Procédures légères

Génétiquement privées de facteur IX, les souris de ce projet ne saignent pas spontanément mais risquent l'hémorragie au moindre traumatisme. 21 vont être utilisées, 16 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 5 un niveau léger. Chacune reçoit une injection quotidienne de facteur IX pendant cinq jours, puis une plaie vasculaire est pratiquée à une patte arrière sous anesthésie et les caillots formés sont comptés pendant quinze minutes. Toutes sont tuées, la mise à mort étant justifiée par le prélèvement d'un millilitre de sang total, volume que le porteur juge incompatible avec le maintien en vie.

Objectifs

L’hémophilie B est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur IX (FIX). La sévérité de l’hémophilie est définie par les taux de FVIII ou FIX plasmatiques. La forme sévère, où le taux du FIX est indétectable dans le sang, est caractérisée par des saignements spontanés surtout au niveau articulaire. La prise en charge recommandée est le traitement prophylactique par concentrés de FIX afin de réduire voire éviter les saignements spontanés. Cette prophylaxie peut être également effectuée par la thérapie génique qui permet au patient de produire son propre FIX. Le FIX est une petite protéine qui peut diffuser à l’extérieur des vaisseaux et en cas d’apport régulier de FIX (comme lors d’une prophylaxie au long cours) et y former un réservoir extravasculaire autour des vaisseaux. L’objectif de ce projet est d’évaluer le comportement extravasculaire d’un variant du FIX appelé FIX-Padua chez les souris hémophiles B, ce variant est utilisé pour la thérapie génique de l’hémophilie B chez l’homme.

Bénéfices attendus

Au travers de la comparaison des groupes de souris recevant un traitement par FIX-WT ou FIX-Padua, ce projet pourrait améliorer la compréhension des mécanismes extravasculaires du FIX, en particulier du variant Padua, et clarifier son potentiel à former des réservoirs tissulaires. Il permettra d’évaluer si cette accumulation extravasculaire contribue à une hémostase durable, même en l’absence de FIX plasmatique détectable. Ces résultats pourraient guider l’optimisation des stratégies de thérapie génique pour l’hémophilie B, en améliorant l’efficacité clinique et le phénotype hémorragique en réduisant les saignements sévères, notamment au niveau des articulations et des muscles.

Procédures

Les souris seront séparées en 2 groupes : Groupe 1 : traitement prophylactique par FIX naturel (FIX-WT) Groupe 2 : traitement prophylactique par le variant FIX-Padua Un traitement quotidien par FIX (naturel ou variant Padua) 100 UI/kg sera injecté chez toutes les souris et sera poursuivi pendant 5 jours. Ensuite, l’activité coagulante du FIX extravasculaire sera évaluée 7 jours après la dernière injection de FIX, en l’absence de tout résidu du FIX dans le sang. Pour cette évaluation, le nombre de caillots sanguins formés seront comptés pendant 15 minutes à partir d’une plaie vasculaire au niveau d’une patte arrière. Un prélèvement sanguin sera réalisé pour la mesure de FIX qui doit être indétectable. Tous les actes qui peuvent engendrer une douleur ou un stress seront effectués sous anesthésie générale et sous médicament anti-douleur. Les souris bénéficieront d’un enrichissement adapté améliorant leur bien-être. Les souris seront mises à mort et les pattes arrière et des organes seront disséquées pour l’étude histologique à la recherche du FIX extravasculaire. Les animaux seront soumis, sous anesthésie générale, à 1. Une plaie vasculaire : 2-3 min 2. Observation de formation de caillots sanguins : 15 min 3. Un prélèvement sanguin : 1 min 4. Une injection: 2 min 5. Un prélèvement sanguin de 1mL et mise à mort: 3-5 min

Impact sur les animaux

Au cours du projet, tous les gestes sont réalisés sous anesthésie à l’isoflurane. Le modèle de souris hémophile KO ne présente pas de saignement spontané mais un risque d’hémorragie en cas de blessure.

Devenir

La mise à mort est justifiée par la nécessité de prélèvement de 1mL de sang total, non compatible avec le maintien en vie de l'animal

Remplacement

La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude l’étude de la diffusion du FIX dans les tissus dont les articulations. La mise au point des techniques in vitro est réalisée au maximum avant l’utilisation des souris ce qui nous permet de conserver le modèle de souris hémophile, modèle éprouvé et fiable pour notre étude.

Réduction

En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesures et d’études sur le même animal.

Raffinement

Application de points limites stricts et spécifiques du projet pour préserver le bien-être de l’animal. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges. Tous gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésies et analgésie.

Choix des espèces

La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de l’hémophilie et d’étudier la destruction articulaire induite par la maladie. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette maladie, n’est pas victime de saignement spontané et les saignements sont provoqués que par des traumatismes. Pour cette étude, nous allons utiliser des souris matures. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car leur croissance articulaire n’est pas encore terminée et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible de la coagulation avec l’âge et par conséquent la tendance hémorragique.

Exposés en une heure à plusieurs centaines voire plus d'un millier de puces, des souriceaux âgés de 2 à 5 jours perdent assez de sang pour perdre conscience puis mourir. 4 928 souris vont être utilisées de cette façon, toutes tuées à l'issue, 1 432 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 3 496 un niveau modéré. Le nourrissage des colonies de puces sert à étudier comment les conditions environnementales modulent la reproduction du vecteur et la transmission du bacille de la peste. Le porteur retient ce stade parce que la peau des souriceaux est fine et glabre, et parce que leur perception de la douleur, présente dès la naissance, ne serait selon lui encore que partiellement intégrée, ce qui limite les réponses comportementales visibles.

