Procédures légères

Tuées à trois mois et demi pour prélever leur moelle épinière, 512 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. L'équipe injecte un vecteur viral dans leur moelle épinière, provoque une lésion médullaire, puis mesure leur marche pendant sept semaines. Les tâches locomotrices ne sont pas détaillées, et le porteur ne retient de la lésion que la douleur, l'infection et le stress. Sur les 512 souris déclarées, il en compte 44 comme "animaux expérimentaux", et indique par ailleurs que les souris n'ayant pas le bon phénotype sont tuées à l'issue du tatouage et du génotypage.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer dans quelle mesure la réorganisation des circuits neuronaux au sein de la moelle épinière peut permettre d'améliorer la récupération neurologique au décours d'une lésion médullaire. Nous testerons dans cette étude une stratégie visant à renforcer la plasticité des circuits neuronaux dans la moelle épinière.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mesurer la récupération locomotrice induite par un renforcement de la plasticité des circuits spinaux au décours d'une lésion médullaire. A plus long terme, ces résultats permettront d'envisager des stratégies thérapeutiques translationnelles chez des patients blessés médullaires.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes, toutes réalisées à l'âge adulte : injection du vecteur viral dans la moelle épinière puis réalisation d'une lésion médullaire ; réalisation de tâches locomotrices et évaluation de la marche pendant 7 semaines ; euthanasie pour prélèvement de la moelle épinière.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent expérimenter des effets secondaires aux procédures chirurgicales (douleur, infection) et à l'évaluation comportementale (stress).

Devenir

Les animaux n'ayant pas le bon phénotype seront euthanasiés à l'issue du tatouage/génotypage. Les animaux expérimentaux seront euthanasiés à 3.5 mois en vue du prélèvement post-mortem de la moelle épinière.

Remplacement

Ce projet ayant pour objectif d'évaluer la récupération locomotrice au décours d'une lésion médullaire in vivo, le recours à des alternatives au modèle animal (lignées cellulaires, simulations, etc) est impossible.

Réduction

Le nombre d'animaux sera réduit au minimum nécessaire à l'obtention d'un nombre statistiquement suffisant pour réaliser une analyse comportementale et transcriptomique robuste. Une analyse statistique du nombre d'animaux nécessaires conduit à un total de 44 animaux expérimentaux pour l'étude.

Raffinement

L’ensemble des expériences de lésions et d’injections seront réalisées sous anesthésie générale. La température des animaux sera maintenue à l'aide d’un tapis chauffant et des antalgiques seront administrés en pré et post-opératoire. Une observation attentive sera effectuée après réveil de l’animal (prise de poids quotidienne et analyse de la douleur). Si l’animal présente un état physiologique anormal (douleurs persistantes, perte de poids), l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle en raison de la nécessité de réaliser ces expériences in vivo, et des nombreuses recherches menées et à venir sur les circuits spinaux et l'intégration proprioceptive chez cette espèce. L'utilisation d'un modèle murin nous permettra de comparer directement nos résultats avec ceux d'études antérieures réalisées dans notre laboratoire et ailleurs. Nous utiliserons exclusivement des animaux adultes pour les procédures expérimentales. L'utilisation d'animaux adultes se justifie par : la nécessité de réaliser une injection intraspinale puis du délai nécessaire à la diffusion puis expression du transgène ; et la nécessité de réaliser une évaluation comportementale avec un suivi longitudinal.

La pose d'un cathéter sous-cutané, qui peut entraîner des douleurs, concerne environ la moitié des souris et des rats, et un petit nombre d'entre eux subit une chirurgie sous anesthésie profonde pour recevoir un agent de contraste dans le cerveau, sans réveil. 200 souris et 100 rats, 300 individus au total, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, avec une à quatre séances d'imagerie en contention, chacune de deux heures trente au maximum. Tous sont tués après la dernière séance pour prélever leur cerveau. Le porteur qualifie pourtant l'IRM de "méthode indolore et non invasive", après avoir décrit un risque d'hypothermie sous anesthésie prolongée, un inconfort de positionnement et un léger risque de saignement pendant la chirurgie.

Objectifs

En neurosciences, les études précliniques menées avec des modèles rongeurs sont souvent réalisées pour identifier des « signatures » - des biomarqueurs – des mécanismes cérébraux sains ou pathologiques pour envisager un transfert vers une recherche clinique. L’Imagerie par résonance magnétique (IRM) préclinique constitue un outil majeur pour l’étude des pathologies neurodéveloppementales, neurologiques et psychiatriques, car elle offre une exploration non invasive de multiples paramètres fonctionnels et anatomiques du cerveau des modèles étudiés. Il existe plusieurs modalités d’IRM, chacune ayant ses spécificités et permettant la caractérisation de paramètres précis mais restreints et une modalité utilisée seule ne permet souvent pas d’identifier un biomarqueur. Afin d’optimiser la découverte de biomarqueurs d’intérêt et de favoriser des translations vers la clinique à partir de modèles de pathologies cérébrales, nous proposons de combiner plusieurs modalités d’IRM – on parle d’IRM multimodale – pour offrir une vue d’ensemble détaillée et dynamique des processus biologiques au sein du cerveau d’un modèle rongeur : en multipliant les grilles de lecture, nous sommes capables, pour un modèle rongeur donné, d’évaluer la structure cérébrale, la connectivité fonctionnelle et les profils métaboliques. Nous pouvons ainsi identifier et comparer des biomarqueurs d’intérêt et suivre leur évolution longitudinale. Les modalités d’IRM utilisées dans ce protocole sont multiples et complémentaires : - IRM anatomique pour visualiser les structures cérébrales, offrant ainsi une vue détaillée de l’intégrité structurale du cerveau. - IRM fonctionnelle (IRMf) pour étudier l’activité neuronale et la connectivité fonctionnelle et ainsi obtenir des informations sur les réseaux neuronaux et leurs interactions en réponse à des stimuli. - Spectroscopie par résonance magnétique (MRS) pour étudier le métabolisme cérébral et donc comprendre les mécanismes sous-jacents aux maladies neurologiques et psychiatriques. - Imagerie par transfert de saturation d’échange chimique (CEST) pour détecter des biomarqueurs moléculaires spécifiques. MODIFICATION Une injection dans le cerveau d'un agent de contraste est proposée, pour certains projets, afin d'améliorer la visualisation de l'espace périvasculaire en imagerie post-mortem, notamment pour les pathologies impliquant une altération du système glymphatique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont nombreux et couvrent plusieurs domaines de la recherche en neurosciences et en imagerie médicale. Nous pouvons identifier notamment : - L’amélioration de la compréhension des maladies neurologiques et psychiatriques. - L’identification de biomarqueurs. - Le suivi longitudinal des maladies. - L’optimisation des modèles animaux. - La translation vers l’imagerie clinique.

Procédures

Pendant les sessions d’IRM, un système de contention adapté sera employé pour assurer l’immobilisation des animaux indispensable à la qualité des acquisitions. les animaux seront placés sous anesthésie gazeuse . Chaque animal pourra subir de 1 à 4 séances d’imagerie selon le projet et le type de modèle : les modèles neurodéveloppementaux ou neurodégénératifs nécessitent généralement des suivis longitudinales, tandis que les autres projets prévoient une seule séance. Un intervalle d’au moins deux semaines sera respecté entre les séances pour limiter le stress. Pour les animaux destinés aux sessions d’IRM fonctionnelle un cathéter en sous-cutané sera placé pour l’administration d’un anesthésique ou d’un tranquillisant médicamenteux, l’anesthésie gazeuse n’étant pas adaptée à ce type d’examen. Cela concernera environ la moitié des animaux. Chaque session IRM n’excédera pas 2 heures et demi. Pour un nombre limité des animaux, une chirurgie sera réalisée sous anesthésie profonde afin d'injecter un agent de contraste en intraventriculaire, sans réveil de l'animal.

