Procédures légères

5 580 souris vont être élevées et tuées pour que soient prélevés des embryons à dix jours et demi de gestation, qui ne comptent pas dans cet effectif. Les procédures déclarées se limitent au tatouage des souriceaux et à une biopsie de queue pour le génotypage, dans un niveau de souffrance léger. Les accouplements contrôlés isolent les mâles, les surnuméraires d'élevage et les géniteurs sont tués. Le porteur ramène l'objectif à la compréhension de la nutrition de l'embryon avant la mise en place du placenta, piste avancée pour les fausses couches répétées chez la femme, et estime l'effectif à partir de son expérience des accouplements plutôt que d'un calcul.

Objectifs

Dans ce projet nous élèverons deux lignées de souris mutantes pour deux transporteurs d’acides aminés afin d’étudier le processus de nutrition des embryons avant la mise en place du placenta. Ce processus, appelé nutrition histiotrophique et qui se produit pendant l'organogenèse, repose sur la dégradation et la transformation en nutriments de macromolécules maternelles par un tissu extra-embryonnaire, le sac vitellin. Nous étudierons la régulation de ce processus par les transporteurs d'acides aminés en effectuant des accouplements contrôlés des souris mutantes et en analysant des tissus embryonnaires et extra-embryonnaires prélevés avnt le dernier tiers de la gestation. L’étude de ces deux transporteurs dans la régulation de la nutrition précoce de l’embryon offrira de nouvelles perspectives pour la compréhension des fausses couches répétées chez la femme, qui pourraient avoir une origine génétique.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre comment les embryons de mammifères se nourissent dans une phase précoce du développement. Les résultats obtenus pourraient permettre de mieux comprendre certaines causes génétiques à l’origine de fausses couches répétées.

Procédures

Les nuissances prévues sont minimales : tatouage des souriceaux et prélèvement d'une biopsie pour le génotypage.

Impact sur les animaux

La procédure de génotypage des animaux implique une biopsie de queue qui peut povoquer un stress (contention légère) et une douleur (prélèvement) de très courte durée et d'intensité faible. Certaines souris mutantes peuvent présenter des défauts oculaires, qui feront l'objet de soins simples et non invasifs (nettoyage doux, lubrification) pour éviter la douleur et les risques d'infection.

Devenir

Les animaux surnuméraires d'élevage seront mis à mort. Les géniteurs des accouplements contrôlés seront mis à mort à la fin de la procédure. Les tissus des embryons sujets de l’étude (jour de gestation 10,5 - non soumis à la directive européenne relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques) seront prélevés pour réaliser diverses analyses (mesures de taille, histologie, immunomarquages, identification de métabolites clés).

Remplacement

Le processus de nutrition histiotrophique est spécifique des mammifères. Il ne peut pas être reproduit par des approches in vitro et il ne peut pas être étudié dans des modèles animaux invertébrés.

Réduction

Les lignées de souris mutantes seront maintenues avec un nombre minimal d'accouplements afin de limiter la production d'animaux surnuméraires. Ce nombre a été estimé à partir de notre expérience de ces accouplements (besoins pour l’élevage, fréquence de réussite des accouplements contrôlés).

Raffinement

Les animaux seront élevés en groupe sauf dans le cas des accouplements contrôlés nécessaires pour produire des embryons pour lesquels des mâles seront isolés. L’isolement des mâles sera limité strictement dans le temps afin de minimiser le stress induit par l’absence de congénères et l’enrichissement sera augmenté dans les cages. Les souris mutantes présentant des défauts oculaires feront l'objet de soins simples et non invasifs pour éviter la douleur et les risques d'infection. Des points limites stricts, spécifiques et précoces seront appliqués tout au long du projet.

Choix des espèces

Le processus de nutrition histiotrophique par le sac vitellin est spécifique des mammifères. La souris constitue un modèle de choix parmi les mammifères en raison de sa petite taille et de la rapidité de son développement. Le sac vitellin des rongeurs présente aussi une particularité anatomique qui facilite l’étude de la nutrition histiotrophique. Le choix du stade de développement E10,5 est basé sur le fait qu’à ce stade, le sac vitellin et l’embryon ont une taille optimale pour la dissection, et que la nutrition de l’embryon se fait toujours via le sac vitellin, et non via le placenta qui devient complètement fonctionnel plus tardivement (E14,5).

