Procédures légères
Réponse des oiseaux marins aux changements environnementaux : adaptations et limites physiologiques (MODIFICATION)
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Capturés dans une colonie sauvage de 20 000 couples reproducteurs, 100 manchots royaux adultes et 50 poussins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Certains ont déjà été suivis les années précédentes sans que le porteur puisse l'établir avec certitude, les bagues métalliques ayant été abandonnées pour leurs effets délétères à long terme. Chaque oiseau subit jusqu'à sept prises de sang à la veine alaire en un an, la pose sous la peau d'un transpondeur, un enregistreur fixé aux plumes du dos pendant huit à quinze jours, et un capteur avalé qui reste dans son tube digestif de sept jours à deux mois. Les 145 oiseaux relâchés sur leur site de capture et les 5 réutilisés échappent à la mise à mort, le porteur limitant chaque manipulation à moins de 35 minutes, yeux couverts d'une cagoule opaque.
Objectifs
A l’échelle de la Terre, l’environnement change à un rythme sans précédent. Le changement climatique, la fragmentation des habitats, les interactions entre l’homme et la nature, l’émergence de nouvelles maladies ; tous ces facteurs exercent une pression intense sur des écosystèmes autrefois préservés. De tels changements sont exacerbés dans les milieux polaires des hautes latitudes où le forçage climatique, l’écotourisme et les zones de reproduction limitées accentuent le stress auquel sont soumis les populations animales, en particulier les oiseaux marins. Des connaissances sur les adaptations physiologiques individuelles des oiseaux marins et leurs limites sont nécessaires pour comprendre et prédire si les individus et les populations sont capables ou non de faire face aux changements environnementaux. Le présent projet a pour ambition de poursuivre un observatoire à long terme des réponses physiologiques des manchots royaux aux changements de leurs environnements. Le projet sera construit en combinant des données précédemment collectées, complétées par un suivi annuel d’un échantillon représentatif de manchots se reproduisant dans différentes conditions coloniales et saisonnières (l’objet de la présente demande). Ce suivi permet d’étudier la variabilité inter- et intra-annuelle des réponses physiologiques (en termes d’énergie, de température corporelle et de stress) mises en oeuvre par les oiseaux face aux changements à terre de leur micro-habitat, des conditions de vie en colonie, du parasitisme et de la prédation. En combinant des protocoles d’échantillonnage standardisés sur le long-terme à des outils d’analyse statistiques avancés, nous étudions la contribution des différentes sources exogènes de pressions environnementales (climat, prédation, parasitisme, dérangement lié à l’homme) au phénotype du stress ainsi qu’à la reproduction et al croissance du manchot royal, afin de comprendre à quels facteurs et à quelles périodes ces animaux sont le plus vulnérables.
Bénéfices attendus
Les changements climatiques actuels et ceux prédits par les différent scénarios IPCC posent de nouvelles contraintes pour les espèces animales. Les observations répétées de stress thermique chez le manchot royal (i.e. comportement de halètement et ajustements posturaux des adultes diminuant la protection de l’œuf et du poussin) suggèrent que les espèces sub-Antarctiques sont également sensibles au stress thermique de chaleur, mais il n’existe à ce jour aucune données / publications sur cet enjeu majeur de conservation de la biodiversité. Les résultats obtenus seront cruciaux pour ajuster les projections concernant les dynamiques de populations de cette espèce en fonction des différents scénarios climatiques futurs (IPCC) pour renforcer les mesures de protection des espèces en fonction de leur sensibilité, et permettrons l’utilisation de l’approche la moins invasive possible pour d’autres étude du stress thermique de chaleur chez le manchot royal et possiblement d’autres espèces sub-Antarctiques et Antarctiques
Procédures
Les animaux seront soumis à maximum quatre types d’interventions sur animaux vigiles (maximum 100 adultes de 50 couples et leurs 50 poussins) : - Prélèvement sanguin à la veine alaire (7x en l’espace d’environ 1 an, durée du prélèvement ~ 2 minutes) - Implantation sous-cutanée d’un transpondeur d’identification thermo-sensibles (durée de la pose < 5 min) - Pose d’un enregistreur électronique comportant un accéléromètre tri-dimensionnel et un cardio-fréquencemère sur une durée de 8 à 15j - Equipement avec un logger ingérable mesurant la température interne (en place pour 7 jours à 2 mois selon la durée de rétention naturelle dans le tractus digestif)
Impact sur les animaux
Les procédures du projet sont assez peu invasives (capture, prise de sang, marquage par transpondeur sous-cutané, équipement avec loggers peu invasifs) mais soumettent les individus à un stress de courte durée (manipulations < 35 min). Des manipulations relativement similaires réalisées depuis plus de 15 ans n’ont pas révélé d’effets indésirables sur la reproduction ou la survie des individus.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront relâchés sur leur site de capture. Des animaux ayant participé au suivi à long-terme (classe Légère) les années antérieures comme adultes reproducteurs ou comme poussins pourront être à nouveau suivis, bien que cela reste rare du fait de la taille de la colonie d’étude (20000 couples reproducteurs) et de l’absence de marquage externe permanent des individus ; les bagues métalliques ayant été abandonnées du fait d’effets délétères à long-terme. Etant donné la légèreté des procédures, et l’intervalle de temps d’au moins une année entre la première utilisation et la seconde, aucun effet cumulatif n’est attendu.