Impact sur les animaux

La pose d’un cathéter en sous-cutané pourra entraîner des douleurs. Le positionnement nécessaire pour l’imagerie peut être inconfortable. L’IRM peut induire un stress lié à la manipulation et à l'immobilisation prolongée sous anesthésie. L’examen lui-même n’est pas douloureux, mais la préparation et le maintien immobile de l’animal peuvent entraîner un léger stress. . Une anesthésie prolongée présente un risque d’hypothermie. Un léger risque de saignement pendant la chirurgie est possible.

Devenir

A l’issue de la dernière session IRM, tous les animaux seront euthanasiés pour récupérer leur cerveau pour des études ex vivo indispensables pour confirmer la validité des biomarqueurs qui seront identifiés au cours de l’étude

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes physiopathologiques et tester de nouvelles approches thérapeutiques.

Réduction

L’application combinée d’imageries anatomiques, fonctionnelles et métaboliques permet une caractérisation plus complète que chaque technique isolée. Le recours à l’IRM multimodale contribue également à la réduction du nombre d’animaux utilisés, en multipliant les mesures obtenues sur un même individu. Nous avons déterminé le nombre d’animaux en fonction des nécessités d’effectifs pour réaliser des statistiques significatives. Cela a été possible grâce aux expériences réalisées précédemment sur les modèles de souris et de rat. L’IRM qui est une méthode indolore et non invasive, permet d’examiner de nombreux paramètres sur un même animal, réduisant ainsi considérablement le nombre d’animaux et d’expériences nécessaires pour obtenir ces informations. Dans le cadre du présent projet plateforme, chaque projet utilisateur accueilli comprend plusieurs groupes expérimentaux, par exemple des animaux modèles et des animaux contrôles, éventuellement différenciés par âge, sexe ou type de modification génétique. Sur une année, la plateforme prévoyoit d’accueillir environ deux projets impliquant la souris et un projet impliquant le rat, chacun comportant 2 groupes de 10 animaux. Sur cinq ans cela correspond à un maximum de 200 souris et 100 rats. En tenant compte des différents groupes expérimentaux ainsi que des acquisitions longitudinales prévues, ce nombre d’animaux est justifié. Il permet de couvrir l’ensemble des besoins liés aux conditions expérimentales, d’assurer la robustesse des résultats obtenus et de réduire au strict minimum le nombre d’animaux utilisés, tout en maximisant les informations recueillies pour chaque individu.

Raffinement

Raffinement Le raffinement repose sur des procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, l’observation des signes cliniques et des points limites, ainsi que des soins post-anesthésiques adaptés. Anesthésie Avant chaque examen, les animaux seront anesthésiés par un opérateur qualifié afin d’éviter toute douleur ou stress. Selon le type de session, l’anesthésie sera réalisée sous forme gazeuse ou injectable. Pendant l’examen, les animaux resteront sous anesthésie et leur fréquence respiratoire sera surveillée en continu pour garantir leur sécurité. Chaque session d’IRM durera au maximum 2,5 heures. Après l’examen, les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil complet dans un environnement calme et chauffé. Immobilisation et réduction de l’inconfort Lors des séances d’IRM, la tête des animaux sera stabilisée à l’aide d’un dispositif de maintien adapté, afin d’éviter les mouvements pendant l’enregistrement des images. Pour limiter tout inconfort, une anesthésie locale sera appliquée avant la mise en place du dispositif. Maintien de la température corporelle Les animaux seront maintenus au chaud grâce à un tapis chauffant adapté, afin de prévenir toute hypothermie pendant la procédure.

Choix des espèces

Les fonctions cérébrales des rongeurs sont bien documentées, ce qui en fait des modèles de référence pour l’étude du cerveau. L’utilisation de rats et de souris adultes permet de reproduire plus fidèlement les mécanismes cérébraux observés chez l’adulte, notamment dans le cadre de modèles de pathologies neurologiques ou psychiatriques. Les expériences seront donc réalisées sur des souris adultes (18–35 g) et des rats adultes (150–250 g).

Vouées à être mises à mort pour des études histologiques, biochimiques et génétiques, 8 160 souris mutantes et témoins vont être produites, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune subit plusieurs contentions, une biopsie et trois à quatre injections, les souris porteuses de la mutation pouvant présenter une perte de poids et une posture anormale. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, augmenter la connaissance sur les mécanismes moléculaires du développement de cellules que le résumé ne nomme pas. Rien n'appuie l'effectif de 8 160 souris au-delà de stratégies d'accouplement calculées d'après des expériences antérieures et d'un nombre déclaré "réduit à son minimum".

Objectifs

La quasi-totalité des cellules qui pigmentent la peau, des cellules du système nerveux sont issus d’une structure bien spécialisée dans l’embryon. Une anomalie de développement ou de maintien de cette structure conduisent à des maladies chez l’homme, dont les causes sont incomplètement caractérisées. Grace à la génération des modèles de souris génétiquement modifiées, le projet permettra de déterminer le rôle d’un nouveau mécanisme moléculaire à l'origine de ces maladies.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est d’augmenter la connaissance scientifique sur les mécanismes moléculaires impliqués au cours du développement des cellules d’intérêt.

Procédures

Plusieurs contentions, une biopsie (quelques secondes), des injections (entre 3 et 4 ; environ 5 sec) seront réalisées.

Impact sur les animaux

La contention et la biopsie peuvent provoquer un stress chez l’animal. La biopsie peut provoquer une légère douleur. Les différentes injections entraineront un stress et une douleur légère au point d’injection (chaque injection dure environ 5 sec). Les souris mutantes pourront présenter une perte de poids et une posture anormale.

Devenir

L'ensemble des animaux mutants et contrôles générés sont voués à être mis à mort pour études histologiques biochimique et génétique.

Remplacement

Le recours à l’utilisation d’un modèle animal est indispensable afin de comprendre comment les mutations d’intérêts impactent le développement des cellules d’intérêt, en particulier les cellules qui pigmentent la peau et les cellules du système nerveux. L'étude des mécanismes impliqués ne peut pas être réalisée uniquement en culture car elle nécessite des interactions entre les différents types cellulaires et doivent être mesurés chez l'animal.

Réduction

Les stratégies d’accouplements ont été calculées selon des expériences antérieures pour générer un nombre suffisant d’animaux pour réaliser au mieux nos expériences. Le nombre de souris est réduit à son minimum. Des tissus seront collectés après mise à mort afin d’approfondir les études moléculaires, cellulaires et génétiques. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations.

Raffinement

Les points limites définis dans le projet seront strictement appliqués et la douleur sera limitée à son maximum. Une grille de score adaptée à la procédure a été mise en place. Pour limiter les nuisances/effets indésirables dues aux injections une aiguille fine sera utilisée.

Choix des espèces

Les mécanismes impliqués dans la formation des cellules qui pigmentent la peau, des neurones et des cellules gliales sont très conservés entre l'homme et la souris. En particulier, les phénotypes observés dans ces cellules après délétion d’un grand nombre de gènes sont très similaires dans les deux espèces. De plus, il existe un ensemble d’outils nécessaires à l’étude de ces cellules qui ont été développés quasiment exclusivement chez la souris. Les stades choisis (jour 18.5 de développement embryonnaire, naissance, jour 4, jour 30) pour l’étude correspondent à des phases précises de leur développement.

