Procédures légères
Mise au point protocole de stress par défaite sociale
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Exposées chaque jour à un mâle dominant pendant cinq minutes, puis maintenues en contact olfactif avec lui vingt-quatre heures, les souris subissent ce protocole dix jours de suite, après cinq jours d'injections. Elles sont 95, dont 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et toutes sont tuées pour prélever les organes. Le porteur attend une perte de poids de 5 à 10 %, une baisse du toilettage, une réduction des déplacements et des interactions sociales, et une anxiété accrue. Ce projet sert à roder le protocole avant les expériences de l'équipe, et le RNT ne précise ni comment la défaite sociale sera évaluée ni sur quels critères le protocole sera jugé au point.
Objectifs
L’enjeu principal du projet est de mettre au point un protocole de stress basé sur la défaite sociale, c'est à dire mettre un animal dans une situation d'impuissance face à une adversité sociale (exposition à un mâle dominant). L’objectif du projet sera de mettre en place ce protocole dans nos zones d’expérimentation et d’optimiser son utilisation avant que l’équipe de recherche lance des lots expérimentaux visant à étudier comment les récepteurs aux hormones du stress exprimés par différents types cellulaires du cerveau impactent l’activité cérébrale lors de l’adaptation au stress. Pour ce projet, nous allons nous appuyer sur des éléments de la littérature détaillant précisément le protocole à suivre. Pour cela, nous utiliserons 1 modèle de souris. Le but est de pouvoir étudier les conséquences de l’invalidation du récepteur aux hormones du stress dans des cellules non-neuronales du cerveau (les cellules microgliales) lors des réponses au stress.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra, à court terme, de tester et optimiser un protocole de stress par défaite sociale. Cette mise au point est essentielle pour la mise en place du projet innovant de l’équipe de recherche notamment pour déterminer la taille des groupes expérimentaux et limiter le nombre de souris utilisées.
Procédures
1- injections sur animaux vigiles = moins d’une minute par souris pendant 5 jours 2- protocole de stress chronique = 5 minutes interactions directes + contact olfactif (24h) pendant 10 jours
Impact sur les animaux
Une légère nuisance (lésion, stress contention) peut être attendu lors de l'injection intrapéritonéale d'une substance pharmacologique pouvant induire un risque d’inflammation/douleur.. Les nuisances attendues sont principalement liées au stress induit par la défaite sociale. Une souris stressée montrera : • Une perte de poids (5-10%) • Une diminution du toilettage • Une diminution de la locomotion • Une diminution de l’interaction sociale • Une augmentation de l’anxiété Ce dommage sera limité dans le temps, avec un maximum définit de 11 jours après début de protocole de stress.
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort et les organes d’intérêt seront récupérés pour une analyse histologique post mortem.
Remplacement
Ce projet vise à mettre au point une méthode expérimentale évaluant l’impact du stress dans un type cellulaire impliqué dans l’épilepsie. Ces fonctions ne sont modélisables que dans un organisme complet à même d’exprimer l’ensemble des physiologiques de régulations.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe expérimental a été déterminé à l'aide d'outils statistiques et sur la base de résultats antérieurs obtenus dans d’autres projets d’études utilisant le même test.
Raffinement
Un suivi quotidien sera mis en place pour détecter des premiers signes cliniques pouvant apparaitre chez les animaux dès le début du protocole. Une étude pondérale sera aussi réalisée dès réception des cohortes jusqu’à la fin des tests expérimentaux. Une grille de score avec des points limites pouvant amener à la mise à mort de l’animal sera mise en place dès l’apparition de signes cliniques.
Choix des espèces
La souris est l’animal le plus utilisé en laboratoire pour étudier la fonction des gènes en réalisant des modifications génétiques (souris transgénique). Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines d’âge permettant de réaliser l’étude sur un modèle adulte où les réseaux neuronaux et les fonctions physiologiques sont développés et stables.
Evaluation préclinique de produits de santé pour la chirurgie des tissus mous – MODIFICATION
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Lapins : 800
Cochons : 800
Chèvres : 160
Moutons : 640
2720 animaux non-humains de cinq espèces, 320 rats, 800 lapins, 800 cochons, 160 chèvres et 640 moutons, vont être utilisés et tous tués à l'issue, 410 d'entre eux sous anesthésie sans réveil, 310 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 2000 un niveau modéré. Chacun subit une chirurgie d'une heure trente à deux heures trente sous anesthésie générale pour recevoir un produit de chirurgie des tissus mous, prothèse de renforcement abdominal, colle, poudre ou compresse destinée à arrêter les saignements, puis selon les cas des prises de sang et une à trois séances d'imagerie, l'IRM imposant jusqu'à une heure trente de transport vers un établissement partenaire. Le porteur cite, selon les procédures, des défauts d'hémostase avec hypotension et apathie, des difficultés respiratoires par défaut d'étanchéité de la cage thoracique, des vomissements et du sang dans les selles pendant quelques jours. Il indique que ces essais, demandés par un "donneur d'ordre", fournissent les données de performance et de tolérance des produits avant leur mise sur le marché. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative" pour les évaluer et que "l'utilisation d'animaux est requise dans la réglementation" des dispositifs médicaux.
Objectifs
Il s’agit d’un projet de recherche et développement qui vise à étudier la performance (efficacité) de produits de santé utilisés en chirurgie des tissus mous et/ou d’en évaluer la tolérance (sécurité). Il peut s'agir de produits de renforcement abdominaux (prothèse de renforcement), de produits permettant d'arréter les saignements (colle, poudre, compresses...). Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir la sécurité des patients et l’efficacité lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. En ce sens, différents types d’essais peuvent être menés : - Essais de performance : - Essais de screening d’efficacité : Les essais de screening d’efficacité vérifient si la performance d’un produit mérite d’être approfondie ou s’il est nécessaire de mener d’autres études avant de passer aux essais de confirmation de performance. Ces essais sont essentiels dans la stratégie de réduction du nombre total d’animaux utilisés. - Essais de confirmation de performance : Les essais de confirmation de performance sont effectués après validation des essais de screening d’efficacité. Comme leur nom l’indique, ils visent à confirmer les résultats obtenus lors des essais préalablement menés sur un produit. - Essais de tolérance locale : Les essais de tolérance locale évaluent la réaction d’un organisme en contact avec un produit étranger. Dans ce projet, ces essais peuvent être réalisés en complément des essais de performance, sur les mêmes animaux. Les critères d’évaluation à prendre en considération sont définis lors de la rédaction du protocole d’essai. Ce projet pourra se conduire dans plusieurs EU partenaires, afin d'obtenir des résultats d'imagerie spécifique non disponible dans notre EU.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'obtenir des données de performance et de tolérance de produits de santé utilisés en chirurgie des tissus mous. En mimant au plus près l'implantation du dispositif chez les patients, ces études permettront de mieux appréhender la réaction de l’organisme au produit à tester, et ainsi améliorer la sécurité et/ou les performances du produit, avant sa mise sur le marché.
Procédures
Pour l'ensemble des procédures, tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale afin d'implanter le dispositif médical à tester (cette intervention chirurgicale peut durer entre 1h30 et 2h30). Cette intervention a toujours lieu sous anesthésie générale (chimique et gazeuse), et analgésie. L’antibiothérapie est ajoutée au cas par cas en fonction de l’invasivité de la chirurgie et des risques infectieux associés. Des prélèvements sanguins peuvent etre réalisés en cours d'étude (en général un prélèvement à la chirurgie et un prélèvement en fin d'étude, d'une durée de quelques minutes). Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude). D'autres types d'interventions non douloureuses, de type IRM ou radiographies pour observer le dispositif en cours d'étude, peuvent être réalisées sous anesthésie légère (en général, en fonction de la durée de l'étude, 1 à 3 sessions d'imagerie peuvent etre envisagées en cours d'étude). L'IRM sera externalisé dans un EU partenaire, la durée de l'intervention est d'environ 1h30.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont, selon les procédures, les suivants : - mise à jeun - stress liés à la chirurgie - perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant quelques jours - hématome ou oedème au niveau du site opératoire, pendant quelques jours - défaut d'hémostase (hypotension, pâleur muqueuse, apathie) - défaut d'oxygénation, d'étanchéité de la cage throracique, difficultés respiratoires pendant quelques jours - reflux gastrique, vomissements pendant quelques jours - diarrhées, présence de sang dans les selles pendant quelques jours. Les douleurs post-opératoires peuvent apparaitre et seront prises en charge par des mesures de raffinement. Les animaux recevront une anesthésie fixe afin de réaliser l'imagerie, pouvant induire un stress. Du produit de contraste pourra être injecté grâce à un cathéter en intraveineux. Une légère perte de poids (non systématique) pourrait être observée dans les quelques jours suivant l'anesthésie.
Devenir
Pour répondre aux objectifs de chacune des procédures du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus et organes entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induit par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les organes et le dispositif prélevé (exemple : tests mécaniques sur des prothèses abdominales pour évaluer la résistance du dispositif). En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.
Remplacement
A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer la performance et la tolérance locale des produits de chirurgie des tissus mous en raison des interactions complexes s'établissant entre le tissus ciblé et le dispositif lui-même. De plus, l’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation que doivent suivre les tests précliniques sur les dispositifs médicaux, avant de pouvoir lancer les tests cliniques.
Réduction
Le donneur d'ordre demandant la réalisation de ces tests s'engage à ne pas faire renouveler à l'identique un essai déjà mené précédemment. Par ailleurs pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "contrôle" (produit dont l'effet est déjà connu), pour plusieurs groupes "test" recevant des produits à tester différents. Les études de screening permettent également de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêt à être développé, réduisant de ce fait le nombre de tests sur des produits ayant un intérêt moindre. Les études dites "pilotes" sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit ou le choix du modèle expérimental le plus approprié (matériel ou abord chirurgical le plus adéquat…), avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc).