Remplacement
Le but de ces études est de comprendre les stratégies adaptatives de l’animal dans son milieu : les méthodes alternatives sont donc inexistantes. De plus, nous étudions un modèle animal qui présente des adaptations particulières et quasi-uniques dans le règne animal, ceci permet d’aborder la notion fondamentale des compromis énergétiques ayant des répercussions sur le taux de reproduction et de survie de l’individu. Nos expérimentations ont pour but de cerner les capacités physiologiques et comportementales d’adaptation de ces animaux aux contraintes de l’environnement, un point clé dans la compréhension des réponses populationnelles au changement global.
Réduction
Le projet est réfléchi afin de réduire au maximum l’impact des procédures sur le bien-etre des animaux et réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Nous mutualisons nos animaux et données avec d’autres programmes scientifiques (la base de données a vocation à être entièrement publique d’ici à 2027, les premiers élements étant déjà publiés en ligne) et cherchons à répondre à plusieurs problématiques en n’utilisant qu’un groupe d’oiseaux. Par ailleurs, les effectifs animaux sont choisis à minima (12-13 couples par zone * 4 zones contrastées pour le suivi longitudinal) au regard d’analyses statistiques permettant de caractériser la variation naturelle observée. Ceci comprend notamment l’étude de l’attribution de variance à travers de modèles statistiques complexes (Modèles Linéaires Mixtes Généralisés (GLMMs), Analyses en Composantes Principales (ACPs), Equations d’Estimations Généralisées (GEEs)).
Raffinement
Des précautions particulières sont prises pour minimiser le dérangement des animaux et réduire l’impact des procédures sur leur bien-être. En termes de Raffinement, nous avons développé une méthodologie d’étude du fonctionnement mitochondrial visant à remplacer les biopsies musculaires par l’analyse des cellules sanguines, ce qui limite considérablement le côté invasif des expérimentations. De manière semblable, nous combinons l’utilisation de transpondeurs pour l’identification des animaux avec la collecte des données de température corporelle afin de minimiser le côté invasif de nos manipulations (transpondeurs thermo sensitifs). Les interventions sur les animaux se limitent en fait à des captures, pesées, mensurations, prises de sang à la veine alaire, identification par transpondeur et pose de biologgers externes ou ingérables. Le temps de manipulation est réduit au minimum grâce notamment à l’intervention de chercheurs confirmés et formés à manipuler des manchots royaux. Durant les manipulations les animaux ont de plus les yeux couverts d’une cagoule opaque qui limite leur stress. Toutes les manipulations sont effectuées dans le calme et les oiseaux sont surveillés en permanence pendant les interventions et quotidiennement après. Nous avons fixé le point limite d’arrêt des manipulations à l’apparition de polypnée (indice du stress de l’animal) ou d’une apathie. Les biologgers utilisés sont fixés (de manière non permanente) en externe sur les plumes dorsales, ce qui n’entraine pas de souffrance chez l’animal. Les modèles que nous déployons sont utilisés en routine avec succès chez cette espèce depuis plusieurs années, sans effets négatifs sur la reproduction et la survie.
Choix des espèces
Le manchot royal est choisi comme modèle au regard de son écologie chez l’adulte que le poussin. Les adultes se nourrissent en mer et jeûnent plusieurs semaines lors des séjours à terre, durant l’incubation et la mue. Ils font face à de fortes contraintes environnementales à terre (stress social, parasites, climat) et en mer (hypoxie en plongées profondes, prédation). Le poussin a une croissance très longue (+1 an) pour un oiseau, interrompue par une phase de jeûne pendant l’hiver austral. C’est un modèle idéal pour l’étude de la plasticité des mécanismes physiologiques et des compromis énergétiques dans un contexte de changement global. Le manchot royal, espèce adaptée au froid, souffre de plus en plus de vagues de chaleur à terre dues au réchauffement climatique (stress thermique), justifiant par ailleurs la recherche de nouvelles méthodologies de suivi non-invasif de la température corporelle des animaux à l’aide de transpondeurs d’identification passifs. Adultes, indispensables pour la part des expériences basées sur l’évaluation du succès reproducteur et les caractéristiques de la recherche alimentaire en mer qu’ils sont les seuls à effectuer. Poussins pour étudier l’influence des conditions environnementales sur la croissance, le statut hormonal et la survie.