208 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent une injection par jour pendant cinq semaines, une mesure de glycémie hebdomadaire et des prélèvements de 70 microlitres de sang à la queue, précédés d'une privation de nourriture pour les tests métaboliques. Une perte de poids supérieure à 15 % déclenche la mise à mort du rat concerné. Les retombées annoncées pour les personnes diabétiques restent au stade de "candidats prometteurs", tandis que le porteur affirme que l'étude de l'inflammation associée au diabète ne peut se faire que sur "un organisme vivant dans son intégralité".

Objectifs

Le diabète de type 2 est une maladie complexe due à une combinaison de facteurs génétiques et de facteurs liés au mode de vie. Parmi ces derniers, on retrouve surtout une alimentation trop riche, le manque d’activité physique et le vieillissement. Dans cette maladie, le taux de sucre dans le sang reste trop élevé sur le long terme. Cela s’explique principalement par deux problèmes : d’une part, le pancréas ne produit pas suffisamment d’insuline, la seule hormone qui réduit le taux de glucose dans le sang, et d’autre part, l’organisme répond moins bien à l’insuline. Lorsque les cellules sont exposées trop longtemps à un excès de sucre, cela provoque des effets nocifs appelés « glucotoxicité ». Ce phénomène endommage de nombreuses cellules de l'organisme, en particulier celles du pancréas qui produisent l’insuline. Il favorise aussi l’apparition d’une inflammation chronique légère mais persistante. Cette inflammation joue un rôle important dans le mauvais fonctionnement des organes impliqués dans la régulation du sucre dans le sang, comme le pancréas et le foie. Ainsi, réduire l’inflammation, notamment au niveau des cellules du pancréas, afin de préserver leur bon fonctionnement, représente une piste à exploiter pour mieux traiter le diabète de type 2. Ce projet se situe dans la continuité des travaux en cours dans notre équipe et vise à explorer les effets de l'inhibition d'une enzyme dans les processus inflammatoires associés aux maladies métaboliques dans un modèle de rat diabétique. Cette étude sera réalisée à la fois chez le mâle et la femelle car il est important de déterminer si le traitement pharmacologique à l'inhibiteur peut améliorer l'état inflammatoire dans les deux sexes. Nous utiliserons le rat sain Wistar (mâle et femelle) comme contrôle.

Bénéfices attendus

Le bénéfice majeur de cette étude sera d’identifier les inhibiteurs d'une enzyme comme des candidats prometteurs pour le développement d’une pharmacothérapie ciblée chez les patients atteints de diabète de type 2. Nos travaux précédents ont mis en évidence les effets bénéfiques de ces inhibiteurs sur la prolifération des cellules bêta du pancréas qui sécrètent l'insuline ainsi que sur l’amélioration du métabolisme glucidique. Cette nouvelle étude permettra non seulement d’approfondir la compréhension du rôle de l'enzyme dans les processus inflammatoires associés au diabète, mais également de proposer une stratégie thérapeutique dite « curative » plus globale, visant à limiter la progression de la maladie par la réduction de l’inflammation chronique qui caractérise le diabète de type 2.

Procédures

Tous les animaux de la procédure 1 (64 rats) et de la procédure 2 (144 rats) subiront un prélèvement de la durée de quelques secondes d'un très petit volume sanguin pour mesurer leur glycémie 1 fois par semaine pendant 5 semaines et 2 prélèvements de 70 microlitres de sang à la queue pour le dosage d’insuline plasmatique (1 prélèvement au début du traitement et 1 prélèvement à la fin du traitement). Ce prélèvement dure moins d'une minute. Tous les animaux de la procédure 1 et 2 subiront des injections répétées de traitement pouvant engendrer une douleur légère (1 fois par jour pendant 5 semaines). Durant les tests métaboliques d'une durée de 2 heures, les animaux de la procédure 1 (64 rats) subiront une injection et 3 prélèvements à la queue de 70 µl de sang pour le dosage de l'insuline plasmatique et/ou la mesure de glycémie (prélèvement de la durée de moins d'une minute).

Impact sur les animaux

Notre modèle de rat diabétique présente une augmentation de la consommation hydrique et de l’excrétion urinaire. Cette manifestation est légère chez les femelles et modérée chez les mâles. Les animaux diabétiques présentent une espérance de vie comparable à celle des animaux contrôles non diabétiques et ne nécessitent pas de traitement spécifique pour assurer leur survie. Contrairement aux inhibiteurs « classiques » notre nouvel inhibiteur ne provoque pas d'effets toxiques sur l'ensemble de l'organisme ni sur le système nerveux. L'innocuité de ce produit a été validé dans nos études antérieures dans lesquelles on a effectué des traitements de la même durée sans qu'aucun effet indésirable se manifeste chez ces animaux. Les nuisances attendues pour les animaux sont principalement liées aux manipulations expérimentales. Elles comprennent un inconfort léger et transitoire associé aux injections. Un inconfort ponctuel est également attendu lors des prélèvements sanguins à l’extrémité de la queue. Enfin, la privation alimentaire temporaire préalable aux tests métaboliques est susceptible d’induire un inconfort transitoire, sans conséquence durable pour les animaux.

Devenir

A l'issue de chaque procédure tous les animaux seront mis à mort pour permettre les prélèvements des tissus d’intérêt

Remplacement

Le modèle animal est fondamental dans ce projet, puisque l’étude du diabète et de l'inflammation associée ne peut se faire que sur un organisme vivant dans son intégralité afin d’étudier la réponse physiologique globale de l’organisme au traitement. Plusieurs niveaux de complexité sont nécessaires, impliquant des interactions entre différents types cellulaires et organes qui présentent une inflammation importante, aspects qui ne peuvent pas être développés in vitro ou ex vivo. Le choix de notre modèle de rat diabétique (et de son contrôle Wistar) pour cette étude réside dans le fait qu'il présente de grandes similitudes dans sa physiologie et physiopathologie avec celle de l'Homme.

Réduction

La stratégie expérimentale visera à étudier l’implication d'une enzyme sur les mecanismes de l'inflammation. Dans ce sens nous constituerons des groupes expérimentaux comportant un nombre d'animaux réduit au maximum, mais permettant de prendre en compte la variabilité individuelle de la réponse à l’inhibiteur et de valider statistiquement les différences détectées entre les groupes. Pour les tests métaboliques des différences significatives pourront être démontrées à partir de groupes de 8 animaux (en référence à nos études précédentes et en accord avec les résultats des tests statistiques). Pour les analyses sur les ilots, des groupes de 12 animaux pour les Wistar et de 24 pour les rats diabétiques seront necessaires, en raison de leur masse pancréatique réduite d'environs 50%.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe de deux par cage pour respecter leur comportement social naturel. Chez les rats mâles diabétiques, qui boivent et urinent davantage, une litière plus absorbante sera utilisée et changée deux fois par semaine afin de maintenir les animaux au sec et de limiter leur inconfort. Chez les femelles diabétiques, ces modifications étant très peu marquées, une litière standard sera utilisée selon la fréquence habituelle de change. Les biberons seront renouvelés 3 fois par semaine. Les cages comprendont des batonnets de bois afin que les animaux puissent satisfaire leur besoin naturel de rongueur. Les rats seront surveillés quotidiennement afin de détecter des signes de souffrance portant sur l'apparence physique (manque de toilettage, poils ébouriffés, dos arrondi), le comportement (modification de la prise alimentaire, prostration) et les modifications de poids. Une grille de scoring et des points limites seront mis en place. Une perte de poids de plus de 15% entraînera la mise à mort de l'animal concerné. Pour le traitement pharmacologique et pour les tests métaboliques, les animaux seront préparés à la contention par les expérimentateurs pendant la semaine qui précède. L'inconfort généré sera uniquement dû à la piqure d'aiguille qui sera limité en alternant le coté d'injection. Les études effectuées jusqu'a présent ne montrent aucun effet secondaire en réponse au traitement. Le prélèvement de sang de 2-3μL à la queue de l'animal pour mesurer les glycémies peut engendrer une légère douleur. Les animaux seront mis à mort conformément aux recommandations en vigueur afin de limiter leur souffrance.