Raffinement
Pour limiter le stress des animaux, une période d’acclimatation pendant laquelle ils ne subissent aucune manipulation non indispensable est réalisée à leur arrivée dans l’EU. Ensuite, et avant la chirurgie, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée si nécessaire pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations (exemples : habituation aux pesées, habituation alimentaire). Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (exemple : jouets), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements : pommes dans la litière des porcs, ou friandises dans les jouets, et augmentation de la litière des ovins). Les transports des animaux vers les EU partenaires seront organisés dans le respect du bien-être animal et de la réglementation en vigueur (durée du transport jusqu'à 1h30 en fonction des EU avec ajout de litière et transport en groupe). Un contrôle clinique de chaque animal est réalisé par du personnel qualifié (vétérinaire, technicien ou zootechnicien) au départ et à l'arrivée. Lors des séances d'imagerie externalisées, afin de limiter le stress des animaux, une période de repos adéquate sera instaurée entre la réception des animaux et l'anesthésie et entre le réveil des animaux et le transport retour vers notre EU. La douleur des animaux : la chirurgie est réalisée sous anesthésie et analgésie (à base de morphiniques). En phase post-opératoire, les suivis quotidiens sont renforcés et des soins post-opératoires spécifiques peuvent être mis en place (désinfection des sites chirurgicaux à une fréquence adaptée). Les signes cliniques servant de points limites ont été définis, pour la prise de décision des mesures à mettre en place pour limiter les souffrances. Selon l'espèce, les prises de sang peuvent être réalisées sous anesthésie générale (injectable et/ou volatile, lors d'une phase de chirurgie par exemple), ou sous sédation légère (voir paragraphe sur la liste des médications) avec au besoin une analgésie, afin de maitriser le stress et la douleur potentielle. Les conséquences de l’anesthésie/chirurgie : du gel oculaire est appliqué au niveau de la cornée lors des anesthésies des animaux pour prévenir l'assèchement oculaire. Une attention particulière est portée à la lutte contre l'hypothermie : température de la salle, isolation du sol, couvertures, lampes chauffantes si besoin. En cas de doute, une mesure de la température rectale est réalisée.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est définie dans les textes de référence. Les produits de petite taille/miniaturisés seront testés préférentiellement chez les rongeurs ou le lapin. Les produits de taille importante seront préférentiellement testés chez le porc ou les ovins/caprins. Lorsque plusieurs espèces répondent aux critères, le choix est arbitré par la durée de l’essai (le long terme: espèces à longue durée de vie). Le stade de développement est exprimé en âge ou en poids. Dans la plupart des cas, l’utilisation d’animaux adultes est recommandée. Le stade de développement est pertinemment sélectionné en fonction de l'utilisation clinique du produit ou de sa taille par exemple. En l’absence d’exigence particulière, l’utilisation d’animaux au stade adulte est privilégiée. Cas particulier des porcs domestiques : étant donné les conditions d’hébergement, le comportement social et la manipulation des animaux, l’utilisation de porcs domestiques en croissance (âgés d’au moins 8 semaines) est la plus appropriée dans ce projet.
Mise en place d’un modèle expérimental sur les chauves-souris à des fins de formation et de recherche
- Formation professionnelle
Chauves-souris frugivores du genre Pteropus, réservoirs naturels de virus émergents, 15 individus sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Aucune mise à mort n'est comptée, les 15 étant déclarées réutilisables, et le porteur indique que la plupart seront gardées en vie après avis du vétérinaire et de la structure de bien-être animal. Chaque séance comprend deux à huit répétitions du même geste sur la même chauve-souris, injections sous-cutanées, intramusculaires ou intraveineuses, pose de cathéter et prises de sang, sous anesthésie générale d'au plus une heure ou sous anesthésie locale sur animal vigile, avec sept à quinze jours de repos entre deux séances. La finalité déclarée est la formation du personnel de l'établissement, et le porteur affirme qu'aucune alternative ne reproduit les conditions réelles de manipulation d'une chauve-souris.
Objectifs
Notre laboratoire est impliqué dans un projet global d'étude des maladies émergentes tropicales d'origine virale dont plusieurs ont pour réservoir des chauve-souris frugivores du genre Pteropus. Notre rôle est de maintenir en laboratoire, dans les meilleures conditions, des spécimens de ces espèces, et de réaliser des suivis cliniques ainsi que des prélèvements de sang sous anesthésie. La connaissance de la biologie, de l'élevage et des constantes normales de ces espèces est fondamentale pour la suite du projet. Nous devons donc, dans un premier temps, au contact d'un vétérinaire expert, former toute une équipe à l'élevage, à la manipulation et aux procédures de bases de notre laboratoire, déjà très performante dans le travail avec d'autres espèces animales. Les prélèvements réalisés au cours de cette phase d'apprentissage seront analysés et contribueront à l'amélioration des connaissances de base en hématologie et biochimie de ces animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en place l’hébergement et les procédures expérimentales sur les chauves-souris, récemment ajoutées à l’agrément de l’établissement. Il a pour but de former le personnel aux gestes techniques de base (manipulation, anesthésie, prélèvements, contention, etc.) et de favoriser la familiarisation avec cette nouvelle espèce. Ces formations contribueront à améliorer la qualité des futures études avec une meilleure maîtrise des techniques et une réduction du stress et de la douleur pour les animaux. Elles permettront également d’assurer des conditions de travail sécurisées pour le personnel et de renforcer les compétences internes de la plateforme. À terme, ce projet doit permettre de disposer d’un modèle expérimental fiable et d’un personnel formé, conditions necessaires pour la mise en œuvre des futures études en virologie.
Procédures
Trois essais de gestes techniques différents pourront être réalisés : une administration sous-cutanée, une administration intramusculaire ou intraveineuse (ou la pose d’un cathéter). Ces actes pourront être effectués sous anesthésie générale ou sur animal vigile après application d’une anesthésie locale. Le nombre de ponctions sera limité à deux par site au maximum, afin de réduire toute gêne ou irritation locale. La durée totale d’anesthésie ne dépassera pas une heure, incluant la phase de réveil et la surveillance post-anesthésique. La durée totale ne dépassera pas 5 à 10 minutes pour les gestes effectués sans anesthésie — les manipulations seront progressives et leur durée augmentera graduellement, sans toutefois excéder 10 minutes. Sous anesthésie, la durée maximale sera d’une heure. Un minimum de 7 jours de repos sera appliqué entre les sessions.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues dans le cadre de ce projet sont limitées. Elles concernent principalement le stress lié à la manipulation et à la familiarisation avec un nouvel environnement. Certaines formations pratiques pourront entraîner un stress transitoire ou un léger inconfort, notamment lors de la contention, de l’anesthésie ou de la réalisation de prélèvements sanguins.
Devenir
Dans ce projet, la grande majorité des actes techniques à mettre en place sont peu invasives et n’entraînent ni douleur significative ni altération durable de l’intégrité ou du bien-être de l’animal. Ainsi, la plupart des animaux seront gardés en vie à l'issue de leur procédure, afin de pouvoir être réutilisés, après avis du vétérinaire sanitaire et de la structure chargée du bien-être animal, prenant en compte un temps de repos suffisant en fonction de la procédure qui a été effectuée sur l'animal, ainsi que leur état de santé et des possibilités de réutilisation.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants est rendue nécessaire pour cette phase de formation et d’acquisition des gestes techniques. Aucune alternative ne permet actuellement de reproduire les conditions réelles de manipulation, d’anesthésie ou de prélèvements sur des chauves-souris, dont la morphologie et le comportement diffèrent des autres espèces déjà étudiées. Des supports théoriques et audiovisuels (présentations, vidéos, photos) seront utilisés en amont pour limiter le nombre d’animaux impliqués et préparer au mieux le personnel avant toute manipulation pratique. Lorsque cela est possible, des modèles inertes (matériel de simulation, animaux décédés issus d’autres protocoles) pourront être utilisés pour les démonstrations initiales. Les séances pratiques sur animaux vivants seront donc réduites au strict nécessaire, et réalisées uniquement dans le cadre de la formation du personnel devant intervenir ultérieurement sur cette espèce.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera limité au strict nécessaire pour assurer la formation pratique du personnel et la mise au point des procédures expérimentales. Chaque séance de formation sera organisée de manière à maximiser l’apprentissage tout en réduisant le nombre d’animaux manipulés, en regroupant plusieurs apprentissages sur les mêmes individus lorsque cela est compatible avec leur bien-être. Les animaux ne seront utilisés qu’une seule fois par jour, avec des périodes de repos suffisantes entre les séances.
Raffinement
Les techniques utilisées sont les mêmes que celles que nous mettons en oeuvre pour nos projets. Trois principales mesures de raffinement sont utilisées. La première est la limitation du nombre d’actes par animal et par séances. Deux à huit répétitions de geste par animal et par séance (comme la prise de sang par exemple). Les volumes administrés ou prélevés sont minimes (< 1 ml). Largement inférieurs aux recommandations d’usage en recherche, puisque ce qui compte est que le geste soit bien réalisé. L’autre est un enregistrement précis des utilisations et réutilisations de chaque animal en respectant un temps de repos de 7 jours entre deux séances sans anesthésie et 15 jours entre deux séances avec anesthésie. Toute blessure au cours de la séance est prise en charge et prolonge le temps de repos de l’animal. De plus, les conditions hébergement des animaux seront adaptées à l'espèce, ainsi que leurs soins quotidiens. Seuls les animaux en bonne santé participent à ces séances de formation. Les séances sont interrompues si les animaux montrent un signe de mal-être ou de stress trop important. Des critères d'arrêt anticipé, très précoce sont mis en place pour éviter dee solliciter un animal qui n'est pas en parfaite santé et de les soigner au moindre signe de mal-être. Un programme de conditionnement avec des friandises adaptées sera mis en place. Enfin, la troisième mesure de raffinement repose sur la formation du personnel, qui sera assurée par le vétérinaire désigné, déjà formé dans la gestion et les soins des chauves-souris.
Choix des espèces
Chauves souris constituent des modèles d’intérêt majeur en virologie, en raison de leur rôle reconnu comme réservoirs naturels de nombreux virus, et de leur tolérance particulière aux infections virales. Les animaux utilisés seront des chauves-souris adultes.
Nouvelle stratégie d’alimentation en polyculture de poissons d’étang
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Pêchés à l'épuisette, transférés vers six étangs de 500 m², repris six mois et demi plus tard, anesthésiés puis mesurés une à trois minutes hors de l'eau, 312 poissons sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'expérience compare deux aliments chez des carpes communes, des carpes Amour, des gardons, des tanches et des sandres, dont un aliment pauvre en protéines censé stimuler la production naturelle de l'étang. Le porteur écrit que l'expérience est à vocation zootechnique et qu'aucun modèle in silico ne permet de la remplacer. 162 poissons repartent comme géniteurs ou dans un nouveau cycle de croissance, 150 sont tués et envoyés au laboratoire pour analyse chimique de leur corps.
Objectifs
L’expérience vise à adapter l’approche d’alimentation des poissons, développée pour les étangs tropicaux, aux étangs en climat tempéré. Cette stratégie repose sur une alimentation enrichie en fibres peu digestibles et à faible teneur en protéines, afin de stimuler la productivité naturelle de l’écosystème aquatique. L’intérêt est double : réduire l'apport d'aliments commerciaux et favoriser le développement de ressources alimentaires présentes naturellement dans les étangs (micro-organismes, plancton, invertébrés, macrophytes) qui deviennent une source indirecte de nutriments pour les poissons. L’expérimentation se déroulera sur six étangs de 500 m² (3 étangs pour chaque type d’aliment) avec une polyculture de poissons composée pour chaque étang de 12 carpes communes, 14 carpes Amour, 12 gardons, 6 tanches et 8 sandres, à même de valoriser les ressources alimentaires de l’écosystème. Deux types d’aliments seront comparés : un de type commercial et un formulé pour stimuler la croissance des ressources naturellement présentes dans l'étang. Des analyses nutritionnelles, moléculaires et écologiques seront menées pour évaluer les effets sur la croissance des poissons et le fonctionnement de l’écosystème.
Bénéfices attendus
L’enjeu de cette expérience est de vérifier l’applicabilité de cette approche nouvelle forme d’alimentation en contexte tempéré, tout en analysant ses implications nutritionnelles pour les poissons et sur le fonctionnement de l’écosystème étang. Plus globalement, il s’agit d’introduire une nouvelle façon d’envisager la nutrition des poissons d’étang en Europe, fondée sur la nature et en adéquation avec les principes de l’agroécologie, en misant sur la stimulation des ressources naturelles du milieu et en diminuant les apports alimentaires en quantité et en qualité, permettant un meilleur bilan environnemental et économique.