Objectifs

La peste est une maladie mortelle transmise par les puces. Les conditions environnementales influencent sa dynamique, mais les facteurs impliqués et leurs effets réels restent mal documentés. Ce projet vise à recenser les facteurs biotiques et abiotiques qui modulent la dynamique de la peste. Il s’intéresse en particulier à leur impact sur la reproduction des puces et sur la transmission du bacille de la peste. L’objectif est également d’identifier les mécanismes moléculaires associés aux phénomènes observés. Les résultats obtenus permettront d’éclairer les liens entre environnement, physiologie vectorielle et dynamique épidémique, d’améliorer les modèles prédictifs, de contribuer au développement de nouvelles contremesures, et de mieux comprendre les conditions ayant conduit à la disparition de la peste en Europe ainsi que les risques de réémergence.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier les conditions environnementales qui influencent la dynamique de la peste, en particulier en modifiant la physiologie et la compétence vectorielle des puces. Il contribuera à une meilleure compréhension des mécanismes biologiques sous-jacents à la transmission de Yersinia pestis, grâce à des approches multiomiques ciblant la réponse de la puce au pathogène. Ces résultats permettront de renforcer les modèles prédictifs utilisés en santé publique pour évaluer les risques de réémergence de la maladie, notamment dans les zones anciennement touchées. A terme, le projet pourra contribuer au développement de nouvelles stratégies de surveillance ou de lutte contre les vecteurs, voire même les protéger.

Procédures

Les animaux seront exposés une seule fois au contract de puces pendant une durée d'heure.

Impact sur les animaux

L’exposition aux puces peut entraîner deux types de nuisance. D’une part, les piqûres elles-mêmes, atténuées par les propriétés analgésiques et anti-inflammatoires de leur salive. D’autre part, la perte sanguine liée à l’alimentation des insectes. Lors d’expositions avec un nombre limité de puces, la quantité de sang prélevée demeure faible et n’entraîne pas d’effet physiologique observable dans nos conditions. A l’inverse, lors du nourrissage de colonies établies sur souriceaux, l’alimentation simultanée d’un très grand nombre de puces provoque une perte de sang importante, conduisant rapidement à une perte de conscience puis au décès très rapide. Dans ce contexte, la phase consciente est brève et la perception nociceptive potentielle reste transitoire.

Devenir

Quel que soit la procédure, les animaux ne seront pas maintenus en vie après leur utilisation. Leur prise en charge en fin de protocole est strictement encadrée et conforme aux exigences sanitaires et réglementaires en vigueur, afin d’éviter tout risque de contamination croisée et de garantir la sécurité des installations expérimentales.

Remplacement

A ce jour, il n’existe aucun modèle in vitro capable de reproduire le cycle biologique complet des puces ni leurs interactions physiologiques avec un hôte. Les puces sont des insectes hématophages stricts, et la prise de repas sanguin constitue un déclencheur physiologique essentiel à leur développement, leur reproduction et leur ponte. Ce processus dépend non seulement de la disponibilité du sang, mais aussi de signaux sensoriels et hormonaux issus du contact avec un hôte vivant. L’utilisation de systèmes artificiels de nourrissage, comme des membranes synthétiques, reste inadaptée à notre contexte expérimental. Ces dispositifs ne permettent ni une alimentation efficace ni une reproduction stable chez les espèces ciblées ici. Ils exposent également les puces à des anticoagulants et à des contaminations bactériennes ou fongiques, nécessitant l’ajout d’antimicrobiens qui altèrent leur physiologie et compromettent la validité des données. Enfin, il n’existe actuellement ni lignée cellulaire, ni modèle substitutif permettant de reconstituer ex vivo les interactions complexes entre la puce et son hôte.

Réduction

L’utilisation de souriceaux permet de nourrir un grand nombre de puces tout en mobilisant un nombre réduit d’animaux. Un seul souriceau remplace le volume sanguin obtenu par 4 à 5 souris adultes dans un système artificiel équivalent. Cette approche contribue significativement à la réduction du nombre total d’individus utilisés. Notre stratégie expérimentale a également été conçue pour limiter le recours aux animaux, tout en maintenant la robustesse scientifique du modèle. Tout d’abord, nous avons choisi de travailler avec une souche de puce dont le cycle biologique permet un nourrissage bihebdomadaire, contrairement à d’autres espèces qui nécessitent un nourrissage tous les deux jours à minima. Ce choix permet de réduire sensiblement le nombre de souriceaux requis. Nous avons également fait le choix de collecter les œufs produits et d’en suivre directement le devenir, plutôt que de suivre l’évolution complète d’une colonie à partir d’adultes. Cette stratégie permet d’obtenir des données équivalentes sur le développement dans les litières, tout en évitant un nourrissage sur animaux. Notre approche réduit donc très significativement l’utilisation d’animaux. Nous regroupons autant que possible plusieurs tests en présence d’une condition témoin. Enfin, lors des études de caractérisation des puces, nous nous efforcerons de maximiser les données obtenues à partir d’un seul nourrissage lorsque cela est scientifiquement possible, notamment pour l’évaluation du taux d’engorgement et de la quantité de sang ingéré.

