Procédures légères

Les souris A129 portent une mutation qui les prive d'une partie de leur réponse interféron, ce qui les rend plus sensibles aux infections virales et permet de détecter le vaccin dans leur sang. 3 256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour la plupart et modéré pour cent d'entre elles, la modification du projet ajoutant 160 femelles pour atteindre le nombre de gestations attendu. Mises à l'accouplement puis contrôlées chaque jour, les femelles gestantes reçoivent une injection sous-cutanée unique d'un candidat vaccin contre la fièvre jaune, suivie de prélèvements de sang sous anesthésie sans réveil. Après la mise à mort des mères, une césarienne permet d'examiner les portées, les fœtus étant séparés puis tués quelques minutes plus tard, couverts d'un tissu doux censé mimer un nid pour limiter le stress de la séparation.

Objectifs

MODIFICATION L’objectif de ce projet est la réalisation d’une étude réglementaire de toxicologie de la reproduction chez la souris immunodéprimée (souris A129). Cette étude consiste en l’administration unique du produit à tester (nouveau vaccin contre la fièvre jaune) suivie d’observations régulières des animaux, pesées corporelles, évaluation des portées, analyse macroscopique, évaluation de l’immunogénicité et de la virémie du produit. Cette étude permettra d’accéder aux essais cliniques afin de confirmer la sécurité et l’efficacité du produit chez l’Homme avant d’obtenir l’autorisation de mise sur le marché. POUR ATTEINDRE LE NOMBRE ATTENDU DE GESTATION, UNE MODIFICATION DU PROJET AVEC L’AJOUT DE 160 FEMELLES NECESSITE UNE NOUVELLE AUTORISATION DE PROJET

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont : - la détermination de la tolérance et de la sécurité d’un vaccin chez l'animal - l'obtention de l'autorisation d'essai clinique et la réalisation d'essai clinique chez l'homme avec le maximum de sécurité pour les personnes incluses - à long terme la mise sur le marché d’un vaccin présentant moins d’effets indésirables que celui déjà sur le marché.

Procédures

MODIFICATION La procédure consiste en l’administration unique d’un vaccin à tester (et vaccins de référence) par voie sous cutannée pendant la gestation. LES ANIMAUX SERONT MIS EN ACCOUPLEMENT AU PREALABLE POUR INDUIRE UNE GESTATION ET UNE VERIFICATION DE L’ACCOUPLEMENT SERA FAIT QUOTIDIENNEMENT. La durée de l’administration est rapide, généralement de quelques secondes. Les administrations sont suivies de prélèvements de sang pour mesurer la virémie et l’immunogénicité (collectés sur animaux anesthésiés et sans réveil). Après euthanasie des mères, une césarienne sera faite pour évaluer le développement morphologique des portées. Les fœtus seront donc séparés de leur mère pendant un temps court (quelques minutes) avant leur euthanasie.

Impact sur les animaux

MODIFICATION La procédure consistant en l’administration unique d’un candidat vaccin par voie sous cutanée, des effets toxicologiques ou pharmacologiques légers à modérés dus à l’administration du candidat médicament à tester (perte de poids transitoire, diminution d’activité transitoire, hypertermie transitoire, tremblements, irritation ou inflammation locale au site d’administration…). IL N’EST PAS ATTENDU D’EFFET INDESIRABLE SUITE A L’ACCOUPLEMENT DES ANIMAUX ENTRE EUX. DES EFFETS PHYSIOLOGIQUES LEGERS (MODIFICATION DU CYCLE OESTRAL) PEUVENT ETRE OBSERVES SUITE A LA VERIFICATION DE L’ACCOUPLEMENT.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin d’expérimentation en vue d’examens et de prélèvements d’organes, de sang ou de tissus (examens macroscopiques et examens fœtaux) tels que requis par la réglementation.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas d’alternatives à l’utilisation d’animaux qui permettent de déterminer la toxicité de substances sur un organisme entier, ni de déterminer sa distribution et la dose sans effet adverse. Dans ces études sur le développement embryo-fœtal, un relevé de poids, des signes cliniques et une évaluation macroscopique des organes ainsi que l’évaluation des fœtus et de leur developement est requise. Il est donc nécessaire d’avoir accès à l’animal dans son entièreté, pour évaluer l’ensemble des paramètres demandés par les lignes directrices en vigueur (ICH S5R3).

Réduction

MODIFICATION Le nombre d’animaux par groupe ou sous groupe (jusqu’à 104, INCLUANT LES animaux principaux et LES animaux dédiés aux prises de sang et/ou d’embryons en fonction des groupes et du taux d’accouplement ou de gestation) est établi au plus juste afin d’obtenir des résultats exploitables et en tenant compte des lignes directrices en vigueur (ICH S5R3), des objectifs de l’étude et du nombre de produits administrés (1 contrôle, 1 candidat vaccin et 2 vaccins de référence). Une seule dose sera testée pour chaque composé (dose humaine ou inférieure) et sera administrée en début de gestation ou en millieu de gestation (groupe control et candidat vaccin uniquement).

Raffinement

Pour améliorer leur bien être, les souris seront hébergées dans des cages sur fond plastique et sur de la litière avec un enrichissement adapté (papier kraft, batonnet de bois, cocon et mouchoir en papier) en portoirs ventillés pour limiter le risque d’exposition à des agents pathogènes. Les animaux sont observés au moins 1 fois par jour (incluant le week-end) afin de permettre la détection rapide de signes cliniques et d’agir au plus vite pour limiter toute souffrance ou douleur inutile. En cas de signes cliniques ayant des répercussions importantes sur le bien-être animal, des mesures rapides et appropriées seront prises par le vétérinaire. Le volume d’administration et de prélèvement de sang de cette étude se basent sur les recommandations éthiques. Après la césarienne, les fœtus seront couverts par un tissu doux avant l’euthanasie pour mimer un nid et limiter le stress physique lié à la séparation de la mère.

Choix des espèces

La souris est une espèce rongeur acceptée par les agences réglementaires. Le choix des souris transgénique de souche A129 a été est fait en fonction de critères scientifiques précis. Cette souche qui exprime une mutation sur certains interférons qui permet de détecter le vaccin dans le sang après administration d’un vaccin antiviral prophilactique, au contraire des rats et des souris wild-type. Elle est plus sensible aux infections virales car la mutation entraine des déficiences immunitaires facilitant une réplication virale sans complètement annuler la réponse immunitaire. Le virus de la fièvre jaune et son vaccin utilisant les interférons, l’utilisation de ces souris permet une meilleure exposition au vaccin. Les animaux utilisés dans l’étude seront des femelles sexuellement matures et accouplées par le fournisseur d’animaux et leurs petits.

