparation contenant l’antigène (la substance qui stimule la production d'anticorps) associée à l’adjuvant (produit qui renforce la réponse immunitaire) peuvent occasionnellement entraîner une légère rougeur au point d'injection et/ou une irritation locale temporaire. Ces effets demeurent rares et transitoires, se résorbant spontanément en quelques jours sans nécessiter de traitement particulier.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés pour récupérer les organes du système immunitaire car les cellules productrices d'anticorps se trouvent dans des organes internes qui ne peuvent être prélevés que post-mortem.

Remplacement

Notre laboratoire utilise une approche combinée associant technologies sans animaux (in vitro) où ces méthodes sont particulièrement efficaces pour développer des anticorps contre des cibles conservées (protéines très similaires entre l'homme et la souris) et expérimentation animale (in vivo) car cette approche reste indispensable pour obtenir des anticorps de haute affinité (anticorps qui se fixent très fortement à leur cible), caractéristique essentielle pour l'efficacité thérapeutique. Les nouvelles technologies de laboratoire (bibliothèques d'anticorps de nouvelle génération) sont en développement constant dans notre laboratoire. Ces innovations devraient progressivement permettre de remplacer l'utilisation de souris transgéniques une fois que les limitations techniques actuelles seront surmontées. L’objectif à terme est de réduire encore davantage le recours à l'expérimentation animale grâce aux progrès technologiques, tout en maintenant la qualité des anticorps produits pour les patients. Actuellement, l’animal reste nécessaire car seul le système immunitaire complet de l'animal peut générer des anticorps avec l'affinité très élevée requise pour les traitements, explorer toute la diversité des réponses immunitaires possibles et reproduire les processus naturels de maturation des anticorps.

Réduction

Grâce aux progrès technologiques et aux approches complémentaires développées ces dernières années, nous avons atteint une réduction de 50% du nombre d'animaux par rapport au projet précédent. Pour chaque programme thérapeutique, une sélection rigoureuse du nombre minimal d'animaux est réalisée afin de capturer la diversité des anticorps recherchés tout en limitant au maximum le nombre d'animaux utilisés. Cette réduction s'explique par l’amélioration des techniques (méthodes sont plus efficaces permettant d'obtenir de meilleurs résultats avec moins d'animaux), une meilleure récupération des cellules immunes et l’utilisation d’approche combinée en créant plusieurs types d'anticorps différents avec un seul animal au lieu d'avoir besoin d'un animal par type d'anticorps. Ces progrès techniques permettent de diviser par deux le nombre d'animaux nécessaires tout en obtenant les mêmes résultats scientifiques.

Raffinement

Nous avons mis en place plusieurs mesures pour améliorer le bien-être des animaux tout au long de l'étude : Qualité des produits administrés : Tous les antigènes administrés sont rigoureusement purifiés et contrôlés avant utilisation, garantissant l'absence de contaminants qui pourraient provoquer des réactions indésirables. Les adjuvants (substances qui renforcent la réponse immunitaire) sont sélectionnés pour leur excellente tolérance, limitant considérablement le risque de réaction au point d'injection. Choix des méthodes d'administration les moins invasives : Les voies d'administration sont choisies selon une stratégie visant à minimiser l'inconfort. La technique de manipulation en coupe (cupping) est utilisée pour la contention des animaux. Cette méthode, moins stressante que la contention par la queue, réduit l'anxiété des animaux et favorise leur habituation aux manipulations. Surveillance continue et environnement enrichi : Les animaux peuvent être hébergés dans des cages spéciales équipées de capteurs qui permettent de surveiller leur activité 24h/24. Cette surveillance continue permet une intervention rapide en cas de problème. En cas de comportements agressifs entre animaux, un enrichissement supplémentaire du milieu est ajouté (matériaux de nidification, objets à ronger, tunnels) afin d'améliorer leur bien-être. Des points limites stricts et spécifiques à ce projet ont été définis et sont appliqués tout au long de la procédure. Ces critères permettent une intervention anticipée dès l'apparition des premiers signes de mal-être.