Retrait de la portée à la naissance, adoption croisée, séparation de cinq à six heures au deuxième jour d'allaitement, test de tétée sur une femelle inconnue : 1 606 souris et souriceaux passent par ces manipulations, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles reçoivent pendant six semaines une alimentation riche en gras et en sucre qui les mène à un état pré-diabétique, avec 33 % d'adiposité en plus que les témoins, pour mesurer si l'alimentation de la mère modifie l'avidité de tétée et les circuits cérébraux de la faim chez leurs petits. Tous sont tués à l'issue, les cerveaux des souriceaux étant prélevés. Le porteur écrit pourtant que ce projet "ne contient pas d'interventions invasives".

Objectifs

L’environnement nutritionnel précoce joue un rôle considérable sur la vulnérabilité d’un individu face aux maladies métaboliques. Notamment, une alimentation maternelle riche en graisse et en sucre (obésogène) pendant la grossesse et l’allaitement entraîne des adaptations des organes du fœtus et du nouveau-né. Le cerveau se forme pendant la vie intra-utérine et poursuit son développement pendant la jeune enfance. L’alimentation maternelle peut donc affecter durablement le développement neuronal du jeune individu, son métabolisme et son comportement. Notre laboratoire a déjà montré que dès les premiers jours de vie, les souriceaux sont capables de distinguer des laits maternels selon leur signature olfactive. Par exemple, des souriceaux de 2 jours nés d’une mère sous alimentation obésogène pendant la gestation, présentent une préférence olfactive pour un lait collecté d’une femelle sous alimentation obésogène, même si ces souriceaux sont adoptés et allaités dès la naissance par une mère sous nourriture standard. Cette observation démontre l’acquisition d’une préférence sensorielle in utero, qui se maintient après la naissance. De plus, nous avons montré que les souriceaux, dès la naissance, acceptent de téter une femelle allaitante même si elle reçoit une alimentation différente de leur mère biologique. En revanche, nous n’avons pas d’informations sur l’avidité du comportement de tétée dans ces conditions. Nous souhaitons déterminer dans ce projet si les préférences olfactives induites par l’alimentation maternelle obésogène impactent réellement le comportement de tétée. Nous allons pour cela quantifier la quantité de lait ingérée en fonction de la signature olfactive du lait présenté. D’autre part nous souhaitons explorer les mécanismes cérébraux impliqués dans la régulation de la prise de lait chez le souriceau jusqu’au sevrage. Les structures cérébrales impliquées dans la régulation de la prise alimentaire chez l’adulte, telles que l’hypothalamus, sont encore en cours de formation chez le nouveau-né. D’autres mécanismes et structures cérébrales semblent donc mis en œuvre très tôt pour contrôler l’ingestion de lait. Nous souhaitons les identifier et évaluer l’impact de l’alimentation maternelle sur leur fonctionnement.

Bénéfices attendus

Les résultats permettront de mieux comprendre le comportement alimentaire du nouveau-né et les mécanismes neuronaux sous-jacents. Cette étude sera également pionnière dans la mise en place d’un protocole standardisé de quantification de l’ingestion de lait chez le jeune souriceau. Le présent projet permettra enfin de préciser l’effet de l’alimentation maternelle obésogène sur les mécanismes de faim et de satiété à un stade de vie très précoce et ainsi de mieux comprendre les mécanismes conduisant à l’obésité chez les jeunes pour pouvoir la prévenir.

Procédures

Ce projet ne contient pas d'interventions invasives (prélèvements, interventions chirurgicales, injections), uniquement une exposition à une alimentation enrichie en gras et sucre pendant 3 à 6 semaines pour les géniteurs et leurs souriceaux.

Impact sur les animaux

Les femelles sous alimentation obésogène pendant les 6 semaines de gestation et d’allaitement présentent une intolérance au glucose et un excès d’adiposité (+33% par rapport aux femelles sous régime standard STD) en fin de lactation, tout en gardant un poids corporel similaire aux femelles STD. Ces effets indésirables constituent des perturbations métaboliques modérées qualifiées d’état pré-diabétique. Un stress peut être généré chez les femelles lors du retrait de leur portée à la naissance et de la mise en adoption d’une autre portée. Un stress additionnel peut être généré lors de la séparation, au 2ième jour d’allaitement, de leur portée pendant 5-6h, pour la quantification de la quantité de lait ingérée par les souriceaux. Sur les souriceaux, les nuisances ou effets indésirables sont, en fonction des procédures 1 ou 2, le potentiel stress de l’adoption à la naissance, le stress des manipulations (mesures de poids jusqu’au sevrage, et de la composition corporelle dans l’EchoMRI au 2ième jour de vie) et le stress pendant le test d’allaitement sur une femelle inconnue au 2ième jour de vie après 4 heures de séparation de leur mère.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à l’issue des procédures. En effet les géniteurs auront déjà eu plusieurs portées à la fin du projet et pour une partie sous un régime obésogène impliquant des modifications métaboliques non compatibles pour intégrer un autre projet. De même les souriceaux soumis à un régime obésogène in utero et/ou in lacto seront euthanaliser car non utilisable dans d’autres protocoles de physiologie du métabolisme. Les autres souriceaux sont mis à mort pour prélever leur cerveau.