1 214 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des souriceaux âgés de deux à sept jours sont placés sans contention pendant une heure au contact de colonies de puces, et lorsque plus de mille puces se nourrissent en même temps l'exsanguination entraîne une perte de conscience puis la mort en cinq minutes environ. Aucun anesthésique n'est administré, le porteur indiquant qu'il perturberait la prise de repas des puces, et des souris adultes rasées puis maintenues en contention stricte pendant une heure sont prévues en dernier recours. L'objectif est d'établir en laboratoire des colonies de puces de rongeurs pour étudier la transmission de la peste, et les molécules analgésiques que les puces injectent en piquant sont présentées comme "une forme de raffinement biologique supplémentaire".

Objectifs

La peste est une maladie transmise par les puces, qui touche principalement les rongeurs et parfois de nombreux mammifères, y compris les humains. Les raisons ayant conduit à la disparition de la peste en Europe, ainsi que les conditions d’une éventuelle réémergence ou propagation sur le territoire français et européen, restent mal comprises. Cette incertitude tient en grande partie à notre méconnaissance des espèces de puces présentes localement et de leur capacité à transmettre Yersinia pestis, que ce soit dans des contextes passés, actuels ou futurs. Or, cette connaissance est essentielle pour mieux comprendre les épidémies anciennes et évaluer les risques contemporains de résurgence. Dans ce contexte, la mise en place de colonies stables de puces constitue une étape préalable indispensable à toute étude expérimentale visant à caractériser leur biologie, leur comportement alimentaire et leur compétence vectorielle. Notre projet a ainsi pour objectif d’établir en laboratoire des colonies viables de puces de rongeurs, issues de sept espèces différentes au maximum, à partir d’individus adultes collectés sur le terrain. Pour cela, nous développerons des protocoles d’élevage spécifiques à chaque espèce, selon une approche progressive et itérative combinant observation, ajustements environnementaux et documentation rigoureuse. Ce travail vise à poser les bases d’un modèle expérimental aujourd’hui inexistant pour des espèces d’intérêt majeur en santé publique et animale.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu de ce projet est l’établissement de colonies stables de puces de rongeurs collectées sur le territoire français, dans des conditions expérimentales reproductibles. A ce jour, aucun protocole validé ne permet l’élevage en laboratoire de la plupart des espèces ciblées, pourtant cruciales pour comprendre leur écologie et leur rôle potentiel dans la transmission de pathogènes. L’obtention de telles colonies représentera une avancée méthodologique majeure, en fournissant pour la première fois un matériel biologique vivant, contrôlé et standardisé. Elle ouvrira la voie à des recherches expérimentales sur la biologie de ces puces, leur comportement alimentaire, leur physiologie et leur compétence vectorielle. Ce projet posera ainsi les bases d’une capacité expérimentale inédite, au service de la santé publique, de la santé animale et de l’écologie vectorielle.

Procédures

Les animaux seront exposés une seule fois au contract de puces pendant une durée d'heure.

Impact sur les animaux

L’exposition aux puces peut entraîner deux types de nuisance. D’une part, les piqûres elles-mêmes, atténuées par les propriétés analgésiques et anti-inflammatoires de leur salive. D’autre part, la perte sanguine liée à l’alimentation des insectes. Lors d’expositions avec un nombre limité de puces, la quantité de sang prélevée demeure faible et n’entraîne pas d’effet physiologique observable dans nos conditions. A l’inverse, lors du nourrissage de colonies établies sur souriceaux, l’alimentation simultanée d’un très grand nombre de puces provoque une perte de sang importante, conduisant rapidement à une perte de conscience puis au décès très rapide. Dans ce contexte, la phase consciente est brève et la perception nociceptive potentielle reste transitoire. Chez l’adulte, la contention est douce et de courte durée, constituant une source de stress supplémentaire, sans douleur manifeste observée.

Devenir

Quel que soit la procédure, les animaux ne seront pas maintenus en vie après leur utilisation. Leur prise en charge en fin de protocole est strictement encadrée et conforme aux exigences sanitaires et réglementaires en vigueur, afin d’éviter tout risque de contamination croisée et de garantir la sécurité des installations expérimentales.

Remplacement

A ce jour, il n’existe aucun modèle in vitro capable de reproduire le cycle biologique complet des puces ni leurs interactions physiologiques avec un hôte. Les puces sont des insectes hématophages stricts, et la prise de repas sanguin constitue un déclencheur physiologique essentiel à leur développement, leur reproduction et leur ponte. Ce processus dépend non seulement de la disponibilité du sang, mais aussi de signaux sensoriels et hormonaux issus du contact avec un hôte vivant. L’utilisation de systèmes artificiels de nourrissage, comme des membranes synthétiques, reste inadaptée à notre contexte expérimental. Ces dispositifs ne permettent ni une alimentation efficace ni une reproduction stable chez les espèces ciblées ici. Ils exposent également les puces à des anticoagulants et à des contaminations bactériennes ou fongiques, nécessitant l’ajout d’antimicrobiens qui altèrent leur physiologie et compromettent la validité des données. Enfin, il n’existe actuellement ni lignée cellulaire, ni modèle substitutif permettant de reconstituer ex vivo les interactions complexes entre la puce et son hôte. L’objectif de ce projet, en développant un modèle expérimental fiable, est aussi de jeter les bases de futures alternatives, plus éthiques, reproductibles et standardisées.

Réduction

L’utilisation de souriceaux permet de nourrir un grand nombre de puces tout en mobilisant un nombre réduit d’animaux. Un seul souriceau remplace le volume sanguin obtenu par 4 à 5 souris adultes dans un système artificiel équivalent. Cette approche contribue significativement à la réduction du nombre total d’individus utilisés. Par ailleurs, notre stratégie expérimentale a été conçue pour limiter autant que possible le recours aux animaux, tout en garantissant la validité scientifique du modèle. Lors de la phase initiale de mise au point, un nourrissage tous les deux jours est prévu pour identifier les conditions optimales de développement et de reproduction pour chaque espèce. Dès qu’une reproduction est confirmée, la fréquence est réduite progressivement à trois, puis à deux nourrissages hebdomadaires, en fonction de la dynamique de la colonie. Un suivi de la viabilité des colonies sera mis en place afin d’ajuster en continu le nombre d’animaux requis pour le maintien de chaque lignée.