Etude de l’inhibition de l’inflammation sur un modèle d’ossification chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Des injections de biomatériaux ensemencés de cellules musculaires humaines, puis des injections d'anticorps, sous anesthésie générale : 414 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour qu'on récupère les biomatériaux et les tissus. Une partie d'entre elles sont des souris Nude, dépourvues de système immunitaire, que le porteur signale comme plus exposées aux infections aux points d'injection. L'objet est de vérifier si des cellules prélevées sur le muscle de patients paralysés fabriquent bien l'os anormal qui se forme dans leurs muscles, et si deux anticorps l'empêchent. Le suivi clinique annoncé court jusqu'à 28 jours, sans que le RNT dise ce que devient sur cette durée la gêne à se déplacer qu'il attribue aux injections, ni quelle taille atteint l'os produit.
Objectifs
Les patients polytraumatisés paralysés présentent de nombreuses complications qui impactent leur récupération et leur qualité de vie. Parmi ces complications, les paraostéoarthropathies neurogènes (POAN) sont un développement anormal de tissu osseux au sein du muscle, à proximité des articulations (hanche, coude, genou et épaule). Ces ossifications entraînent des douleurs, des raideurs articulaires et des compressions des nerfs et des vaisseaux qui ont des conséquences majeures chez ces patients déjà lourdement handicapés. A ce jour, il n’existe aucun traitement médical efficace et la seule option thérapeutique est de retirer chirurgicalement le tissu osseux anormal. Ce traitement tardif et palliatif expose ces patients fragiles à de nombreux risques anesthésiques et opératoires. Du fait de son mécanisme d’apparition inconnu, il est impossible actuellement de proposer des thérapeutiques préventives. Nos travaux de recherche ont permis de caractériser une population cellulaire du muscle (FAPs) à l’origine de ce développement osseux et le rôle clef de deux protéines. Ce projet vise à étudier le rôle des FAPs dans le développement de tissu osseux. Pour cela nous étudierons notre modèle murin d’ossification ectopique par biomatériaux. Ces biomatériaux sont ensemencés avec des FAPs humains isolés à partir de résidus opératoires de muscle de patients. Ils sont ensuite injectés en sous-cutané ou en intramusculaire chez des sourisdes souris immunodéficientes ou immunocompétentes puis prélevés afin d’analyser les marqueurs d’ossification. Enfin, nous étudierons l’effet d’un traitement avec des anticorps neutralisant ces deux protéines.
Bénéfices attendus
L’utilisation de ce modèle in vivo d’ossification ectopique par biomatériaux est indispensable pour caractériser et étudier le devenir des FAPs humains en modélisant un système biologique. Nous pourrons ainsi confirmer leur capacité à générer un tissu osseux pathologique et mettre en évidence les mécanismes impliqués. L’objectif est ensuite de pouvoir évaluer une approche thérapeutique préventive par l’utilisation d’anticorps neutralisants et de documenter leur potentiel intérêt dans la prise en charge des patients.
Procédures
Les deux interventions comprennent des injections de biomatériaux et des injections d’anticorps qui seront réalisées sous anesthésie générale. Les interventions dureront 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les souris peuvent présenter une gêne passagère à se déplacer due aux injections des biomatériaux. De part leur état d'immunodeficience, les souris Nude peuvent être plus sensibles au risque biologique notamment aux sites d'injection.
Devenir
Les souris seront euthanasiées pour prélever les biomatériaux pour étudier leur structure par coloration et réaliser des analyses moléculaires des tissus.
Remplacement
Une grande partie de nos travaux de recherche sont réalisés sur des modèles de remplacement in vitro par culture cellulaire et ont fait l'objet de publications. Néanmoins, cette approche présente des limitations et ne peut pas rendre compte de la complexité des processus pouvant s’établir dans un organisme entier notamment la réponse inflammatoire qui est primordiale dans le développement des ossifications pathologiques. Les modèles de culture in vitro des biomatériaux ensemencés avec les FAPs seront toujours réalisés en parallèle de ce projet, nos dernières études . A notre connaissance, la modélisation in silico ne peut pas être utilisée.
Réduction
Ce projet nécessite un nombre maximal de 414 souris. Les protocoles expérimentaux seront réalisés de manière séquentielle dans le but d’optimiser les temps de prélèvement des biomatériaux et appliquer le principe de réduction et limiter le nombre d’animaux nécessaires. Le nombre d’animaux a été calculé par un logiciel adapté pour réduire le nombre d’animaux tout en permettant d’obtenir des résultats significatifs. Chaque souris contribuera à des analyses histologiques et immunohistochimies ou des analyses moléculaires et protéiques.
Raffinement
Les procédures d'anesthésie générale, d'injections et le suivi des souris seront réalisées par du personnel habilité. Afin de raffiner nos procédures et réduire au maximum le stress et la douleur, nous utiliserons des protocoles établis d’anesthésie et de prise en charge de la douleur (analgésie) en respectant les points limites d’arrêt du protocole. Les souris anesthésiées seront placées sur tapis chauffant durant les procédures d'injections. Le suivi post-injections associé à une surveillance clinique rapprochée à 24h, 48h, J7, J14 et J28 seront strictement réalisés et retranscrits dans une fiche de scoring. Enfin, les conditions d’hébergement des animaux sont contrôlées avec le respect d’une période d’acclimatation et la mise à disposition d’un enrichissement adéquat.
