Procédures légères

Chaque souris est tuée puis autopsiée après l'apprentissage d'un seul geste, pour valider la maîtrise technique du participant qui l'a manipulée. 300 souris vont être utilisées dans ce projet de formation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections sous la peau, dans le péritoine ou dans la veine de la queue, jusqu'à huit fois sur un mois pour cette dernière, un gavage d'eau, ou une prise de sang à la joue ou à la patte, sur animal vigile immobilisé dans un tube. Le porteur indique qu'une sonde de gavage mal introduite peut provoquer une détresse respiratoire et que l'animal sera alors tué immédiatement s'il s'étouffe, et présente le recours à des souris transgéniques "de réforme", déjà destinées à la mise à mort, comme une contribution à la réduction du nombre d'animaux non-humains utilisés.

Objectifs

Ce projet concerne la réalisation du tutorat au sein de l’établissement pour contrôler les compétences ou la formation du personnel et des utilisateurs, selon une méthodologie définie et finalisée par une validation de la maitrise du geste technique. Il concerne les techniques d’administration par injections sous-cutanées, dans le péritoine, dans la veine de la queue, ou par gavage, et de prélèvements sanguins dans la veine de la patte ou en veine submandibulaire, chez la souris. Dans le cadre de l’expérimentation animale, l’administration de substances, peut se réaliser selon différentes voies choisies selon les volumes et le produit à administrer. Les prélèvements sanguins permettent de suivre différents paramètres physiologiques. Afin de limiter son impact sur l’animal, des recommandations quant au volume à prélever et la fréquence de ces prélèvements doivent être suivies. Ces techniques doivent être maitrisées pour être correctement réalisées, en respectant le bien-être des animaux, et limiter le stress de l’animal et de l’expérimentateur. Conformément à la règlementation, les personnes amenées à expérimenter sur des animaux doivent justifier de la maitrise des gestes techniques qu’ils doivent réaliser dans le cadre d’un projet. Ainsi, ce tutorat sera destiné uniquement aux personnes sélectionnées selon leur besoin de maîtriser un de ces techniques requis spécifiquement dans le cadre d’un projet ayant obtenu une autorisation. La formation sera adaptée à chaque participant et ne concerna que les gestes techniques requis et non réalisables systématiquement par un autre personnel de l’établissement. La supervision par le tuteur se fera jusqu’à l’autonomie de l’expérimentateur en formation et observation du geste sur les premiers animaux du projet. La formation devra être réalisée juste en amont du démarrage du projet. Ces formations seront progressives et encadrées par du personnel qualifié référent identifié au sein de l’établissement. Les compétences validées lors de cette formation répondent à un certain nombre de critères définis à chaque étape de la formation. Si les gestes ne sont pas acquis à une étape, le tuteur peut exiger la reprise du geste dès la première étape sur animal simulateur ou sur un animal mort. Après validation, la formation sera inscrite dans leur livret de compétences. Ainsi, les participants pourront réaliser leurs travaux de recherche selon les bonnes pratiques d’expérimentation animale et en accord avec la règlementation.

Bénéfices attendus

Cette formation s’adresse aux personnels sélectionnés selon leur besoin de maîtriser une ou plusieurs gestes techniques dans le cadre de la réalisation de projets ayant obtenu une autorisation. Elle permettra de s’assurer de la bonne réalisation de gestes techniques fréquemment utilisés en expérimentation animale pour l’administration de substances/cellules et les prélèvements sanguins, selon les bonnes pratiques d’expérimentation animale (raffinement), afin d’assurer le bien-être des animaux et de répondre aux exigences réglementaires. De plus, les souris de réforme, qui sont des souris systématiquement mises à mort car elles sont non utilisables dans les projets et non re-plaçables (souris transgéniques), seront utilisées dans le cadre éducatif, permettant la réduction du nombre d’animaux à produire pour l’apprentissage de ces gestes.

Procédures

Une souris sera soumise à un seul des gestes techniques enseigné, c’est-à-dire soit des injections sous la peau, soit dans le péritoine, soit dans la circulation sanguine via la veine de la queue, soit une administration d’eau par gavage, soit des prélèvements de sang (en veine submandibulaire ou en saphène au niveau de la patte postérieure). Toutes les injections se feront avec des solutions injectables type sérum physiologique stérile avec des volumes bien inférieurs aux recommandations et aux lignes directives en vigueur. Les administrations réalisées qu’une seule fois, à l’exception des injections dans la veine de la queue. En effet, cette technique nécessite un apprentissage plus long, et le geste sera répété au maximum 8 fois espacés d’une semaine, sur une durée totale de 1 mois. Les volumes de prélèvement de sang seront adaptés en fonction du poids de l'animal, en respectant la physiologie de la souris mais aussi les recommandations. Le prélèvement sanguin sera effectué une seule fois pour chaque animal. L’apprentissage se fera sur animal simulateur et sur cadavre quand c’est possible ou sinon si ça n’est pas possible sur animal anesthésié ; puis, une fois les gestes maitrisés, ils seront effectués sur des animaux vigiles, immobilisés par une contention ou dans un tube à contention adapté à la taille de la souris.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis, selon le geste effectué, au stress de l’anesthésie ou de l’immobilisation par contention. L’injection d’une solution de sérum physiologique par voie sous-cutanée, ou dans le péritoine ou intraveineuse ne devrait induire qu’une légère douleur due à la piqure. Le gavage de la souris pourra induire un inconfort, voire une irritation due à la sonde. Si la sonde n’a pas été introduite correctement, l’animal peut montrer des signes de détresse respiratoire ; dans ce cas, elle sera ressortie très délicatement et l’animal sera surveillé jusqu’à un retour à un état normal ou mis à mort immédiatement par le tuteur si l’animal s’étouffe. En effet, si un animal montre des signes de souffrance, présente des difficultés respiratoires ou une modification motrice/de posture qui perdure lors de la procédure, il sera mis à mort. Le prélèvement sanguin en veine submandibulaire pourra induire une douleur légère lors de la piqure si la zone est mal anesthésiée. Il est possible d’observer un saignement à l’oreille ou au nez si la piqure est mal réalisée. Le prélèvement sanguin en veine saphène ou l’injection en intraveineuse entrainera en plus de la douleur légère induite par la piqure, un inconfort de la souris quand le geste technique sera réalisé sur la souris vigile et immobilisée dans un tube de contention.