Raffinement

Plusieurs mesures ont été intégrées pour minimiser la contrainte associée aux nourrissages. Les souriceaux seront exposés sans contention, pendant une durée limitée à une heure. Ce choix contribue au raffinement en réduisant stress et douleur. Les stades utilisés (2 à 5 jours) correspondent à une période de développement où la perception nociceptive est présente, mais encore partiellement intégrée, ce qui limite la réponse comportementale complexe. Des observations seront menées pendant et après l’exposition afin de détecter tout signe de souffrance (vocalisation, évitement, apathie). Enfin, les puces injectant naturellement des molécules salivaires aux propriétés analgésiques et anti-inflammatoires, cette particularité constitue une forme de raffinement biologique supplémentaire. Des points limites adaptés ont été définis pour chaque procédure afin de permettre l’identification précoce de signes de souffrance justifiant l’interruption de l’expérimentation et l’euthanasie immédiate de l’animal.

Choix des espèces

L’espèce choisie est la souris (Mus musculus), qui constitue un hôte naturel ou compatible pour de nombreuses espèces de puces ciblées par le projet. Elle est couramment utilisée pour le nourrissage de puces en contexte expérimental, notamment dans les protocoles publiés pour les espèces du genre Xenopsylla. Son statut d’espèce modèle, sa physiologie bien connue, et sa compatibilité avec les besoins alimentaires des puces en font un choix scientifiquement pertinent et largement validé pour ce type de protocole. Souriceaux âgés de 2 à 5 jours. Il s’agit du stade privilégié pour les nourrissages expérimentaux. A ce stade, les souriceaux sont glabres, leur peau est fine, et leur système nerveux est encore en développement. Bien que la perception nociceptive soit présente dès la naissance, son intégration centrale est partielle, ce qui limite la réponse comportementale complexe. Lorsqu’ils sont exposés à un grand nombre de puces (>1000), l’exsanguination entraîne une perte rapide de conscience suivi du décès rapide. La perception nociceptive potentielle est intense mais très transitoire, et ne s’accompagne d’aucun signe comportemental prolongé. Par ailleurs, l’utilisation de souriceaux permet de réduire significativement le nombre total d’animaux utilisés: un seul individu alimente les puces alors qu’il faudrait 4 à 5 souris adultes nécessaires pour obtenir un volume sanguin équivalent lors d’un nourrissage artificiel. La faible pilosité des souriceaux permet également de limiter les risques de fuite des insectes, ce qui sécurise la procédure. Ces animaux seront exposés sans contention, pendant une durée maximale d’une heure, ce qui réduit le stress. Ce stade est également optimal pour les puces, en raison de la vascularisation cutanée. Leur utilisation répond donc à la fois aux objectifs scientifiques et au principe de raffinement.

Deux heures de course sur tapis roulant, des injections intramusculaires quotidiennes pendant quatre jours, dix prises de sang au bout de la queue et cinq jours d'hébergement isolé : 4 320 souris vont être utilisées, toutes tuées pour récolter des tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 480 d'entre elles et modéré pour 3 840 autres. Certaines reçoivent quatre semaines d'alimentation enrichie en graisses, d'autres passent par l'imagerie optique et la résonance magnétique. Le porteur présente le bien-être des animaux non-humains comme une priorité et met lui-même le mot "confort" entre guillemets, tout en décrivant des micro-lésions musculaires et une inflammation du muscle un à deux jours après chaque injection. L'effectif de 4 320 animaux repose sur des études antérieures et des tests préliminaires, sans qu'aucun calcul soit détaillé, pour un projet portant sur deux facteurs de croissance de la régénération musculaire.

Objectifs

L'activité physique est reconnue pour ses effets bénéfiques sur la santé et son rôle dans la prévention de certaines maladies. Avec l'âge, la perte de force et de masse musculaire peut réduire l'autonomie des individus. Le maintien d'un bon fonctionnement musculaire, notamment grâce à l'exercice, contribue à préserver la mobilité et l'indépendance des personnes âgées. Dans nos travaux, nous avons étudié des substances produites par les muscles lors de l'exercice, qui pourraient jouer un rôle dans la régénération musculaire. Deux d’entre elles semblent particulièrement impliquées dans ce processus et pourraient avoir un effet bénéfique sur la récupération musculaire après un effort ou une blessure. Afin de mieux comprendre son rôle, nous avons développé des animaux transgéniques, permettant d'observer son action dans un organisme vivant. L'objectif de ce projet est d'explorer comment ces mécanismes pourraient être utilisés pour améliorer la santé musculaire, en particulier chez les personnes âgées ou celles souffrant de maladies affectant les muscles. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs, en fonction du matériel qui est à disposition dans les établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment les muscles se réparent après un effort ou une blessure. Il s'intéresse particulièrement à certaines substances produites par l'organisme qui pourraient jouer un rôle clé dans ce processus. Pour cela, des études sont menées sur des animaux transgéniques afin d'observer leur impact sur la récupération musculaire. En intégrant des facteurs comme l'âge et le sexe, cette recherche permettra d'affiner les approches existantes pour étudier la régénération musculaire, avec une meilleure prise en compte des situations rencontrées dans la réalité. À terme, ces travaux pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour préserver la force musculaire et lutter contre les effets du vieillissement sur les muscles. Ils pourraient aussi avoir des applications pour certaines maladies qui altèrent la masse et la fonction musculaire.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, différents types d'interventions pourront être soumis aux animaux en fonction de la procédure à laquelle ils sont ratachés. Voici les différents types d'interventions : un hébergement individuel pendant cinq jours ; des injections uniques ou quotidiennes sur une durée de quatres jours, n’excédant pas 10s par injections ; 10 prélèvements sanguins sur animal vigile à l’extremité de la queue n’excédant pas deux min ; une alimentation enrichie en lipides durant maximum 4 semaines consécutives ; un seul exercice sur tapis de course d’une durée de 2h maximum ;placées une fois dans un système d’imagerie optique pendants 5mins ; placées une fois dans un appareil de mesure par résonance magnétique nucléaire pendants 2mins.