Procédures
- le transfert de tous les poissons entre les étangs de stockage et les étangs d'élevage en début d'expérience, et le transfert de tous les poissons vers les bassins de stockage temporaire avant les mesures de poids et de longueur, puis leur transfert aux étangs de stockage en fin d'expérience - l'anesthésie de tous les poissons lors des mesures de longueur et de poids - Mesures de poids et de longueur non invasives sur animaux anesthésiés réalisées deux fois au cours des 6,5 mois d'élevage. La durée de la procédure totale, comprenant les stockages intermédiaires peut être d'une heure, avec une phase de biométrie hors d'eau d'une à trois minutes.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances pour les animaux consistent en la pêche avec épuisettes en début et fin d’expérience, afin de réaliser des mesures (poids, longueurs) individuelles et les répartir dans leurs structures d’accueil (étangs expérimentaux en début d’expérience, étangs de stockage en fin d’expérience).
Devenir
Les poissons ne subissant que la manipulation et l'anesthésie en vue de leur mesure de poids et longueur sont tous réutilisés, soit comme géniteurs soit entrant dans un nouveau cycle de croissance ou d'expérimentation. Les poissons euthanasiés sont envoyés au laboratoire pour l'analyse chimique corporelle.
Remplacement
Cette expérience est principalement à vocation zootechnique. Elle nécessite le recours aux espèces utilisées en élevage classique. Le manque de recul et de modèles sur les interactions entre les espèces aquatiques d’élevage et leur écosystème, ne permet pas de réaliser ce type d’expérience in silico.
Réduction
Les proportions des différentes espèces et leurs effectifs ont été déterminés pour représenter les pratiques d’empoissonnement en polyculture d’étang courantes. Il n’est pas possible de les diminuer sans perdre le caractère représentatif des pratiques. Le nombre de trois répliquats est le minimum que nous pouvons admettre pour obtenir des résultats statistiquement exploitables. De même, le nombre de 5 individus mis à mort par espèce et par étang fait référence à l'effectif minimum admis pour la représentativité des résultats d'analyses corporelles et isotopiques.
Raffinement
Afin de limiter les nuisances envers les poissons, les conditions de contention sont surveillées, notamment en maintenant un renouvellement d’eau lors des stockages temporaires et le contrôle des comportements. Avant chaque manipulation pour mesures (non invasives), les poissons sont anesthésiés, afin de limiter le stress, les risques de chute, limiter la durée hors d’eau en augmentant la rapidité des mesures de biométrie. La phase de réveil est contrôlée dans des bassins séparés par espèce, avec renouvellement d’eau.
Choix des espèces
Les espèces choisies : carpe Amour, carpe commune, tanche, gardon et sandre, sont représentatives des polycultures de poissons d'étangs extensives ou semi-intensives en France. Ce sont par ailleurs, des espèces particulièrement tolérantes aux bas niveaux de qualité d’eau ce qui les rend tolérantes aux manipulations. Les carpes communes, les carpes Amour et les sandres sont de taille moyenne (2 ans de croissance), afin d’optimiser leur croissance dans le dispositif. Les tanches et les gardons sont des géniteurs fertiles afin d’optimiser leur reproduction qui se produira lors de l'élévation naturelle de la température de l'eau au printemps.
Exploration d’un marqueur métabolique dans les lésions précancéreuses induites ou dans le vieillissement chez la souris.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Biopsie de deux millimètres au bout de la queue, tatouage des coussinets avant le sevrage, gavage oral, prélèvement de sang à la joue toutes les deux semaines, jeûne de douze à quinze heures, puis mise à mort par dislocation cervicale. 20 960 souris vont être utilisées, 20 160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 800 un niveau modéré, toutes tuées à l'issue. Le porteur annonce que les souris seront étudiées avant l'apparition du phénotype dommageable, et décrit aussi une baisse d'appétit, un amaigrissement et une diminution de l'activité liés aux lésions prétumorales et au vieillissement accéléré. Rien ne justifie un effectif de 20 960 animaux au-delà d'une phrase sur le "nombre minimum d'animaux nécessaires".
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont de développer de nouvelles lignées de souris présentant une activation ou diminution d’une molécule d'intérêt récemment identifiée impliquée dans le métabolisme des lipides et qui serait responsable du vieillissement cellulaire. Nous souhaitons moduler génétiquement son expression dans un contexte de lésions précancéreuses et tester son effet thérapeutique sur la progression des lésions dans le tissu. Nous souhaitons confirmer des données obtenues dans un modèle cellulaire sur sa capacité à induire le vieillissement cellulaire.
Bénéfices attendus
Dans un contexte de recherche physiopathologique sur des lésions prétumorales ou le vieillissement, les expérimentations chez la souris ne peuvent en aucun cas être remplacées par des expériences sur un modèle cellulaire unique, où les cellules sont sorties de leur environnement. Les analyses cellulaires ne sont pas utilisables dans ce contexte car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. Les résultats obtenus sur des modèles cellulaires ont permis d'identifier un gène d'intérêt.
Procédures
-avant le sevrage, (2 contentions, quelques secondes ) pour biopsie de queue de 2 millimètres et pour le tatouage aux coussinets -lors des pesées (1 contention, quelques secondes ) - gavage oral à 3 ou 6 semaines de vie (1 ou 5 fois, avec 1 minute par gavage) -prélèvement de sang à la joue (1 fois toutes les 2 semaines, quelques minutes -1 jour avant la mise à mort (mise à jeun (1fois, 12 à 15H) mise à mort précoce par dislocation cervicale et prélèvement des tissus pour différentes analyses.
Impact sur les animaux
-léger stress due à la contention pour biopsie, identification, pesée et prélèvement sanguin -Le gavage oral quotidien peut engendrer des risques de fausse route. -Les souris induites développent des lésions non dommageables à un âge précoce et seront étudiées avant le phénotype dommageable. -Les lésions prétumorales et le vieillissement accéléré peuvent entraîner à un stade avancé une baisse de l’appétit, un amaigrissement et une diminution de l’activité.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de la procédure pour renouveler les croisements ou pour exploration des tissus et organes d'intérêt.
Remplacement
Dans un contexte de recherche physiopathologique sur des lésions prétumorales ou le vieillissement, les expérimentations chez la souris ne peuvent en aucun cas être remplacées par des expériences sur un modèle cellulaire unique, où les cellules sont sorties de leur environnement. Les analyses cellulaires ne sont pas utilisables dans ce contexte car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. Les résultats obtenus sur des modèles cellulaires ont permis d'identifier un gène d'intérêt.
Réduction
Les expériences sont réalisées avec le nombre minimum d'animaux nécessaires à l'obtention d'un résultat significatif déterminé par des tests statistiques adaptés, et qui satisfait à l’objectif de réduction du nombre d’animaux exposés dans ce projet.
Raffinement
Les souris bénéficieront d'un enrichissement. Les souris seront hébergées en groupes sociaux en cage ventilée. Une surveillance accrue sera mise en place tout au long de la procédure. Cependant, tout animal en souffrance sera mis à mort avant l'apparition des points limites stricts et spécifiques définis selon les recommandations en vigueur.
Choix des espèces
La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Ces souris sont particulièrement intéressantes pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Les jeunes souris de trois semaines sont utilisées car il est nécessaire que les organes soit suffisament matures et fonctionnels.
Marquage des noyaux de la jonction myotendineuse par administration de Cre via un AAV.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Marquer les seuls noyaux situés à la jonction entre le muscle et le tendon, faute de lignée de souris qui les distingue aujourd'hui : c'est l'objet de cette étude pilote. 36 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour biopsie musculaire. Un groupe reçoit un virus adéno-associé dans les deux pattes arrière, l'autre dans le sinus rétro-orbitaire, sous anesthésie et sous analgésique. Le porteur n'attend pas de douleur au-delà d'une gêne du membre injecté, et prévoit qu'une souris cotée au niveau maximal reçoive un antalgique deux fois par jour, puis soit mise à mort si la douleur n'est pas revenue à zéro deux heures après la seconde injection.
Objectifs
Les muscles sont constitués de longues fibres qui contiennent de nombreux noyaux cellulaires. Ces noyaux ne sont pas tous identiques : certains ont des fonctions spécifiques dépendantes de leur emplacement dans le muscle. À l'extrémité des fibres musculaires, à l’endroit où elles s'attachent aux tendons, se trouve une région appelée jonction myotendineuse (JMT). Cette région absorbe la majeure partie de la force de traction lorsque les muscles travaillent et c'est souvent à cet endroit que se produisent les blessures. À l'heure actuelle, les scientifiques ne disposent pas de lignées de souris génétiquement modifiées pour étudier uniquement les noyaux de cette jonction. Les méthodes existantes affectent tous les noyaux d'une fibre musculaire à la fois, ce qui rend impossible d'observer précisément le rôle des noyaux de la JMT. Dans le cadre de ce projet, nous souhaitons créer de nouvelles lignées génétiquement modifiées chez la souris dont seuls les noyaux de la JMT seraient marqués. Cela nous permettrait de les observer et de les étudier en détail.
Bénéfices attendus
Grâce à ces nouvelles lignées de souris, les scientifiques pourront observer le comportement des noyaux de la jonction myotendineuse dans des muscles sains, lors d'une blessure et en cas de maladie. Cela nous aidera à comprendre un aspect important mais peu étudié de la biologie musculaire. À l'avenir, ces connaissances pourraient orienter le développement de nouveaux traitements visant à protéger ou à réparer les muscles.
Procédures
Le 1er groupe d’animaux sera injecté très rapidement, en environ 30 secondes, par voie locale dans les 2 membres postérieurs avec un virus adéno-associé pour activer le marquage des noyaux de la jonction myotendineuse des muscles injectés. Le 2éme groupe d’animaux sera injecté très rapidement, en quelques secondes, par voie systémique dans le sinus retro-orbital avec le même virus pour activer le marquage des noyaux de la jonction myotendineuse de tous les muscles accessibles par cette voie. Les injections de virus des 2 groupes seront faites sous anesthésie générale grâce à une injection qui sera réalisée en quelques secondes. 30 min avant l’injection du virus nous injecterons un antalgique qui prendra en charge la douleur de la procédure et celle résultant de la procédure. Après les injections de virus adéno-associés un antidote à l’anesthésie sera injecté pour accélérer et améliorer le réveil. .
Impact sur les animaux
Notre projet n'entraîne aucune nuisances ou effets néfastes au-delà des injections locales et systémiques de vecteurs viraux, et des injections d’anesthésiques et d’analgésiques. Les souris mutantes utilisées expriment une protéine rapporteuse fluorescente dans les noyaux des cellules, fonctionnellement neutre, dont l’expression est dépendante d’une protéine qui n’a pas d’effet nocif..
Devenir
Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons les biopsies musculaires de tous les animaux à la fin de chaque procédure. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçons pas et ne ferons pas adopter les animaux.