Choix des espèces

Le modèle Wistar est connu depuis longtemps pour être un bon modèle d’étude de l’obésité et des comorbidités associées telles que le diabète. Notre modèle de rat diabétique est dérivé du rat Wistar et présente spontanément un diabète de type 2 au stade adulte. Les animaux non vertébrés n'ont pas de pancréas organisé comme l'humain et les rongeurs. De ce fait, le choix du rat pour cette étude réside dans les grande similitudes que cette espèces présente dans sa physiologie et physiopathologie avec celle de l'humain. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 3 et 4 mois) car nous étudions les effets de l'inhibition à l'âge adulte, quand le diabète et bien installé.

3 168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 1 440 d'entre elles sont gavées une fois par jour pendant cinq jours, 864 subissent une injection stéréotaxique bilatérale de virus dans le cerveau sous anesthésie, d'environ soixante minutes, 240 reçoivent des injections d'hormone et 48 une ovariectomie ou une orchidectomie de trente minutes. Le porteur indique que le gavage est indolore tout en immobilisant totalement la souris, décrit des douleurs post-opératoires après l'incision de la peau du crâne et, pour les ablations de gonades, des douleurs, une déshydratation et des risques cardiorespiratoires pendant l'anesthésie. Les souris sont maintenues en vie après ces interventions et pendant des durées définies de régime hypercalorique, puis tuées pour le prélèvement de leurs organes.

Objectifs

L'obésité est un problème mondial, touchant plus de 13% de la population et entraînant des comorbidités graves telles que le diabète, l'hypertension et les maladies cardiaques. Cette condition résulte principalement de troubles de la balance énergétique. Cependant, les thérapies actuelles ont des limites en termes d'efficacité à long terme. Pour développer de nouvelles stratégies, il est essentiel de comprendre les mécanismes biologiques régulant la balance énergétique. Dans ce contexte, il existe dans notre cerveau des neurones capables de détecter différents nutriments issus de l’alimentation, afin d’adapter nos choix alimentaires. Certains de ces neurones ont longtemps été considérés comme responsables de la satiété, mais des études récentes ont dévoilé leur grande hétérogénéité. L'objectif est d'identifier ces sous-populations de neurones susceptibles de dysfonctionner dans l'obésité. Pour cela, une caractérisation de la structure, de l'activité électrique et de la fonction de ces neurones grâce à des lignées de souris transgéniques sera effectuée. Les bénéfices escomptés incluent une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans les dysfonctionnements neuronaux liés à l'obésité, ouvrant la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

À l’heure actuelle, l’Organisation Mondiale de la Santé estime à plus d’1 milliard le nombre de personnes obèses à travers le monde, ce qui représente un problème de santé publique de la plus haute importance. Malheureusement, les traitements disponibles à l’heure actuelle ne sont que peu efficaces pour lutter contre cette pathologie, et seules des techniques extrêmement invasives comme la chirurgie bariatrique permettent une perte de poids durable (sans garantie de succès systématique). Il est donc crucial d’approfondir nos connaissances sur les mécanismes biologiques participant au développement de l’obésité, dans l’espoir de fournir à l’avenir de meilleurs traitements aux personnes affectées. À court terme, notre projet apportera des informations nouvelles sur les mécanismes biologiques qui favorisent le développement de l’obésité et des comorbidités associées. En outre, il s’inscrit pleinement dans un contexte de recherche international visant à décrypter les rôles spécifiques des différentes souspopulations de "neurones de la satiété". À plus long terme, ce projet pourrait ainsi conduire à la mise au point de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre l’obésité.

Procédures

Gavage oral (1440 animaux) : un gavage oral sera réalisé 1 fois par jour durant 5 jours, sans anesthésie. La durée de l’administration orale de tamoxifène ne dure que 15 secondes par animal, en prenant en compte la contention de l’animal et l’administration de l’agent pharmacologique à proprement parler. La durée de l'administration de la dose d’euthanasiant quant à elle ne dure que 10 secondes à prenant en compte la contention et l’administration en elle même. Neurochirurgie : Cette technique sera réalisée sous anesthésies générale. Une seule chirurgie sera effectuée dans la vie de l’animal. Le temps estimé d’une telle chirurgie, de l’anesthésie au réveil, est d’environ 60 minutes (864 animaux). AJOUT PROCEDURE 5 : L'INJECTION D'HORMONE (240 ANIMAUX): L'ADMINISTRATION DE L'HORMONE SERA REALISE 1 FOIS PAR JOUR DURANT 5 JOURS, SANS ANESTHESIE, A L'EXCEPTION D'UNE HORMONE QUI SERA INJECTE TOUS LES TROIS JOURS A PARTIR DU 10e JOUR POSTNATAL. L'ADMINISTRATION DE L'HORMONE NE PREND QUE 10 SECONDES, Y COMPRIS LE TEMPS NECESSAIRE POUR IMMOBILISER L'ANIMAL ET L'ADMINISTRATION ELLE-MEME. L'OVARIECTOMIE/ ORCHIDECTOMIE (48 ANIMAUX EN TOTALE) : L'INTERVENTION D'OVARIECTOMIE/ORCHIDECTOMIE DURE 30 MINUTES, Y COMPRIS L'INDUCTION DE L'ANESTHESIE.

Impact sur les animaux

Certaines souris de l'étude seront soumises à une administration orale de tamoxifène. Le tamoxifène est un agent pharmacologique susceptible d’induire des effets indésirables. Il induit une perte temporaire de tissu adipeux. Il entraine donc une perte de poids, qui est néanmoins temporaire. Le gavage oral est une méthode indolore, mais implique une immobilisation totale de l’animal, induisant du stress chez ce dernier. Des douleurs post-opératoires sont possibles pour les souris qui subiront une injection stéréotaxique bilatérale de virus (deuxième partie du projet), par neurochirurgie. Ces douleurs sont les plus importantes lors de la neurochirurgie. L’incision de la peau du crâne et la déshydration induite par l’anesthésie peuvent provoquer des douleurs post-opératoires, celles-ci devraient s’estomper dans les jours suivant la chirurgie, grâce au traitement analgésique mis en place. AJOUT DES PROCEDURES D'OVARIECTOMIE ET ORCHIDECTOMIE EN RAISON DE L'INCISION PRATIQUEE SUR LA PEAU ET L'ABDOMEN, DES DOULEURS POST-OPERATOIRES PEUVENT ETRE ATTENDUES, AINSI QU'UNE DESHYDRATATION OU DES RISQUES CARDIORESPIRATOIRES PENDANT L'ANESTHESIE. SA SEVERITE EST CONSIDEREE COMME MODEREE. AVEC L'INJECTION D'HORMONES, UN CHANGEMENT DE POIDS PEUT ETRE ATTENDU. CELUI-CI NE DEVRAIT PAS DEPASSER UNE PERTE DE POIDS DE PLUS DE 10 % PAR RAPPORT AU POIDS INITIAL. PARMI LES AUTRES RISQUES ASSOCIES AUX INJECTIONS, ON PEUT CITER L'IRRITATION ET L'INFLAMMATION AU NIVEAU DU SITE D'INJECTION DUES A LA PENETRATION DE L'AIGUILLE.

Devenir

Toutes les souris seront gardées en vie à l'issue du gavage. Après des temps précis de régime hypercalorique, LES SOURIS SERONT MISES A MORT POUR PRELEVEMENTS D’ORGANES. Pour les procédures 2 et 5 : toutes les souris seront gardées en vie après la chirurgie. A la fin de l’expérience, LES SOURIS SERONT MISES A MORT POUR PRELEVEMENTS D’ORGANES.