Choix des espèces

L'animal utilisé dans ce projet est la souris adulte avec un système immunitaire mature (âgée de 6 à 12 semaines). Ce choix repose sur plusieurs raisons scientifiques importantes : Similitude avec le système immunitaire humain: Le système immunitaire de la souris présente une organisation et des mécanismes très similaires au système immunitaire humain. Cette similitude permet de reproduire fidèlement les étapes naturelles de production des anticorps dans l'organisme. Utilisation de souris transgéniques humanisées: Pour ce projet, nous utilisons principalement des souris transgéniques humanisées. Ces souris spéciales ont été génétiquement modifiées pour produire des anticorps possédant des caractéristiques humaines. Cet avantage majeur permet une transposition directe à l'homme des anticorps découverts, facilitant leur développement comme futurs médicaments et réduit considérablement le risque de rejet lorsqu'ils seront administrés aux patients.

Les souris dont l'état ne s'améliore pas malgré un traitement antidouleur sont mises à mort, sur la base d'une grille de score portant sur le poids, la posture, l'aspect du poil et le comportement. 288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation qui peut provoquer perte de poids, déshydratation et diarrhée la première semaine, une immunisation, puis des prélèvements sanguins répétés pouvant conduire à une hémorragie. Les traitements espérés contre l'asthme et la fibrose pulmonaire idiopathique restent lointains, l'objet immédiat étant de savoir si l'absence d'une protéine de surface modifie le développement d'une population de globules blancs, sans qu'aucun effectif par groupe soit donné.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier le rôle d’une protéine particulière présente à la surface de certains globules blancs du système immunitaire inné (première ligne de défense de l'organisme en cas d'infections par des bactéries ou des virus), et d’évaluer si son absence affecte leur développement et leur fonction. Ces cellules étant également impliquées dans diverses pathologies, notamment les pathologies des voies respiratoires comme l’asthme et la fibrose pulmonaire idiopathique, il est essentiel de comprendre comment elles se développent afin de pouvoir intervenir sur leur formation et ainsi pouvoir apporter de nouvelles stratégies de traitement de ces maladies.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l’origine du défaut de développement de certains globules blancs notamment dans des maladies comme l'asthme et d’avoir un modèle d'étude pour tester leur importance lors d'infections pulmonaires. A plus long terme, ce modèle pourra être utilisé afin d’étudier de nouvelles stratégies de traitements.

Procédures

Dans ce projet, une partie des souris (normales ou n'exprimant pas la protéine d'intérêt) seront irradiées (exposition à des rayons X qui permettront d'éliminer les cellules de la moelle osseuse en vue de leur remplacement par les cellules qui seront injectées; durée 2 fois 5 min). Une heure après cette étape, les souris recevront des cellules de moelle osseuse exprimant ou non la molécule d'intérêt par voie intra-veineuse (injection dans la veine de la queue, sans anesthésie; durée: 1 min). Nous vérifierons par un prélèvement sanguin au niveau de la veine de la joue si la prise de greffe a bien été obtenue 1 mois après le début de la procédure expérimentale (sur souris non anesthésiée; durée: 15 secondes) puis une fois par mois (3 prélèvements de sang sur la durée de l'expérience). Trois mois après le début de l'expérience, les souris seront euthanasiées. Dans la seconde partie du projet, les souris normales ou n'exprimant pas la molécule d'intérêt, recevront un traitement favorisant l'activation d'une partie des globules blancs (injection dans le ventre sur souris non anesthésiées; durée 15 secondes). Quatre heures plus tard, les souris seront euthanasiées.

Impact sur les animaux

L’irradiation peut constituer une nuisance. En effet, Il y a un effet indésirable possible au cours de la première semaine (perte de poids, déshydratation/diarrhée). L’immunisation (injection d'une molécule qui stimule les cellules que nous étudions) ne constitue pas une nuisance particulière,mise à part le stress de la contention. Les doses administrées ne présentent pas d’effets indésirables. Les prélèvements sanguins répétées entraineront un stress pour l'animal lié à la contention et pourraient dans de très rares cas conduire à une hémorragie.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées en fin de procédures (soit 3 mois soit 4 heures après le début de l'expérience) afin de prélever les différents organes du système immunitaire et de faire une analyse complète de leur composition.

Remplacement

Le développement du système immunitaire inné implique de nombreux organes qu'il est impossible à l'heure actuelle de modéliser. L'utilisation d'organisme vivant entier est donc indispensable afin de comprendre comment les globules blancs se développent et fonctionnent dans des conditions normales mais également lorsque des modifications affectant certains gènes sont présentes.