Remplacement

Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier le comportement alimentaire et sa régulation. De plus, les réponses comportementales autonomes et les sensations de faim et de satiété que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables in vitro ou par simulation informatique. Ainsi ce projet sera réalisé chez la souris, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire.

Réduction

Les accouplements seront réalisés en trios (1 mâle pour 2 femelles), ce qui permet de diminuer de moitié le nombre de mâles géniteurs utilisés. De plus, les mâles non exposés au régime obésogène seront utilisés pour plusieurs accouplements successifs, ce qui permet de diminuer encore le nombre de mâles géniteurs utilisés. Les femelles génitrices seront à la fois les mères biologiques, les mères adoptives et les femelles allaitantes pour le test de mesure de l’ingestion de lait ce qui permet de diminuer le nombre de femelles utilisées. Le fait de travailler avec des animaux standardisés (âge et fond génétique maitrisés) dans des conditions d’élevage standardisées (environnement, nutrition, intervention humaine) est un élément qui permet de réduire la variabilité inter-individuelle, et donc de réduire les effectifs nécessaires dans l’étude. Le nombre d’individu par lot pour les analyses histologiques (n=12), moléculaires (n=12), et comportementales (n=20) a été défini précédemment. Ces effectifs sont appropriés pour réaliser des tests de corrélation et des études statistiques comparatives suffisamment puissantes et robustes pour détecter les éventuels effets recherchés.

Raffinement

Pendant les moments de séparation, les souriceaux seront rassemblés dans le nid formé par leur mère dans leur cage d’hébergement, et la cage sera posée sur une plaque chauffante à 38°C pour maintenir le nid à 36°C malgré l’absence de la femelle et ainsi éviter un stress thermique des souriceaux. Les femelles isolées de leur portée seront placées dans une cage séparée avec accès à l’eau et à leur nourriture, et seront remises dans leur cage d’hébergement avec leur portée juste après les mesures réalisées sur leurs souriceaux. Des grilles de scores cliniques ont par ailleurs été élaborées pour suivre les animaux et les euthanaliser en cas d'atteinte des points limites définis avec la SBEA.

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils d’analyses génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Dans ce projet nous souhaitons mettre en évidence des effets très précoces de l’alimentation maternelle obésogène sur la descendance. Nous étudierons donc le comportement alimentaire des souriceaux au cours des premiers jours de vie, en quantifiant les quantités de lait ingérées à deux jours de vie, âge pour lequel nous avons mis en évidence une préférence sensorielle en fonction de l’alimentation maternelle. Nous suivrons également le poids corporel des souriceaux jusqu’au sevrage pour corréler les mesures de comportement alimentaire avec la prise de poids pendant la période d’allaitement. Nous étudierons également les mécanismes cérébraux à 2, 5, 7, 10, et 14 jours de vie. En effet les projections neuronales se mettent en place au cours des deux premières semaines de vie chez la souris.

Des tirs de laser sur la rétine, ou une injection sous la rétine, servent à provoquer une dégénérescence maculaire chez 1 200 lapins âgés de deux à trois mois. Suivent des examens ophtalmologiques répétés, des gouttes administrées jusqu'à six à huit fois par jour et des injections dans l'œil sous anesthésie, l'ensemble étant déclaré en niveau de souffrance léger. Le porteur affirme que le développement de la maladie n'est pas douloureux, tout en indiquant que la pathologie "devrait entrainer une altération permanente de la vision sur l'œil ayant reçu l'induction". 1 104 lapins sont tués pour les analyses ex vivo, les 96 autres, écartés avant l'induction pour un défaut anatomique de l'œil, étant réutilisés dans d'autres procédures.