Remplacement
Bien que les cellules musculaires puissent être différenciées in vitro, elles ne forment pas de jonctions myotendineuses (JMT), car cela nécessite des interactions complexes entre le tendon et le muscle. Par conséquent, cet aspect de la biologie musculaire ne peut pas être étudié à l'aide de modèles de culture cellulaire.
Réduction
Il s'agit d'une étude pilote visant à tester notre stratégie de marquage dans différentes conditions. Le projet est intentionnellement conçu pour être réduit avant d'être étendu à des expériences à plus grande échelle. Nous avons déterminé que 3 animaux/groupe (3 femelles et 3 mâles) seront suffisants pour obtenir une robustesse statistique. Nous analyserons les données des femelles et des mâles séparément et si les résultats sont statistiquement semblables alors nous regrouperons les données des 2 sexes. Afin de minimiser davantage l'utilisation d'animaux, nous procéderons de manière séquentielle, en testant d'abord l’injection intramusculaire avec la concentration de virus adéno-associé la plus forte. Si le virus fonctionne comme attendu alors nous testerons dans un second la concentration intermédiaire, puis la plus faible. Dans cette voie d’administration, les deux membres postérieurs seront injectés afin de maximiser les données provenant de chaque animal. Si le virus fonctionne avec ce mode d’administration alors nous testerons l’injection au sinus retro-orbital qui touche tout l’organisme. Nous ferons 2 analyses différentes sur le même animal pour les 2 procédures ce qui réduira ainsi le nombre d’animaux qui seront utilisés par 2. Les tests statistiques appropriés seront utilisés pour analyser les résultats obtenus.
Raffinement
Nous ne nous attendons pas à voir apparaitre un phénotype douloureux résultant des injections de virus adéno-associés mais uniquement une gêne transitoire suite à l’injection intramusculaire (IM) qui sera réalisée sous anesthésie et couverture antalgique, néanmoins tout signe de douleur sera pris en charge par des mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé (0 à 3). Nous n’attendons pas de douleur supérieure à une douleur de niveau 1, c’est-à-dire une douleur légère comme un inconfort du membre injecté ou une légère boiterie. Si une douleur sévère (niveau 3) venait à être observée alors un antalgique serait injecté à l’animal concerné 2 fois/ jour. Si 2h après la 2é injection le niveau de douleur n’est pas redescendu à 0, alors l’animal sera mis à mort. Les souris seront surveillées quotidiennement les 3 jours suivants l’injection du virus puis 2 à 3 fois par semaine jusqu’à la fin de la procédure. Le suivi de nos souris comprend une observation du comportement général (perte de poids, motricité, apathie, aspect du pelage, aspect physique, vigilance, interaction sociale, toilettage). Cette observation est visuelle car nous n’attendons pas de phénotype douloureux et aucune dégradation de l’état général des animaux, en dehors de la gêne transitoire suite à l’injection local ou systémique de virus adéno-associé qui sera faite sous anesthésie générale et sous couverture d’un analgésique. Une attention particulière sera également portée aux sites d’injections. Mais si un signe d’inconfort, de détresse ou de douleur était constaté lors de la surveillance alors celle-ci deviendrait quotidienne pour les animaux concernés. De plus si des souris devaient présenter des difficultés à se déplacer et donc des difficultés à manger de la nourriture solide (croquettes), de la nourriture en gel sera placée dans la litière de la cage et le suivi serait renforcé avec avis vétérinaire en cas de besoin.
Choix des espèces
Les virus adéno-associés que nous utiliserons ont tous été développés pour les souris et sont spécifiquement conçus pour infecter efficacement les muscles. De plus la validation de l’activité du promoteur utilisé qui cible notre région d’intérêt, la jonction myotendineuse, résulte d’une étude précédente (APAFIS #37568-202206031219283 v4) réalisée chez la souris. Par conséquent, le modèle murin est le choix le plus approprié. Les injections seront effectuées sur des souris âgées d’au moins 10 semaines. Cet âge correspond au début de l'âge adulte, lorsque le développement musculaire est achevé et que des titres viraux plus faibles peuvent être utilisés efficacement.
Création d’un modèle de souris transgéniques permettant d’évaluer le rôle de la production rénale de glucose au cours du jeûne et du diabète.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Biopsiées à l'âge de sept à dix jours, puis injectées sous la peau cinq jours de suite pour éteindre dans leurs reins un gène de la fabrication du glucose, des souris sont ensuite privées de nourriture pendant vingt-quatre à quarante-huit heures. 180 souris vont être utilisées, 72 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 80 un niveau modéré et 28 un niveau léger, toutes tuées à l'issue pour prélever foie, reins et intestin. L'objectif déclaré est de mesurer la part des reins dans la production de sucre pendant un jeûne prolongé, et de reproduire l'atteinte rénale d'une maladie rare. Le porteur écrit que le ciblage des seuls reins évitera aux souris de fortes baisses de sucre dans le sang, et décrit aussi faiblesse, frissons, inactivité et injection de glucose en urgence si l'hypoglycémie devient trop marquée.
Objectifs
Pour que notre corps fonctionne correctement, il est essentiel de maintenir le taux de sucre (glycémie) dans le sang autour de 1 g/L. Lors d’un repas, ce sucre, appelé glucose, est apporté par la nourriture et est stocké dans le foie sous forme d’une molécule complexe, le glycogène. Entre les repas, le foie va d’abord dégrader ses stocks de glycogène, puis si le jeûne se prolonge, le corps peut produire lui-même du glucose, en utilisant d’autres substances (comme certains acides aminés ou des lipides). Alors que le foie est reconnu depuis longtemps comme l’organe central de la production de glucose par l’organisme, on sait aujourd’hui que les reins et l’intestin peuvent aussi produire du glucose de novo. Après utilisation du glycogène, le foie ralentit sa production de glucose, alors que les autres organes augmentent leur production au cours du jeûne prolongé, pour éviter une chute de la glycémie (hypoglycémie) qui peut être fatale. Des études ont montré que : -qu’une production trop importante de glucose par le foie peut dérégler l’équilibre glycémique et énergétique et favoriser le développement du diabète, caractérisé par des hyperglycémies ; -à l’inverse, l’induction de la production par l’intestin peut avoir des effets bénéfiques, comme lutter contre le diabète et le développement de foie gras. Aujourd’hui, la contribution des reins à la production endogène de glucose est encore mal comprise, et souvent sous-estimée. Ce projet vise à mieux comprendre cette fonction physiologique, en particulier lors du jeûne prolongé dans le maintien de l’équilibre glycémique et énergétique. Pour cela, nous allons créer des souris génétiquement modifiées dans lesquelles le rein ne pourra plus produire de glucose. Après validation du modèle, nous analyserons comment cette suppression affecte régulation de la glycémie pendant un jeûne court ou long. Nous étudierons aussi le rôle du rein dans le diabète, en nourrissant ces souris avec un régime très riche en calories, pour voir si les reins ont un effet protecteur ou néfaste sur le métabolisme. Ce modèle pourrait aussi devenir un outil précieux pour mieux comprendre la maladie rénale associée à la glycogénose de type I, qui est une maladie rare induite par une perte de la production de glucose par l’organisme. Les patients développent de graves hypoglycémies, des problèmes de foie et des maladies rénales à long terme
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de créer une souris « génétiquement modifiée » dans laquelle les reins ne produisent plus du tout de glucose. Cela permettrait de mieux comprendre à quel point les reins participent à la production de sucre dans le corps, surtout pendant un jeûne prolongé. Ce modèle de souris pourrait aussi aider à mieux comprendre comment les reins contribuent à maintenir l’équilibre énergétique dans le corps — ce qui est très important pour développer de nouveaux traitements contre des maladies comme le diabète. On sait déjà que diminuer la production de sucre par le foie est un objectif important pour limiter le développement du diabète. Des études récentes montrent à l’inverse que l’induction de la production de glucose par l’intestin a des effets positifs contre le diabète et contre l’accumulation de graisse dans le foie. Dans ce contexte, il devient donc essentiel d’étudier aussi le rôle des reins dans la production de sucre, car cela pourrait influencer le développement ou la prévention du diabète. Plus globalement, ce projet remet en question l’idée que seul le foie est responsable de produire du glucose quand on jeûne. Il pourrait permettre d’en apprendre davantage sur la façon dont le sucre est fabriqué et utilisé dans l’organisme. Enfin, ce modèle de souris pourrait aussi servir à mieux comprendre une maladie rare appelée glycogénose de type Ia (GSDIa), qui touche les reins. Cette maladie a beaucoup de points communs avec la maladie rénale observée chez les personnes diabétiques. Ces souris pourraient donc aider à tester de nouveaux traitements, utiles en diabétologie et en néphrologie. Aujourd’hui, il n’existe pas de traitement qui empêche efficacement l’aggravation des maladies rénales sévères sur le long terme. Pourtant, de plus en plus de patients diabétiques ou atteints de GSDIa en souffrent. Par exemple, 70 à 80 % des personnes atteintes de glycogénose de type I développent une maladie rénale chronique.
Procédures
Interventions réalisées sur toutes les souris : Dans le cadre de ce projet de recherche, nous allons utiliser des souris génétiquement modifiées pour mieux comprendre certaines maladies liées au métabolisme du sucre. Pour identifier les souris porteuses des modifications nécessaires, nous prélèverons un petit échantillon de tissu (biopsie) de manière rapide (quelques secondes). Les souris recevront ensuite une injection quotidienne, sous la peau et pendant 5 jours, d’une solution permettant de bloquer un gène impliqué dans la production de glucose. Ce traitement vise à reproduire, dans leurs reins, une glycogénose de type I. En fin de toutes les procédures, toutes les souris seront mises à jeun pendant 6h et une prise de sang sera réalisée, juste avant la mise à mort, pour des mesures biochimiques. Cette prise de sang sera réalisée en environ 20 secondes. -Interventions spécifiques: -Un premier lot de souris nourris ad libitum sera utilisé pour valider le modèle et évaluer le bien-être. Ces souris ne subiront pas d’autres interventions que celles décrites ci-dessus. - Deux lots de souris seront mis à jeun pendant 24 heures ou entre 30 heures et 48 heures au maximum. Une goutte de sang sera prélevée après l’incision de l’extrémité de la queue pour la mesure de la glycémie grâce à un glucomètre (appareil utilisé par les diabétiques). Ce geste n’est réalisé qu’une seule fois et est très rapide (1-2 secondes). Le massage de la queue permet d’obtenir les prélèvements suivants. Ce geste peut induire un léger stress. - Un lot de souris sera mis à jeun 24h et leur glycémie sera mesurée régulièrement (sept fois, comme décrit ci-dessus) pendant 2 heures après l’injection d’un substrat. Le même test sera réalisé avec un autre composé à une semaine d’intervalle. L’injection du composé sera réalisée en moins d’une minute. Toutes les injections de substrat qui seront réalisées nécessitent une contention en main de la souris de quelques secondes.