Devenir

Les animaux utilisés sont des animaux de réforme, c’est-à-dire des souris transgéniques de génotype non pertinent pour les études, sans pathologie, non utilisables en protocole et non replaçables, et qui sont systématiquement euthanasiées en dehors de ce projet de tutorat. Chaque animal est mis à mort après chaque apprentissage d’un geste pour réaliser ensuite une autopsie afin de valider la formation du geste et vérifier que la souris n’a subi aucune autre atteinte non souhaitée.

Remplacement

La formation des expérimentateurs sert à valider sur animaux vigiles la réalisation de gestes techniques de prélèvement et d’injection afin de les réaliser ensuite de façon autonome et en respectant les bonnes pratiques et le bien-être animal. Même si une partie de l’apprentissage sera d’abord réalisée sur des modèles d’imitation de la souris (Simulateur Mimicky souris) et des cadavres (pour l’administration par voie sous cutanée et intrapéritonéale), il est nécessaire de valider l’ensemble de ces gestes techniques sur des souris vigiles, avant la réalisation des procédures expérimentales incluant des groupes plus importants d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux a été optimisé en tenant compte de l’expérience relative à la validation des compétences de l’établissement. La validation des compétences d’un utilisateur expérimenté ne peut nécessiter qu’un animal sur les trois prévus dans un apprentissage complet. De plus, les gestes techniques seront réalisés d’abord sur des modèles imitant une souris ou sur une souris décédée afin d’utiliser le moins possible d’animaux vivants. Enfin, un geste maitrisé par un utilisateur représente un raffinement pour la réalisation des projets, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux analysés par groupe. Il est aussi important de préciser que la totalité des animaux utilisés lors de ces formations sont des animaux de réforme, c’est-à-dire des souris transgéniques de génotype non pertinent pour les études et non replaçables, systématiquement euthanasiées en dehors de ce projet de tutorat. L’utilisation de ces animaux contribue à la réduction du nombre d’animaux, en évitant de produire des animaux uniquement pour l’apprentissage des gestes techniques. Ainsi, le nombre d’animaux vivants a été limité à 3 souris maximum par geste technique par participant.

Raffinement

Les animaux seront manipulés régulièrement par des personnes compétentes avant le début du projet afin qu’ils soient habitués avant leur premier contact avec les participants de la formation. Une attention particulière sera portée à l’apprentissage initial la préhension et contention de l’animal avant l’apprentissage et la réalisation de tous les gestes enseignés. La présence du tuteur lors de la réalisation du geste garantira la qualité de l’apprentissage de manière individuelle pour chaque participant. Les gestes techniques seront réalisés d’abord sur des modèles imitant une souris et sur une souris mises à mort, avant de valider le geste sur un animal vigile, afin de générer le moins de stress possible. Enfin, un seul geste technique ne sera réalisé par animal, ce qui justifie le nombre de procédures.

Choix des espèces

Lorsqu’il n’y a pas de méthodes de remplacement permettant de répondre à une question scientifique sans recours à l’animal, notre établissement utilise principalement des souris transgéniques pour ses projets scientifiques. Le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en reproduisant la physiologie de l’homme, et en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyses disponibles. Les souris seront âgées au minimum de 8 semaines pour afin d’assurer l’apprentissage sur des animaux de taille adulte, avec un poids minimal de 25g.

Surexposées au bruit pendant quelques heures ou injectées trois jours de suite dans l'abdomen pour déclencher une inflammation de l'oreille, 4 660 souris sont soumises à des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, et toutes tuées à l'issue. Leur audition est mesurée environ toutes les deux semaines, chaque séance durant une heure, et une partie subit une chirurgie de deux heures sans réveil. L'équipe cherche à identifier les mécanismes de la perte auditive chez les patients porteurs de mutations d'un gène de l'inflammasome, symptôme qu'elle décrit comme le plus invalidant de la maladie. Le porteur affirme pourtant que ces mêmes atteintes auditives sont "largement compensées" chez la souris et n'entraînent pas de phénotype dommageable, et que les chirurgies terminales ne sont "pas susceptibles d'entraîner une douleur".

Objectifs

Les patients atteints de syndrome auto-inflammatoire rare appelé syndrome périodique associé à la cryopyrine (CAPS) présentent une inflammation chronique, une fièvre intermittente et des douleurs articulaires, ainsi que des caractéristiques très spécifiques comme une éruption type urticaire (> 95 % des patients) et des caractéristiques neuroinflammatoires telles qu'une perte auditive neurosensorielle (60 %). Les traitements actuels ciblant certaines molécules stabilisent la maladie ; cependant, dans la plupart des cas, ils ne font pas régresser la perte auditive, qui reste le symptôme le plus invalidant. Les mécanismes qui sous-tendent le phénotype de perte auditive chez les patients restent inconnus, ce qui empêche le développement de tests audiologiques et de traitements appropriés. Nous avons récemment découvert que certaines mutations pour un gène entraînaient une forme atypique de maladie avec perte auditive mais où la plupart des autres symptômes sont atténués. Notre projet a pour but i) d'identifier et de caractériser de manière approfondie chez la souris les événements responsables de la perte auditive progressive chez les individus porteurs de mutations de ce gène aux niveaux moléculaire, cellulaire et tissulaire, et ii) de décrire, aux niveaux moléculaire et cellulaire, le nouveau mécanisme physiopathologique qui sous-tend la perte auditive chez les patients porteurs de mutations. Le projet bénéficiera de modèles animaux spécifiques pour les formes classiques et atypiques de cette maladie.

Bénéfices attendus

En caractérisant les atteintes auditives dans les formes génétiques de surdité, notre projet permettra les avancées suivantes : -Nous déterminerons les mécanismes physiopathologiques à l’origine des surdités dans les patients porteurs des mutations du gène étudiées. -Ce gène étant impliqué dans un complexe impliqué dans l’immunité innée, notre travail ouvrira la porte à l’identification d’autres protéines du complexe comme potentiellement impliquées dans la surdité -Un grand nombre de cas de surdités progressives reste souvent inexpliqué. En caractérisant très finement la signature audiologique des souris mutantes et avec un travail similaire qui est en cours chez les patients porteurs de mutations dans ce gène, notre travail aidera à identifier les cas de surdités non expliqués qui pourraient être liés à une mutation de ce gène. Enfin, notre travail générera des pistes pour de nouvelles approches thérapeutiques susceptibles de prévenir la surdité chez les patients porteurs de mutations de ce gène. L’existence de médicaments capables d’inhiber le complexe dont fait partie cette molécule rend cette perspective très concrète.