Raffinement

Plusieurs mesures ont été intégrées pour minimiser la contrainte associée aux nourrissages. Les souriceaux seront exposés sans contention, pendant une durée limitée à une heure. Ce choix participe activement au raffinement, en limitant le stress et la douleur. Le stade utilisé (2 à 7 jours) correspond à une période de développement où le système nerveux central est encore immature, ce qui réduit la perception de la douleur. Si aucune reproduction n’est observée avec les souriceaux de 2 à 5 jours, un test sera réalisé avec des individus légèrement plus âgés (6 à 7 jours). En cas d’échec persistant, des souris adultes pourront être utilisées en dernier recours. Elles seront rasées sur le flanc et placées en contention stricte pendant une heure, avec surveillance renforcée du bien-être. Aucun anesthésique ne sera administré, car il perturberait la prise de repas des puces et compromettrait la reproductibilité du modèle. Des observations systématiques seront réalisées pendant et après l’exposition afin de détecter tout signe de souffrance (vocalisation, évitement, apathie). Le raffinement repose ainsi sur plusieurs axes : réduction de la durée d’exposition, sélection de stades faiblement sensibles à la douleur, recours limité aux adultes en cas d’échec des protocoles sur souriceaux, contention encadrée, et ajustement progressif du rythme de nourrissage au strict nécessaire. Enfin, les puces injectant naturellement des molécules aux propriétés analgésiques et anti-inflammatoires lors de la prise de sang, cet effet propre à leur mode de nutrition constitue une forme de raffinement biologique supplémentaire. Des points limites adaptés ont été définis pour chaque procédure afin de permettre l’identification précoce de signes de souffrance justifiant l’interruption de l’expérimentation et l’euthanasie immédiate de l’animal.

Choix des espèces

L’espèce choisie est la souris (Mus musculus), qui constitue un hôte naturel ou compatible pour de nombreuses espèces de puces ciblées par le projet. Elle est couramment utilisée pour le nourrissage de puces en contexte expérimental, notamment dans les protocoles publiés pour les espèces du genre Xenopsylla. Son statut d’espèce modèle, sa physiologie bien connue, et sa compatibilité avec les besoins alimentaires des puces en font un choix scientifiquement pertinent et largement validé pour ce type de protocole. Trois stades de développement pourront être utilisés dans ce projet, chacun sélectionné pour des raisons scientifiques et éthiques spécifiques. Souriceaux âgés de 2 à 5 jours. Il s’agit du stade privilégié pour les nourrissages expérimentaux. A ce stade, les souriceaux sont glabres, leur peau est fine, et leur système nerveux est encore en développement. Bien que la perception nociceptive soit présente dès la naissance, son intégration centrale est partielle, ce qui limite la réponse comportementale complexe. Lorsqu’ils sont exposés à un grand nombre de puces (>1000), l’exsanguination entraîne une perte rapide de conscience suivi du décès (~5 minutes après exposition). La perception nociceptive potentielle est intense mais très transitoire, et ne s’accompagne d’aucun signe comportemental prolongé. Par ailleurs, l’utilisation de souriceaux permet de réduire significativement le nombre total d’animaux utilisés : un seul individu alimente les puces alors qu’il faudrait 4 à 5 souris adultes nécessaires pour obtenir un volume sanguin équivalent lors d’un nourrissage artificiel. La faible pilosité des souriceaux permet également de limiter les risques de fuite des insectes, ce qui sécurise la procédure. Souriceaux âgés de 6 à 7 jours. Ce stade sera utilisé uniquement en cas d’échec avec les souriceaux plus jeunes. Les yeux sont encore fermés, mais une pilosité débute. Cette évolution pourrait influencer la prise alimentaire ou la reproduction des puces via des facteurs physiologiques ou comportementaux. Comme pour les stades plus jeunes, l’absence de contention et la durée d’exposition limitée permettent de maintenir un bon niveau de raffinement. Souris adultes. L’utilisation de souris adultes est envisagée en dernier recours, uniquement si les tentatives de nourrissage sur souriceaux s’avèrent inefficaces.

Quatre-vingt-huit souris seront réutilisées dans d'autres procédures, les 504 autres tuées après une greffe de cellules cancéreuses pour analyse de leurs organes. 592 souris au total vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal reçoit sept gavages en quatorze jours puis huit autres en vingt et un jours, six récoltes de selles, des prélèvements de sang répétés et jusqu'à cinq administrations de chimiothérapie, d'inhibiteurs de tyrosine kinase, d'immunothérapie anti-PD-1 ou du candidat médicament bactérien de la société. Parmi les trois objectifs annoncés figure un objectif économique, rendre le traitement plus accessible et "attirer les industriels" en simplifiant les critères de sélection des patients.

Objectifs

Le microbiote intestinal, c’est-à-dire l’ensemble des micro-organismes vivant dans nos intestins, joue un rôle important dans la façon dont notre corps réagit au cancer et aux traitements, notamment en influençant la réponse immunitaire. La modulation de la réponse immunitaire antitumorale par le microbiote intestinal repose sur des interactions spécifiques entre certaines souches bactériennes et les cellules immunitaires au niveau de l’intestin. Des données précliniques ont mis en évidence le rôle immunomodulateur d’une souche bactérienne sélectionnée pour ses propriétés de restauration de la sensibilité à certaines thérapie anti-cancéreuse. Cette souche est utilisée actuellement en phase I d’un essai clinique (NCT05865730), administré à des patients atteints de cancer du rein avancé et traités exclusivement par immunothérapie. Avant de pouvoir proposer notre médicament à un plus grand nombre de patients, la recherche doit vérifier si la bactérie qu’il contient peut bien s’installer dans l’intestin, même chez les personnes qui ont déjà naturellement des bactéries similaires. Cette étape est importante pour s’assurer que le traitement fonctionne sans avoir besoin de vérifier à l’avance la composition du microbiote de chaque patient. Actuellement, notre médicament est testé uniquement chez des patients atteints d’un cancer du rein. Pour pouvoir en faire bénéficier d’autres personnes, nous envisageons de l’essayer aussi dans d’autres types de cancers. Le but secondaire de ces études est également de s’assurer que ce traitement fonctionne bien lorsqu’il est utilisé en même temps que les nouvelles combinaisons de médicaments déjà prescrites contre le cancer chez les patients. Il est donc nécessaire de faire ces études pour permettre d’élargir l’essai cliniques auprès de nouvelles personnes atteintes de cancers. Ces études doivent être menées sur un modèle pertinent et proche de l’humain ; bien que le microbiote de la souris diffère de celui de l’homme, ils partagent des fonctions biologiques essentielles et des réponses immunitaires similaires, ce qui en fait un modèle adapté pour étudier les effets thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Comme ce nouveau « candidat médicament » développé par notre société ne peut pas encore être testé directement chez les humains, nous devons d’abord le tester dans des conditions sûres. Pour cela, nous utilisons des souris de laboratoire, car elles sont très couramment utilisées dans la recherche contre le cancer. Elles partagent beaucoup de points communs avec l’être humain, notamment au niveau génétique. De plus, il existe déjà de nombreux modèles de cancer bien connus chez la souris, ce qui permet de reproduire des situations proches de celles observées chez les patients. Cela nous aide à vérifier si le médicament fonctionne bien, et à comparer les résultats avec les traitements standards déjà utilisés. Utiliser un autre animal rendrait les résultats moins fiables et plus difficiles à interpréter. Elles partagent beaucoup de points communs avec nous sur le plan génétique, et permettent de tester les traitements dans des conditions fiables. Le projet comporte deux grandes étapes : La première vise à vérifier si le candidat médicament, une bactérie thérapeutique, peut s’installer dans l’intestin même si une autre bactérie appelée Akkermansia n’est pas déjà présente. Si c’est le cas, cela permettrait de simplifier l’accès au traitement pour les patients, sans avoir besoin de tests préalables. La deuxième étape cherche à montrer que le candidat médicament peut renforcer l’efficacité des traitements classiques contre différents types de cancers solides (foie, rein, poumon,peau,…). Cela pourrait en faire une option complémentaire pour les patients chez qui les traitements actuels ne fonctionnent pas bien. Ce projet a trois objectifs : Pharmacologique : s’assurer que le candidat médicament fonctionne bien et peut être utilisé chez tous les patients. Thérapeutique : tester le candidat médicament avec différents traitements (comme la chimiothérapie ou la radiothérapie) pour élargir ses usages. Économique : rendre le traitement plus accessible, réduire les coûts et attirer les industriels en simplifiant les critères de sélection des patients. En résumé, ce projet pourrait changer la façon dont on personnalise les traitements contre le cancer, en utilisant le microbiote (les bactéries intestinales) pour améliorer la réponse aux thérapies.