Impact sur les animaux

Certaines étapes de ce projet peuvent entraîner un inconfort temporaire pour les animaux : L’hébergement individuel peut causer un stress aux animaux. Les injections nécessaires pour l’étude peuvent provoquer une douleur locale et une inflammation passagère au niveau du muscle durant un à deux jours. De même, l’administration des molécules étudiées peut entraîner un inconfort léger et temporaire (légère inflammation dû à l'injection dans le muscle). Les exercices physiques réalisés sur tapis roulant peuvent entraîner des micros lésions musculaires, associées à un inconfort modéré pendant quelques jours. Les tests fonctionnels, comme la course ou l’évaluation de la force musculaire, peuvent également induire un stress temporaire, mais ils restent non invasifs. Un régime alimentaire particulier, plus riche en graisses, est utilisé dans certaines expériences. Bien qu’il puisse entraîner une prise de poids, celle-ci reste contrôlée pour ne pas affecter la mobilité des animaux. Enfin, certains tests nécessitent des prélèvements sanguins ou des mesures comporelles. Les prises de sang, réalisées peuvent générer un stress modéré. Les mesures de composition corporelle demandent un bref placement des souris dans un dispositif de contention, provoquant un stress léger qui ne dure que quelques minutes.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récolter des tissus d'intérêts.

Remplacement

Avant de recourir à des modèles animaux, différentes approches ont été explorées pour étudier la régénération musculaire. Des expériences en laboratoire sur des cellules musculaires ont permis d’analyser certains mécanismes impliqués dans ce processus. De plus, des analyses informatiques ont aidé à identifier des molécules potentiellement impliquées dans la réparation des muscles. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de reproduire toute la complexité des interactions qui se produisent dans un organisme vivant. C'est pourquoi l'utilisation de modèles animaux reste nécessaire pour mieux comprendre comment les muscles se régénèrent et comment certaines substances pourraient aider à améliorer ce processus. Tout au long du projet, le recours aux animaux est strictement encadré et limité au minimum nécessaire. Leur bien-être est une priorité, et toutes les mesures sont prises pour réduire leur inconfort.

Réduction

Ce projet a été conçu pour utiliser le moins d'animaux possible, tout en garantissant des résultats fiables. Le nombre d'animaux a été déterminé sur la base d'études précédentes et de tests préliminaires, afin de s'assurer que chaque expérience apporte des informations précises tout en limitant leur recours. Pour réduire encore davantage le nombre d’animaux nécessaires, des analyses informatiques ont été réalisées en amont afin de mieux cibler les molécules d’intérêt. De plus, si certains résultats sont obtenus plus rapidement que prévu, les tests seront ajustés afin d’éviter toute utilisation inutile d’animaux. Tout au long du projet, une attention particulière est portée à l’optimisation des protocoles afin de concilier progrès scientifique et respect du bien-être animal.

Raffinement

Le bien-être des animaux est une priorité dans ce projet. Ils seront surveillés chaque jour par des professionnels afin de détecter rapidement tout signe d'inconfort. Leur poids, un des reflets de la bonne santé de l’animal, sera contrôlé chaque semaine . Les souris seront hébergées en petits groupes dans des cages adaptées, avec du matériel leur permettant d’exprimer leur comportement naturel (papier, bâtonnets de bois, abris). Elles ne seront pas isolées, sauf si cela est strictement nécessaire pour certaines expériences, et elles resteront toujours en contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Dans le cadre de transport, les animaux sont transportés selon une charte de transport définie par la zootechnie de départ et garantissant le bien-être des animaux. Ils sont transportés dans leur cage d'origine avec leurs congénères pour éviter tout stress supplémentaire pendant le transport. Les interventions prévues dans ce projet ont été soigneusement étudiées pour limiter leur impact. La majorité des injections sera réalisée sous anesthésie et avec des dispositifs permettant d'assurer le « confort » des animaux. De même, les exercices physiques seront adaptés aux capacités des animaux afin d'éviter toute contrainte excessive. Les animaux hébergés individuellement recevront le maximum d’enrichissement comme il est le cas dans leur cage d’origine, ici la roue d’activité est également considéré comme un enrichissement en plus pour les animaux. De plus, des grilles de scoring ont été faites pour chaque procédure afin d'établir des points limites important au bien être des animaux.