Objectifs

La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) est la première cause de mal voyance chez les personnes de plus de 50 ans dans les pays industrialisés. Cette pathologie touche l'œil dans une zone particulière de la rétine : la macula, impliquée dans la vision fine et la vision centrale. La maladie est silencieuse pendant plusieurs années, puis la vision et la perception des détails baissent, des tâches sombres apparaissent au centre du champ de la vision. Dans la forme dite humide de la DMLA, plus grave qui évolue rapidement vers une perte importante de la vision centrale, de nouveaux vaisseaux sanguins poussent de façon anormale depuis la choroïde et endommagent la rétine. La stratégie des traitements est de stopper la progression anarchique de ces vaisseaux délétères. Dans une autre forme dite "sèche" la maladie ne développe pas cette néovascularisation, mais des zones de rétine s'atrophient et perdent leur fonction. L’objectif de ce projet est de mettre en place dans l’établissement utilisateur, un modèle expérimental de forme humide en induisant la néovascularisation choroïdienne et aussi un modèle expérimental de forme sèche avec atrophie de la rétine sans néovascularisation, chez le lapin pour participer au développement de substances thérapeutiques limitant l'évolution de cette maladie de la rétine.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera au développement de médicaments luttant contre la DMLA et améliorant la vue des patients. La DMLA est la première cause de mal voyance chez les personnes de plus de 50 ans dans les pays industrialisés et la troisième cause dans le monde (1,5 millions de personnes en France, 196 millions dans le monde). Sa fréquence augmente avec l’âge et le nombre de patient augmentera compte tenu de l’allongement de l’espérance de vie.

Procédures

L’induction de la DMLA chez le lapin se fera par des tirs de laser ophtalmiques sur la rétine sous anesthésie, ou par une injection sous la rétine. Cette manipulation a lieu une fois au début de l'étude. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives. Ces examens sont réalisés chez l’homme en cabinet médical en ambulatoire sans anesthésie. Ils sont également régulièrement pratiqués sur l’animal en clinique vétérinaire dans le cadre des consultations. Pour notre projet, ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles (examens en lampe à fente) mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère. Ils sont rapides, ne dureront pas plus de quelques minutes. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par injection au niveau de l'œil (injection intravitréenne, sous conjonctivale), soit par administration orale, par injection sous cutanée, intraveineuse, ou intramusculaire (pour les anesthésiants). Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 6 à 8 administrations par jour. Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont plus limitées, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical, et durent en général 5 minutes par animal. Si le traitement est administré par voie orale il peut être au maximum quotidien, par voie intraveineuse il sera au maximum 3 fois par semaine, si la voie d’administration est l’injections sous-cutanée, la fréquence sera au maximum de 2 fois par jours, sur la durée de l’étude soit maximum 2 mois. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Le développement de la DMLA chez l’homme, et par transposition chez l’animal, n’est pas douloureux. Les nuisances pour l’animal sont celles dues aux manipulations de l'animal pour les observations, le stress dû aux contentions manuelles de l'animal pour les administrations de produits, les instillations ou la douleur éventuelle de la piqûre lors des injections de produits ou d'anesthésiant. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une douleur légère et de courte durée notamment lors de l’anesthésie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue. En dehors de ces périodes d’examen ou d’administration de traitement, l’animal est libre de ces mouvements, avec un accès à l’eau et à la nourriture. La pathologie devrait entrainer une altération permanente de la vision sur l'œil ayant reçu l'induction.

Devenir

Les animaux qui auront suivi la totalité de chaque procédure expérimentale seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...). Pour les études d’efficacité de traitement, les animaux n’ayant pas suivi la totalité de la procédure (estimé à environ 10%, hormis ceux exclus pour cause de points limites) pourront être réutilisés dans d’autres procédures expérimentales compatibles avec l’avis du vétérinaire. Ces animaux sont des animaux qui sont exclus de l'étude en raison d'un défaut anatomique ou physiologique détecté aux examens de baseline au niveau de l'œil avant le début de l’étude. Ces animaux n'auront pas reçu d'induction de la pathologie, ni d'administration de traitement, seulement des examens qui ne sont pas invalidants mais qui potentiellement nécessitent une anesthésie.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. Les lignées cellulaires ou les systèmes alternatifs comme les organoïdes ne permettent d’étudier qu’une partie des mécanismes. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse ...) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Les études in vivo permettent d’observer les réponses physiologiques d’un traitement dans un organisme vivant en tenant compte des pharmaco cinétiques, des métabolites générés. Compte tenu de la complexité de l’organe nous aurons donc recourt à des animaux.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques paramétriques ou non paramétriques suivant la distribution des données, avec possibilité d'effectuer des comparaisons multiples. Chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. Des évaluations non invasives de la pathologie sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en binôme avec différents enrichissements adaptés à l'espèce. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Lors des anesthésies des substituts de larmes sont régulièrement instillés sur les cornées pour éviter le dessèchement, un dispositif est prévu pour éviter l’hypothermie (tapis chauffant, ou lampe). Les procédures impliquées ne devraient pas entrainer de douleur. La sévérité de la demande est classée légère. L’application d’anesthésiant locaux est prévue avant les injections. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum, cependant si une complication apparait au cours du temps, l’emploi d’un analgésique de type buprénorphine sera envisagé.