Procédures

Chaque souris recevra 7 gavages pendant 14 jours puis 8 pendant 21 jours (durée 1 minute, vigile). Des récoltes de selles auront lieu à selles à 6 temps (J0, J6, J14, J21, J28, J34). Pour la procédure avec implantation de tumeur, les souris recevront une implantation tumorale sous anesthésie locale (durée 1 minute) suivie de traitements combinés : chimiothérapie, inhibiteurs de tyrosine kinase, immunothérapie anti-PD-1, et/ou d’Oncobax® (5 administrations par souris, durée 1 minute, anesthésie locale)). Des prélèvements de sang seront réalisés sur animaux vigiles à différents temps (J0,J7,J14, J21). Les animaux seront suivis cliniquement et euthanasiés si des critères éthiques sont atteints. Aucun autre geste invasif n’est prévu en dehors des prélèvements de selles/plasma et des injections nécessaires au protocole.

Impact sur les animaux

La contention peut induire un stress léger et transitoire, tandis que les injections sous-cutanées ou intrapéritonéales peuvent provoquer, en plus du stress, des douleurs passagères ainsi que des risques de lésions locales ou de péritonite en cas d’erreur. Le gavage oral peut induire une douleur tranistoire et légère. Les prélèvements de fèces, bien que brefs, peuvent générer un stress léger, avec des effets cumulatifs en cas de répétition, avec un impact poivant devenir modéré. La croissance tumorale peut altérer l’état général des souris : douleur modérée, réduction de la mobilité, perte d’appétit, hypothermie, complications locales (ulcérations, nécroses), et cachexie (amaigrissement sévère, fonte musculaire) dans les cas avancés.

Devenir

Certaines des souris ayant eu une procédure légère, pourront être réutilisées. D’autres souris recevront des greffes de cellules cancéreuses, et seront euthanasiées pour analyses post-mortem sur tissus et organes.

Remplacement

Avant d’envisager l’utilisation de souris, plusieurs approches alternatives ont été explorées pour tenter de répondre aux objectifs scientifiques: des outils de modélisation informatique ont été utilisés pour prédire certaines interactions moléculaires. Bien qu’utiles, ces modèles ne permettent pas de reproduire la complexité d’un organisme vivant, en particulier les réactions du système immunitaire et la dynamique des bactéries de l'intestin. Des modèles cellulaires (in vitro) ont également été employés en amont. Ces systèmes permettent d’étudier certains mécanismes localisés, mais ils ne disposent ni d’un microbiote fonctionnel, ni d’un système immunitaire complet, ce qui limite leur capacité à simuler les effets globaux du traitement. Des approches basées sur l’étude de tissus ou d’organes isolés (ex vivo), ont aussi été envisagées. Elles permettent des analyses ponctuelles, mais ne reflètent pas les processus dynamiques comme la colonisation bactérienne ou la progression d’un cancer dans un organisme entier. Enfin, les bases de données et modèles statistiques ont été utiles pour concevoir les protocoles, mais ne peuvent pas prédire la réponse globale d’un organisme vivant à un traitement complexe. Ainsi, malgré l’utilisation maximale de méthodes alternatives, l’expérimentation animale reste indispensable pour valider les hypothèses du projet. Le modèle murin (la souris) a été choisi car il est bien connu, maîtrisé par les équipes, et déjà utilisé dans les phases précédentes du développement.

Réduction

Dans ce projet, il est utilisé des modèles expérimentaux bien connus et déjà validés, ce qui permet de limiter les ajustements techniques et donc d’éviter des pertes animales inutiles. Le nombre de souris utilisées est calculé avec précision à l’aide d’outils statistiques, afin d’obtenir des résultats fiables sans utiliser plus d’animaux que nécessaire. Par exemple, pour mesurer l’effet du traitement sur la croissance tumorale ou la survie, les chercheurs ont défini à l’avance le nombre minimum d’animaux requis pour détecter une différence significative entre les groupes. Ces calculs sont basés sur des données issues d’études précédentes et sur des hypothèses réalistes. Les analyses statistiques prévues permettent d’exploiter au mieux les données recueillies, sans multiplier les expériences. De plus, les expérimentations sont regroupées autant que possible, notamment pour limiter le nombre de groupes témoins, souvent nécessaires pour comparer les effets d’un traitement. Chaque procédure ne sera répétée qu’une seule fois, uniquement si les résultats sont concluants, afin d’éviter toute répétition inutile. Si une expérience ne donne pas de résultats exploitables, elle sera interrompue pour ne pas utiliser d’animaux sans raison valable. Enfin, le personnel impliqué est hautement qualifié, ce qui garantit une bonne maîtrise des gestes techniques et limite les erreurs ou les pertes d’animaux liées à des manipulations inappropriées.