Procédures

Les interventions seront : - Une inflammation de l’oreille sera induite sur les modèles animaux de deux façons possibles : i) soit par une surexposition sonore de quelques heures soit ii) par l’injection d’une faible dose d’une substance dans l’abdomen sur trois jours par doses croissantes pour mimer une petite infection. - Nous effectuerons un suivi de l’audition de modèles de souris pour des atteintes auditives à la suite de l’activation de l’inflammation dépendant du gène étudié. Ce suivi aura lieu approximativement toutes les deux semaines afin de suivre l’évolution de la surdité induite par l’inflammation de l‘oreille. Chaque suivi dure environ 1h. - Une partie des animaux auront une chirurgie terminale de 2h pour faire des mesures fonctionnelles dans l’oreille.

Impact sur les animaux

La plupart des procédures impliquent des expérimentations légères ou une succession d’expérimentations légères. On ne s’attend donc pas à des nuisances majeures ou effets indésirables sur les animaux. Les modèles de souris que nous utilisons ont des modifications génétiques entraînant des surdités périphériques associées parfois à des atteintes auditives centrales. La souris reposant principalement sur l’olfaction, son système sensoriel et dans une moindre mesure sur son système visuel lors des interactions sociales, ces atteintes auditives sont largement compensées et n’entrainent pas de phénotype dommageable. Quelques manipulations du projet pourraient entraîner de légères nuisances : -Certaines expositions sonores pourraient induire un stress temporaire sur l’animal. C’est pourquoi les différentes mesures utilisant ces tests sont espacées dans le temps. Les études des cinquante dernières années sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité liée au bruit chez les rongeurs. -En ce qui concerne les chirurgies, celles-ci sont terminales et donc ne sont pas susceptibles d’entraîner une douleur. -En ce qui concerne l’induction de la réaction inflammatoire, celle-ci sera limitée à l’oreille et pourrait causer une douleur légère et/ou un inconfort léger. - Les doses typiquement utilisées sont 4-5 fois inférieures à celles utilisées pour induire une réaction inflammatoire forte qui peut entraîner des pertes de poids importantes les deux premiers jours après injection puis une reprise de poids les jours suivants. Aux doses plus faibles, on s’attend à pas d’effet ou un effet mineur. De plus, une douleur légère au point d’injection de et une réduction de l’activité et de la mobilité peut survenir pendant quelques jours.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, l’ensemble des animaux du projet sont des organismes génétiquement modifiés, de nombreuses procédures nécessitent la mise à mort de l’animal pour récupérer des tissus afin d’effectuer différentes expérimentations ex vivo. D’autres procédures impliquent des interventions qui signifient qu’on ne peut pas les réutiliser. La plupart des animaux sont porteurs de mutations de gènes de surdité très spécifiques rendant leur réutilisation, par d’autres équipes. Cependant, une fois les animaux mis à mort, nous essayons de les utiliser pour des entraînements à la dissection et la mise au point de nouveaux protocoles lorsque c’est possible. Ces partages se font typiquement à l’échelle du centre de recherche au-delà de notre équipe.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative que ce soient des études au niveau cellulaire ou tissulaire ne sont connues et envisagées pour ce projet. En effet, il n’est pas possible actuellement de simuler de manière pertinente les effets des entrées sensorielles sur des circuits cérébraux composés de millions de neurones densément connectés, en interaction avec l’évolution des niveaux de stress des animaux.

Réduction

La détermination du nombre d’animaux a été réalisée en tenant compte à la fois des contraintes techniques (coût, hébergement, temps, etc.) et de l’expertise développée dans l’équipe sur des expériences similaires. Pour les procédures qui en nécessitent, une analyse de puissance détaillée a été effectuée. Dans toutes les procédures, des cages standard de 5 animaux seront utilisées.

Raffinement

Les animaux du projet seront suivis quotidiennement. Ce projet ne concerne que des procédures dont la mise en œuvre ne devrait se traduire ni par une dégradation de l’état de santé de l’animal ni par des douleurs importantes. Si nous observions un comportement anormal en termes de santé (observation du poids, du pelage, etc.) dès l’initiation de l’intégration dans un groupe expérimental, l’animal serait immédiatement mis à mort. Plusieurs méthodes de raffinement sont utilisées dans nos projets. Nous avons par exemple veillé à ce que nos tests comportementaux ne reposent pas sur des motivations par des déprivations de nourriture ou d’eau. Lors des enregistrement de données sous anesthésie, des antalgiques et des couvertures chauffantes sont utilisées afin de limiter au strict minimum le risque d’hypothermie et de stress physique. Nous utilisons également des enrichissements de cage par défaut et renforcés après certaines procédures. En cas d’hypothermie, des couvertures chauffantes sur le fond de la cage sont également utilisées. En cas de déshydratation, des réhydratation sous-cutanées sont réalisées ainsi que la fourniture de gel hydrique.

Choix des espèces

Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs périphérique et central de rongeurs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. Le projet impliquera des animaux de stades différents. Nous étudierons les conséquences de l’inflammation principalement à des âges adultes mais nous serons amenés à considérer de temps en temps des expériences de suivi chez la jeune souris afin de s’assurer (en cas de doute) qu’il n’y a par exemple pas d’inflammation spontanée avant son induction. L’étude utilisera des animaux âgés de 0 jour (naissance) à l’âge adulte (15 mois maximum).

75 porcs de six à dix semaines subissent chacun dix contentions au lasso réparties sur quatre semaines, plus vingt prélèvements de salive, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le filin d'acier serré autour de la mâchoire supérieure peut provoquer des douleurs aux points de contact avec le corps, sur un groin que le porteur décrit lui-même comme un organe sensible. Une prise de sang à la jugulaire et un écouvillonnage nasal accompagnent les contentions. Le projet est déclaré au titre du bien-être des animaux non-humains, et se termine par la dissection des 75 porcs pour vérifier l'état de leur groin et chercher des ulcères gastriques.