Choix des espèces

Ce projet utilise la Souris comme modèle d’étude, car il s’agit de l’animal le plus couramment étudié en recherche biomédicale. Son organisme présente des similitudes avec celui de l’être humain, ce qui permet d’obtenir des résultats pertinents pour mieux comprendre certains mécanismes biologiques. Pour que ces recherches soient encore plus représentatives, différents paramètres sont pris en compte, comme l’âge (3mois et 24mois), le sexe (mâle et femelle) et l’alimentation des animaux. De plus, certaines souris utilisées dans ce projet ont été modifiées génétiquement afin d’étudier plus précisément le rôle de certains gènes impliqués dans la régénération musculaire.

Cent prestations de reproduction assistée et de congélation d'embryons commandées par des laboratoires : 10 700 rats vont être utilisés en cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 10 000 d'entre eux et modéré pour 700 autres. Les femelles donneuses reçoivent deux injections d'hormones à quarante-huit heures d'intervalle pour produire un maximum d'embryons, puis sont tuées pour les récupérer. Les mâles sont vasectomisés et les femelles receveuses subissent une laparotomie d'implantation, avec une douleur abdominale et un risque de mort sous anesthésie. Les mâles vasectomisés sont utilisés pendant dix-huit mois puis tués, leur "efficacité" s'affaiblissant au-delà, les receveuses sont autopsiées après avoir élevé et sevré leurs petits, et seule une partie des jeunes est expédiée au chercheur commanditaire.

Objectifs

La reproduction assistée est utilisée chez le rat pour produire des modèles murins utilisables par la communauté scientifique dans les domaines de la recherche fondamentale, biomédicale, pharmaceutique et préclinique. Afin d’assurer la reproductibilité des études et garantir les résultats obtenus, il est indispensable d’utiliser des modèles génétiquement contrôlés et aux statuts sanitaires conformes aux standards européens. La reproduction assistée est également utilisée dans les élevages pour synchroniser les naissances dans le but d’obtenir des lots d’animaux génétiquement identiques et au même âge (cohortes) pour des besoins expérimentaux. Nous proposons également à la communauté scientifique la possibilité de cryoarchiver sous forme d’embryons leurs lignées. La congélation d’embryons est essentielle pour préserver les modèles de recherche de différents aléas (problème d’élevage, perte de la lignée, dérive génétique, etc.) et permet de réduire le nombre d’animaux utilisés uniquement pour le maintien des colonies. La congélation de lignées permet également de distribuer les lignées sous forme d'embryons congelés en remplaçant le transport d’animaux vivants.

Bénéfices attendus

Les techniques de cryoconservation et reproduction assistée contribuent concrètement aux principes des 3Rs (Réduire, Raffiner, Remplacer) en limitant au maximum la préservation de lignées sous forme respirante et le recours aux accouplements superflus. De plus, l’archivage de lignées en facilite l’accès à l’ensemble de la communauté scientifique, contribuant ainsi à mutualiser l’utilisation d’animaux en optimisant les ressources existantes. Ces techniques permettent aux chercheurs d’utiliser des animaux au statut sanitaire souhaité et génétiquement contrôlés dans le but d’assurer la reproductibilité et la fiabilité de leurs études.

Procédures

Injection sur animaux vigiles : 1 intra-péritonéale d'anesthésique (2 secondes par animal) ou 2 intra-péritonéales d'hormones à 48h d'intervalle. Injection sur animaux déjà anesthésiés : 1 sous-cutanée pré-opératoire d’analgésique (2 secondes par animal) puis une sous-cutanée post-opératoire d’analgésique (2 secondes par animal). Chirurgie ne dépassant pas 10 minutes par animal : vasectomie ou laparotomie pour implantation embryonnaire.

Impact sur les animaux

Les nuisances et les effets indésirables sont liés essentiellement aux injections (superovulation de femelles donneuses) ou à la chirurgie (réimplantation d’embryons sur femelles receveuses et vasectomie de mâles) : douleur ou rougeur sur le lieu d'injection ou d'incision/suture, douleur abdominale suite à la chirurgie, mortalité pendant l'anesthésie. Certaines prestations pourront impliquer l'utilisation d'animaux à phénotype potentiellement dommageable ou induire la naissance d'animaux à phénotype dommageable. Dans ce cas, nous tiendrons compte des recommandations de raffinements propres au modèle, décrites dans les procédures pour leurs élevages.

Devenir

La majorité des animaux issus de ce projet seront mises à mort à la fin de la réalisation de chaque procédure. Les mâles vasectomisés seront utilisés pendant 18 mois pour générer des femelles pseudogestantes puis mis à mort car au-delà de cet âge, leur "efficacité" s'affaiblit. Les femelles superovulées sont mises à mort afin de récupérer les embryons d'intérêt. Les femelles receveuses sont laissées en vie après la chirurgie implantatoire pour donner naissance aux petits, les élever et les sevrer. Ces femelles sont ensuite adressées au service de diagnostic microbiologique afin d'effectuer une autopsie et vérifier la conformité sanitaire des petits avant leur utilisation pour des projets de recherche. Seulement une partie de petits seront gardés en vie et transférés dans une zone d'hébergement de l’EU ou expédiés au chercheur ayant fait la demande de prestation.