Raffinement

Toutes les manipulations (comme le gavage, les injections ou les prélèvements sanguins) seront réalisées en limitant leur fréquence et leur durée au strict nécessaire. Lorsque cela est possible, ces gestes seront effectués sous anesthésie locale, afin de garantir un confort optimal. Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales : alimentation adaptée, eau stérile à volonté, enrichissement de l’environnement (abris, matériaux de nidification, etc.), et une période de quarantaine d’au moins une semaine avant le début des procédures pour favoriser leur acclimatation et réduire le stress. Dès le début de l’étude, les animaux feront l’objet d’un suivi clinique quotidien, basé sur des critères précis : poids, état du pelage, comportement, état des dents, taille et aspect des tumeurs. Ce suivi permet de détecter rapidement tout signe de souffrance ou de dégradation de l’état de santé. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Dans ce projet, des souris adultes âgées de 7 à 8 semaines seront utilisées, un stade correspondant à leur maturité sexuelle, garantissant un système immunitaire pleinement développé et une stabilité hormonale. Le choix de la souris repose sur des critères scientifiques, pratiques et éthiques : c’est un modèle largement utilisé en recherche biomédicale, notamment pour étudier les interactions entre le microbiote, le système immunitaire et les traitements anticancéreux. Sa génétique est bien connue et présente de nombreuses similarités avec celle de l’humain, ce qui en fait un modèle pertinent pour ce type d’étude. L’utilisation de ce modèle permet également de s’appuyer sur des protocoles déjà maîtrisés par les équipes, assurant des conditions expérimentales fiables et reproductibles, tout en limitant le nombre d’animaux nécessaires.

630 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les souriceaux porteurs de la mutation, dont 40 à 50 % meurent avant le sevrage et 60 % de ceux-là dans les 48 heures suivant la naissance, subissent une pesée quotidienne et des injections répétées pendant huit à quatorze jours. Les retombées biomédicales annoncées restent au conditionnel, ces souris pouvant selon le porteur devenir de nouveaux modèles précliniques d'une maladie rare, tandis que l'absence de groupe témoin est présentée comme un gain sur le nombre d'animaux. Aucun modèle alternatif crédible n'existerait pour le stade de la naissance, et la souris est décrite comme la référence "incontournable" du domaine.

Objectifs

Notre projet vise à étudier des modèles murins "perte de fonction" pour une portion spécifique du génome de la souris qui abrite deux gènes. Chez l'humain, ce locus est positionné dans une zone chromosomique où des anomalies génétiques entraînent une maladie rare. Cette maladie se caractérise par un tableau clinique complexe, notamment à la naissance avec un retard de croissance et de nombreux dysfonctionnements métaboliques et hormonaux. Nos résultats préliminaires révèlent que nos modèles murins récapitulent certains aspects de la pathologie humaine. C’est dans ce contexte que s’inscrit cette demande qui vise à atténuer, totalement ou partiellement, les anomalies périnatales des souriceaux génétiquement modifiés par des interventions pharmacologiques ou environnementales.

Bénéfices attendus

Notre programme de recherche vise à associer génétique et exploration phénotypique afin d’approfondir notre compréhension du rôle régulateur de deux gènes dans la survie, la croissance et l’adaptation hormonale et métabolique en période périnatale. L’étude de leur fonction à ce stade critique représente un enjeu majeur, tant sur le plan conceptuel que logistique. Par ailleurs, les expériences proposées pourraient avoir des retombées significatives dans le domaine biomédical, nos souris mutées pouvant constituer de nouveaux modèles précliniques de la maladie. Elles offriraient ainsi une opportunité unique de caractériser les étapes précoces de la pathologie, qui se manifestent dès la naissance.

Procédures

Lorsque les souriceaux sont injectés et pesés en même temps la durée est de 1 à 2 minutes soit entre 8 et 14 jours selon le traitement. Les simples pesées quotidiennes durent moins d’1 minute.

Impact sur les animaux

Le phénotype de cette lignée est que les souriceaux KO sont de plus petite taille et présentent une mortalité périnatale avec une pénétrance incomplète, avec 40-50% des souriceaux mutant qui décèdent avant le sevrage, dont environ 60% dans les 48 heures suivant la mise-bas. Les pesées quotidiennes des souriceaux peuvent induire un léger stress et une douleur légère. Les injections quotidiennes de traitement sur plusieurs jours peuvent entrainer un stress et une douleur modérés.

Devenir

Tous les animaux des procédures sont mis à mort pour réaliser des prélèvements pour des analyses.

Remplacement

Nos gènes d’intérêts sont exclusivement retrouvés chez les mammifères placentaires et sont exprimés uniquement dans le cerveau. Ce mode d’expression strictement neuronal, associé à leur apparition tardive au cours de l’évolution des mammifères, restreint considérablement le choix de modèles d’étude biologiquement pertinents. Ainsi, toutes les études publiées à ce jour ont été menées chez la souris, d’autant que ce modèle reproduit certains traits pathologiques caractéristiques de la maladie. Enfin, notre demande porte sur un stade de développement crucial : la naissance. À ce jour, il n’existe aucun modèle alternatif crédible et biologiquement pertinent pour cette étude.

Réduction

Notre stratégie de croisement permet de limiter le nombre d’animaux à produire. En effet, nous attendons à ce que 50 % des souriceaux présentent la délétion pour nos gènes d’intérêts contre seulement 25 % avec des croisements classiques. De plus, notre choix initial de traiter tous les individus sans inclure de contrôle contribue également à cette réduction puisque nous comparons uniquement deux groupes au lieu de quatre. Cet aspect est particulièrement important dans le contexte d’une expérimentation en aveugle et d’une mortalité à pénétrance incomplète. Le fond génétique, particulièrement adapté aux analyses métaboliques, contribue également à limiter la taille des groupes étudiés. Sur la base de notre expérience avec un autre modèle de souris mutées et des données disponibles dans la littérature, 15 portées par condition étudiée devraient assurer une puissance statistique suffisante. Enfin, à l’issue des expérimentations, nous prélèverons et archiverons un maximum de tissus issus d’un même individu afin d’anticiper d’éventuelles analyses anatomiques et moléculaires ultérieures.

Raffinement

Ce projet a pour objectif de suivre la survie et la prise de poids des souriceaux mutants grâce à un traitement pharmacologique ou environnemental. Les pesées et les injections de traitements seront effectuées au même moment pour ne réaliser qu’une seule préhension et contention. Nous réaliserons une surveillance deux fois par jour pour les traitements pharmacologiques et une fois par jour pour les interventions environnementales. Ce qui nous semble être un bon compromis pour le déroulement de nos expériences. L’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux seront pris en compte à chaque observation. Des points limites précoces seront mis en place pour les traitements pharmacologiques. Si les animaux présentent des signes de souffrance alors ils seront mis à mort. En revanche il n’y a pas de points limites spécifiques pour les interventions environnementales.