Choix des espèces

Le lapin possède une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. Le modèle chez le lapin grâce à la taille de l’œil offre la possibilité de pose d’implant pour répondre au mieux à la problématique et identifier des principes actifs pouvant être bénéfiques aux patients. Les animaux seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans les études auront 2 à 3 mois.

Génétiquement modifiées et élevées pour fournir des lignées modèles de déficience intellectuelle et d'autisme, 1 500 souris subissent le prélèvement de deux millimètres de l'extrémité de la queue, sur animal vigile sous contention, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'opération dure cinq secondes et se pratique entre le treizième et le vingt-huitième jour de vie, âge où la queue est peu ossifiée, ce qui permet de s'en tenir à une contention sans anesthésie. Le porteur indique avoir écarté trois méthodes non invasives, dont le prélèvement de poils, parce que "le souffle sous la hotte de change fait voler les poils hors des tubes". Le sort de chaque souris dépend ensuite du génotypage : celles qui portent le génotype recherché rejoignent un projet expérimental ou l'élevage, les autres sont tuées.

Objectifs

Les animaux génétiquement modifiés constituent des modèles puissants pour étudier la fonction des gènes et comprendre leur rôle dans le cadre de projets scientifiques au bénéfice de la santé humaine et animale ou de l’environnement. Dans le cadre des projets scientifiques utilisant des animaux à fins scientifiques (soumis indépendamment à cette demande d’autorisation de projet), des modèles animaux génétiquement modifiés sont développés et élevés. Dans ce but, il est important d’avoir un élevage adapté et des animaux dont les caractéristiques génétiques sont bien déterminées pour constituer les lots expérimentaux et maintenir une production régulière et adaptée aux besoins. Il est donc nécessaire de caractériser les animaux génétiquement modifiés afin de sélectionner les animaux d’intérêt pour les procédures expérimentales de projets autorisés et ceux nécessaires au maintien des lignées. Nous avons testé des prélèvements par 3 méthodes non invasives à partir de follicules pileux, de fèces, ou via un écouvillonnage bucal. Elles ne sont pour l’instant pas adaptées à nos conditions de diagnostics et manquent de fiabilité: 1) l'écouvillonnage bucal donne des résultats de très faible intensité et parfois même ne mettant pas en évidence une mutation, 2) le prélèvement de poils donne des intensités faible et il y a aussi une forte probabilité d'erreur due au souffle sous la hotte de change qui fait voler les poils hors des tubes, 3) l’utilisation d’encoche à l’oreille ne permet pas un marquage fiable d’un nombre important d’animaux sur les moyens et longs termes. Dans tous les cas, cela peut amener à des erreurs qui compromettraient les résultats obtenus et conduiraient à la nécessité de répéter des prélèvements sur les mêmes animaux ou à en utiliser un plus grand nombre, ce qui est en contradiction avec les principes de raffinement et de réduction. L’objectif de ce projet est une procédure de prélèvement par biopsie utilisée au sein de notre équipe pour le génotypage (technique permettant de relever les différences génétiques entre les animaux d'une même fratrie) identification des animaux qui sera associée à une identification par pose d'une bague auriculaire. Les animaux produits seront utilisés sur des projets concernant l’étude l’étude des maladies neurodéveloppementales présentant déficiences intellectuelle (DI) et/ou troubles du spectre autistique (TSA) comme dans le Syndrome de l’X fragile.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de sélectionner les animaux ayant un gène d'intérêt afin d'optimiser la gestion de l'élevage et de fournir les animaux nécessaires aux projets de l'équipe.

Procédures

Prélèvement de 2mm de l’extrémité de la queue (durée maximale 5 secondes) réalisé une seule fois sur chaque animal vigile sous contention.