Impact sur les animaux
À l’âge de 7 à 10 jours, un petit prélèvement de tissu sera effectué, ce qui peut provoquer une légère douleur de très courte durée ; le risque de saignement est extrêmement faible. Ce moment peut être légèrement stressant pour les petits, car ils doivent être immobilisés quelques secondes. Les injections sous la peau peuvent également entraîner une courte sensation de douleur et un peu de stress. Les injections dans le péritoine sont généralement un peu plus douloureuses et nécessitent une contention en main entrainant un léger stress. Deux lots de souris seront privées de nourriture pendant une période de 24h ou au maximum 48 heures. Ce jeûne prolongé peut provoquer un inconfort, une perte de poids (principalement liée à la perte d’eau et à la fonte musculaire), ainsi que des changements de comportement : au début, elles peuvent devenir anormalement actives, puis s'affaiblir progressivement en cas de jeûne prolongé. Les animaux peuvent aussi devenir plus agressifs. Leur température corporelle peut baisser, mais ces effets sont réversibles dès qu’ils sont réalimentés. Si la perte de poids dépasse 20% de leur poids initial, les animaux seront retirés de l’étude pour éviter toute souffrance. Le suivi de la glycémie permettra aussi de vérifier leur état de santé : une baisse modérée du glucose dans le sang ne provoque pas de gêne, mais si ce taux devient trop bas, les souris peuvent présenter des signes de mal-être importants (faiblesse, inactivité, frissons), nécessitant alors une intervention rapide (injection de glucose ou nécessité de mise à mort de l’animal pour raisons éthiques). Le prélèvement de sang à l’extrémité de la queue est limité en quantité et n’entraine pas de mal-être. La première incision de la queue peut être cependant légèrement douloureuse. D’autres prélèvements sanguins seront effectués par une piqûre sous la mâchoire, ce qui peut causer une gêne passagère et, dans de rares cas, un petit saignement. La maladie rénale étudiée dans ce projet n’entraîne généralement pas de signes visibles de souffrance chez les souris, même lorsqu’elles sont nourries avec une alimentation riche en graisses et en sucres. Toutefois, si une insuffisance rénale devait survenir, les signes suivants seraient surveillés de près : perte de poids importante, léthargie, absence de toilette, yeux mi-clos, et respiration rapide. Ces signes déclencheront des mesures appropriées pour préserver le bien-être des animaux.
Devenir
Les animaux transgéniques seront produits en zone d’élevage et seront mis à mort en fin d’expérimentation pour le prélèvement des tissus (foie, rein et intestin) qui seront analysés au niveau structurel et moléculaire
Remplacement
Même si les chercheurs savent aujourd’hui fabriquer en laboratoire de petites structures qui ressemblent à des petits reins, appelées organoïdes, il est encore nécessaire d’étudier certaines fonctions complexes, comme la production de sucre par le corps, directement chez des animaux. En effet, des organes comme le foie, les reins et l’intestin travaillent ensemble pour réguler le taux de sucre dans le sang, en particulier pendant le jeûne, et ces mécanismes impliquent aussi des signaux hormonaux et nerveux qu’on ne peut pas reproduire en laboratoire. De plus, certaines maladies rénales, comme la maladie rénale chronique, mettent des mois à se développer, dans l’organe complexe qu’est le rein, ce qui n’est pas possible à observer avec des cellules cultivées en laboratoire. Pour étudier une maladie rare appelée glycogénose de type 1a, les scientifiques utilisent un modèle de souris spécialement modifiées. Ces souris reproduisent les symptômes rénaux de la maladie tout en maintenant la production de sucre par le foie et l’intestin, ce qui est essentiel pour comprendre la maladie dans son ensemble. De plus, il est très difficile d’étudier cette maladie directement chez les patients, car elle est extrêmement rare (seulement 1 naissance sur 100 000). Enfin, la souris est aussi un modèle très proche de l’humain en ce qui concerne le métabolisme.
Réduction
Pour planifier ces expériences, nous avons utilisé un logiciel spécialisé afin de calculer le nombre d’animaux nécessaires, en tenant compte de la précision des mesures, de la variabilité entre les individus, et du fait que nous devons inclure aussi bien des mâles que des femelles, car le métabolisme est régulé différemment selon le sexe. Au total, le projet nécessitera 180 souris : 90 souris ne produisant pas de sucre au niveau des reins et 90souris en bonne santé servant de groupe témoin. Les naissances de souris seront arrêtées dès que nous aurons atteint ce nombre. Enfin, toutes ces expériences sont prévues avec le plus grand soin pour limiter le nombre d’animaux utilisés, en s’appuyant sur nos connaissances antérieures et en appliquant des méthodes statistiques rigoureuses pour garantir la fiabilité des résultats.
Raffinement
Pour réduire la douleur, les prélèvements de tissus (biopsies) seront réalisés sur des souriceaux âgés de 7 à 10 jours, à un moment où leurs terminaisons nerveuses ne sont pas encore totalement développées. Afin d’éviter le stress dû à la séparation d’avec leur mère, les soigneurs manipuleront les petits en portant des gants imprégnés de la litière de leur cage, pour conserver leur odeur familière. Pour habituer les souris à être manipulées et réduire leur stress, elles seront régulièrement en contact avec les expérimentateurs et seront prises en main à l’aide d’un petit tunnel plutôt qu’attrapées directement. Quand cela est possible, les injections seront réalisées sous la peau plutôt que dans le ventre, pour réduire la douleur due aux injections. Les points d’injection seront changés chaque jour pour limiter les irritations. Dans cette expérience, seuls les reins sont ciblés génétiquement, ce qui évitera aux souris de souffrir de fortes baisses de sucre dans le sang, car leur foie et leurs intestins continueront de produire du glucose. Lors des périodes de jeûne, les souris resteront en groupe dans de grandes cages enrichies (petites maisons, tunnels) pour limiter leur stress et éviter qu’elles deviennent agressives entre elles. Une partie de la cage sera chauffée. Pour les prises de sang, la queue des souris sera réchauffée pour faciliter le prélèvement et nettoyée pour éviter les infections. Les volumes de sang prélevés resteront très limités conformément aux recommandations internationales sur le bien-être animal. Pour les mesures répétées de la glycémie, une petite incision de l’extrémité de la queue sera réalisée après application d’une pommade anesthésiante. Le sang sera ensuite prélevé sans autre incision en grattant la croute pour éviter toute autre incision. Les prélèvements d’urine se feront de manière naturelle, sans avoir besoin d’isoler les souris. Au début, la maladie rénale étudiée n’aura pas d’effet visible sur la santé des souris. Ce n’est que plus tard, en cas d’insuffisance rénale, qu’on pourra observer une perte de poids importante. Grâce à une bonne connaissance de ce modèle, des critères précis (une grille d’évaluation avec des points limites) permettront de suivre l’évolution de la maladie et de décider quand il sera nécessaire de mettre fin à la vie des animaux pour éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris pour notre projet de recherche car, contrairement à d’autres espèces comme le poisson, elle possède des mécanismes de régulation de la glycémie similaires à ceux de l’être humain. De plus, il est possible dans cette espèce de désactiver précisément un gène important dans les reins grâce à des techniques génétiques avancées. Ce modèle de souris devrait imiter très fidèlement la maladie chronique rénale associée à la glycogénose de type I, ce qui en fait un outil précieux pour mieux comprendre cette pathologie et développer de nouvelles approches. Au laboratoire, tous les outils nécessaires, comme des anticorps spécifiques à la souris, sont disponibles pour analyser les effets de la maladie et des traitements. Les manipulations sur les souris seront limitées et réalisées à différents âges : une petite biopsie de l’oreille sera faite chez les bébés souris (entre 7 et 10 jours) pour vérifier leur patrimoine génétique. Ensuite, un traitement spécifique sera administré à l’âge de 6 à 8 semaines pour déclencher la modification du gène étudié. Les tests pour mesurer l’impact de cette modification seront réalisés quand les souris seront adultes, entre 2 et 4 mois après le traitement. L’étude se terminera avant que les souris n’atteignent 6 mois.
Impact du microbiote des puces sur leur dynamique de reproduction et d’infection
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Un seul souriceau de deux à cinq jours fournit aux puces le volume de sang que donneraient quatre à cinq souris adultes. 2 602 souris vont être utilisées, 1 324 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 1 278 un niveau léger, toutes tuées à l'issue. Le projet cherche à savoir comment le microbiote des puces modifie leur reproduction et leur aptitude à transmettre le bacille de la peste, et annonce la mise au point d'une lignée cellulaire de puce qui remplacerait plus tard certaines expériences. Le stade de deux à cinq jours est retenu parce que la peau des souriceaux est fine et glabre, ce qui limite aussi les fuites d'insectes, et parce que leur perception de la douleur ne serait, selon le porteur, encore que partiellement intégrée.
Objectifs
La peste est une maladie mortelle transmise par les puces. Ce projet vise à étudier comment le microbiote influence la physiologie des puces et leur capacité à transmettre le bacille de la peste. Il s’agira également d’identifier les mécanismes moléculaires associés à ces effets. Dans une perspective de réduction du recours aux animaux, nous tenterons de développer une lignée cellulaire de puce permettant l’étude de ces mécanismes in vitro. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre les interactions entre microbiote, physiologie vectorielle et dynamique épidémique, d’améliorer les modèles prédictifs, de contribuer au développement de nouvelles stratégies de lutte, et d’éclairer les conditions ayant conduit à la disparition historique de la peste en Europe ainsi que les risques actuels de réémergence.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des connaissances inédites sur l’impact d'endosymbionte sur la dynamique de reproduction des puces, leur infection par l’agent de la peste et les mécanismes moléculaires sous-jacents. Ces résultats permettront d’améliorer la compréhension des interactions entre microbiote, physiologie vectorielle et transmission du bacille de la peste. Ils contribueront également à renforcer les modèles prédictifs utilisés en santé publique pour évaluer les risques de réémergence de la maladie, notamment dans les zones anciennement touchées. A terme, ces travaux pourraient orienter le développement de nouvelles stratégies de surveillance ou de lutte ciblant les vecteurs, tout en favorisant la réduction du recours aux animaux grâce à la mise au point d’une lignée cellulaire de puce.
Procédures
Les animaux seront exposés une seule fois au contract de puces pendant une durée d'heure
Impact sur les animaux
L’exposition aux puces peut entraîner deux types de nuisance. D’une part, les piqûres elles-mêmes, atténuées par les propriétés analgésiques et anti-inflammatoires de leur salive. D’autre part, la perte sanguine liée à l’alimentation des insectes. Lors d’expositions avec un nombre limité de puces, la quantité de sang prélevée demeure faible et n’entraîne pas d’effet physiologique observable dans nos conditions. A l’inverse, lors du nourrissage de colonies établies sur souriceaux, l’alimentation simultanée d’un très grand nombre de puces provoque une perte de sang importante, conduisant rapidement à une perte de conscience puis au décès très rapide. Dans ce contexte, la phase consciente est brève et la perception nociceptive potentielle reste transitoire.
Devenir
Quel que soit la procédure, les animaux ne seront pas maintenus en vie après leur utilisation. Leur prise en charge en fin de protocole est strictement encadrée et conforme aux exigences sanitaires et réglementaires en vigueur, afin d’éviter tout risque de contamination croisée et de garantir la sécurité des installations expérimentales.