Choix des espèces

Tous les modèles animaux de la pathologie décrits à ce jour ont été réalisés chez la souris. Ce modèle murin est donc devenu la référence incontournable dans notre domaine de recherche, car il permet non seulement d’établir des comparaisons avec les données existantes dans la littérature, mais aussi de réduire le nombre de souris en évitant la répétition d’expériences déjà publiées et donc pouvant être considérées comme inutiles sur le plan éthique. Notre demande porte sur un stade de développement crucial, la naissance, jusqu'au sevrage des souriceaux.

Les souris utilisées sont soit porteuses d'une mutation qui déclenche une pathologie de type Alzheimer, soit greffées d'un glioblastome dans le cerveau, soit rendues stéatosiques par douze semaines de régime gras et sucré. Elles sont 175, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 95 d'entre elles et modéré pour 80. Chaque examen d'IRM dure de deux à trois heures sous anesthésie, précédé le cas échéant d'une mise à jeun de six heures, avec deux à cinq prélèvements de sang et l'injection de sucres marqués au deutérium, les souris du modèle Alzheimer passant jusqu'à quatre examens entre deux et huit mois d'âge. Toutes sont tuées en fin de procédure pour que leurs organes fournissent les données post-mortem censées valider les images acquises sur l'animal vivant.

Objectifs

En imagerie par résonance magnétique (IRM), le signal provient classiquement des noyaux d’hydrogène (1H) de l’eau présent dans tous les organes. Avec l’avènement en recherche de scanners IRM à très haut champ magnétique, la spectroscopie et l’imagerie RMN in vivo permettent de détecter et quantifier de nombreuses autres molécules ou ions d’intérêt pour la biochimie, la physiologie et la pharmacologie que ce soit en conditions normales ou pathologiques. Ceci ouvre la voie à de nouveaux outils d’exploration métabolique et fonctionnelle d’organes en conditions normales ou pathologiques. L’imagerie métabolique du deutérium (2H) repose sur le suivi de sucres marqués à cet isotope non-radioactif de l’hydrogène. Cette approche permet d’étudier de manière non-invasive le métabolisme des sucres dans des modèles animaux de pathologies et à terme chez des patients souffrant d’afflictions auxquelles sont associées des altérations métaboliques comme la maladie d’Alzheimer, les tumeurs ou encore la stéatose hépatique non-alcoolique. L’étude de ces altérations métaboliques servira à mieux comprendre ces maladies et possiblement à évaluer l’efficacité de nouveaux traitements. Par ailleurs, cette approche devrait être moins chère, plus versatile et plus accessible que d’autres modalités d’imagerie plus courantes. Dans ce contexte, notre projet vise au développement et la validation de sucres communément présents dans l’alimentation (tels que le glucose ou le fructose) marqués au deutérium pour l’étude des altérations métaboliques dans des modèles validés de pathologies telles que la maladie d’Alzheimer, le glioblastome et la stéatose hépatique non-alcoolique.

Bénéfices attendus

Les méthodes validées lors de ce projet seront utiles à court terme pour leur application à l’évaluation de traitement innovant chez ces modèles rongeurs de pathologies et à moyen terme pour préfigurer les études chez l’Homme par IRM du 2H. A plus long terme, l’imagerie métabolique du deutérium pourrait concurrencer d’autres modalités d’imagerie métabolique déjà utilisées en recherche clinique.

Procédures

Chaque examen IRM durera de 2 à 3 heures sous anesthésie. Des sucres marqués au deutérium seront administrés aux animaux anesthésiés avant ou pendant cet examen IRM pour suivre leur métabolisme : Etude d’un modèle transgénique d’Alzheimer : les souris seront imagées au plus 4 fois (à 2, 4, 6 et 8 mois). Etude d’un modèle de glioblastome : dans ce cas, il est nécessaire de réaliser une chirurgie d’implantation des cellules tumorales (durée approximative de 20 minutes) sur les souris. Celles-ci seront imagées une seule fois. Etude d’un modèle de stéatose hépatique non-alcoolique: les souris seront imagées une seule fois après 12 semaines d’un régime hyperlipidique et hyperglucidique. Dans tous les cas, 2 à 5 prélèvements sanguins de quelques secondes chacun pourront être réalisés, juste avant, pendant ou juste après l’examen IRM pour la détermination de certains paramètres physiologiques.

Impact sur les animaux

Les examens IRM sont en eux-mêmes non-invasifs. Des effets indésirables (stress, fatigue) peuvent exister en lien avec la contention, l’anesthésie pendant l’examen IRM et les éventuelles injections ou prélèvements de sang. Les injections de sucres marqués au deutérium sont réalisées juste avant ou au cours de l’examen IRM et peuvent entrainer une douleur transitoire. Dans le cas de l’administration de glucose marqué, l’animal est mis à jeun (typiquement 6 heures avant l’examen IRM) pour réduire sa glycémie basale et garder la glycémie stable pendant l’examen IRM. Concernant l’étude du modèle de tauopathie, les animaux sont utilisés à des âges d’au plus 8 mois, c’est-à-dire avant l’apparition de symptômes cliniques délétères induits par la maladie. Pour ce qui est de l’étude du modèle de glioblastome, la chirurgie nécessaire à l’implantation de cellules tumorales entraine une légère inflammation et une douleur transitoire. La croissance tumorale peut entrainer une perte de poids ou une apathie.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort afin de prélever les organes d’intérêt. Ainsi, des données post-mortem biochimiques et d’imagerie haute-résolution seront acquises pour valider/compléter nos observations/résultats in vivo.