Remplacement

L'objectif du projet est de cryopréserver ou de redériver/revivifier un modèle animal. De ce fait, aucun remplacement n'est possible parce qu’à ce jour, pour le cryoarchivage ou la reproduction assistée d’une lignée de rat, il n’y a pas d’autre alternative que l’utilisation d’animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux prévu a été calculé afin de pouvoir réaliser un volume de 100 prestations sur 5 ans en utilisant le nombre d'animaux minimum nécessaire. L’utilisation de lots homogènes d’animaux (âge, génotype et statut sanitaire) permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés, optimise les résultats obtenus et évite notamment les répétitions. La superovulation permet d’obtenir un maximum d’embryons en réduisant le nombre de femelles utilisées. Ces femelles seront réutilisées si elles ne présentent pas de bouchon vaginal. De plus, un tri des embryons sous microscope est réalisé avant le transfert, il consiste en la sélection des embryons au préalable selon leur morphologie pour augmenter la probabilité de viabilité de ces derniers. Pour les cryopréservations de lignées, dans la mesure du possible les chercheurs nous fournissent de jeunes mâles bons reproducteurs afin d'utiliser le moins possible d'animaux pour chaque lignée cryopréservée. Les mâles sont mis régulièrement en accouplement avec des femelles produites dans notre EU ou fournies par les autres EU.

Raffinement

Les animaux sont hébergés si possible en groupe social et ont à disposition trois types d’enrichissement (refuge, matériaux de nidification et de rongeage). Au vu de la douleur estimée comme modérée (incision lombaire inférieure à 1cm et temps d’intervention inférieur à 5 min), on estime que l’analgésie doit durer 24h post-chirurgie. Le protocole appliqué est une anesthésie par voie intrapéritonéale (IP) et une fois l’animal endormi, une injection sous-cutanée (SC) d'analgésique est effectuée. A la fin de la chirurgie, une injection sous-cutanée d'antidouleur est effectuée. Pour les animaux ayant subi une microchirurgie (les mâles vasectomisés et les femelles après réimplantations d’embryons), un suivi post-opératoire avec grille de scoring est réalisé à +1h, +4h et +24h après intervention, avec prolongation possible à +48h et +72h. Dans le cas où des animaux à phénotype dommageable seraient utilisés dans ce projet, nous tiendrons compte des recommandations de raffinements propres au modèle. L’expérience de notre EU dans la reproduction assistée et la cryoconservation de lignées nous permet d’optimiser nos pratiques.

Choix des espèces

Le rat est la quatrième espèce animale la plus utilisée à des fins scientifiques en France (source : enquête statistique 2023). De ce fait, les prestations de service sur ce modèle sont de plus en plus demandées par les chercheurs utilisateurs de notre plateforme. Les femelles sont utilisées à partir de 3 semaines pour la superovulation. Les mâles vasectomisés doivent être matures sexuellement (à partir de 7-8 semaines) pour les accouplements contrôlés, ainsi que les femelles pseudo gestantes réimplantées.

3 584 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 224 d'entre elles et modéré pour 2 360 autres. La plupart sont des souriceaux de deux à cinq jours, exposés une heure sans contention à des puces qui se nourrissent de leur sang. Quand la colonie dépasse mille puces, le porteur décrit une perte de sang importante conduisant à une perte de conscience puis à la mort du souriceau, et qualifie la perception de la douleur d'intense mais très transitoire. Il présente la salive analgésique des puces comme un "raffinement biologique supplémentaire", et affirme qu'un seul souriceau remplace quatre à cinq souris adultes dans un système de nourrissage artificiel, qu'il juge inadapté.

Objectifs

Les puces constituent un vecteur majeur de Yersinia pestis, l’agent responsable de la peste bubonique, une maladie mortelle. Bien que souvent négligée, la recherche sur la biologie des puces est essentielle pour comprendre la dynamique de la peste. Ce projet vise à étudier la contribution des cellules immunitaires (hémocytes) des puces à leur physiologie et à leur compétence vectorielle, à travers des études comparatives et fonctionnelles sur des populations de puces provenant de régions où la peste présente des prévalences contrastées. Il s’intéresse en particulier à l’impact des hémocytes sur la reproduction des insectes et sur la transmission du bacille de la peste. L’objectif est également d’identifier les mécanismes moléculaires sous-jacents aux phénomènes observés. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre les liens entre les hémocytes et les dynamiques épidémiques, d’améliorer les modèles prédictifs, de contribuer au développement de nouvelles stratégies de lutte, et d’éclairer les conditions ayant conduit à la disparition de la peste en Europe ainsi que les risques de réémergence.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer si et comment les hémocytes influencent la capacité de reproduction des puces et leur sensibilité au bacille de la peste. Il contribuera ainsi à une meilleure compréhension des mécanismes biologiques sous-jacents à la dynamique de la maladie. Les résultats obtenus renforceront les modèles prédictifs utilisés en santé publique pour évaluer les risques de réémergence, notamment dans les zones anciennement touchées. A terme, ce projet pourrait également contribuer au développement de nouvelles stratégies de surveillance ou de lutte ciblant les vecteurs.