Impact sur les animaux

Les nuisances engendrées sont le stress léger inhérent à la préhension et à la contention des animaux, la douleur légère lors du prélèvement sur la queue. Un saignement peut aussi apparaître et dans de très rares cas un rejet par la mère.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de cette unique procédure sauf ceux dont le génotypage ne correspond pas à nos besoins. Leur devenir dépendra du résultat du genotypage et/ou de leur sexe parmi les cas suivants : a) Utilisé dans une procédure expérimentale d’un projet autorisé, b) Utilisé pour le maintien de la lignée, si génotypage donnant les génotypes attendues, c) Mise à mort avec ou sans prélèvements post mortem pour les animaux au génotype non recherché .

Remplacement

A ce jour, les techniques de prélèvements de tissus non invasives que nous avons testées n'ont pas données des résultats exploitables. Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux modèles génétiquement modifiés pour les différents projets de l'équipe.

Réduction

L’enjeu et l’objectif majeur d’une réduction consistent à optimiser les élevages pour limiter la production du nombre d’animaux au strict nécessaire à leur utilisation dans les projets scientifiques ou pour le maintien des lignées. Dans cette perspective plusieurs stratégies sont mises en œuvre : - seules les lignées en cours d’utilisation dans des projets sont maintenues, les autres sont conservées congelées, - les lignées génétiquement modifiées sont maintenues sur des fonds génétiques homogènes de référence, - les schémas d’accouplement sont adaptés pour limiter au maximum la génération d’animaux au génotype (constitution génétique) non pertinent ou la nécessité d’avoir à génotyper et donc d’avoir à effectuer des prélèvements sur les animaux (utilisation de parents homozygotes, c’est-à-dire ayant des gènes identiques, si phénotype non dommageable, c'est-à-dire que l'ensemble des caractères observables d'un individu n'a pas de conséquence sur l'animal) - des réunions mensuelles avec les utilisateurs permettent d'anticiper les besoins à venir

Raffinement

La méthode utilisée est éprouvée, précise, rapide et standardisée permettant de minimiser les nuisances causées aux animaux par leur manipulation et par le prélèvement lui-même. Une liste de points limites et d'actions correctives est utilisée.

Choix des espèces

La souris est un mammifère qui présente de nombreuses similitudes biologiques, structurales et fonctionnelles avec l’être humain qui permettent de répondre à de nombreuses questions scientifiques en biologie, avec un degré élevé d’extrapolation à d’autres espèce (dont l’être humain) ou systèmes biologiques. De nombreux outils moléculaires et génétiques ont été développés avec les rongeurs, et en particulier chez la souris, qui permettent de mieux comprendre les mécanismes de nombreuses pathologies (ex: autisme). Les prélèvements de l’extrémité de la queue peuvent être réalisés entre P13 (animaux agés de 13 jours) et P28 (animaux agés de 28 jours), à des âges auxquels la zone est peu ossifiée et peu vascularisée, ce qui rend le prélèvement réalisable sans anesthésie avec des risques hémorragiques extrêmement réduits.

Tués si leur génotype ne convient pas, versés dans des protocoles de recherche s'il convient, 2 500 souris et 800 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun subit une biopsie de moins d'un millimètre à l'extrémité de la queue vers 15 jours, sur animal vigile, ou à l'oreille sous anesthésie générale à partir de 4 semaines. Le projet ne poursuit aucune question scientifique : il couvre l'ensemble des actes de génotypage de l'établissement. Le porteur présente son bénéfice attendu comme statistique, faire figurer dans les comptes annuels les animaux génotypés de façon invasive, et indique que des techniques non invasives restent "en cours d'évaluation".

Objectifs

L'objectif de ce projet est de couvrir l'ensemble des actes de génotypage de l'établissement de recherche.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de prendre en compte les animaux qui sont génotypés de manière invasive en plus de leur identification par tatouage dans les statistiques annuelles de l'établissement. Cela permet de continuer à travailler sur des mesures de raffinement de ce génotypage et d'encourager les équipes à développer des méthodes non invasives.

Procédures

les animaux sont soumis à une biopsie de tissu à l’extrémité de la queue ou à l’oreille, selon l’âge de l’animal, qui sera inférieure à 1mm. Pour les animaux de moins de 15jours l'intervention sera faite sur desanimaux vigiles et anesthésiés pour des animaux plus âgés. Cette intervention dure quelques secondes.

Impact sur les animaux

La biopsie de tissu pour génétypage sera réalisée à l’extrémité de la queue ou à l’oreille cela implique un stress léger lors de la contention de l'animal et une douleur de courte durée lors de la coupe de tissu.

Devenir

En fonction du génotype, les animaux seront soit euthanasiés soit incorporés dans des protocoles de recherche.