Remplacement

Le but de ce projet est d’étudier la relation entre l’activité des sous populations de neurones et la consommation de régime obésogène. Dans ce contexte, les neurones que nous étudions interagissent avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques qui influencent l’activité neuronale via des signaux hormonaux. Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre divers réseaux de neurones et la périphérie. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et les variables mesurées ici telles que le comportement alimentaire nécessite évidemment un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.

Réduction

Nous avons utilisé un test de puissance pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires chez les deux sexes, pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Le nombre d’animaux que nous demandons est le nombre maximal dont nous estimons avoir besoin. Si nous nous rendons compte en cours de projet que ce nombre peut encore être réduit, il le sera bien évidemment.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 6 semaines et seront habitués pendant au moins 2 semaines. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) Nous utiliserons ces tunnels pour transporter les souris, qui est la méthode de manipulation la moins stressante pour ces animaux. L'enrichissement comprend des maisons ou des tunnels en polycarbonate + du safe crinklets (bandes de papier kraft) 3) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis : ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échéant). Des mesures conservatoires sont prévues pour chaque critère, afin de prendre en charge promptement toute modification de l’état de l’animal. Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel et du comportement alimentaire sont depuis longtemps etudies chez la souris, qui represente donc une espece adaptee a ce type d’études. De plus, les lignées transgéniques dont nous avons besoin pour mener à bien ce projet ont été créées chez la souris. Enfin, la forte proximite biologique entre l’Homme et la souris en ce qui concerne le controle de la prise alimentaire fait de cette espèce un bon modele predictif. Toutes les souris de ce projet arriveront à l’âge de 6 semaines dans notre animalerie, mais nous ne débuterons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines, sur des souris adultes. Il est admis qu’à 8 semaines, la croissance des os est achevée, ce qui facilite les procédures impliquant une chirurgie stéréotaxique (car les points de repère anatomiques se situent sur le crâne). Les souris seront logées dans des cages collectives pour favoriser les interactions sociales.

Jusqu'à quatre injections dans l'œil, sous anesthésie de cinq minutes, et jusqu'à huit injections de chaque côté dans la veine ou dans le ventre : 2 202 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur indique que les injections intraoculaires peuvent enflammer ou endommager l'œil, que les injections répétées dans la veine peuvent abîmer celle-ci et que celles dans le ventre peuvent provoquer une inflammation. L'objet déclaré est de tester des molécules identifiées au laboratoire, censées protéger le nerf optique et le faire repousser dans un contexte de glaucome. Le résumé ne dit pas comment le glaucome ou l'élévation de la pression intraoculaire est provoqué chez ces souris, ni combien d'entre elles subissent chaque type d'injection.

Objectifs

Le glaucome concerne plus de 10 millions de patients dans le monde. Cette maladie entraine la dégénération du nerf optique, le seul lien entre l’œil et le cerveau ce qui induit une perte définitive de la vue. Notre projet consiste à protéger les neurones de la mort et à faire repousser le nerf optique pour maintenir la vision. Ce projet a pour but de tester de nouveaux molécules identifiés dans le laboratoire pour induire la neuroprotection et la régénération du système nerveux.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de définir des molécules pour proteger et faire repousser le nerf optique. De ce fait il est important de comprendre leurs actions dans un contexte de glaucome. Ainsi ce projet contribuera à identifier des approches thérapeutiques pour des maladies comme le glaucome où les neurones doivent être protégés.

Procédures

Les souris peuvent subir une ou plusieurs injections : - dans l’œil (au maximum 4) : les souris sont endormies environ 5 min. L’injection dans l’œil dure 20s. - dans la veine ou dans le ventre (au maximum 8 de chaque coté) 20s.

Impact sur les animaux

- L’injection intraoculaire ou dans la chambre antérieure de l’œil peut entrainer l’inflammation de l’œil et/ou endommager l’œil - - injections répétées dans la veine peut endommager la veine. - injections dans le ventre répétées peuvent induire une inflammation.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour des analyses moléculaires ou pour analyse de tissus

Remplacement

Pour atteindre nos objectifs, les modèles murins sont essentiels et non remplaçables car i) les structures anatomiques sont similaires à l’humain, et ii) les mécanismes de mise en place de l’augmentation de la pression intra-oculaire nécessitent l’intervention de différents composante de l'oeil neurones, cellules gliales, environnement de la rétine et ne peuvent être mimés efficacement dans une culture de cellule ou par modèle informatique. Le modèle murin est le standard international reconnu pour la recherche sur la régénération du système visuel.

Réduction

Plusieurs mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet : -L’entrainement de toutes les personnes qui pratiquent les expériences pour ne pas perdre d’animaux dû à de mauvaises chirurgies. -L’utilisation de tests statistiques optimaux pour avoir le nombre d’animaux le plus restreint possible tout en gardant une valeur biologique et statistique suffisante. -Nous testerons d’abord les molécules identifiées en culture cellulaire. Seuls les candidats qui donneront des résultats satisfaisants en culture seront utilisés dans les souris.

Raffinement

L’état de santé des animaux sera suivi quotidiennement tout au long de l’expérience, notamment suite à la chirurgie. Les interventions sur l’œil sont des chirurgies et seront réalisées sous anesthésie générale. Les souris recevront une injection d’un médicament antidouleur et anti-inflammatoire adapté avant l’opération. Après chaque anesthésie, les souris seront placées sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil. Les critères de poids, d’apparence physique, et de comportement basés sur la grille proposée par le comité d’éthique n°004 seront pris en compte dans le suivi des animaux qui subissent une intervention chirurgicale. Nous serons également vigilants quant à l’état de l’œil.

Choix des espèces

La régénération du nerf optique et l’augmentation de la pression intraoculaire sont des phénomènes multifactoriels. La modélisation de ces processus dans un système unicellulaire (telle que la culture cellulaire) ne permet ni d’identifier correctement les voies moléculaires ni de tester efficacement les capacités de régénération. La souris représente le modèle in-vivo standard dans la communauté scientifique grâce à une grande similitude anatomique avec l’homme. Ceci n’est pas possible avec d’autres modèles telles que le poisson zèbre dont le système nerveux central régénère spontanément ou la drosophile dont le système nerveux est trop éloigné de celui des mammifères. Enfin, les modèles transgéniques nécessaires à notre projet sont disponibles chez la souris ce qui n’est pas le cas pour d’autres modèles tels que le rat. Pour l’ensemble des expériences proposées nous utiliserons des souris adultes (animaux de 28 jours minimum). Nous voulons étudier les mécanismes de neuroprotection dans le système visuel adulte pour être le plus proche possible des lésions chez l’homme.

Soumises à onze injections de morphine en six jours, puis à une période de sevrage, 1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie subit une chirurgie stéréotaxique d'environ une heure, avec injection de virus et implantation de fibres optiques ou de canules, puis jusqu'à dix injections directement dans le cerveau, sur animal éveillé. Le porteur décrit un sevrage qui réduit l'activité pendant une semaine, puis des "symptômes psychiatriques" sur environ quatre semaines, le suivi comportemental s'étendant sur huit semaines. Les comportements annoncés dans les objectifs sont les interactions sociales, les signes anxio-dépressifs et la consommation de nourriture et de boisson, mais la rubrique des procédures se limite à indiquer qu'elles "subiront également des tests comportementaux".