Objectifs

Certains actes vétérinaires, en élevage commercial ou lors de projets de recherche, nécessitent l’immobilisation complète des porcs pour la sécurité des animaux eux-mêmes comme des opérateurs qui les réalisent. Cette contention est communément effectuée par l’utilisation d’un filin généralement en acier (dit « lasso ») disposé autour de la mâchoire supérieure de l’animal. Le groin étant un organe sensible, la pression exercée par un lasso sur le groin peut se révéler douloureuse. Cette opération peut aussi être dangereuse pour les opérateurs compte tenu des réactions parfois violentes des animaux. Que ce soit pour l’amélioration du bien-être des animaux, des opérateurs réalisant les actes vétérinaires ou par souci de rendre les résultats des projets scientifiques de meilleure qualité, les recherches sur l’impact de la contention des animaux sont cruciales. L’outil communément utilisé ne donne pas entière satisfaction. Son remplacement ou son perfectionnement sont par conséquent primordiaux pour les études chez le porc. À notre connaissance, il existe également aucune étude qualifiant les niveaux de stress des animaux placés en contention. Notre projet se propose donc d’évaluer l’état de stress des porcs en croissance lors de deux actes vétérinaires communément réalisés sous contention au lasso pour obtenir des valeurs de référence : une prise de sang à la veine jugulaire et un écouvillonnage nasal. Conjointement, deux dispositifs alternatifs de contention pressentis pour générer moins de stress chez l’animal (un lasso recouvert d’une gaine de protection en matière plastique et une cage de contention) seront mis à l’épreuve. Ces évaluations des niveaux de stress s’appuieront sur l’utilisation d’indicateurs physiologiques et comportementaux. Le bien-être de l’opérateur réalisant la contention étant tout aussi important et pouvant directement affecté le bien-être des animaux (approche OneWelfare), nous réaliserons en parallèle une évaluation de l’ergonomie des différents outils et une appréciation du ressenti des opérateurs.

Bénéfices attendus

Ces évaluations complètes des niveaux de stress vont nous permettre d’obtenir des valeurs de référence sur les niveaux de stress ressentis par les porcs lors des contentions classiques réalisés au lasso filin acier ; ainsi qu’avec deux outils de contention alternatifs. Cela devrait nous permettre d’émettre des recommandations pour le développement de futurs outils de ce type aussi bien en faveur du bien-être des animaux, de la sécurité et du confort des opérateurs, tout en s’assurant de la qualité des actes vétérinaires effectués. S’il s’avère qu’un des dispositifs alternatifs testés dans le projet minimise le stress des animaux et des opérateurs, il pourrait également directement être recommandé en substitution des lassos communément utilisés. La mise en évidence d’un outil fonctionnel, bénéfique pour les animaux et les opérateurs, qui de surcroît garantit la qualité des actes effectués représenterait une formidable opportunité pour la réalisation de nombreuses recherches à venir par la facilité de prélèvements sur les animaux.

Procédures

Les porcs seront soumis à 10 contentions au total réparties sur 4 semaines. Les contentions dureront 1 minute. Lors de ces contentions, une prise de sang à la veine jugulaire ainsi qu’un écouvillonnage nasal seront réalisés. Ils auront également 20 prélèvements salivaires répartis sur 5 semaines. Ces prélèvements seront effectués par mâchouillement volontaire et spontané des animaux préalablement habitués.

Impact sur les animaux

Afin de rendre compte du stress subi par les animaux lors des contentions, ces derniers vont nécessairement être exposés à des contentions multiples ainsi qu’à des actes de prélèvements de type vétérinaires. Il est attendu que ces contentions génèrent des stress de courtes durées liés aux manipulations. Les animaux pourront aussi potentiellement ressentir des douleurs aux points entre les dispositifs de contention et leur corps (ex : pression de la sangle du lasso serrée autour de la mâchoire supérieure), tout comme aux zones de réalisation des actes invasifs (cou pour la prise de sang à la veine jugulaire ; naseau pour l’écouvillonnage nasal).

Devenir

En fin d’essai, au cours des autopsies, les animaux seront disséqués afin d’apprécier l’état des parties anatomiques en contact avec les outils de contention (ex : groin), ainsi que la présence d’ulcères gastriques (signe de stress chronique chez l’animal).

Remplacement

Le projet concerne spécifiquement l’espèce porcine. Les animaux eux-mêmes sont nécessaires, le processus de stress étant un état complexe et dynamique que l’on ne peut pas recréer sans considérer l’individu dans son entièreté.

Réduction

Ce protocole expérimental est pensé de façon à minimiser le nombre de porcs utilisés tout en conservant un effectif suffisant pour avoir des résultats statistiquement significatifs. Le stress ressenti lors d’une manipulation est propre à chaque individu. Par ailleurs, il existe également une variabilité inter-individuelle de réponse propre aux différents dispositifs de contention qui vont être testés. Le groupe des animaux témoins pour lequel l’absence de dispositif de contention n’engendrera pas de variabilité supplémentaire a été par conséquent légèrement réduit.

Raffinement

Les animaux seront élevés en groupes stables au cours de la durée du projet. Ils seront alimentés à volonté et auront accès à discrétion à de l’eau. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes et des plaques de couchage dans les jours qui suivent le sevrage. Ils auront accès à des jouets type "mordille", "tourniquet", etc. Après chaque prélèvement, une récompense type grenadine leur sera distribuée. Une attention particulière sera apportée au suivi clinique de chaque animal pendant toute la durée de la procédure expérimentale.

Choix des espèces

Ce projet concerne directement la filière porcine, affectée par la problématique des prélèvements invasifs à effectuer sur animal vigile. Le porc est l’espèce cible. Il est donc la seule espèce adaptée aux objectifs de ladite étude. Les animaux seront testés de 6 à 10 semaines d’âge, ce qui correspond à la fin de la période du post-sevrage en élevage. Ce choix est fait en raison de la facilité de mis au point des alternatives utilisées dans les essais (taille restreinte des outils) et sera, de toute façon, déclinable sur des animaux plus agés en augmentant au besoin la taille du dispositif.