Remplacement

Des tests in vitro sur des cultures 3D (organoïdes) sont prévus en amont de nos études in vivo afin d’évaluer la pertinence de cette approche alternative dans le cadre d’études d’imagerie moléculaire et métabolique par résonance magnétique nucléaire. Ce projet de recherche vise à valider in vivo la sensibilité et la spécificité de l’imagerie de molécules marquées au deutérium dans le contexte de trois pathologies chroniques complexes. Il n’existe aujourd’hui aucune méthode alternative (modèle ex vivo ou computationnel) permettant de modéliser la complexité des mécanismes moléculaires, cellulaires, physiologiques ou de biodistribution inhérent à ce projet. Avant d’envisager des études cliniques chez l’Homme, il est donc justifié de mener nos études chez le rongeur en raison de sa proximité évolutive avec l’être humain et du fait qu’il propose des modèles pathologiques versatiles et reproductibles.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera minimisé autant que possible grâce à l’étude de plusieurs paramètres chez le même animal et si nécessaire de façon répétée avec des approches non-invasives comme l’IRM. S’agissant d’une recherche exploratoire, des effectifs de 20 ou 30 animaux par sous-groupe (condition et sexe) ont été considérés pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats. Le cas échéant, les effectifs seront réduits si les observations faites lors des expériences pilotes le permettent.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe sociaux stables conformément aux conditions stipulées en annexe III du décret 2013-118 du 1er février 2013 portant sur les exigences relatives aux soins et hébergement des animaux. Une grande attention est apportée au bien-être des animaux, et tout est mis en œuvre pour éviter les sources potentielles de stress avec notamment du matériel favorisant la nidification. Les animaux sont suivis régulièrement afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec les points-limites et la structure chargée du bien-être animal et les conseils vétérinaires. Examen IRM : Il est réalisé sous anesthésie, dans un berceau chauffé uniquement dédié à ces animaux, avec contrôle de la respiration et de la température. Un anesthésique local est appliqué au niveau des conduits auditifs. Un gel ophtalmique est passé sur les yeux pour limiter leur déshydratation. Lors d’une acquisition IRM, si la respiration sort des limites prévues, l’examen est immédiatement interrompu et l’animal est mis sous surveillance accrue jusqu’à sa récupération. Chirurgie : Pour l’implantation de cellules tumorales, les animaux recevront une antalgie préopératoire 30 minutes avant le début de la chirurgie, puis seront anesthésiés.

Choix des espèces

Les modèles souris représentent les modèles les plus utilisés en recherche biomédicale notamment parce que les études comparatives sont facilitées par l’existence de souches qui fournissent des animaux génétiquement similaires. Les modèles sélectionnés pour chaque procédure expérimentale correspondent à un état de l’art pour évaluer par IRM nos sucres deutérées. Les souris seront utilisées à partir d’un âge adulte typiquement de 6-8 semaines, et jusqu’à un âge de 8 mois uniquement pour l’étude d’un modèle transgénique d’Alzheimer.

Immunisées à trois reprises avec un adjuvant qui peut former des abcès au point d'injection, puis greffées de cellules tumorales, 212 souris vont être utilisées, 112 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 100 un niveau léger. Pendant les quatre semaines de l'expérience, celles qui portent des tumeurs peuvent perdre du poids, cesser de bouger et s'isoler, et toutes sont tuées pour que leurs organes soient prélevés. Le projet cherche des fragments de protéines capables de déclencher une production d'anticorps, première étape avant des essais sur des modèles animaux de cancers, l'élargissement de l'offre thérapeutique aux patients venant au terme d'une longue chaîne d'étapes. Sur l'effectif, le porteur écrit seulement que "les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés", et annonce des points limites "stricts et spécifiques au projet" sans en nommer aucun.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'identifier des fragments de protéines dont l'expression est impliquée dans la progression de certains cancers. Nous espérons identifier des fragments de protéines induisant la production d'anticorps dans le but, par la suite, de tester leur efficacité dans des modèles animaux de cancers ce qui entrainerait à terme un élargissement de l'offre thérapeutique pour les patients.

Bénéfices attendus

Le but est d'identifier des fragments de protéines dont l'expression est impliquée dans la progression de certains cancers chez l'homme et à terme d'élargir l'arsenal thérapeutique pour les patients.

Procédures

Injection de produit : 3 fois, sur animaux vigiles ; durée du geste: 1-2 min. Injection de cellules: 1 fois, sur animaux vigiles ; durée du geste: 1-2 min. Injection de traitement sur souris vigiles : 4 injections (2 fois/semaine sur 15 jours); durée totale du geste 1-2 min. Prélèvement de sang: 1 fois/souris sur souris anesthésiées ; durée du geste : 1-2 min.

Impact sur les animaux

Les injections répétées peuvent induire une douleur légère et transitoire ou une irritation au niveau du site d’injection. L’utilisation de l’adjuvant peut entrainer la formation d’abcès au point d’injection. Afin de réaliser les prélèvements de sang, les animaux seront anesthésiés, ce qui pourra engendrer un stress et une douleur légère de courte durée. Sur la durée entière de l’expérience (soit environ 4 semaines), les souris avec les tumeurs peuvent perdre du poids ou présenter des troubles du comportement (immobilité, isolement...).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les organes en vue de l’analyse de la production d’anticorps et de la réponse immunitaire

Remplacement

La réponse immunitaire suite à une vaccination ainsi que les réponses anticorps impliquées dans la réponse immune antitumorale sont complexes. L’efficacité d’un vaccin ne peut être évaluée que dans des organismes entiers et les modèles in vitro ne permettent pas de mimer fidèlement les réponses immunitaires ni le microenvironnement tumoral. C’est pourquoi il est nécessaire d’avoir recours à des modèles animaux. Ces modèles sont fondamentaux pour étudier l’efficacité de nouveaux traitements thérapeutiques. Ils sont un prérequis nécessaire avant le lancement d’essais cliniques chez l’homme.

Réduction

Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été déterminés. Les prélèvements sanguins sont réalisés sous analgésie et anesthésie générale.

Choix des espèces

Afin de développer des vaccins thérapeutiques contre la progression du cancer chez l'homme, les traitements développés doivent préalablement être validés chez l'animal. La souris est un mammifère de choix classiquement utilisé dans la littérature pour les études de production d'anticorps. Il est nécessaire que l'animal soit adulte (âge supérieur à 8 semaines) afin que le système immunitaire soit mature.