Choix des espèces
La souris est un modèle in vivo communément utilisé dans l’étude du métabolisme osseux et de la physiologie musculaire. Les gestes chirurgicaux sur ces animaux sont parfaitement maîtrisés par les personnels impliqués qui sont par ailleurs formés pour évaluer et prendre en charge la douleur. Les souris seront utilisées au stade jeune adulte pour un âge compris entre 8 et 10 semaines. Il s’agit du stade le plus largement décrit et validé dans les publications. A cet âge, nous limitons les biais liés à l’utilisation de souris vieillissantes. De plus, leur taille est suffisante pour une manipulation aisée lors de l’injection des biomatériaux.
Evaluation de la biodisponibilité de différents Polluants Organiques Persitants (POPs) du sol afin d’étalonner des méthodes alternatives in vitro
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Un porcelet de deux mois a un tube digestif comparable à celui d'un enfant de trois ans : c'est à ce titre que 140 porcelets sevrés depuis une semaine vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à l'issue. Ils ingèrent des boulettes contenant environ deux grammes de sol pollué aux PCB, aux HAP ou à la chlordécone, enfermés seuls deux heures pour que l'ingestion soit contrôlée, puis vingt-quatre heures avant la mise à mort pour que leur urine soit recueillie individuellement. Leur foie, leur tissu adipeux et leurs surrénales sont prélevés après la mort pour y doser les polluants. Le projet contamine ainsi des porcelets afin d'étalonner des tests in vitro que le porteur présente comme devant ensuite réduire "très significativement" l'usage des méthodes in vivo.
Objectifs
Pour prédire la biodisponibilité orale des POPs dans les sols, plusieurs consortiums ont développé différents tests de digestion in vitro pour estimer la bioaccessibilité orale. Ces tests simulent les mécanismes et les conditions physiologiques de la digestion de l'animal producteur de denrées alimentaires ou de l'Homme, en particulier les processus physico-chimiques appliqués par le système gastro-intestinal. Ces tests permettent d'évaluer l'intensité des transferts à l'Homme et font partie de la méthodologie reprise en évaluation quantitative des risques sanitaires liée à la gestion des sites et sols pollués. Cependant de nombreuses publications dénotent de résultats mitigés en terme de comparaison avec l'in vivo, contrairement à certains éléments traces métalliques pour lesquels un test standardisé existe. L'enjeu du projet BORG est de développer des tests de bioaccessibilité in vitro aptes à prédire la biodisponibilité orale de trois familles de POPs dans les sols (PCBs, HAPs et chlordécone), en comparaison à la biodisponibilité mesurée in vivo qui est l'objet de cette demande et de préciser les conditions de son utilisation et de tester son utilité dans d'autres contextes d'évaluation des risques. Le projet fait partie de l'approche ONE HEALTH qui relie la santé de l'environnement, des animaux et des humains. L'objectif est de créer une méthode d'évaluation des risques que les professionnels pourront utiliser sur les sites et sols pollués.
Bénéfices attendus
La mise au point de modèles in vitro fiables pour évaluer les risques sanitaires sur des sites et sols pollués permettra aux acteurs de reduire très significativement l'utilisation des méthodes in vivo sans pour autant compromettre la fiabilité des résultats de ces évaluations, aujourd'hui trop approximatives pour assurer la sécurité sanitaire concernant les POPs.
Procédures
Les porcelets seront pendant environs 2h contenus dans des compartiments afin de contrôler finement leur exposition aux sols ou huiles (témoins) étudiés. Lors de la dernière journée d'expérimentation, les animaux seront également en claustration dans les compartiments individuels pendant 24h pour assurer la collecte individuelle de l'urine.
Impact sur les animaux
Les animaux seront exposés à des doses de contamination très faibles, bien en dessous du seuil à partir duquel on commence à observer des ffets sur la santé. Par ailleurs, nous menons ce type d'étude depuis plus d'une décennie et nous n'avons jamais rencontré d'effets négatifs sur la santé des animaux mis en essai. Les éventuelles sources de stress pour les animaux seront le transport pour rejoindre notre animalerie dans un véhicule conforme à la réglementation ainsi que les claustrations temporaires. En effet, nous sépareront temporairement les animaux en compartiments individuels pour nous assurer de l'ingestion complète de la boulette d'aliment contenant environ 2g de sol (ou d'huile) à étudier. Cette séparation peut perturber les animaux, notamment lors de la période d'adaptation. Néanmoins, l'accoutumance à cette séparation temporaire est par expérience très rapide (environ 3 jours). De plus, les animaux seront maintenus en compartiment individuel également les 24h dernières heures précédant la mise à mort dans les mêmes conditions afin de collecter l'intégralité de l'urine à l'échelle individuelle en dessous de chaque compartiment de la cage. Dans chacun des deux cas, les interactions interindividuelles seront maintenues par un contact visuel, olfactif et auditif pendant cette période.