Anesthésiées vingt minutes, ouvertes sur un centimètre d'abdomen, injectées de cellules tumorales dans le foie : les souris de ce protocole repassent ensuite sous anesthésie jusqu'à sept fois en six semaines pour des échographies et des imageries. Entre le troisième et le dix-septième jour après la greffe, elles reçoivent jusqu'à six injections de traitement, dont la moitié sous anesthésie. 882 souris sont concernées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, et le porteur présente ce suivi répété du même individu comme une réduction "drastique" du nombre d'animaux. Toutes sont tuées à la fin de leur procédure et leurs organes prélevés.

Objectifs

Le projet concerne un nouveau traitement du cancer du foie, une des causes les plus courantes de décès liés au cancer avec une incidence en constante augmentation (830 000 décès dans le monde en 2020). L’absence de traitement efficace et les difficultés de diagnostic précoce en font un cancer de mauvais pronostic par le plan stratégique national décennal de lutte contre le cancer (survie à 5 ans de seulement 18%). Le carcinome hépatocellulaire représente plus de 80% des cancers primitifs du foie et se développe fréquemment sur un fond de maladie hépatique chronique causée par l'alcool, l'hépatite virale B ou C chronique ou le syndrome métabolique associé à un excès de poids et au diabète. Le carcinome hépatocellulaire est souvent diagnostiqué tardivement et se prête mal à un traitement curatif. L'objectif du projet est d’apporter la preuve de concept du bénéfice de l’association d’une vaccination antitumorale avec l’action de virus capable d’éliminer préférentiellement des cellules cancéreuses dans un contexte de cancer du foie. Pour la formule de vaccin, nous utiliserons de l’ARNm comportant des modifications moléculaires qui ont démontré leur valeur dans les vaccins ARNm actuellement très utilisés dans la pandémie COVID. L’effet protecteur et curatif de la vaccination, ainsi que l’apport d’un traitement combinant le vaccin et le virus ciblant les cellules cancéreuses, seront évalués. Ce projet est réparti sur 3 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les traitements du carcinome hépatocellulaire restent insatisfaisants. Ils reposent essentiellement sur des interventions lourdes ou des thérapies peu efficaces. L’immunothérapie est basée sur la stimulation du système immunitaire du patient et reste une option thérapeutique de choix, mais en l’état elle doit être améliorée pour atteindre un niveau d’efficacité satisfaisant. Les vaccins en cours de test contre le cancer du foie utilisent surtout de petits morceaux de protéines fabriqués en laboratoire pour apprendre au système immunitaire à reconnaître et attaquer les cellules cancéreuses. De récentes avancées dans l’utilisation de l’ARNm et des nanoparticules ouvrent la voie à une nouvelle génération de vaccins contre le cancer. Par exemple, des essais sur le cancer de la peau ont montré qu’associer une immunothérapie ciblée avec un vaccin à ARNm transporté par des nanoparticules lipidiques pouvait renforcer la réponse du système immunitaire contre la tumeur. Le projet présenté ici innove en combinant deux approches puissantes : d’une part, des virus spéciaux qui attaquent directement la tumeur et facilitent l’accès du système immunitaire aux cellules cancéreuses, et d’autre part, un vaccin à ARNm qui entraîne le système immunitaire à reconnaître les cellules tumorales. Cette stratégie combinée vise à : (1) apprendre au système immunitaire à cibler précisément la tumeur grâce au vaccin, et (2) intensifier la destruction des cellules cancéreuses par l’action des virus, tout en stimulant davantage la réponse immunitaire.

Procédures

Un lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 5 minutes puis une injection de 30 secondes, réalisé dans l’EU1. Un autre lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre, puis une injection (30 secondes) dans le foie (réalisé dans l’EU1 ou l’EU2), puis 7 anesthésies d'environ 5 à 20 minutes chacune afin d'effectuer à chaque fois une échographie et/ou une imagerie, sur une durée totale de 6 semaines (5 imageries réalisées dans l’EU2 et 2 échographies réalisée dans l’EU3). D’autres lots d’animaux auront une anesthésie d'environ 5 minutes puis une injection de 30 secondes, suivi de 3 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection), avec anesthésie (5 minutes pour l’injection) pour la moitié des animaux, entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). Un 5ème lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre, puis une injection (30 secondes) dans le foie (réalisé dans l’EU1 ou l’EU2), suivi de 3 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection) sous anesthésie (5 minutes) entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). 5 anesthésies d'environ 5 à 20 minutes chacune seront réalisées afin d'effectuer à chaque fois une imagerie, sur une durée totale de 6 semaines (réalisées dans l’EU2). Un 6ème lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 5 minutes puis une à deux injections de 30 secondes selon la pousse tumorale, suivi de 6 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection), dont 3 réalisées avec anesthésie (5 minutes pour l’injection), entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). Un 7ème lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre, puis une à deux injections (30 secondes) dans le foie (réalisé dans l’EU1 ou l’EU2), suivi de 6 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection), dont 3 réalisées avec anesthésie (5 minutes pour l’injection), entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). 5 anesthésies d'environ 5 à 20 minutes chacune seront réalisées afin d'effectuer à chaque fois une imagerie, sur une durée totale de 6 semaines (réalisées dans l’EU2).

Impact sur les animaux

Un stress peut intervenir lors de la préhension de l'animal dans le cadre des différentes interventions (injection, anesthésie, mesure de la taille des tumeurs) et une douleur légère peut apparaitre au point d'injection (cellules tumorales et traitement). La chirurgie pour injecter les cellules tumorales dans le foie peut entrainer une douleur post-opératoire au niveau de la suture, voire une infection locale. Le niveau de nuisance dû à la croissance tumorale peut augmenter avec la taille de la tumeur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chacune des procédures et leurs organes prélevés en post-mortem pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Le foie est un organe complexe composé de nombreux types de cellules, dont les hépatocytes et des cellules immunitaires. Les modèles classiques en laboratoire, comme les cultures de cellules, ne permettent pas de reproduire cette complexité. Des modèles plus avancés, comme les organoïdes ou les organes sur puce, imitent mieux certaines fonctions du foie et seront utilisés pour évaluer la toxicité des traitements. Cependant, ce projet repose sur des interactions complexes entre les cellules tumorales, le système immunitaire et l’environnement du foie. Aucun modèle de laboratoire ne permet aujourd’hui de recréer cette dynamique, d’où la nécessité d’utiliser un modèle animal

Réduction

Les traitements seront analysés et présélectionnés par une série d’essais in vitro sur cellules immunitaires et hépatiques en culture. Cette sélection in vitro des meilleurs traitements contribuera à réduire le nombre d’individus inclus dans le projet et permettra d’affiner les protocoles en fonction du type de réponses immunitaires désiré. Seuls les traitements présentant un intérêt seront testés chez la souris. Un suivi au cours du temps, sur un même individu, de la taille des tumeurs sera réalisé et permettra de réduire drastiquement le nombre d'animaux qui aurait été utilisé pour obtenir des courbes de croissance de la tumeur par mise à mort des animaux à chaque temps étudié. Enfin, un calcul des effectifs nécessaires nous permettra d'atteindre une significativité des résultats avec un minimum d'animaux.