Remplacement
A ce jour, il n’existe aucun modèle in vitro capable de reproduire le cycle biologique complet des puces ni leurs interactions physiologiques avec un hôte. Les puces sont des insectes hématophages stricts, et la prise de repas sanguin constitue un déclencheur physiologique essentiel à leur développement, leur reproduction et leur ponte. Ce processus dépend non seulement de la disponibilité du sang, mais aussi de signaux sensoriels et hormonaux issus du contact avec un hôte vivant. L’utilisation de systèmes artificiels de nourrissage, comme des membranes synthétiques, reste inadaptée à notre contexte expérimental. Ces dispositifs ne permettent ni une alimentation efficace ni une reproduction stable chez les espèces ciblées ici. Ils exposent également les puces à des anticoagulants et à des contaminations bactériennes ou fongiques, nécessitant l’ajout d’antimicrobiens qui altèrent leur physiologie et compromettent la validité des données. Enfin, il n’existe actuellement ni lignée cellulaire, ni modèle substitutif permettant de reconstituer ex vivo les interactions complexes entre la puce et son hôte. Dans le cadre de ce projet, nous visons à développer une lignée cellulaire de puce qui pourra remplacer certaines expériences in vivo dans de futures études.
Réduction
Nos approches expérimentales ont été conçues pour réduire significativement le recours aux animaux. (1) L’utilisation de souriceaux permet de nourrir un grand nombre de puces tout en mobilisant un nombre restreint d’animaux. Un seul souriceau fournit un volume sanguin équivalent à celui obtenu à partir de quatre à cinq souris adultes dans un système artificiel comparable, ce qui contribue à une diminution notable du nombre total d’animaux utilisés. (2) Notre expérience montre qu’il est possible d’interrompre le nourrissage des colonies pendant une semaine chaque mois sans compromettre leur survie, permettant ainsi de réduire la fréquence des nourrissages et, par conséquent, le nombre d’animaux nécessaires à leur maintien. (3) Nous avons également choisi de collecter des puces vierges d’âge similaire directement à partir des cocons présents dans les pots d’élevage pour les expériences de développement. Cette approche évite la mise en place de sous-colonies dédiées pendant deux mois, une méthode plus simple mais qui nécessiterait entre 16 et 24 souris par colonie, par traitement et par répétition, soit environ 384 à 576 souris. (4) Les expériences d’infection durent habituellement 27 jours. Nous avons choisi de les limiter à 20 jours, car notre expérience montre qu’il n’est plus nécessaire de prolonger les essais à 27 jours pour obtenir des données robustes et statistiquement fiables. Cette adaptation permet de réduire significativement le nombre de souris utilisées. (5) Ce protocole est mutualisé avec un autre projet impliquant le maintien des souches parentales. Les mêmes colonies de puces sont donc utilisées pour plusieurs projets, évitant la duplication des élevages et réduisant significativement le nombre total de souriceaux nécessaires. (6) Dans la mesure du possible, nous maximisons également les données obtenues à partir d’une seule expérience, en regroupant plusieurs tests sous une même condition témoin.
Raffinement
Plusieurs mesures ont été intégrées pour minimiser la contrainte associée aux nourrissages. Les souriceaux seront exposés sans contention, pendant une durée limitée à une heure. Ce choix contribue au raffinement en réduisant stress et douleur. Les stades utilisés (2 à 5 jours) correspondent à une période de développement où la perception nociceptive est présente, mais encore partiellement intégrée, ce qui limite la réponse comportementale complexe. Des observations seront menées pendant et après l’exposition afin de détecter tout signe de souffrance (vocalisation, évitement, apathie). Enfin, les puces injectant naturellement des molécules salivaires aux propriétés analgésiques et anti-inflammatoires, cette particularité constitue une forme de raffinement biologique supplémentaire. Des points limites adaptés ont été définis pour chaque procédure afin de permettre l’identification précoce de signes de souffrance justifiant l’interruption de l’expérimentation et l’euthanasie immédiate de l’animal
Choix des espèces
L’espèce choisie est la souris (Mus musculus), qui constitue un hôte naturel ou compatible pour de nombreuses espèces de puces ciblées par le projet. Elle est couramment utilisée pour le nourrissage de puces en contexte expérimental. Son statut d’espèce modèle, sa physiologie bien connue, et sa compatibilité avec les besoins alimentaires des puces en font un choix scientifiquement pertinent et largement validé pour ce type de protocole. Souriceaux âgés de 2 à 5 jours. Il s’agit du stade privilégié pour les nourrissages expérimentaux. A ce stade, les souriceaux sont glabres, leur peau est fine, et leur système nerveux est encore en développement. Bien que la perception nociceptive soit présente dès la naissance, son intégration centrale est partielle, ce qui limite la réponse comportementale complexe. Lorsqu’ils sont exposés à un grand nombre de puces (>1000), l’exsanguination entraîne une perte rapide de conscience suivi du décès rapide. La perception nociceptive potentielle est intense mais très transitoire, et ne s’accompagne d’aucun signe comportemental prolongé. Par ailleurs, l’utilisation de souriceaux permet de réduire significativement le nombre total d’animaux utilisés: un seul individu alimente les puces alors qu’il faudrait 4 à 5 souris adultes nécessaires pour obtenir un volume sanguin équivalent lors d’un nourrissage artificiel. La faible pilosité des souriceaux permet également de limiter les risques de fuite des insectes, ce qui sécurise la procédure. Ces animaux seront exposés sans contention, pendant une durée maximale d’une heure, ce qui réduit le stress. Ce stade est également optimal pour les puces, en raison de la vascularisation cutanée. Leur utilisation répond donc à la fois aux objectifs scientifiques et au principe de raffinement.
Microévolution du bacille de la peste dans le vecteur puce : dynamiques et conséquences fonctionnelles
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Exposés une heure au contact de puces, des souriceaux de deux à cinq jours sont utilisés pour nourrir les colonies d'insectes. 5 104 souris vont être utilisées, 2 760 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 2 344 un niveau léger, toutes tuées à l'issue. Le porteur indique qu'au-delà d'un millier de puces l'alimentation simultanée provoque une perte de sang importante, une perte de conscience puis un décès rapide, et qualifie la phase consciente de brève. L'objet du projet est de savoir si le bacille de la peste mute dans la puce, où et quand, et la description des procédures tient en une phrase, sans dire combien de souriceaux sont exposés à ces effectifs de puces.
Objectifs
Le bacille de la peste, responsable de la maladie du même nom transmise par les puces, connaît des phénomènes de microévolution, révélés par des signatures génétiques partiellement documentée. Toutefois, on ignore encore si ces microévolutions surviennent dans le vecteur. Si c’est le cas, on ne sait ni où ni quand elles apparaissent, ni quelles fonctions elles remplissent dans la colonisation de la puce. Ce projet vise à lever ces inconnues en identifiant ces signatures moléculaires, en les localisant de façon spatio-temporelle chez la puce, puis en évaluant leur impact sur la capacité du bacille à produire une infection transmissible chez l’insecte. En améliorant notre compréhension des mécanismes d’adaptation du bacille dans son vecteur, cette recherche contribuera à évaluer le risque d’émergence épidémique et à concevoir de nouvelles stratégies de lutte.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des connaissances inédites sur les mécanismes d’adaptation de Y. pestis à ses vecteurs, en identifiant les mutations associées à la persistance et à la transmission. Ces données permettront d’évaluer plus finement le risque d’émergence épidémique et de cibler de nouvelles stratégies de lutte. Les bénéfices attendus sont en santé publique, animale, comme en recherche fondamentale.
Procédures
Les animaux seront exposés une seule fois au contract de puces pendant une durée d'heure.
Impact sur les animaux
L’exposition aux puces peut entraîner deux types de nuisance. D’une part, les piqûres elles-mêmes, atténuées par les propriétés analgésiques et anti-inflammatoires de leur salive. D’autre part, la perte sanguine liée à l’alimentation des insectes. Lors d’expositions avec un nombre limité de puces, la quantité de sang prélevée demeure faible et n’entraîne pas d’effet physiologique observable dans nos conditions. A l’inverse, lors du nourrissage de colonies établies sur souriceaux, l’alimentation simultanée d’un très grand nombre de puces provoque une perte de sang importante, conduisant rapidement à une perte de conscience puis au décès très rapide. Dans ce contexte, la phase consciente est brève et la perception nociceptive potentielle reste transitoire.
Devenir
Quel que soit la procédure, les animaux ne seront pas maintenus en vie après leur utilisation. Leur prise en charge en fin de protocole est strictement encadrée et conforme aux exigences sanitaires et réglementaires en vigueur, afin d’éviter tout risque de contamination croisée et de garantir la sécurité des installations expérimentales.
Remplacement
A ce jour, il n’existe aucun modèle in vitro capable de reproduire le cycle biologique complet des puces ni leurs interactions physiologiques avec un hôte. Les puces sont des insectes hématophages stricts, et la prise de repas sanguin constitue un déclencheur physiologique essentiel à leur développement, leur reproduction et leur ponte. Ce processus dépend non seulement de la disponibilité du sang, mais aussi de signaux sensoriels et hormonaux issus du contact avec un hôte vivant. L’utilisation de systèmes artificiels de nourrissage, comme des membranes synthétiques, reste inadaptée à notre contexte expérimental. Ces dispositifs ne permettent ni une alimentation efficace ni une reproduction stable chez les espèces ciblées ici. Ils exposent également les puces à des anticoagulants et à des contaminations bactériennes ou fongiques, nécessitant l’ajout d’antimicrobiens qui altèrent leur physiologie et compromettent la validité des données. Enfin, il n’existe actuellement ni lignée cellulaire, ni modèle substitutif permettant de reconstituer ex vivo les interactions complexes entre la puce et son hôte.
Réduction
L’utilisation de souriceaux permet de nourrir un grand nombre de puces tout en mobilisant un nombre réduit d’animaux. Un seul souriceau remplace le volume sanguin fourni par 4 à 5 souris adultes dans un système artificiel équivalent, ce qui contribue significativement à la réduction du nombre total d’animaux utilisés. Notre stratégie expérimentale a également été conçue pour limiter le recours aux animaux, tout en maintenant la robustesse scientifique du modèle. Nous avons aussi choisi de travailler avec une souche de puce dont le cycle biologique permet un nourrissage bihebdomadaire, contrairement à d’autres espèces qui nécessitent un nourrissage tous les deux jours à minima. Ce choix permet de réduire sensiblement le nombre de souriceaux requis. Par ailleurs, notre expérience montre qu’il est possible d’interrompre un nourrissage une fois par mois sans compromettre la survie des colonies, ce qui permet de réduire le nombre total d’animaux utilisés pour leur maintien. Pour l’étude sur l’émergence de nouveaux variants, nous avons choisi un nourrissage tous les deux jours. Ce rythme est plus fréquent que le bihebdomadaire habituel, mais reste inférieur au quotidien. Il maximise les chances de détection d’un événement évolutif sans pour autant mobiliser davantage d’animaux qu’un nourrissage quotidien, qui ne nous apporterait pas d’information supplémentaire utile. Enfin, nous regroupons autant que possible plusieurs tests en présence d’une condition témoin.