Remplacement

L’utilisation d’animaux transgéniques permet l’étude d’un gène de façon ciblée ou d’une fonction spécifique de l’organisme. Des techniques génétiques permettent de modifier le génome de façon très précise. De plus, la modification du génome peut induire la perte ou l’activation de l’expression d’un gène, et ceci de façon ciblée dans le temps ou dans un organe, constitutivement ou après induction. Ces modèles animaux sont précieux pour réaliser des recherches scientifiques fondamentales ou précliniques et ne peuvent souvent pas être remplacés car les fonctions étudiées mettent en jeu des interactions inter-organes essentielles au bon fonctionnement de l’organisme, impliquant des réponses hormonales, immunitaires et nerveuses.

Réduction

Le nombre d’animaux pour le maintien d’un élevage de souris est maintenu au minimum pour garantir le fonds génétique et éviter la dérive génétique (environ 10 à 15 animaux maximum /lignée âgées de 6 mois au maximum pour garantir leur fertilité). L’élevage de lignées transgéniques est limité et restreint aux lignées utilisées dansles projets de recherche. En cas d’arrêt ou d’interruption de projets, les lignées sont cryoconservées par congélation de sperme. Les animaux de mauvais généotypes pourront être proposés en interne pour une utilisation par d'autres équipes.

Raffinement

La biopsie de la queue sera réalisée précocement, à l’âge de 15 jours, avant l’ossification de la queue ce qui permet de limiter la nuisance de ce geste. Chez l’adulte, une biopsie de la pina de l’oreille sera privilégiée et sera réalisée sous anesthésie générale. La taille de la biopsie est réduite à son minimum et représente au maximum 1 mm. Des techniques alternatives de biopsie non invasives sont en cours d’évaluation et pourront être utilisées lorsque le génotypage sera validé et si l’absence de contaminations croisées est démontrée.

Choix des espèces

La transgenèse est généralement réalisée chez la souris et depuis récemment chez le rat et l’établissement utilisateur possède à la fois un zone d’élevage et d’expérimentation sur les différents modèles de souris et rats transgéniques utilisées en recherche fondamentale et préclinique. La biopsie caudale sera réalisée à l’âge de 10-15 jours afin de limiter les nuisances du prélèvement. La biopsie de la pina de l’oreille sera réalisée à l’âge de 4 semaines pour éviter l’incision de la queue qui s’est ossifié.

Les poissons zèbres utilisés portent une modification génétique qui rend fluorescent un gène du métabolisme intestinal, ce qui permet de lire à l'œil ce qu'une substance fait dans leur intestin. 700 d'entre eux vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Exposés à des perturbateurs endocriniens entre 72 et 120 heures après la fécondation, ils passent ensuite cinq séances d'imagerie sans anesthésie jusqu'à l'âge de trois mois, chacune d'une dizaine de secondes. Ils sont tués pour prélever leurs intestins et mesurer l'expression du gène, et le porteur présente la lignée transgénique comme un moyen de réduire le nombre de poissons employés dans les tests réglementaires.

Objectifs

Dans le cadre de l’étude des perturbateurs endocriniens en lien avec les pathologies métaboliques telles que l’obésité, le diabète ou la stéatose, nous développons une lignée transgénique de poisson zèbre apte à rendre compte d’effets de substances au niveau du métabolisme intestinal, y comprit chez l’Homme. La quantification de la fluorescence dans cette lignée transgénique permet de suivre l'expression de notre gène d'intérêt et est réalisée après exposition d’embryons issus de cette lignée à des substances pendant 48h, de 72 heures post-fécondation (hpf) à 120hpf. Afin d’étudier la réversibilité de la réponse de ce modèle nous souhaitons poursuivre les mesures de fluorescence au microscope au-delà de 120hpf, jusqu’à 3 mois. Les animaux ne seront donc pas exposés aux substances passé 120hpf. L’utilisation de la lignée transgénique apportera des informations complémentaires sur les mécanismes d’action des substances sans augmenter le nombre de poissons nécessaires à la réalisation des essais pour l’identification des perturbateurs endocriniens. A terme, le modèle que nous développons permettra d’évaluer l’impact de perturbateurs endocriniens en ayant recours à des embryons âgés de moins de 120hpf et les données générées au cours de ce projet permettront le développement/l’amélioration de voies de toxicité impactant le métabolisme qui pourront être utilisées pour une meilleure évaluation des dangers et des risques des perturbateurs endocriniens au niveau réglementaire.