Raffinement

Pour limiter la souffrance animale, la taille des tumeurs sera suivie afin qu’elles ne dépassent jamais les limites acceptées en recherche sur le cancer. Nous améliorerons aussi notre protocole en nous appuyant sur des études montrant que les nanoparticules utilisées sont bien tolérées et que le moment de la journée où la greffe est réalisée peut influencer son succès. Ainsi, nous choisirons le moment le plus adapté. L’utilisation d’analgésique et d’anesthésique sera réalisée lorsque nécessaire et des points limites prédictifs et précoces, basés sur des grilles score adaptés aux interventions sur l’animal, avec des critères d’arrêt seront mis en place afin de réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal. Les animaux seront transportés par un expérimentateur compétant suivant la réglementation, dans des cages occultées, contenant de l'enrichissement et des croquettes mouillées.

Choix des espèces

Le développement de tumeur par greffe chez la souris est facilement réalisable, reproductible et est un modèle de référence dans le domaine de l’immuno-oncologie. Les lignées de souris présentent l'intérêt d'être génétiquement homogènes, réduisant ainsi la variabilité des réponses immunitaires. Nous emploierons des souris de deux souches différentes qui présentent l'avantage d'être bien connues dans leur capacité de réponse immunitaire. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines pour les greffes, ainsi que décrit dans la littérature. C’est aussi le stade de développement auquel leur immunité est effective.

Les rates donneuses sont tuées pour qu'on récupère leurs embryons, et les mères porteuses opérées le sont au plus tard au sevrage de leurs petits, faute de pouvoir être réutilisées après une chirurgie. 3 725 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, seules les femelles dont le cycle a été synchronisé sans opération pouvant repartir vers un autre projet, jusqu'à quatre fois. Les donneuses reçoivent deux injections d'hormones à 48 heures d'intervalle sous contention, les mères porteuses quatre injections et une chirurgie de transfert d'embryons de cinq minutes, avec un risque d'automutilation de la cicatrice que le porteur signale. L'activité est vendue comme prestation de service, et le porteur écrit que la quantité d'animaux "a été adaptée pour chaque procédure afin de remplir les conditions stipulées dans les contrats", sans approche statistique.

Objectifs

Notre travail est de créer, d’amplifier et d’archiver des lignées de rats génétiquement modifiées. Ces lignées peuvent devenir des modèles de maladies humaines et vont permettre de mieux comprendre leurs processus de développement. Ces modèles peuvent également répondre à d’autres intérêts scientifiques tout aussi importants (comme par exemple devenir des modèles de choix pour la recherche fondamentale). Ces rongeurs, en tant que modèle de maladies humaines, vont également permettre de tester des médicaments et de valider (ou d’invalider) des cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Notre coeur de métier est la création, l'amplification et l'archivage de lignées génétiquement modifiées de rats pour le service des chercheurs et de la commumauté scientifique. Notre rôle est de fournir aux chercheurs des lignées précises, établies et robustes en améliorant sans cesse nos techniques afin de répondre aux exigences de réduction et raffinement. La réduction du nombre d'animaux utilisés et leur bien-être est une préoccupation permanente.

Procédures

Les rates donneuses d'embryons vont subir 2 injections d'hormones à 48h d'intervalle pour stimuler la production d'embryons. Cet acte rapide se fait sur animaux vigiles et sous contention. Les rates mères-porteuses seront d'abord soumise à une injection de composé chimique pour synchroniser leur cycle (acte rapide, sur animaux vigiles sous contention), puis quelques jours plus tard (J+5), elles recevront lors de la chirurgie de transfert d'embryons ou d'insémination artificilelle : Une injection d'analgésique 30 minutes avant l'injection du cocktail anesthésique (actes rapides, sur animaux vigiles sous contention). Une fois l'endormissment suffisamment profond, la chirugie est réalisée. Elle dure environ 5 minutes par animal. Avant le réveil des animaux, une dernière injection d'anti-inflammatoire combinée à une réhydratation sera pratiquée. Chaque femelle mère-porteuse recevra au total 4 injections. (composé pour la synchronisation, analgésique, anesthésique et anti-inflammatoire/réhydratation).

Impact sur les animaux

Les rats peuvent ressentir un léger stress de courte durée lors des manipulation/contentions pour réaliser les différentes injections. Lors des injections des différents produits utilisés dans cette procédure (hormones, composé pour la synchronisation, analgésique, anesthésique et anti-inflammatoire), les animaux vont sentir une légère douleur de courte durée, le temps de l'introduction de l'aiguille. Les composés injectés sont tous très bien tolérés, mais le site d'injection sera surveillé pour s'assurer qu'il n'y a pas d'inflammation, d'infection ou de lésions de grattage. En post-opératoire, l'animal peut ressentir une gêne, entièrement prise en charge par la couverture antalgique. La plaie générée par la chirurgie sera étroitement surveillée car elle peut s'inflammer ou s'infecter dans de très rares cas. Les animaux en post chirurgie peuvent s'attaquer à leur cicatrice : soit enlever les agrafes, soit ronger la peau autour (automutilation).