Raffinement
Plusieurs mesures ont été intégrées pour minimiser la contrainte associée aux nourrissages. Les souriceaux seront exposés sans contention, pendant une durée limitée à une heure. Ce choix contribue au raffinement en réduisant stress et douleur. Les stades utilisés (2 à 5 jours) correspondent à une période de développement où la perception nociceptive est présente, mais encore partiellement intégrée, ce qui limite la réponse comportementale complexe. Des observations seront menées pendant et après l’exposition afin de détecter tout signe de souffrance (vocalisation, évitement, apathie). Enfin, les puces injectant naturellement des molécules salivaires aux propriétés analgésiques et anti-inflammatoires, cette particularité constitue une forme de raffinement biologique supplémentaire. Des points limites adaptés ont été définis pour chaque procédure afin de permettre l’identification précoce de signes de souffrance justifiant l’interruption de l’expérimentation et l’euthanasie immédiate de l’animal.
Choix des espèces
L’espèce choisie est la souris (Mus musculus), qui constitue un hôte naturel ou compatible pour de nombreuses espèces de puces ciblées par le projet. Elle est couramment utilisée pour le nourrissage de puces en contexte expérimental. Son statut d’espèce modèle, sa physiologie bien connue, et sa compatibilité avec les besoins alimentaires des puces en font un choix scientifiquement pertinent et largement validé pour ce type de protocole. Souriceaux âgés de 2 à 5 jours. Il s’agit du stade privilégié pour les nourrissages expérimentaux. A ce stade, les souriceaux sont glabres, leur peau est fine, et leur système nerveux est encore en développement. Bien que la perception nociceptive soit présente dès la naissance, son intégration centrale est partielle, ce qui limite la réponse comportementale complexe. Lorsqu’ils sont exposés à un grand nombre de puces (>1000), l’exsanguination entraîne une perte rapide de conscience suivi du décès rapide. La perception nociceptive potentielle est intense mais très transitoire, et ne s’accompagne d’aucun signe comportemental prolongé. Par ailleurs, l’utilisation de souriceaux permet de réduire significativement le nombre total d’animaux utilisés: un seul individu alimente les puces alors qu’il faudrait 4 à 5 souris adultes nécessaires pour obtenir un volume sanguin équivalent lors d’un nourrissage artificiel. La faible pilosité des souriceaux permet également de limiter les risques de fuite des insectes, ce qui sécurise la procédure. Ces animaux seront exposés sans contention, pendant une durée maximale d’une heure, ce qui réduit le stress. Ce stade est également optimal pour les puces, en raison de la vascularisation cutanée. Leur utilisation répond donc à la fois aux objectifs scientifiques et au principe de raffinement.
Rôle du variant K460X-ANGPTL6 dans l’anévrisme intracrânien chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Piquées chaque semaine pour la glycémie, tous les quinze jours pour les lipides, puis cinq fois en deux heures lors d'un test de tolérance au glucose et sept fois lors d'un test à l'insuline, 144 souris porteuses d'une mutation liée à l'anévrisme intracrânien sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le gavage et l'injection intrapéritonéale de ces tests provoquent, selon le porteur, un stress et une douleur qu'il qualifie de petits. Il écrit être "malheureusement contraint" de recourir aux modèles animaux, faute de pouvoir étudier le métabolisme énergétique in vitro. Les 144 souris sont tuées par ponction cardiaque sous anesthésie, pour prélever leurs organes.
Objectifs
Notre objectif global est d'améliorer notre connaissance des mécanismes physiopathologiques de l'anévrisme intracrânien. L'anévrisme est une anomalie cérébrovasculaire fréquente et généralement asymptomatique affectant environ 3 % de la population générale. L'anévrisme intracrânien se caractérise par une dilatation localisée et un amincissement de la paroi des artères intracrâniennes, le plus souvent au niveau des bifurcations des artères cérébrales. La complication dévastatrice de l'anévrisme est sa rupture et l'hémorragie intracrânienne qui en résulte, mortelle dans la moitié des cas ou laissant des séquelles neurologiques majeures. Encore aujourd’hui, il n'existe aucun traitement permettant de prédire la formation ou le devenir d'un anévrisme. Les facteurs de risque tels que l'hypertension, l'âge, le tabagisme, les antécédents familiaux d'anévrisme mais également le sexe féminin, prédisposent à la formation et à la rupture de l'anévrisme. Le laboratoire a récemment identifié une mutation dans plusieurs familles atteintes d’anévrisme. Ce gène code pour une protéine circulante, essentiellement exprimée au niveau du foie, et décrite pour favoriser la croissance et le développement des vaisseaux sanguins. Cette mutation conduit à l'expression d'une protéine plus petite, non sécrétée. Cette protéine est également connue pour être impliquée dans le métabolisme énergétique, le métabolisme du glucose mais aussi celui des lipides. Pour comprendre pourquoi cette mutation prédispose à l'anévrisme, nous avons développé un modèle de souris exprimant cette mutation. Nos premiers résultats suggèrent que cette protéine joue un rôle majeur dans la physiopathologie de l’anévrisme, avec un impact plus fort chez les femelles que chez les mâles. La compréhension des mécanismes physiopathologiques conduisant à la formation de l’anévrisme intracrânien est donc une condition préalable à l'amélioration de l'évaluation de la maladie et de la prise en charge des patients atteints d'anévrisme intracrânien.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont: 1) Apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires à l'origine de la formation de l'anévrisme et identifier les voies régulées par la mutation de notre gène d'intérêt. Notre projet pourrait ainsi, à court terme, contribuer à clarifier le lien entre les troubles métaboliques et l'anévrisme, et permettrait d'améliorer la qualité de vie des personnes atteintes d'anévrisme intracrânien. 2) Identifier les voies dérégulées par notre mutation d'intérêt. Notre projet, à court terme, pourrait ainsi aider à clarifier le lien entre les troubles métaboliques et l'anévrisme, et ouvrirait de nouvelles voies pour la recherche de biomarqueurs de progression de l'anévrisme afin d'optimiser l'évaluation du risque pronostique pour prévenir les hémorragies intracérébrales aiguës. 3) Découvrir de nouvelles cibles pharmacologiques potentielles qui, à moyen/long terme, pourraient être utilisées pour développer des thérapies innovantes afin de limiter ou de prévenir la progression de l'anévrisme.
Procédures
1fois/semaine, prélèvement de sang pour contrôler la glycémie (1 min). Toutes les 2 semaines, 1 prélèvement de sang réalisé pour contrôler les concentrations plasmatiques lipidiques (durée 2min). Pour le test de tolérance au glucose, glycémie contrôlée toutes les 30 minutes pendant 2heures, soit 5 prélèvements. Durée de chaque prélèvement : 1 à 2 minutes. Pour le test de tolérance à l’insuline, 7 prélèvements de sang pour contrôler la glycémie (durée: 1 à 2 min). Enfin, prélèvement de sang par ponction cardiaque lors de l’euthanasie (animal sous anesthésie pendant le prélèvement: durée: 5 minutes)
Impact sur les animaux
Il s’agit d’une procédure légère, nous n’attendons pas d’effets indésirables notables. Les nuisances pourraient concerner : - les prélèvements de sang : petite douleur possible au niveau de l’incision, - le gavage lors du test de tolérance au glucose peut induire un stress - l’injection intrapéritonéale lors du test de tolérance à l’insuline (stress lié à la contention et douleur liée à l’introduction de l’aiguille).
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure pour réaliser des prélèvements d'organes en vue d'analyses histologiques, biochimiques et transcriptomiques.
Remplacement
Le métabolisme énergétique et le développement de l'obésité sont des processus physiologiques complexes, impliquant l’action combinée d’une multitude d’organes et de diverses voies métaboliques. Il est donc actuellement impossible d’étudier ce paramètre d’une façon intégrale ex vivo ou in vitro et nous sommes malheureusement contraints d’utiliser les modèles animaux.
Réduction
Ce projet a été construit avec la volonté de mettre en place et de respecter « la règle des 3 R ». Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en œuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation a été défini avec un logiciel de statistique. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant la lignée murine la plus adaptée à l’étude. Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations.
Raffinement
Les procédures, de classe légère, ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations. Les animaux seront hébergés à 4 ou 5 par cage dans un environnement contrôlé. Les cages seront enrichies par des frisottis et un dôme en carton. Une surveillance quotidienne des animaux sera réalisée. Une grille de score et de points limites seront mises en place pour permettre d'identifier tout signe précoce de souffrance et y remédier si besoin. Si la douleur ne peut être traitée, l’animal sera alors mis à mort. De plus, tout geste invasif sera réalisé sous analgésie et/ou anesthésie adaptées.
Choix des espèces
Pour le système vasculaire et les mécanismes de régulation de l’homéostasie énergétique, il est fondamental d’étudier les potentielles anomalies sur l’animal entier, soumis à l’ensemble des systèmes régulateurs, de façon parfaitement intégré. Le modèle murin reste donc le modèle de choix. Nous choisissons donc de travailler sur la souris, cette dernière nous permettant plus facilement de mettre en œuvre l’étude du gène Angptl6 identifié en amont Les procédures débuteront chez des animaux adultes jeunes, matures, soit à partir de 8 semaines de vie.
Anticorps anti-TNF alpha et anticorps anti-IL6 pour le traitement curatif de l’arthropathie hémophilique dans un modèle murin d’hémophilie B
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
Une aiguille est enfoncée dans le genou droit de souris hémophiles pour y provoquer un saignement, geste répété quinze jours plus tard sur la même articulation. 29 souris vont être utilisées ainsi, 24 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 5 un niveau léger, toutes tuées à l'issue. Le porteur écrit n'attendre aucune douleur après le réveil, et prévoit pourtant de poser nourriture et eau gélifiées au sol pour éviter aux souris de se redresser sur les pattes arrière compte tenu des douleurs du genou. La mise à mort est justifiée par le prélèvement d'un millilitre de sang, volume qu'il juge incompatible avec le maintien en vie de l'animal.