Devenir
En raison des prélèvements envisagés (foie, tissu adipeux surrénal), la mise à mort est rendu nécessaire.
Remplacement
Si des tests pharmaceutiques in vitro sont utilisés en laboratoire et en industrie pour étudier la biodisponibilité de nombreuses molécules, cette méthode n'est que peu éprouvée concernant les polluants organiques qui peuvent être présents dans les sols. Il est donc indispensable, que de tels tests in vitro soient validés par comparaison avec des études in vivo afin d'atteindre le niveau de fiabilité nécesssaire avant leur utilisation pour une évaluation des risques sanitaires. Ainsi, ce travail vise à remplacer à terme des expérimentations in vivo sur ce type de problématiques par des tests in vitro adaptés aux POPs.
Réduction
La biodisponibilité relative compare la fraction du contaminant assimilée lorsque le sol la véhicule, comparativement à la fraction assimilée lorsqu'apportée sous une forme de référence (huile alimentaire pour les POPs). La première partie de l'expérience consistera à évaluer la linéarité de la dose-réponse (c'est-à-dire la relation liant la dose ingérée de contaminant par jour et par kg de poids corporel par rapport aux concentrations mesurées dans les tissus cibles) par un contrôle statistique. Lorsque la linéarité est respectée, un simple rapport entre la réponse des concentrations dans les tissus cibles obtenue après une exposition aux contaminants via le sol ou via l'huile sera utilisé afin d'en dériver une estimation de la biodisponibilité relative. La linéarité de la réponse a été préalablement établie pour les PCBs et la chlordécone mais pas encore pour les HAPs. Ainsi, la première partie du projet consistera à établir le domaine de linéarité de la réponse suite à une exposition à des doses croissantes d'HAPs et une deuxième partie consistera ensuite à évaluer la biodisponibilité relative des PCBs, HAPs et de la chlordécone présents dans des sols choisis pour leurs caractéristiques variées, par comparaison à la biodisponibilité obtenue lorsque ces contaminants sont véhiculés par l'huile (vecteur de référence). La biodisponibilité relative obtenue in vivo pour ces sols servira comme valeur de référence pour améliorer les tests de bioaccessibilité in vitro des différents partenaires du projet.
Raffinement
Les animaux seront logés dans des conditions réglementaires d'hébergement avec une possibilité de les séparer temprairement (2h) dans des compartiments pour la distribtion des boulettes d'exposition (cf. plus haut). Pendant cette période de claustration, les intercations sociales interindividus seront préservées par des contacts visuels, olfactifs et auditifs. Les animaux ont accès à l'eau ad libitum. Au delà de ces conditions, un contrôle quotidien sera réalisé. Un enrichissement sera réalisé par des cordes en chanvre BIO suspendues dans les cages. Le passage d'une musique douce permettra de réduire leur sensibilité aux bruits, très marquée chez les porcins.
Choix des espèces
Les tests de biodisponibilité des POPs évaluent le risque sanitaire pour la catégorie d'individus la plus sensible : l'enfant de 3 ans d'âge. La similitude de la physiologie digestive, du type d'alimentation entre porc et Homme ainsi que de la maturité du tractus digestif d'un porcelet de 2 mois d'âge correspondant à celle d'un enfant d'environ 3 ans d'âge, en font un modèle de prédilection pour ce type d'étude. Ainsi le modèle porcelet est utilisé pour mimer l'enfant qui est le modèle de référence pour évaluer la biodisponibilité des POPs chez l'Homme. Les porcelets seront recrutés une semaine après le sevrage, c'est à dire à 42 jours. Les animaux entreront en procédure expérimentale après 1 semaine d'acclimatation. Cet âge représente un compromis entre la bonne tenue des expérimentations et le développement approprié du porcelet.
Immuno-virothérapie du cancer du foie 1/3 MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
Anesthésiées vingt minutes, ouvertes sur un centimètre d'abdomen, injectées de cellules tumorales dans le foie : les souris de ce protocole repassent ensuite sous anesthésie jusqu'à sept fois en six semaines pour des échographies et des imageries. Entre le troisième et le dix-septième jour après la greffe, elles reçoivent jusqu'à six injections de traitement, dont la moitié sous anesthésie. 882 souris sont concernées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, et le porteur présente ce suivi répété du même individu comme une réduction "drastique" du nombre d'animaux. Toutes sont tuées à la fin de leur procédure et leurs organes prélevés.