Devenir

Les donneuse d'embryons pour la création et l'archivage des lignées créées seront mises à mort pour récupérer les embryons au stade souhaité. Pour les mères-porteuses, dès lors qu'il y a eu la chirurgie de transfert d'embryon ou de gamètes, elle seront mises à mort soit le lendemain de la mise bas théorique (donc à J+23 de la chirurgie) pour pratiquer une césarienne, si elles n'ont pas mis bas naturellement, ou au plus tard au sevrage de leurs petits (soit 3-4 semaines post partum). Nous ne pouvons pas les réutiliser comme reproductrices ou de nouveau mère porteuses, ayant déjà subi une chirurgie. En revanche, pour les femelles mères porteuses dont le cycle a juste été synchronisé, donc sans avoir été opérées, elle peuvent être réutilisées dans la limite de 4 fois en respectant un temps de repos de minimum 21 jours entre les injections de synchronisation pour un autre projet dans le cadre de nos activités de service.

Remplacement

Il n'y a pas d’autre possibilité que le recours à l’animal vivant pour toutes ces techniques de création, d'amplification et d'archivage de lignées de rats génétiquement modifiées. L'état actuel de nos connaissances ne permettent pas de s'affranchir d'utiliser des animaux en recherche fondamentale ou appliquée.

Réduction

La réduction du nombre d'animaux utilisés et leur bien-être est une préoccupation permanente. L’amélioration des techniques permet sans cesse de répondre aux exigences de réduction et de raffinement. Le raffinement de nos techniques de transgénèse, de procréation médicalement assistée et de cryoconservation permet de générer de moins en moins d'animaux pour l'ensemble des prestations de l'institut, ce qui permet de réduire de manière importante la quantité d'animaux générés. Ces techniques sont utilisées en prestation de service, la quantité d'animaux utilisée a été adaptée pour chaque procédure afin de remplir les conditions stipulées dans les contrats avec les clients. Il n'y a donc pas d'approche statistique.

Raffinement

Le personnel en charge de cette étude est habitué à ces gestes techniques car ils sont pratiqués en routine depuis des années dans notre laboratoire. Les femelles restent sous surveillance après leurs injections, afin d’observer aucune apparence physique externe de souffrance. Lors de la chirurgie, les animaux sont anesthésiés et reçoivent un traitement antalgique adapté à ce type de procédure. Du gel oculaire est placé systématiquement sur les yeux des animaux anesthésiés afin de prévenir tout dommage de la cornée de l’animal. De plus, les animaux anesthésiés sont placés sur une plaque chauffante pour palier toute déperdition de chaleur liée à l’anesthésie. Une injection conjointe de sérum physiologique tiédi sera réalisée pour compenser les pertes hydriques liées à la chirurgie et limiter la déperdition de chaleur. Cette compensation a pour objectif de permettre aux animaux une récupération idéale post chirurgie. Les animaux opérés restent en observation jusqu’à leur complet réveil en bonne forme (effets de l'anesthésie dissipés et reprise de mobilité), dans leur cage placée sur une platine chauffante à 37°C. Nos rats sont hébergés en cages ventilées, en groupe dans la mesure du possible, avec de multiples enrichissements : bâton de bois à ronger, balles de bois à ronger, nids, croquettes de nourriture au fond de la cage.

Choix des espèces

Le rat est un très bon modèle d'expérimentation animale car il est de petite taille, son génome est parfaitement connu et il a un taux de reproduction très rapide. Ils sont de très bons modèles expérimentaux puisque 99% de leurs gènes présentent un gène homologue chez l'Homme. Il est couramment utilisé par les chercheurs pour des créations de lignées transgéniques. Les femelles utilisées pour produire les embryons sont prépubères car elles répondent mieux aux traitements hormonal de superovulation. (réduit le nombre de femelles donneuses utilisées) Les mères-porteuses utilisées sont de jeunes adultes matures. La souche choisie est connue pour être d’excellentes mères, très calmes, qui peuvent donner naissance à de grandes portées de nouveau- nés, ce qui permet de réduire significativement le nombre de femelles mères porteuses utilisées.

882 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie d'entre elles subit une anesthésie de vingt minutes, une incision abdominale d'un centimètre et une injection de cellules tumorales directement dans le foie, puis jusqu'à sept nouvelles anesthésies en six semaines pour des imageries, et jusqu'à six injections de traitement. La preuve de concept recherchée, associer un vaccin à ARNm et un virus tueur de cellules cancéreuses contre le carcinome hépatocellulaire, reste une hypothèse de laboratoire, quand les tumeurs greffées, elles, grossissent réellement dans le foie des souris. Le porteur mentionne des organoïdes et des organes sur puce qu'il emploiera pour la toxicité, puis conclut à la "nécessité" d'un modèle animal pour le reste.

Objectifs

Le projet concerne un nouveau traitement du cancer du foie, une des causes les plus courantes de décès liés au cancer avec une incidence en constante augmentation (830 000 décès dans le monde en 2020). L’absence de traitement efficace et les difficultés de diagnostic précoce en font un cancer de mauvais pronostic par le plan stratégique national décennal de lutte contre le cancer (survie à 5 ans de seulement 18%). Le carcinome hépatocellulaire représente plus de 80% des cancers primitifs du foie et se développe fréquemment sur un fond de maladie hépatique chronique causée par l'alcool, l'hépatite virale B ou C chronique ou le syndrome métabolique associé à un excès de poids et au diabète. Le carcinome hépatocellulaire est souvent diagnostiqué tardivement et se prête mal à un traitement curatif. L'objectif du projet est d’apporter la preuve de concept du bénéfice de l’association d’une vaccination antitumorale avec l’action de virus capable d’éliminer préférentiellement des cellules cancéreuses dans un contexte de cancer du foie. Pour la formule de vaccin, nous utiliserons de l’ARNm comportant des modifications moléculaires qui ont démontré leur valeur dans les vaccins ARNm actuellement très utilisés dans la pandémie COVID. L’effet protecteur et curatif de la vaccination, ainsi que l’apport d’un traitement combinant le vaccin et le virus ciblant les cellules cancéreuses, seront évalués. Ce projet est réparti sur 3 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les traitements du carcinome hépatocellulaire restent insatisfaisants. Ils reposent essentiellement sur des interventions lourdes ou des thérapies peu efficaces. L’immunothérapie est basée sur la stimulation du système immunitaire du patient et reste une option thérapeutique de choix, mais en l’état elle doit être améliorée pour atteindre un niveau d’efficacité satisfaisant. Les vaccins en cours de test contre le cancer du foie utilisent surtout de petits morceaux de protéines fabriqués en laboratoire pour apprendre au système immunitaire à reconnaître et attaquer les cellules cancéreuses. De récentes avancées dans l’utilisation de l’ARNm et des nanoparticules ouvrent la voie à une nouvelle génération de vaccins contre le cancer. Par exemple, des essais sur le cancer de la peau ont montré qu’associer une immunothérapie ciblée avec un vaccin à ARNm transporté par des nanoparticules lipidiques pouvait renforcer la réponse du système immunitaire contre la tumeur. Le projet présenté ici innove en combinant deux approches puissantes : d’une part, des virus spéciaux qui attaquent directement la tumeur et facilitent l’accès du système immunitaire aux cellules cancéreuses, et d’autre part, un vaccin à ARNm qui entraîne le système immunitaire à reconnaître les cellules tumorales. Cette stratégie combinée vise à : (1) apprendre au système immunitaire à cibler précisément la tumeur grâce au vaccin, et (2) intensifier la destruction des cellules cancéreuses par l’action des virus, tout en stimulant davantage la réponse immunitaire.