Procédures

Les animaux seront exposés une seule fois au contact de puces pendant une durée d'heure

Impact sur les animaux

L’exposition aux puces peut entraîner deux types de nuisance. D’une part, les piqûres elles-mêmes, atténuées par les propriétés analgésiques et anti-inflammatoires de leur salive. D’autre part, la perte sanguine liée à l’alimentation des insectes. Lors d’expositions avec un nombre limité de puces, la quantité de sang prélevée demeure faible et n’entraîne pas d’effet physiologique observable dans nos conditions. A l’inverse, lors du nourrissage de colonies établies sur souriceaux, l’alimentation simultanée d’un très grand nombre de puces provoque une perte de sang importante, conduisant rapidement à une perte de conscience puis au décès très rapide. Dans ce contexte, la phase consciente est brève et la perception nociceptive potentielle reste transitoire.

Devenir

Quel que soit la procédure, les animaux ne seront pas maintenus en vie après leur utilisation. Leur prise en charge en fin de protocole est strictement encadrée et conforme aux exigences sanitaires et réglementaires en vigueur, afin d’éviter tout risque de contamination croisée et de garantir la sécurité des installations expérimentales.

Remplacement

A ce jour, il n’existe aucun modèle in vitro capable de reproduire le cycle biologique complet des puces ni leurs interactions physiologiques avec un hôte. Les puces sont des insectes hématophages stricts, et la prise de repas sanguin constitue un déclencheur physiologique essentiel à leur développement, leur reproduction et leur ponte. Ce processus dépend non seulement de la disponibilité du sang, mais aussi de signaux sensoriels et hormonaux issus du contact avec un hôte vivant. L’utilisation de systèmes artificiels de nourrissage, comme des membranes synthétiques, reste inadaptée à notre contexte expérimental. Ces dispositifs ne permettent ni une alimentation efficace ni une reproduction stable. Ils exposent également les puces à des contaminations bactériennes ou fongiques, nécessitant l’ajout d’antimicrobiens et d’anticoagulant qui altèrent leur physiologie et compromettent la validité des données. Enfin, il n’existe actuellement ni lignée cellulaire, ni modèle substitutif permettant de reconstituer ex vivo les interactions complexes entre la puce et son hôte.

Réduction

Nos approches expérimentales ont été conçues pour réduire significativement le recours aux animaux. (1) L’utilisation de souriceaux permet de nourrir un grand nombre de puces tout en mobilisant un nombre restreint d’animaux. Un seul souriceau fournit un volume sanguin équivalent à celui obtenu à partir de quatre à cinq souris adultes dans un système artificiel comparable, ce qui contribue à une diminution notable du nombre total d’animaux utilisés. (2) Notre expérience montre qu’il est possible d’interrompre le nourrissage des colonies pendant une semaine chaque mois sans compromettre leur survie, permettant ainsi de réduire la fréquence des nourrissages et, par conséquent, le nombre d’animaux nécessaires à leur maintien. (3) Nous avons également choisi de collecter des puces vierges d’âge similaire directement à partir des cocons présents dans les pots d’élevage pour les expériences de développement. Cette approche évite la mise en place de sous-colonies dédiées pendant deux mois, une méthode plus simple mais qui nécessiterait plusieurs centaines d'animaux. (4) Les expériences d’infection durent habituellement 27 jours. Nous avons choisi de les limiter à 20 jours, car notre expérience montre qu’il n’est plus nécessaire de prolonger les essais à 27 jours pour obtenir des données robustes et statistiquement fiables. Cette adaptation permet de réduire significativement le nombre de souris utilisées. (5) Dans la mesure du possible, nous maximisons également les données obtenues à partir d’une seule expérience, en regroupant plusieurs tests sous une même condition témoin.

Raffinement

Plusieurs mesures ont été intégrées pour minimiser la contrainte associée aux nourrissages. Les souriceaux seront exposés sans contention, pendant une durée limitée à une heure. Ce choix contribue au raffinement en réduisant stress et douleur. Les stades utilisés (2 à 5 jours) correspondent à une période de développement où la perception nociceptive est présente, mais encore partiellement intégrée, ce qui limite la réponse comportementale complexe. Des observations seront menées pendant et après l’exposition afin de détecter tout signe de souffrance (vocalisation, évitement, apathie). Enfin, les puces injectant naturellement des molécules salivaires aux propriétés analgésiques et anti-inflammatoires, cette particularité constitue une forme de raffinement biologique supplémentaire. Des points limites adaptés ont été définis pour chaque procédure afin de permettre l’identification précoce de signes de souffrance justifiant l’interruption de l’expérimentation et l’euthanasie immédiate de l’animal

Choix des espèces

L’espèce choisie est la souris (Mus musculus), qui constitue un hôte naturel ou compatible pour de nombreuses espèces de puces ciblées par le projet. Elle est couramment utilisée pour le nourrissage de puces en contexte expérimental. Son statut d’espèce modèle, sa physiologie bien connue, et sa compatibilité avec les besoins alimentaires des puces en font un choix scientifiquement pertinent et largement validé pour ce type de protocole. Souriceaux âgés de 2 à 5 jours. Il s’agit du stade privilégié pour les nourrissages expérimentaux. A ce stade, les souriceaux sont glabres, leur peau est fine, et leur système nerveux est encore en développement. Bien que la perception nociceptive soit présente dès la naissance, son intégration centrale est partielle, ce qui limite la réponse comportementale complexe. Lorsqu’ils sont exposés à un grand nombre de puces (>1000), l’exsanguination entraîne une perte rapide de conscience suivi du décès rapide. La perception nociceptive potentielle est intense mais très transitoire, et ne s’accompagne d’aucun signe comportemental prolongé. Par ailleurs, l’utilisation de souriceaux permet de réduire significativement le nombre total d’animaux utilisés: un seul individu alimente les puces alors qu’il faudrait 4 à 5 souris adultes nécessaires pour obtenir un volume sanguin équivalent lors d’un nourrissage artificiel. La faible pilosité des souriceaux permet également de limiter les risques de fuite des insectes, ce qui sécurise la procédure. Ces animaux seront exposés sans contention, pendant une durée maximale d’une heure, ce qui réduit le stress. Ce stade est également optimal pour les puces, en raison de la vascularisation cutanée. Leur utilisation répond donc à la fois aux objectifs scientifiques et au principe de raffinement.