Bénéfices attendus

L’étude la réversibilité de la réponse après exposition des embryons de poissons zèbres aux substances de 72hpf à 120hpf permettra d’approfondir notre connaissance des mécanismes régulant cette réponse. Nous pourrons ainsi analyser si l’expression de la fluorescence, induite ou inhibée à la suite de l’exposition aux substances, persiste ou au contraire revient à la normale alors que les poissons n’y sont plus exposés. Ainsi, la fluorescence étant relative à l’expression de notre gène d'intérêt, acteur clé du métabolisme intestinal chez le poisson zèbre, cette expérimentation permettra d’étudier les effets au long terme (jusqu’à 3 mois) sur ce métabolisme à la suite d’une exposition courte (48h) aux substances inductrices ou inhibitrices de de ce gène. Dans le cadre du développement d’un modèle de poisson zèbre apte à rendre compte des impacts des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme intestinal, y comprit chez l’Homme, l’étude de la réversibilité de la réponse aux substances a toute son importance. Ces données participeront à la caractérisation du modèle et de fait à l’élaboration d’un outil d’évaluation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme chez l’Homme, au cœur des objectifs du projet européen dans lequel s’inscrivent ces travaux.

Procédures

Les poissons zèbres seront soumis à des prises d'image en microscopie à fluorescence. Les animaux (5, 7, 10, 15 et 20 jours post fécondation) ne seront pas anesthésiés mais resteront dans de l'eau tout le temps de l'imagerie qui ne durera que 10 secondes environ. Chaque animal sera soumis à 5 imageries au cours de l'expérimentation.

Impact sur les animaux

L’exposition aux substances réalisée en début d’expérimentation (de 72hpf à 120hpf) aura un effet sur l'expression de notre gène d'intérêt (et probablement d'autres qui ne seront pas mesurés) sur le court terme et peut être le long-terme mais aucun effet toxique ou développemental n'est attendu aux concentrations sélectionnées. Les manipulations répétées tout au long de l’expérimentation (la prise d'image au microscope à fluorescence) pourraient entrainer un stress chez les animaux.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de l'expérimentation afin de prélever les intestins pour réaliser des mesures d'expression du gène d'intérêt à l'aide de techniques de biologie moléculaire.

Remplacement

L’étude de la réversibilité de la réponse dans le modèle poisson zèbre que nous développons ne peut s’affranchir de l’utilisation d’animaux vivants. En effet, cette expérimentation est essentielle à la caractérisation de ce modèle biologique, permettant de renseigner de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme à l’échelle de l’organisme entier, une problématique encore peu investiguée. Les modèles cellulaires ne permettent pas cette approche. Quant aux modèles mathématiques, s’agissant d’une problématique émergente, la modélisation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme est encore balbutiante. A terme, l’expérimentation menée ici permettra d’établir un modèle de poisson zèbre pertinent pour l’évaluation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme.

Réduction

L'utilisation d'animaux transgéniques pour le suivi des effets dans le temps des substances permet de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés en réutilisant les mêmes individus à chaque temps d'étude. Les effectifs ont été calculé en tenant compte de la variabilité de l'expression de notre gène d'intérêt et de la mortalité normale au cours du développement afin de pouvoir mettre en évidence des effets des substances de plus de 50% (test statistique).

Raffinement

Les animaux sont conservés dans un environnement controlé connus pour engendrer un minimum de stress (aquariums teintés en bleu si possible avec un fond en décors graviers, paramètres physico-chimiques de l'eau et photopériode contrôlés). Ils sont hébergés en groupe afin de respecter leur comportement grégaire et limiter l’anxiété que pourrait entrainer l’isolement, en gardant des populations faibles afin d’éviter les comportements agressifs. Les poissons sont également nourris en partie avec des artémies vivantes, leur permettant ainsi d’enrichir l’éventail de leurs comportements sociaux, notamment celui de la chasse. Tout au long des expérimentations, les animaux seront suivi avec une grille de bien-être adaptée à chaque stade de développement. L'ensemble de ces procédures est réalisé par des personnes formées et sensibilisées à l'évaluation de la souffrance animale.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est une des espèces recommandées pour la réalisation de tests réglementaires sur les perturbations endocriniennes. Sa petite taille permet des expositions dans de faibles volumes d’eau d’où une faible consommation de substances toxiques et une quantité de déchets générés moindre. Ces dernières années un nombre croissant de lignées de poissons zèbres génétiquement modifiés ont été développées et se sont avérées être des outils pertinents pour la détection des perturbateurs endocriniens tout en réduisant le nombre d'animaux.