Procédures

Un lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 5 minutes puis une injection de 30 secondes, réalisé dans l’EU1. Un autre lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre, puis une injection (30 secondes) dans le foie (réalisé dans l’EU1 ou l’EU2), puis 7 anesthésies d'environ 5 à 20 minutes chacune afin d'effectuer à chaque fois une échographie et/ou une imagerie, sur une durée totale de 6 semaines (5 imageries réalisées dans l’EU2 et 2 échographies réalisée dans l’EU3). D’autres lots d’animaux auront une anesthésie d'environ 5 minutes puis une injection de 30 secondes, suivi de 3 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection), avec anesthésie (5 minutes pour l’injection) pour la moitié des animaux, entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). Un 5ème lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre, puis une injection (30 secondes) dans le foie (réalisé dans l’EU1 ou l’EU2), suivi de 3 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection) sous anesthésie (5 minutes) entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). 5 anesthésies d'environ 5 à 20 minutes chacune seront réalisées afin d'effectuer à chaque fois une imagerie, sur une durée totale de 6 semaines (réalisées dans l’EU2). Un 6ème lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 5 minutes puis une à deux injections de 30 secondes selon la pousse tumorale, suivi de 6 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection), dont 3 réalisées avec anesthésie (5 minutes pour l’injection), entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). Un 7ème lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre, puis une à deux injections (30 secondes) dans le foie (réalisé dans l’EU1 ou l’EU2), suivi de 6 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection), dont 3 réalisées avec anesthésie (5 minutes pour l’injection), entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). 5 anesthésies d'environ 5 à 20 minutes chacune seront réalisées afin d'effectuer à chaque fois une imagerie, sur une durée totale de 6 semaines (réalisées dans l’EU2).

Impact sur les animaux

Un stress peut intervenir lors de la préhension de l'animal dans le cadre des différentes interventions (injection, anesthésie, mesure de la taille des tumeurs) et une douleur légère peut apparaitre au point d'injection (cellules tumorales et traitement). La chirurgie pour injecter les cellules tumorales dans le foie peut entrainer une douleur post-opératoire au niveau de la suture, voire une infection locale. Le niveau de nuisance dû à la croissance tumorale peut augmenter avec la taille de la tumeur.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chacune des procédures et leurs organes prélevés en post-mortem pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Le foie est un organe complexe composé de nombreux types de cellules, dont les hépatocytes et des cellules immunitaires. Les modèles classiques en laboratoire, comme les cultures de cellules, ne permettent pas de reproduire cette complexité. Des modèles plus avancés, comme les organoïdes ou les organes sur puce, imitent mieux certaines fonctions du foie et seront utilisés pour évaluer la toxicité des traitements. Cependant, ce projet repose sur des interactions complexes entre les cellules tumorales, le système immunitaire et l’environnement du foie. Aucun modèle de laboratoire ne permet aujourd’hui de recréer cette dynamique, d’où la nécessité d’utiliser un modèle animal

Réduction

Les traitements seront analysés et présélectionnés par une série d’essais in vitro sur cellules immunitaires et hépatiques en culture. Cette sélection in vitro des meilleurs traitements contribuera à réduire le nombre d’individus inclus dans le projet et permettra d’affiner les protocoles en fonction du type de réponses immunitaires désiré. Seuls les traitements présentant un intérêt seront testés chez la souris. Un suivi au cours du temps, sur un même individu, de la taille des tumeurs sera réalisé et permettra de réduire drastiquement le nombre d'animaux qui aurait été utilisé pour obtenir des courbes de croissance de la tumeur par mise à mort des animaux à chaque temps étudié. Enfin, un calcul des effectifs nécessaires nous permettra d'atteindre une significativité des résultats avec un minimum d'animaux.

Raffinement

Pour limiter la souffrance animale, la taille des tumeurs sera suivie afin qu’elles ne dépassent jamais les limites acceptées en recherche sur le cancer. Nous améliorerons aussi notre protocole en nous appuyant sur des études montrant que les nanoparticules utilisées sont bien tolérées et que le moment de la journée où la greffe est réalisée peut influencer son succès. Ainsi, nous choisirons le moment le plus adapté. L’utilisation d’analgésique et d’anesthésique sera réalisée lorsque nécessaire et des points limites prédictifs et précoces, basés sur des grilles score adaptés aux interventions sur l’animal, avec des critères d’arrêt seront mis en place afin de réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal. Les animaux seront transportés par un expérimentateur compétant suivant la réglementation, dans des cages occultées, contenant de l'enrichissement et des croquettes mouillées.

Choix des espèces

Le développement de tumeur par greffe chez la souris est facilement réalisable, reproductible et est un modèle de référence dans le domaine de l’immuno-oncologie. Les lignées de souris présentent l'intérêt d'être génétiquement homogènes, réduisant ainsi la variabilité des réponses immunitaires. Nous emploierons des souris de deux souches différentes qui présentent l'avantage d'être bien connues dans leur capacité de réponse immunitaire. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines pour les greffes, ainsi que décrit dans la littérature. C’est aussi le stade de développement auquel leur immunité est effective.