Réduction

Nous avons réalisé des analyses statistiques grâce un logiciel nous permettant de déterminer le nombre d’animaux nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats interprétables scientifiquement.

Raffinement

Nous réaliserons une observation visuelle quotidienne et un suivi clinique hebdomadaire à l'aide d'une grille d'évaluation (évaluation de la perte de poids, de la posture, de l'aspect du poil, du comportement) permettant d'établir un score clinique pour le protocole expérimental de 3 mois. En cas d'apparition de signes de souffrance, les souris recevront un traitement anti-douleur et l'euthanasie sera réalisée en cas de non amélioration de leur état. Nous veillerons à apporter des conditions d'hébergement adaptées aux souris en ajoutant dans les cages des enrichissements (buchettes en bois à ronger et papier kraft pour la création de nid et de cachettes). Dans le cas du protocole ne durant que 4h, les souris seront observées 30 minutes après l'injection pour s'assurer de l'absence d'effet indésirable.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère dont la génétique et le comportement sont bien connus. Ainsi, l’évaluation du bien-être de la souris ainsi que de la douleur liée à l’expérimentation peut être effectuée aisément permettant une prise en charge adaptée. De même, les modèles de souris génétiquement modifiées sont utilisés depuis longtemps en immunologie fondamentale et la littérature qui en a découlée nous permet d’avoir un recul important sur nos expériences. De manière importante, il y a une conservation des gènes impliqués dans le développement de ces cellules chez l’homme et la souris permettant de faire un parallèle justifiant l’utilisation de la souris comme espèce animale. Pour les expériences de greffe et de traitement, les souris receveuses seront des souris adultes afin d'avoir un système immunitaire inné développé et fonctionnel.

Une injection unique de vecteur AAV ou de sérum physiologique, un prélèvement sanguin sous anesthésie, puis pour une partie d'entre elles un analgésique, un anesthésique profond et une perfusion intracardiaque qui les tue : 168 souris saines suivent ce parcours. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur ramène l'ensemble des nuisances attendues à une douleur légère liée à la piqûre. Toutes sont tuées pour prélever les tissus qui permettront de comparer où se distribue chacun des deux vecteurs de thérapie génique dans le corps.

Objectifs

A ce jour, de nombreuses maladies génétiques ont été identifiées, avec des profils très variés en termes d’âge d’apparition des symptômes, de sévérité et de pronostic vital. La thérapie génique est une approche thérapeutique prometteuse pour ces pathologies, en permettant l'introduction d'une copie fonctionnelle du gène défectueux dans les cellules affectées grâce à des transporteurs. À ce jour, ces transporteurs, les vecteurs adéno-associés (AAV), utilisés en clinique sont majoritairement d’origine naturelle. Bien que les AAV aient démontré leur efficacité dans plusieurs essais cliniques, leur distribution non spécifique, correspondant à la présence du vecteur dans des organes ou tissus non concernés par la thérapie, limite la précision du traitement ce qui réduit leur capacité à atteindre efficacement les tissus concernés par la maladie. Cette faible spécificité nous contraint à l'injection de fortes doses de vecteur, ce qui entraîne un coût très important de production et un plus haut risque d'effets secondaires, notamment des réponses immunitaires ou des toxicités dans le foie, comme cela a été observé dans plusieurs essais cliniques de thérapie génique utilisant des AAV. Il est désormais essentiel, dans le domaine de la thérapie génique, de développer des vecteurs AAV optimisés avec un ciblage précis et restreint, permettant de ne pas cibler des tissus qui ne nécessitent pas d'être traités. Le but de notre projet est de comparer un nouvel AAV optimisé, que l'on appellera AAVx, à un AAV naturel connu pour son ciblage important des muscles et du système nerveux central. Nous comparerons la distribution globale dans l’organisme de ces deux AAVs après une injection intraveineuse administrée à des doses différentes. Nous cherchons à déterminer si notre vecteur d’intérêt présente une efficacité supérieure, une action plus rapide et une spécificité accrue par rapport à un vecteur AAV d’origine naturelle. Si l’AAVx cible efficacement les muscles et le système nerveux central, sans pénétrer dans les organes dont le foie, il serait un très bon candidat dans le cadre du développement d’un traitement de thérapie génique pour des maladies génétiques neuromusculaires.