Objectifs
L’hémophilie est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur VIII (FVIII) de la coagulation pour l’hémophilie A et le facteur IX (FIX) pour l’hémophilie B. La sévérité de l’hémophilie est définie par les taux de FVIII ou FIX plasmatiques. La forme sévère, où le taux du FVIII ou FIX est indétectable dans le sang, est caractérisée par des saignements spontanés surtout au niveau articulaire. Les saignements articulaires répétés, peuvent conduire à une atteinte articulaire handicapante appelée arthropathie hémophilique. Il s’agit d’une complication grave, de la maladie. La présence anormale du sang dans la cavité articulaire conduit à une inflammation et à terme à la destruction progressive de l’articulation. L’arthropathie hémophilique partage certaines caractéristiques avec d’autres maladies articulaires telles que la polyarthrite rhumatoïde. Comme dans le stade précoce de l’arthropathie hémophilique, chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, il existe une inflammation articulaire. Le pilier du traitement de l'hémophilie est la substitution du facteur de coagulation manquant, afin de prévenir les saignements récurrents responsables de l'arthropathie. Cependant, aucun traitement actuellement disponible ne cible spécifiquement l’inflammation articulaire, pour la faire régresser afin de bloquer la progression de l’arthropathie hémophilique, alors que les anticorps anti-TNF alpha et anti-IL6 largement utilisés dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde entant que médicament de première intention pourrait être potentiellement efficace. Il s’agit de médicaments visant à contrôler l’inflammation. Il a été montré que les anti-TNF alpha étaient efficaces chez 60 à 70 % des patients avec polyarthrite rhumatoïde et les anti-IL6 ont montré une efficacité chez 55% des patients avec la polyarthrite rhumatoïde qui ont eu une rémission. Nous avons fait l’hypothèse que le ces anticorps pourrait réduire l’inflammation de la synovite comme traitement curatif chez les hémophiles et empêcher l’évolution de cette arthropathie handicapante, comme il fait dans la polyarthrite rhumatoïde. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité curative des anticorps anti-TNF alpha et anti-IL6 pour traiter la synovite de l’arthropathie hémophilique et de bloquer ainsi l’évolution de l’atteinte articulaire chez les souris hémophiles B
Bénéfices attendus
La comparaison entre le traitement habituel par concentré de facteur de coagulation et les anticorps anti-TNF alpha et anti-IL6, va permettre d’évaluer l’efficacité potentielle de ces médicaments dans le contexte d’arthropathie hémophilique, médicament couramment utilisée dans la polyarthrite rhumatoïde dont les dégâts articulaires sont similaires à ceux causés par l’hémophilie. Si les résultats de l’étude montrent une efficacité suffisante de ces anticorps dans l’arthropathie hémophilique, une étude clinique pourra alors être proposée pour évaluer l’efficacité de ces anticorps chez des patients hémophiles.
Procédures
Les souris seront séparées en 3 groupes : Groupe 1 : recevant un traitement par FIX pour traiter et prévenir les saignements tel qu’il est recommandé actuellement pour les patients hémophiles sévères Groupe 2 : recevant un traitement par FIX en association avec l’anticorps anti-TNF alpha avec l’objectif de contrôler voire faire régresser l’inflammation articulaire Groupe 3 : recevant un traitement par FIX en association avec l’anticorps anti-IL6 avec l’objectif de contrôler voire faire régresser l’inflammation articulaire Nous induirons un saignement articulaire responsable d’arthropathie chez des souris hémophiles B par ponction articulaire, réalisée sous anesthésie générale et médicament anti-douleur, selon la technique déjà publiée par notre groupe. Une mesure quotidienne du diamètre des genoux, sur 15 jours, étudiera la variation du diamètre qui sera exprimée en pourcentage par rapport à la valeur avant ponction. Le 15ème, une 2eme ponction sera réalisée sur le même genou (droit) afin de mimer des saignements articulaires à répétition qui caractérisent la maladie, le genou contrôle ne subira aucune ponction articulaire. Un traitement par FIX à demi-vie allongée tous les 4 jours sera administré chez toutes les souris et sera poursuivi pendant 15 jours. Les souris du groupe 2 et 3 recevront pendant 15 jours un traitement combiné associant l’anticorps anti-TNF alpha ou anti-IL6 2 fois/semaine le même jour que la prophylaxie par FIX afin de limiter le risque d’hématome post-injection. Ensuite, un prélèvement sanguin sera réalisé pour la mesure des marqueurs inflammatoires (IL6 et TNF alpha). Tous les actes qui peuvent engendrer une douleur ou un stress sont effectués sous anesthésie générale et administration d’un médicament anti-douleur. Les souris bénéficieront d’un enrichissement adapté améliorant leur bien-être et compte tenu des douleurs du genou, les conditions d’alimentation seront adaptées afin de leur éviter le redressement sur des pattes arrières avec nourriture et eau gélifiée au sol. Les souris seront mises à mort et les pattes arrière seront disséquées pour l’étude histologique à la recherche d’une inflammation articulaire. Les animaux seront soumis, sous anesthésie générale, à 1. deux ponctions articulaires : 2-3 min 2. Un prélèvement sanguin : 1 min 3. La mesure du genou siège d’arthropathie : 30 sec 4. des injections: groupe 1 : 2 min, groupe 2 et 3 : 3-7 min 5. Un prélèvement sanguin de 1mL et mise à mort : 3-5 min
Impact sur les animaux
Au cours du projet, tous les gestes sont réalisés sous anesthésie à l’isoflurane. • Après le réveil suite à l’induction de l’arthropathie et de l’injection, l’expérience de notre groupe ne nous fait attendre aucune douleur. Une possible gêne locomotrice peut être attendue, en cas d’apparition, de l’eau et de la nourriture seront mis à disposition dans la cage, au sol, pour éviter la station debout aux souris et le redressement sur les pattes arrière pour chercher leur nourriture. Les anticorps anti-TNF alpha et anti-IL6 peuvent augmenter le risque d’infection. Les règles d’asepsie seront attentivement appliquées afin de réduire ce risque (tonte, désinfection cutanée avant ponctions, essuyage par compresse stérile, gants stériles) et surveillance clinique quotidienne.
Devenir
La mise à mort est justifiée par la nécessité de prélèvement de 1mL de sang total, non compatible avec le maintien en vie de l'animal
Remplacement
La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude sur les dégâts articulaires handicapants induits par l’hémophilie et son traitement. La mise au point des techniques in vitro est réalisée au maximum avant l’utilisation des souris ce qui nous permet de conserver le modèle de souris hémophile, modèle éprouvé et fiable pour notre étude.
Réduction
En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisé dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesures et d’études sur le même animal. Les mesures biologiques réalisées sur une souris vivante sont corrélées aux mesures histologiques de cette même souris et chaque souris constitue son propre contrôle pour l‘étude de l’articulation du genou droit.
Raffinement
Application des points limites strcits et spécifiques du projet pour préserver le bien-être de l’animal avec en outre l'utilisation de l'analgésie et de l'anesthésie. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges, de l’eau gélifiée et de la nourriture dans la cage en cas de problèmes locomoteurs. Tous gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésie et analgésie.
Choix des espèces
La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de l’hémophilie et d’étudier la destruction articulaire induite par la maladie. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette maladie, n’est pas victime de saignement spontané et les saignements sont provoqués que par des traumatismes. Pour cette étude, nous allons utiliser des souris matures. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car leur croissance articulaire n’est pas encore terminée et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible de la coagulation avec l’âge et par conséquent la tendance hémorragique.
Caractérisation des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement de l’ostéopathie induite par le méthotrexate (MTX) et efficacité des modalités thérapeutiques : évaluation des conséquences osseuses chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Ovariectomisées chez le fournisseur avant même le début du projet, les souris reçoivent ensuite une injection sous-cutanée hebdomadaire de méthotrexate, un groupe passant à une injection par jour cinq jours sur sept, et certaines portent une minipompe implantée. 90 souris vont être utilisées, 80 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 10 un niveau modéré, toutes tuées pour analyser la microarchitecture de leurs os. Le projet cherche à comprendre les atteintes osseuses provoquées par ce médicament, largement prescrit contre les rhumatismes, et à proposer un traitement. Le porteur affirme n'attendre aucune toxicité hépatique, rénale ou osseuse à la dose employée, et répartit les 90 souris en six groupes de 10 ou 20 sans expliquer ce qui fait varier les effectifs.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de préciser les mécanismes impliqués dans le développement des problèmes osseux liés au méthotrexate (MTX). En effet, les premiers cas ont été décrits dans le cadre des leucémies aigues chez des enfants, dans les années 70. Le méthotrexate a par la suite été largement et reste largement utilisé dans un grand nombre de rhumatismes (avec des doses de traitements moins importantes). Pourtant, il existe aussi des problèmes osseux à des doses faibles.
Bénéfices attendus
Les cas rapportés de problèmes osseux liés au Méthotrexate se multiplient ces dernières années. Ce traitement est fréquemment utilisé dans un grand nombre de rhumatismes. Ce travail a pour but d’avancer dans la compréhension afin de mieux identifier les sujets ou situations à risque, mais surtout de proposer un traitement adapté.
Procédures
Les animaux bénéficieront d'une ovariectomie en amont du projet auprès du fournisseur. Concernant les interventions, les animaux seront soumis à la réalisation hebdomadaire d'une injection sous-cutanée réalisée dans des conditions d'analgésie et d'anesthésie adaptées. Un groupe sera soumis à une injection journalière sous cutanée 5 jours sur 7 réalisée dans des conditions d'analgésie et d'anesthésie adaptées. Les injections seront de faible volume et rapide.
Impact sur les animaux
Pas de toxicité attendue du méthotrexate à cette dose que ce soit au niveau du foie, des reins ou osseux. Stress et douleurs lors des procédures (pose de minipompe et injections sous-cutanées) pris en charge par analgésie et anesthésie.
Devenir
Mise à mort de l'ensembles des 90 animaux pour analyse de la microarchitecture osseuse
Remplacement
Dans une optique de remplacement, ce projet s’associe à des travaux expérimentaux in vitro sur des cellules osseuses qui ne permettent pas d'englober l'ensemble des métabolismes mis en jeu car limité à un type cellulaire (contre 3 types de cellules osseuses fonctionnant conjointement dans un os). Par ailleurs, l'analyse osseuse sur animal vivant (comme par scanner) ne permet pas d'obtenir les informations recherchées, les anomalies étant d’ordre microarchitecturale.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit dans ce projet par l’utilisation de modèles icellulaires. La cohorte constituée de 90 souris sera répartie en 6 groupes expérimentaux (10 animaux/groupe ou 20 animaux/groupe). La taille de l’échantillonnage de chaque groupe a été définie à partir d’un test statistique. Le caractère variable entre les groupes entre 10 et 20 individus est basé sur les observations cliniques retrouvant une amélioration à l'arrêt du traitement par méthotrexate.
Raffinement
L'équipe appliquera un ensemble de démarches pour réduire au maximum le stress et la souffrance des souris utilisées dans ce projet. Les animaux bénéficieront d'une prise en charge par analgésie et anesthésie adaptée à la situation tout au long du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages enrichies avec jouets et tunnel. De plus, tout au long de la durée du protocole, les animaux suivront un contrôle quotidien avec questionnaire effectué par les chercheurs via un registre journalier et individuel. L'enrichissement sera modifié dans le groupe de souris bénéficiant de minipompes pour éviter tout frottemente et donc douleur sur la plaie (retrait du plastique et mise de carton ou coton). Le questionnaire fait ressortir les signes visibles de douleur et d’inconfort chez le rongeur. En cas d'atteinte des points limites décrits dans chacune des procédures, nous procèderons à la sortie de la souris du protocole.
Choix des espèces
La souris est le modèle répondant parfaitement à la problématique pour évaluer le tissu osseux sur ces deux versants. L'équipe a fréquemment utilisé ce type de souris permettant d’utiliser des protocoles de mise à mort bien connus. Le fait de cibler un sexe féminin exclusif répond à la problématique de la pathologie d'intérêt touchant de façon préférentielle (environ 80% des cas) des femmes. Enfin, l'utilisation de souris ovariectomisées de 12 semaines est aussi basée sur la description clinique des patients atteints (90% des femmes atteintes sont ménopausées)