Objectifs
Le projet concerne un nouveau traitement du cancer du foie, une des causes les plus courantes de décès liés au cancer avec une incidence en constante augmentation (830 000 décès dans le monde en 2020). L’absence de traitement efficace et les difficultés de diagnostic précoce en font un cancer de mauvais pronostic par le plan stratégique national décennal de lutte contre le cancer (survie à 5 ans de seulement 18%). Le carcinome hépatocellulaire représente plus de 80% des cancers primitifs du foie et se développe fréquemment sur un fond de maladie hépatique chronique causée par l'alcool, l'hépatite virale B ou C chronique ou le syndrome métabolique associé à un excès de poids et au diabète. Le carcinome hépatocellulaire est souvent diagnostiqué tardivement et se prête mal à un traitement curatif. L'objectif du projet est d’apporter la preuve de concept du bénéfice de l’association d’une vaccination antitumorale avec l’action de virus capable d’éliminer préférentiellement des cellules cancéreuses dans un contexte de cancer du foie. Pour la formule de vaccin, nous utiliserons de l’ARNm comportant des modifications moléculaires qui ont démontré leur valeur dans les vaccins ARNm actuellement très utilisés dans la pandémie COVID. L’effet protecteur et curatif de la vaccination, ainsi que l’apport d’un traitement combinant le vaccin et le virus ciblant les cellules cancéreuses, seront évalués. Ce projet est réparti sur 3 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les traitements du carcinome hépatocellulaire restent insatisfaisants. Ils reposent essentiellement sur des interventions lourdes ou des thérapies peu efficaces. L’immunothérapie est basée sur la stimulation du système immunitaire du patient et reste une option thérapeutique de choix, mais en l’état elle doit être améliorée pour atteindre un niveau d’efficacité satisfaisant. Les vaccins en cours de test contre le cancer du foie utilisent surtout de petits morceaux de protéines fabriqués en laboratoire pour apprendre au système immunitaire à reconnaître et attaquer les cellules cancéreuses. De récentes avancées dans l’utilisation de l’ARNm et des nanoparticules ouvrent la voie à une nouvelle génération de vaccins contre le cancer. Par exemple, des essais sur le cancer de la peau ont montré qu’associer une immunothérapie ciblée avec un vaccin à ARNm transporté par des nanoparticules lipidiques pouvait renforcer la réponse du système immunitaire contre la tumeur. Le projet présenté ici innove en combinant deux approches puissantes : d’une part, des virus spéciaux qui attaquent directement la tumeur et facilitent l’accès du système immunitaire aux cellules cancéreuses, et d’autre part, un vaccin à ARNm qui entraîne le système immunitaire à reconnaître les cellules tumorales. Cette stratégie combinée vise à : (1) apprendre au système immunitaire à cibler précisément la tumeur grâce au vaccin, et (2) intensifier la destruction des cellules cancéreuses par l’action des virus, tout en stimulant davantage la réponse immunitaire.
Procédures
Un lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 5 minutes puis une injection de 30 secondes, réalisé dans l’EU1. Un autre lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre, puis une injection (30 secondes) dans le foie (réalisé dans l’EU1 ou l’EU2), puis 7 anesthésies d'environ 5 à 20 minutes chacune afin d'effectuer à chaque fois une échographie et/ou une imagerie, sur une durée totale de 6 semaines (5 imageries réalisées dans l’EU2 et 2 échographies réalisée dans l’EU3). D’autres lots d’animaux auront une anesthésie d'environ 5 minutes puis une injection de 30 secondes, suivi de 3 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection), avec anesthésie (5 minutes pour l’injection) pour la moitié des animaux, entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). Un 5ème lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre, puis une injection (30 secondes) dans le foie (réalisé dans l’EU1 ou l’EU2), suivi de 3 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection) sous anesthésie (5 minutes) entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). 5 anesthésies d'environ 5 à 20 minutes chacune seront réalisées afin d'effectuer à chaque fois une imagerie, sur une durée totale de 6 semaines (réalisées dans l’EU2). Un 6ème lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 5 minutes puis une à deux injections de 30 secondes selon la pousse tumorale, suivi de 6 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection), dont 3 réalisées avec anesthésie (5 minutes pour l’injection), entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). Un 7ème lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre, puis une à deux injections (30 secondes) dans le foie (réalisé dans l’EU1 ou l’EU2), suivi de 6 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection), dont 3 réalisées avec anesthésie (5 minutes pour l’injection), entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). 5 anesthésies d'environ 5 à 20 minutes chacune seront réalisées afin d'effectuer à chaque fois une imagerie, sur une durée totale de 6 semaines (réalisées dans l’EU2).