Objectifs

Le but de ce projet est de décrire le rôle de la sous-unité GluN3A du récepteur N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) au glutamate dans le sevrage aux opiacés. Cette sous-unité permet de former un hétéromère NMDA dit « non-conventionnel » car activé par la glycine. Son implication dans les pathologies psychiatriques émerge progressivement mais reste à être complètement caractérisé. Il a notamment été démontré que sa dérégulation, dans l’habénula médiane (HbM), une région clé dans le phénomène d'addiction aux opiacés, altère la réponse comportementale face à des stimulations aversives. Ainsi, cette sous-unité semble pouvoir participer aux symptômes aversifs observés lors du sevrage aux opiacés. Dans ce projet, nous utiliserons des approches génétiques et pharmacologiques afin de moduler l’activité de GluN3A dans des régions spécifiques du cerveau, chez des souris mâles et femelles. Nous analyserons les effets de ces manipulations sur différents comportements, notamment les interactions sociales, les symptômes anxio-dépressifs ainsi que la consommation de nourriture et de boisson. Ces mesures seront réalisées de manière automatisée et continue chez des animaux vivant en groupe, avant, pendant et après un traitement chronique à la morphine. Les comportements et les symptômes de sevrage seront suivis sur une période de 8 semaines, incluant des tests ponctuels permettant d’évaluer des signes d’anxiété et de dépression. Dans un second temps, nous mesurerons l’activité neuronale dans certaines régions cérébrales impliquées dans le sevrage, grâce à des enregistrements calciques réalisés pendant et après le traitement à la morphine, ainsi que lors des tests comportementaux. L’ensemble de ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de GluN3A dans le sevrage aux opiacés et d’évaluer son potentiel comme cible thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de la sous-unité GluN3A dans le sevrage aux opiacés. Il permettra à la fois de caractériser son implication dans les symptômes de sevrage et d’évaluer son potentiel comme cible thérapeutique. À court terme, le projet est principalement fondamental et descriptif. Il s’agira de déterminer si, et à quel moment, GluN3A intervient dans le sevrage à la morphine. Ces travaux apporteront également de nouvelles connaissances sur les mécanismes cérébraux impliqués, en particulier dans les régions associées aux états émotionnels négatifs liés au trouble d’usage des opioïdes. À plus long terme, le projet visera à évaluer le potentiel thérapeutique de GluN3A, notamment en identifiant les périodes les plus pertinentes pour cibler cette sous-unité dans le traitement du sevrage. Dans son ensemble, ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives pour le développement de traitements visant à atténuer les symptômes de sevrage aux opiacés.

Procédures

Différentes procédures de ce projet nécessitent que des animaux subissent une chirurgie (1 intervention d'environ 1h). Les animaux recevront un traitement chronique de morphine (11 injections pendant 6 jours; une injection dure environ 1 minute). Les injections se feront sur animal vigile. Des composés seront administrés de façon intra-parenchymateuse (maximum 10 injections) et systémique, sur animal vigile. Les animaux subiront également des tests comportementaux.

Impact sur les animaux

Deux types de nuisances sont attendues au cours de cette étude : 1- Ce projet vise à étudier les symptômes de sevrage à la morphine. Ainsi, dans chaque les souris recevront un traitement chronique de morphine puis subiront une période de sevrage. Ce sevrage engendre des symptômes physiques transitoires, essentiellement visible par une réduction de l’activité de l’animal (durée : ~1 semaine). Suite à ces symptômes physiques, des symptômes psychiatriques se développe sur une période plus longue (~4 semaines) avant de progressivement disparaitre. 2- Chirurgies stéréotaxiques avec injection de virus et/ou implantations de fibres ou optiques ou de canules pouvant induire une douleur modérée, une inflammation transitoire et/ou un inconfort pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour réaliser les contrôles histologiques et prélèvements.

Remplacement

Ce projet a pour but de déterminer les mécanismes neurobiologiques du sevrage, notamment les modifications de comportements sociaux des individus. De plus, il permettra d’évaluer le potentiel thérapeutique de composés pharmacologiques. Ainsi, l’animal entier, vivant et se comportant, est nécessaire et ne peut être remplacé par un autre modèle.

Réduction

Au regard des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique individuelle, nous avons réalisé une analyse statistique de puissance (power analysis) qui a déterminé que les données sont statistiquement exploitables et publiables avec des cohortes de 20 animaux/groupe. Les analyses statistiques seront essentiellement réalisées à l’aide de test de Student ou d’analyse de la variance à un ou plusieurs facteurs, selon les comparaisons.

Raffinement

Nos conditions d’hébergement, en groupes sociaux avec un enregistrement continu des souris permet un suivi quotidien du bien-être animal. De plus, dans ces conditions d’hébergement, l’enrichissement de l’environnement des animaux est important. En effet, les animaux sont hébergés en groupe social avec à disposition: bâtonnets à ronger, cotons compressés pour faire des nids et dômes en polycarbonate. Nous avons établi des points limites standards tels que des signes comportementaux d’inconfort et des signes cliniques qui seront recherchés quotidiennement par visionnage des cages et lors de la visite quotidienne de la pièce d’hébergement, par l’expérimentateur. Lors des chirurgies, toutes les conditions d’aseptise, d’anesthésie et d’analgésie respectent la réglementation vétérinaire en vigueur. De plus, la température des animaux est maintenue à l'aide d'un tapis chauffant. Après chaque chirurgie, les animaux sont réhydratés et ont accès à une nourriture gélifiée pour faovriser la récupération post-chirurgicale et leur état de santé est évalué et objectivé selon des points limites définis par les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur. Les animaux sont habitués aux conditions d'hébergement, aux manipulateurs, ainsi qu'aux procédures experimentales.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser des souris pour ce projet car leur cerveau est suffisamment complexe pour nos études, elles possèdent une molécule appelée GluN3A qui est très similaire chez de nombreuses espèces, et leurs réactions à la morphine sont bien connues et ressemblent à celles observées chez l’humain. Notre projet ne s’intéresse pas au développement du cerveau. De plus, la consommation de substances comme la morphine concerne principalement les adultes, c’est pourquoi toutes les souris utilisées seront adultes (8 semaines) au moment des expériences.

1 986 poulets de chair vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, chacun sorti de sa cage pour une pesée en groupe au premier puis au vingt et unième jour. Une partie reçoit un aliment appauvri en phosphore, ce qui altère la minéralisation de leurs os et provoque des boiteries et des difficultés à se déplacer, une autre une ration réduite en énergie qu'ils compensent en mangeant davantage. Tous sont mis à mort pour le prélèvement des contenus intestinaux et des os. Le porteur affirme que le projet vise à améliorer leur "bien-être" et leur santé, alors que les produits comparés sont des additifs destinés aux rations distribuées aux volailles d'élevage, dont il attend des gains d'efficacité alimentaire, une litière plus sèche et une baisse des rejets de phosphore et d'azote.