Bénéfices attendus

Cette étude permettrait d’identifier un vecteur AAV de seconde génération (AAVx) afin de traiter des maladies génétiques affectant les muscles et le système nerveux central en réduisant les effets secondaires observés dans certains essais cliniques. En effet, si l’AAVx se révèle efficace pour atteindre ces tissus, tout en évitant de cibler des organes tels que le foie, cela permettrait de réduire la dose administrée et de limiter le risque de toxicité du foie ainsi que la réponse immunitaire.

Procédures

Tous les animaux subiront une injection unique d’un traitement (un vecteur ou une solution saline servant de contrôle), qui durera maximum 2 minutes par souris. Un prélèvement sanguin sera réalisé sur animaux vivants anesthésiés, une seule fois et durera maximum 5 minutes par souris. Avant la mise à mort par perfusion intracardiaque terminale d’une partie des animaux, ceux-ci recevront une injection sous-cutanée d’un analgésique, puis une injection intrapéritonéale d’un anesthésique profond. Chaque injection durera maximum 2 minutes par souris.

Impact sur les animaux

Les injections et les prélèvements sanguins peuvent occasionner une douleur légère liée à la piqûre.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de pouvoir prélever des tissus qui nous permettront de comparer l’efficacité des deux vecteurs transporteurs de thérapie génique.

Remplacement

Notre vecteur AAV d’intérêt a été sélectionné par un test cellulaire en laboratoire grâce à sa capacité à pénétrer dans des cellules de muscles et de neurones, en comparaison avec des vecteurs AAV d’origine naturelle connus pour leur forte affinité pour les muscles et le système nerveux central. Cependant, ces travaux, réalisés sur un système cellulaire simple composé d’un type cellulaire unique n’est pas suffisant. Nous avons également pu déterminer que notre vecteur d’intérêt est capable de pénétrer dans les cellules musculaires après une injection réalisée directement dans le muscle, mais cela ne nous permet pas de déterminer la distribution globale de ce vecteur dans l’organisme après une injection intraveineuse (la disponibilité du vecteur dans chaque tissu), ni s’il est capable de pénétrer dans le système nerveux central. Pour cela, nous avons besoin d’un organisme complexe, tel que la souris.

Réduction

Le nombre minimal d’animaux dont nous aurons besoin dans notre étude, afin d’observer des différences en termes de distribution globale entre les deux vecteurs AAV étudiés, a été défini à l’aide de calculs statistiques.

Raffinement

Afin de raffiner nos études, les animaux seront hébergés dans des cages enrichies à l’aide de coton et de bâtons à ronger dans un environnement exempt d’organismes pathogènes. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale pour limiter le stress de l’animal lié à l’acte et assurer son immobilité. Pour augmenter le confort des animaux après anesthésie gazeuse, du gel oculaire pourra être appliqué pour éviter le dessèchement des tissus. Une demi-heure avant la perfusion intracardiaque, un analgésique sera injecté en sous-cutané, ce qui permettra de soulager les douleurs intenses éventuelles. Les souris seront ensuite anesthésiées par administration d’un mélange de deux anesthésiques, dont l’un possédant également des propriétés analgésiques. L’animal sera placé sur un support chauffant tout au long de l’anesthésie.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies comme animaux modèles car elles partagent une grande partie de leur physiologie et de leur génétique avec l’humain, ce qui permet d’obtenir des données transposables et elles possèdent des organes et systèmes similaires (foie, cœur, système nerveux central, muscles), ce qui est essentiel dans ce projet pour évaluer la biodistribution des vecteurs après administration par voie intraveineuse. La biodistribution d’un vecteur AAV correspond à l’étude de sa répartition dans l’organisme après administration, afin d’identifier les organes qui reçoivent le vecteur et d’en quantifier la présence, au-delà de ou des organe(s) cible(s) visé(s) par la thérapie. Cette analyse est indispensable pour vérifier l’absence ou la très faible diffusion vers des organes non concernés par la thérapie, notamment les organes sensibles tels que le foie ou la rate. L’âge des animaux correspond à la phase de jeune adulte. Cet âge garantit la maturité des organes ce qui réduit la variabilité interindividuelle et assure la reproductibilité des résultats. De plus, de nombreuses pathologies génétiques neuromusculaires se manifestent dès la période juvénile, donc le choix d’administration des souris à 4 semaines est pertinent pour une future utilisation du vecteur d’intérêt dans un contexte pathologique.