Impact sur les animaux
Un stress peut intervenir lors de la préhension de l'animal dans le cadre des différentes interventions (injection, anesthésie, mesure de la taille des tumeurs) et une douleur légère peut apparaitre au point d'injection (cellules tumorales et traitement). La chirurgie pour injecter les cellules tumorales dans le foie peut entrainer une douleur post-opératoire au niveau de la suture, voire une infection locale. Le niveau de nuisance dû à la croissance tumorale peut augmenter avec la taille de la tumeur.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chacune des procédures et leurs organes prélevés en post-mortem pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Le foie est un organe complexe composé de nombreux types de cellules, dont les hépatocytes et des cellules immunitaires. Les modèles classiques en laboratoire, comme les cultures de cellules, ne permettent pas de reproduire cette complexité. Des modèles plus avancés, comme les organoïdes ou les organes sur puce, imitent mieux certaines fonctions du foie et seront utilisés pour évaluer la toxicité des traitements. Cependant, ce projet repose sur des interactions complexes entre les cellules tumorales, le système immunitaire et l’environnement du foie. Aucun modèle de laboratoire ne permet aujourd’hui de recréer cette dynamique, d’où la nécessité d’utiliser un modèle animal
Réduction
Les traitements seront analysés et présélectionnés par une série d’essais in vitro sur cellules immunitaires et hépatiques en culture. Cette sélection in vitro des meilleurs traitements contribuera à réduire le nombre d’individus inclus dans le projet et permettra d’affiner les protocoles en fonction du type de réponses immunitaires désiré. Seuls les traitements présentant un intérêt seront testés chez la souris. Un suivi au cours du temps, sur un même individu, de la taille des tumeurs sera réalisé et permettra de réduire drastiquement le nombre d'animaux qui aurait été utilisé pour obtenir des courbes de croissance de la tumeur par mise à mort des animaux à chaque temps étudié. Enfin, un calcul des effectifs nécessaires nous permettra d'atteindre une significativité des résultats avec un minimum d'animaux.
Raffinement
Pour limiter la souffrance animale, la taille des tumeurs sera suivie afin qu’elles ne dépassent jamais les limites acceptées en recherche sur le cancer. Nous améliorerons aussi notre protocole en nous appuyant sur des études montrant que les nanoparticules utilisées sont bien tolérées et que le moment de la journée où la greffe est réalisée peut influencer son succès. Ainsi, nous choisirons le moment le plus adapté. L’utilisation d’analgésique et d’anesthésique sera réalisée lorsque nécessaire et des points limites prédictifs et précoces, basés sur des grilles score adaptés aux interventions sur l’animal, avec des critères d’arrêt seront mis en place afin de réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal. Les animaux seront transportés par un expérimentateur compétant suivant la réglementation, dans des cages occultées, contenant de l'enrichissement et des croquettes mouillées.
Choix des espèces
Le développement de tumeur par greffe chez la souris est facilement réalisable, reproductible et est un modèle de référence dans le domaine de l’immuno-oncologie. Les lignées de souris présentent l'intérêt d'être génétiquement homogènes, réduisant ainsi la variabilité des réponses immunitaires. Nous emploierons des souris de deux souches différentes qui présentent l'avantage d'être bien connues dans leur capacité de réponse immunitaire. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines pour les greffes, ainsi que décrit dans la littérature. C’est aussi le stade de développement auquel leur immunité est effective.
Création, amplification et archivage de lignées de rats génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
Les rates donneuses sont tuées pour qu'on récupère leurs embryons, et les mères porteuses opérées le sont au plus tard au sevrage de leurs petits, faute de pouvoir être réutilisées après une chirurgie. 3 725 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, seules les femelles dont le cycle a été synchronisé sans opération pouvant repartir vers un autre projet, jusqu'à quatre fois. Les donneuses reçoivent deux injections d'hormones à 48 heures d'intervalle sous contention, les mères porteuses quatre injections et une chirurgie de transfert d'embryons de cinq minutes, avec un risque d'automutilation de la cicatrice que le porteur signale. L'activité est vendue comme prestation de service, et le porteur écrit que la quantité d'animaux "a été adaptée pour chaque procédure afin de remplir les conditions stipulées dans les contrats", sans approche statistique.
Objectifs
Notre travail est de créer, d’amplifier et d’archiver des lignées de rats génétiquement modifiées. Ces lignées peuvent devenir des modèles de maladies humaines et vont permettre de mieux comprendre leurs processus de développement. Ces modèles peuvent également répondre à d’autres intérêts scientifiques tout aussi importants (comme par exemple devenir des modèles de choix pour la recherche fondamentale). Ces rongeurs, en tant que modèle de maladies humaines, vont également permettre de tester des médicaments et de valider (ou d’invalider) des cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Notre coeur de métier est la création, l'amplification et l'archivage de lignées génétiquement modifiées de rats pour le service des chercheurs et de la commumauté scientifique. Notre rôle est de fournir aux chercheurs des lignées précises, établies et robustes en améliorant sans cesse nos techniques afin de répondre aux exigences de réduction et raffinement. La réduction du nombre d'animaux utilisés et leur bien-être est une préoccupation permanente.
Procédures
Les rates donneuses d'embryons vont subir 2 injections d'hormones à 48h d'intervalle pour stimuler la production d'embryons. Cet acte rapide se fait sur animaux vigiles et sous contention. Les rates mères-porteuses seront d'abord soumise à une injection de composé chimique pour synchroniser leur cycle (acte rapide, sur animaux vigiles sous contention), puis quelques jours plus tard (J+5), elles recevront lors de la chirurgie de transfert d'embryons ou d'insémination artificilelle : Une injection d'analgésique 30 minutes avant l'injection du cocktail anesthésique (actes rapides, sur animaux vigiles sous contention). Une fois l'endormissment suffisamment profond, la chirugie est réalisée. Elle dure environ 5 minutes par animal. Avant le réveil des animaux, une dernière injection d'anti-inflammatoire combinée à une réhydratation sera pratiquée. Chaque femelle mère-porteuse recevra au total 4 injections. (composé pour la synchronisation, analgésique, anesthésique et anti-inflammatoire/réhydratation).