Objectifs

L’alimentation des poulets de chair repose principalement sur des matières premières d’origine végétale telles que le maïs, le blé et les coproduits comme le tourteau de soja. Ces ingrédients contiennent toutefois des composés partiellement indigestibles, appelés facteurs antinutritionnels, notamment les phytates (phosphore végétal) et certains constituants des fibres. Ces composés limitent l’utilisation des nutriments par les animaux, en réduisant leur digestion et leur absorption. Les volailles possèdent naturellement une capacité limitée à dégrader ces substances. En conséquence, une partie des nutriments apportés par l’alimentation est mal valorisée, ce qui impacte l’efficacité alimentaire et limite l’utilisation de matières premières alternatives, souvent plus riches en fibres. L’ajout de solutions nutritionnelles spécifiques dans l’aliment constitue une réponse efficace pour améliorer cette situation. Ces composés biologiques permettent de dégrader les fractions indigestibles et d’augmenter la disponibilité des nutriments essentiels comme le phosphore, les protéines et l’énergie. Ils contribuent également à améliorer la digestion, la santé du système digestif et la qualité des déjections, tout en réduisant les rejets dans l’environnement. Cependant, leur efficacité peut varier selon plusieurs facteurs, tels que leur nature, leur origine ou les conditions d’utilisation. Toutes ces solutions nutritionnelles ne présentent donc pas le même niveau de performance. Dans ce contexte, le projet vise à évaluer différentes solutions chez le poulet de chair afin de comparer leur efficacité sur la digestibilité des nutriments. L’objectif est d’identifier les options les plus performantes, comparables aux références existantes, afin de contribuer au développement de stratégies nutritionnelles plus efficaces, économiques et respectueuses de l’environnement.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à étudier l’intérêt d’ajouter certaines solutions nutritionnelles dans l’alimentation des poulets de chair. L’objectif est d’améliorer leur bien-être, leur santé et de réduire l’impact de l’élevage sur l’environnement. Certaines parties des aliments, notamment les fibres ou d’autres composants végétaux, sont difficiles à digérer pour les poulets. Cela limite l’utilisation des nutriments présents dans leur nourriture. En ajoutant ces solutions, on aide les animaux à mieux digérer leur alimentation et donc à mieux utiliser les protéines, l’énergie et les minéraux. Cela peut avoir plusieurs effets positifs dont une meilleure digestion et moins de troubles digestifs (comme les diarrhées), des animaux en meilleure forme et plus homogènes, des déjections moins humides, ce qui améliore la qualité de la litière et limite certains problèmes de peau. Ces améliorations permettent aussi de réduire les rejets dans l’environnement, notamment le phosphore et l’azote, qui peuvent polluer les sols et l’eau. Elles contribuent également à améliorer la qualité de l’air dans les bâtiments d’élevage. Enfin, ces solutions permettent de mieux utiliser les matières premières végétales, y compris certains coproduits, ce qui peut réduire les coûts et préserver les ressources naturelles. Dans l’ensemble, ce projet vise donc à trouver des solutions pour produire de manière plus efficace, plus respectueuse des animaux et plus durable pour l’environnement.

Procédures

La manipulation des animaux, incluant leur sortie des cages pour la pesée en groupe, est susceptible d’induire un inconfort et un stress aigu de courte durée (inférieur à 1 minute à J0 et J21).

Impact sur les animaux

Modification transitoire de la consistance des fèces en raison d’une modification de la ration alimentaire. Augmentation de la consommation alimentaire pour compenser une réduction modérée de l’apport en énergie dans l’aliment. Altération modérée de la minéralisation osseuse et apparition de boiterie et de difficultés à se déplacer pour les animaux nourris avec un aliment réduit en phosphore.

Devenir

Tous les animaux entrant dans la procédures seront mis à mort pour le prélèvement des contenus intestinaux et des os.

Remplacement

Pour réduire le recours à l’expérimentation animale, la totalité des produits collectées ont fait l’objet d’une première évaluation in vitro visant à retenir uniquement les produits répondant à des critères stricts de qualité, notamment un haut niveau de pureté, une thermo stabilité compatible avec les procédés industriels et une efficacité démontrée in vitro. Ces critères de sélection utilisés en première intention doivent cependant être confirmés par la réalisation d’expérimentations in vivo, indispensables pour évaluer de manière intégrée les phénomènes de digestion, d’absorption et de métabolisme des nutriments. Ces mécanismes complexes ne peuvent pas être entièrement reproduits par des méthodes alternatives in vitro. Les études de digestibilité permettent ainsi d’obtenir des données mécanistiques essentielles reliant l’action des produits aux performances nutritionnelles et aux impacts environnementaux. Aussi, la sélection des produits implique de connaitre leur mode d’action chez l’animal auquel il est destiné, impliquant l'utilisation d'animaux vivants.

Réduction

Sur la base de travaux antérieurs et de références bibliographiques, des calculs statistiques ont été réalisés afin de déterminer le nombre d’animaux adéquat pour ce projet et a été réduit à la stricte nécessité pour aborder l’objectif du projet. Le nombre d’animaux à utiliser permettra d’apporter de bonnes conditions d’élevage en favorisant une hiérarchie sociale nécessaire au bien-être des animaux, d’avoir suffisamment de quantité d’échantillons pour réaliser les analyses et d’obtenir des données scientifiquement robustes.

Raffinement

La gestion du bien-être des animaux tout au long du projet inclut l’application de points limites spécifiques et précoces. L’inconfort et le stress dus à la sortie des cages pour la pesée en groupe des animaux sont réduits en réalisant les opérations de capture le plus silencieusement possible, par une manipulation délicate des animaux saisis au niveau du tarse juste au-dessus des doigts pour être transférés dans des contenants suffisamment grands pour éviter l’empilement et donc l’étouffement. Le raffinement des conditions d’hébergement consiste en la mise en place au démarrage de l’étude de papier filtre à l’intérieur de la cage, pour éviter que les animaux se coincent les pattes dans les mailles de la grille et en favorisant l’accès facile à l’eau et à la nourriture. L’accès à l’eau est facilité par la mise en place de coupelle d’eau en plus des pipettes et des godets récupérateurs d’eau. L’accès à la nourriture est affiné en mettant directement dans la cage sur le papier filtre un tas d’aliment. En plus, la hauteur des lignes d’eau ainsi que les ouvertures d’accès aux mangeoires, sont ajustées régulièrement en fonction de l’âge des animaux. L’état de santé des animaux est suivi quotidiennement. Les conditions d’hébergement des animaux sont définies de telle sorte que l’enrichissement des cages (balles avec grelots), la densité des animaux par cage, ou encore les paramètres environnementaux (température et hygrométrie) procurent le maximum de confort aux animaux, favorisent les interactions sociales, et correspondent à la législation en vigueur. Aucun animal ne reste isolé, en cage individuelle sans contact visuel ou tactile avec ses congénères, ceci afin de réduire au minimum l’angoisse et le stress des animaux.

Choix des espèces

Les produits qui sont testés, sont destinés à être incorporées dans les rations alimentaires distribuées aux volailles (poulets de chair) pour faire face à la variabilité de la qualité nutritionnelle des ingrédients entrant dans la composition des régimes alimentaires des volailles. Le poulet de chair est le modèle le plus pertinent, compte tenu de sa croissance rapide et de sa sensibilité aux apports en nutriments et en minéraux.

Des lignées de souris génétiquement modifiées pour des gènes du métabolisme forment une partie des 2 736 souris utilisées dans ce projet, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le protocole associe un régime riche en graisses et en sucres, un traitement chimique qui déclenche la fibrose du foie, des injections dans le péritoine et dans une veine, une biopsie de l'oreille pour le génotypage et une mise à jeun de six heures. L'objet déclaré est de suivre chez la souris l'évolution simultanée des lésions du foie et des artères, les retombées annoncées pour les patients, dépistage, cibles de traitement, thérapie génique, restant au conditionnel et au long terme. Le porteur écrit que ces nuisances seront "prises en charge de manière adéquate" et que "le bien-être de l'animal depuis sa naissance jusqu'à sa mort sera pris en compte".