Infectées par des bactéries pathogènes dans les poumons, l'intestin ou la vessie, puis soumises à des gavages et à des instillations intranasales et intratrachéales jusqu'à deux fois par jour, 16 984 souris vont être utilisées, 12 712 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 4 272 un niveau léger. Certaines subissent des prélèvements fécaux deux à trois fois par semaine pendant soixante jours. Le porteur décrit des atteintes brèves, difficultés respiratoires pendant 24 heures au plus, diarrhée pendant 48 heures, "gêne limitée" pour les infections urinaires, tout en prévoyant la mise à mort de toute souris prostrée, ayant perdu plus de 20 % de son poids ou diarrhéique au-delà de deux jours. Aucune ne sort vivante du projet, le porteur indiquant qu'elles sont devenues porteuses potentielles de la bactérie et que la plupart doivent être tuées pour l'analyse de leurs organes vitaux.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de faire avancer les connaissances sur l’utilisation thérapeutique des bactériophages. Les bactériophages sont des virus qui infectent uniquement les bactéries et qui peuvent être utilisés pour traiter des patients infectés par des bactéries résistantes aux antibiotiques. De plus, les bactériophages font partie de la flore microbienne naturelle au même titre que les bactéries. Très abondants dans le tube digestif des animaux ils jouent un rôle important dans le maintien de la santé de l’appareil digestif. Leur utilisation (transplantation virale) pour rétablir une homéostasie intestinale est soutenue par des données cliniques préliminaires encourageantes. Ainsi, ce projet nous permettra d’étudier les interactions dynamiques entre les bactériophages et les bactéries dans trois organes cibles : les poumons, les intestins et la vessie. Les connaissances qui seront acquises permettront de mieux appréhender le potentiel thérapeutique des bactériophages dans le but de permettre leur utilisation plus large en clinique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet sont directement liés à l’utilisation thérapeutiques des bactériophages. Aujourd’hui le nombre de personnes en situation d’impasse thérapeutique et qui ont accès à titre compassionnel à la phagothérapie augmente faiblement car nous manquons de données expérimentales pour soutenir les meilleures conditions d’utilisation. Ce projet permettra à terme de fournir les éléments de compréhension sur les mécanismes impliqués dans l’efficacité de la phagothérapie. Nous apporterons aussi des informations relatives à la dose, la fréquence et la voie d’administration les plus appropriées. De même, nous appréhenderons le rôle du système immunitaire dans l’efficacité des traitements. A terme, le déploiement à plus grande échelle de la phagothérapie repose sur les données que nous pourrons obtenir au cours de ce projet.

Procédures

Les prélèvements sur animaux vigiles seront limités à un seul prélèvement sanguin (quelques secondes) au maximum d’une fois par semaine sur 25 jours, ou des prélèvements fécaux deux à trois fois par semaines pendant 60 jours au maximum avec parfois un suivi plus fréquent jusqu’à deux fois par jour pendant 5 jours (chaque animal est placé dans une boite pendant quelques minutes pour collecter les feces). Les administrations par gavage (quelques secondes) ainsi que les instillations intranasales et intratrachéales seront limitées à 2 par jour.

Impact sur les animaux

Les animaux qui seront infectés par des bactéries pathogènes subiront un stress en relation avec l’organe étudié. Lors d’infections pulmonaires les animaux présenteront des difficultés respiratoires pendant une durée maximale de 24h. Lors d’une infection intestinale, des signes de diarrhée peuvent persister pendant 48h au maximum. Ces situations peuvent provoquer un défaut d’alimentation induisant une baisse de la mobilité. Les infections urinaires seront quant à elles d’une courte durée (24h au plus) et induiront une gêne limitée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront été infectés par une bactérie pathogène. Cela implique que 1) leur défense immunitaire sera différente d’autres animaux non exposés à ce même pathogène et 2) ils sont potentiellement devenus porteurs asymptomatiques de cette bactérie pathogène et seraient donc susceptibles de la transmettre s’ils étaient réutilisés. De plus, la plupart d’entre eux seront sacrifiés pour analyser des organes vitaux.

Remplacement

L’évaluation des différents points évoqués dans le résumé du projet ne peut malheureusement pas s’envisager dans des systèmes in vitro, qui sont inappropriés pour reproduire la complexité d’un organisme entier et sa réponse à l’infection (système immunitaire). Par ailleurs, s’agissant de bactériophages, l’évaluation pharmacocinétique ne peut s’appuyer sur l’existence de modèles mathématiques. De même, l’étude in vitro des communautés microbiennes d’un tube digestif prenant en compte la structuration spatiale des organes n’est pas encore disponible.

Réduction

L’ensemble de ces études s’appuient sur des données préliminaires obtenus in vitro et dont les résultats permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés puisque seuls les éléments les plus pertinents, au regard de la question scientifique posée, sont évalués chez l’animal. D’autre part, autant que possible, le nombre maximal de paramètres sera collecté pour chaque animal de façon à limiter le nombre total d’animaux utilisé. Un maximum de 6 souris par groupe sera utilisé afin d’assurer une représentativité statistique minimale. Au maximum 3 répétitions seront réalisées de façon indépendante pour valider les résultats expérimentaux et augmenter la puissance des analyses statistiques. Pour les données quantitatives, la distribution normale des variables sera vérifiée et les tests statistiques appropriés seront alors choisis. Pour les variables qualitatives d’autres tests seront effectués. Les éventuels effets confondants (sexe et cage par exemple) seront pris en compte au moment de l’analyse en utilisant des modèles linéaires à effets mixtes. L’imagerie sera utilisée pour évaluer l’évolution de l’infection in situ, pour suivre le même animal au cours du temps, limiter les variations inter-individuelles et ainsi diminuer le nombre d’animaux requis.

Raffinement

Les animaux infectés seront évalués 2 à 5 fois au cours du premier jour puis au moins une fois par 24h durant les 2 jours suivants puis ensuite une fois par période de 48h. Ils seront pesés au moins une fois par période de 48h dès le début du protocole. Une grille d’évaluation permettra de suivre l’état de santé de chaque animal. Le score de 1 attribué aux animaux présentant une perte de poids supérieure à 10% et ayant une mobilité réduite, déclenchera l’ajout d’un gel hydrique pour faciliter l’alimentation et l’hydratation. Le score 2 sera attribué aux animaux ne bougeant plus et ayant une posture prostrée, ou présentant une perte de poids supérieur à 20%, ou présentant de signes de diarrhée pendant plus de 48h. Tout animal présentant un score de 2 pour l’un des critères sera mis à mort. Au cours des expériences, toute modification des procédures visant à réduire la douleur des animaux (par exemple, réhydratation sous-cutanée, chauffage des cages) sera évaluée avec le SBEA avant d’être mise en place.

Choix des espèces

A ce stade expérimental du développement de la phagothérapie, la souris représente l’espèce la plus pertinente pour l’évaluation des paramètres pharmacocinétiques et l’innocuité du traitement. Il s’agit d’un mammifère dont le système immunitaire est bien connu et comporte de très grandes analogies avec celui de l’homme. L’utilisation d’autres animaux plus proches de l’homme (primates) ou de références en pharmacocinétique (porc Yucutan) ne peuvent représenter des animaux de première intention à ce stade de nos travaux. De même, la disponibilité d’élevages de souris gnotobiotiques est un outil de choix qui n’est pas encore disponible pour d’autres espèces. Enfin les données et les outils disponibles sur le système immunitaire murin sont aussi une raison justifiant le recours à ces animaux. Dans tous les cas, seuls des animaux adultes seront utilisés (>= à 7 semaines) car leur système immunitaire est arrivé à maturité au contraire d’animaux plus jeunes.