Neuf jours de régime cétogène ou vingt heures de jeûne, une pesée quotidienne, une piqûre de la veine caudale tous les deux jours pour mesurer la glycémie, un gavage libérant des graisses dans le sang, puis un prélèvement à la veine sous-mandibulaire juste avant la mise à mort. 1 258 souris transgéniques vont être utilisées ainsi, toutes tuées pour prélever le sang et les organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour la moitié d'entre elles et modéré pour l'autre moitié. Le projet porte sur les interactions entre trois protéines du foie lors d'un afflux d'acides gras, dont le porteur attend "une contribution à la recherche biomédicale". Des points limites gradés portent sur le poids, l'apparence et le comportement, et il indique qu'un animal qui les atteint est retiré de la procédure et replacé en hébergement standard.

Objectifs

Le foie est un organe majeur qui est capable de s’adapter aux différents changements nutritionnels auxquels nous sommes exposés (période de jeûne, régime enrichi ou carencé en certains nutriments, …). Par exemple, lors d’un jeûne, le foie est le lieu de production du sucre nécessaire au fonctionnement de l’organisme en période de carence en nutriments. Cette grande capacité du foie à s’adapter à différents statuts nutritionnels est principalement assurée par des protéines spécifiques. Parmi ces protéines importantes lors de périodes de jeûne figure la protéine PPARa, qui est également importante lors de la consommation d’un régime cétogène (très riche en graisses et pauvre en sucres). Dans ce projet, pour étudier les interactions entre PPARa et 2 autres protéines lors d'un afflux d'acides gras arrivant au foie, nous générerons des souris dont le gène PPARa et le gène d’autres protéines ne sont plus fonctionnels dans le foie. Les animaux seront soumis à une période de jeûne ou à un régime cétogène ou traités avec une molécule pharmacologique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les différentes protéines qui sont impliquées lors du jeûne et de la consommation d’un régime cétogène, qui sont 2 interventions nutritionnelles actuellement étudiées pour leurs effets bénéfiques dans plusieurs pathologies. Ainsi, les résultats obtenus lors de ces expériences apporteront ainsi une contribution à la recherche biomédicale.

Procédures

Des groupes d’animaux seront nourris à volonté avec un régime standard ou un régime cétogène riche en graisses et pauvre en sucre pendant 2 semaines. MODIFICATION : durée du régime réduite à 9 jours. Les animaux seront pesés chaque semaine. MODIFICATION : pesée des animaux tous les jours. La glycémie sera mesurée chaque semaine (2 fois au total) par prélèvement d’une seule goutte de sang à la queue (petite piqûre de la veine caudale avec une lancette de 1 mm). La mesure ne nécessite pas de contention mais uniquement une prise en main de la queue et prend moins de 5 secondes. MODIFICATION : mesure de la glycémie tous les 2 jours. Juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la veine sous mandibulaire. D’autres groupes d’animaux seront nourris à volonté avec un régime standard ou mis à jeun pendant 20h. Après les 20h de jeûne et juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la veine sous mandibulaire. D’autres groupes d’animaux seront traités par gavage avec une molécule pharmacologique permettant la libération d’une grande quantité de graisses dans la circulation sanguine. Le gavage prend moins de 30 secondes. Six heures après et juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la veine sous mandibulaire.

Impact sur les animaux

Le jeûne peut induire une baisse de la glycémie et de la température corporelle. Le régime cétogène peut induire une perte de poids et une baisse de la glycémie. MODIFICATION : le régime cétogène peut induire une diminution de la prise alimentaire conduisant à une réduction de la mobilité. La piqûre de la queue pour prélever la goutte de sang peut entraîner une légère douleur. Le prélèvement de sang terminal peut entraîner un stress des animaux lié à la contention et une légère douleur. Le gavage peut entraîner un stress des animaux.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique.

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation de l’animal entier car les réponses de l’organisme engendrées par les interventions pharmacologiques nutritionnelles (jeûne et régime cétogène) étudiées sont complexes et ne peuvent pas être mimées avec fidélité en culture cellulaire. En effet, plusieurs organes de l'organisme communiquent entre eux. L’utilisation de souris transgéniques de laboratoire est appropriée car il est possible d'étudier le rôle de protéines spécifiques.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement (hébergement collectif, environnement contrôlé, enrichissements du milieu de vie). Les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Une crème anesthésiante sera appliquée sur la queue de l'animal avant la piqûre permettant de prélever une goutte de sang. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons les consommations alimentaire et hydrique. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres. Si un critère d'arrêt est atteint, l'animal sera retiré de la procédure et replacé en conditions d’hébergement standard après examen par la vétérinaire référente.

Choix des espèces

L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.