Objectifs

La maladie hépatique stéatosique associée à un dysfonctionnement métabolique (MASLD) est une maladie chronique du foie très fréquente. Elle est notamment associée à l’obésité, au diabète de type 2, à des anomalies des lipides sanguins et à l’hypertension artérielle. Elle se caractérise initialement par une accumulation excessive de graisses dans le foie. Chez certaines personnes, elle peut évoluer vers une inflammation et des lésions des cellules du foie, puis vers une fibrose. Dans les formes les plus sévères, la fibrose peut conduire à une cirrhose ou à un cancer du foie. Les personnes atteintes de MASLD présentent également un risque accru de maladies cardiovasculaires, notamment d’athérosclérose. Celle-ci correspond à la formation progressive de dépôts dans la paroi des artères pouvant entraîner un rétrécissement et des complications cardiovasculaires graves. Ce risque semble particulièrement augmenté lorsque la maladie du foie s’accompagne d’une fibrose importante. Les mécanismes expliquant le lien entre fibrose hépatique et athérosclérose restent encore mal compris.L’objectif du projet est de développer un nouveau modèle chez la souris permettant d’étudier simultanément les atteintes du foie et des artères. Il permettra de déterminer si la fibrose hépatique participe au développement ou à l’aggravation de l’athérosclérose et d'identifier les mécanismes impliqués. Différentes conditions expérimentales seront utilisées. Les souris recevront soit une alimentation normale, soit une alimentation favorisant l’apparition de troubles métaboliques et de lésions du foie et des vaisseaux sanguins. Des interventions complémentaires permettront d’induire ou d’aggraver progressivement la fibrose hépatique. Certaines souris feront également l’objet d’une modification ciblée du fonctionnement du foie afin d'étudier le rôle de mécanismes biologiques spécifiques. L’état général et le poids des animaux seront surveillés régulièrement. Des prélèvements permettront d’étudier le sang, le foie et les vaisseaux sanguins. Les analyses porteront notamment sur les lésions du foie, l’inflammation, la fibrose, et la formation des plaques d’athérosclérose. Elles permettront également d’identifier les modifications biologiques associées à ces maladies. L’utilisation de souris est nécessaire car le projet vise à étudier les interactions entre plusieurs organes et l’évolution simultanée des maladies du foie et des vaisseaux sanguins dans un organisme vivant.

Bénéfices attendus

Le projet présente un impact direct chez l'Homme en mettant en avant le rôle clé de la fibrose du foie dans les maladies cardiovasculaires, première cause de décès des patients atteints de MASLD. En s’appuyant sur des modèles précliniques bien caractérisés et des cohortes humaines validées, il permettra 1) de mieux comprendre les mécanismes entre pathologie du foie et complications cardiovasculaires et d’identifier des biomarqueurs dans le sang qui pourraient aider aux stratégies de dépistage en clinique humaine ; 2) de tester de nouvelles cibles de traitement ciblant le foie pour prévenir ou limiter les maladies cardiovasculaires ; 3) d'explorer des approches innovantes de thérapie génique ciblant le foie, avec des applications potentielles à la médecine personnalisée. Ces avancées contribueront à réorienter les stratégies de traitement actuelles qui sont soit orientées sur le foie, soit sur le cœur, vers une approche globale tenant compte des interactions entre les organes, ce qui permettrait de mieux prendre en charge la santé cardiovasculaire.

Procédures

Biopsie à l'oreille : anesthésie gazeuse isoflurane, temps pour le prélèvement inférieur à 10 secondes. Prélèvement de sang à la queue : anesthésie gazeuse isoflurane , temps inférieur à 1 minute. Injection intrapéritonéale: anesthésie locale, temps d'injection inférieur à 10 secondes. Injection intraveineuse : anesthésie par spray xilocaïne 5%, temps d'injection inférieur à 10 secondes. Euthanasie des souris : anesthésie gazeuse isoflurane, disclocation cervicale temps < 1 seconde

Impact sur les animaux

Certaines procédures peuvent engendrer du stress : douleurs liées à la biopsie à l’oreille pour le génotypage ainsi que le marquage avec une bague (courte durée et léger), injections intrapéritonéales d’un composé chimique ou pharmacologique (modérée) ; Stress métabolique suite à une alimentation enrichie en graisses et en sucres (léger) ; stress lié à une mise à jeûn des animaux pendant 6h (léger). Toutes ces nuisances possibles seront prises en charge de manière adéquate et le bien-être de l’animal depuis sa naissance jusqu'à sa mort sera pris en compte grâce à un environnement contrôlé dépourvu de germes pathogènes, la présence d’abris et de jeux dans les cages, une surveillance quotidienne de l’état de santé des animaux par du personnel formé, et la prise en compte de tout signe physique de stress ainsi que de la hiérarchie sociale.

Devenir

A la fin de P1+P2/P3 +P4, les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact de la fibrose hépatique sur le développement de l’athérosclérose dans un conteste métabolique qui met en jeu une communication inter-organes. Pour répondre à cette problématique, il sera utilisé des modèles de souris génétiquement modifiées pour des gènes du métabolisme mais également des procédures d'altération nutritionnelles de type régime riche en graisse associé à un traitement chimique qui va favoriser le développement de la fibrose hépatique. L'utilisation d'animaux vivants revêt donc un caractère de stricte nécessité avec le développement d’approches de physiologies intégrées. Concernant la nécessité de recourir à des méthodes alternatives, nous privilégions cette option quand elle est possible.

Réduction

Le nombre total d’animaux concernant les procédures de l’ensemble des protocoles de notre équipe sur les 5 ans à venir est estimé à 2736. Cette utilisation maximise les données obtenues de chaque animal, ce qui permet de limiter ou d'éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal. La réduction du nombre d'animaux utilisés peut être obtenue par trois moyens principaux : 1.Optimisation des élevages : Éviter la production d'animaux inutiles. 2. Optimisation des groupes expérimentaux : Une prévision du nombre d’animaux total nécessaire par groupe sera réalisée pour respecter le principe des 3R à l’aide du site : https://eda.nc3rs.org.uk/experimental-design-group. 3. Formation adéquate : Assurer une bonne formation des personnes manipulant les animaux afin de maîtriser les gestes techniques et minimiser le stress des animaux. La maîtrise technique permet de réduire la variabilité inter-animale et, par conséquent, le nombre d'animaux nécessaires pour confirmer statistiquement un effet biologique

Raffinement

Les souris seront hébergées dans un environnement non anxiogène regroupant des conditions favorables à leur bien-être : 2 à 6 souris par cage, une alternance lumière/obscurité de 12 h/12 h, un accès permanent à la nourriture et à l’eau, ainsi qu’un enrichissement de l’habitat comprenant des abris et du matériel pour la confection de nids, favorisant l’expression des comportements naturels et la stimulation cognitive. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne, et un registre de suivi du bien-être sera tenu afin de garantir des conditions d’hébergement optimales. Lors de la mise sous régime, le changement de litière et des cages sera effectué deux fois par semaine pour maintenir un environnement propre et confortable. Toutes les procédures expérimentales seront réalisées selon les techniques les moins invasives possibles. L’utilisation d’anesthésiques et d’analgésiques adaptés, combinée à des manipulations douces et à l’habileté du personnel, contribuera à réduire le stress et l’inconfort des animaux. Les souris seront progressivement habituées aux manipulations et aux protocoles expérimentaux lorsque cela est possible. Des critères précis de points limites précoces seront définis et une surveillance rapprochée permettra de détecter rapidement tout signe de douleur, de détresse ou d’altération de l’état général. En cas de dépassement de ces critères, les animaux seront retirés de l’étude et euthanasiés conformément aux recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

La souris offre de nombreux avantages pour la recherche en métabolisme et physiologie. Elles ont un temps de génération relativement court et peuvent développer des pathologies telles que l'obésité, l'insulino-résistance, la stéatohépatite non alcoolique, la fibrose et l’athérosclérose avec des caractéristiques similaires à celles observées chez l'homme. De plus, cette espèce permet de réaliser des manipulations génétiques. L'ensemble des procédures réalisées concerne le métabolisme, il sera donc nécessaire d'utiliser des souris adultes (de 2 à 6 mois). Par ailleurs, les protocoles ont été validés (publications) au sein du laboratoire sur des souris adultes et ce, en accord avec les 3R. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (8 sem). Les pathologies métaboliques recherchées sont des pathologies de l’adulte.