Impact sur les animaux
Les rats peuvent ressentir un léger stress de courte durée lors des manipulation/contentions pour réaliser les différentes injections. Lors des injections des différents produits utilisés dans cette procédure (hormones, composé pour la synchronisation, analgésique, anesthésique et anti-inflammatoire), les animaux vont sentir une légère douleur de courte durée, le temps de l'introduction de l'aiguille. Les composés injectés sont tous très bien tolérés, mais le site d'injection sera surveillé pour s'assurer qu'il n'y a pas d'inflammation, d'infection ou de lésions de grattage. En post-opératoire, l'animal peut ressentir une gêne, entièrement prise en charge par la couverture antalgique. La plaie générée par la chirurgie sera étroitement surveillée car elle peut s'inflammer ou s'infecter dans de très rares cas. Les animaux en post chirurgie peuvent s'attaquer à leur cicatrice : soit enlever les agrafes, soit ronger la peau autour (automutilation).
Devenir
Les donneuse d'embryons pour la création et l'archivage des lignées créées seront mises à mort pour récupérer les embryons au stade souhaité. Pour les mères-porteuses, dès lors qu'il y a eu la chirurgie de transfert d'embryon ou de gamètes, elle seront mises à mort soit le lendemain de la mise bas théorique (donc à J+23 de la chirurgie) pour pratiquer une césarienne, si elles n'ont pas mis bas naturellement, ou au plus tard au sevrage de leurs petits (soit 3-4 semaines post partum). Nous ne pouvons pas les réutiliser comme reproductrices ou de nouveau mère porteuses, ayant déjà subi une chirurgie. En revanche, pour les femelles mères porteuses dont le cycle a juste été synchronisé, donc sans avoir été opérées, elle peuvent être réutilisées dans la limite de 4 fois en respectant un temps de repos de minimum 21 jours entre les injections de synchronisation pour un autre projet dans le cadre de nos activités de service.
Remplacement
Il n'y a pas d’autre possibilité que le recours à l’animal vivant pour toutes ces techniques de création, d'amplification et d'archivage de lignées de rats génétiquement modifiées. L'état actuel de nos connaissances ne permettent pas de s'affranchir d'utiliser des animaux en recherche fondamentale ou appliquée.
Réduction
La réduction du nombre d'animaux utilisés et leur bien-être est une préoccupation permanente. L’amélioration des techniques permet sans cesse de répondre aux exigences de réduction et de raffinement. Le raffinement de nos techniques de transgénèse, de procréation médicalement assistée et de cryoconservation permet de générer de moins en moins d'animaux pour l'ensemble des prestations de l'institut, ce qui permet de réduire de manière importante la quantité d'animaux générés. Ces techniques sont utilisées en prestation de service, la quantité d'animaux utilisée a été adaptée pour chaque procédure afin de remplir les conditions stipulées dans les contrats avec les clients. Il n'y a donc pas d'approche statistique.
Raffinement
Le personnel en charge de cette étude est habitué à ces gestes techniques car ils sont pratiqués en routine depuis des années dans notre laboratoire. Les femelles restent sous surveillance après leurs injections, afin d’observer aucune apparence physique externe de souffrance. Lors de la chirurgie, les animaux sont anesthésiés et reçoivent un traitement antalgique adapté à ce type de procédure. Du gel oculaire est placé systématiquement sur les yeux des animaux anesthésiés afin de prévenir tout dommage de la cornée de l’animal. De plus, les animaux anesthésiés sont placés sur une plaque chauffante pour palier toute déperdition de chaleur liée à l’anesthésie. Une injection conjointe de sérum physiologique tiédi sera réalisée pour compenser les pertes hydriques liées à la chirurgie et limiter la déperdition de chaleur. Cette compensation a pour objectif de permettre aux animaux une récupération idéale post chirurgie. Les animaux opérés restent en observation jusqu’à leur complet réveil en bonne forme (effets de l'anesthésie dissipés et reprise de mobilité), dans leur cage placée sur une platine chauffante à 37°C. Nos rats sont hébergés en cages ventilées, en groupe dans la mesure du possible, avec de multiples enrichissements : bâton de bois à ronger, balles de bois à ronger, nids, croquettes de nourriture au fond de la cage.
Choix des espèces
Le rat est un très bon modèle d'expérimentation animale car il est de petite taille, son génome est parfaitement connu et il a un taux de reproduction très rapide. Ils sont de très bons modèles expérimentaux puisque 99% de leurs gènes présentent un gène homologue chez l'Homme. Il est couramment utilisé par les chercheurs pour des créations de lignées transgéniques. Les femelles utilisées pour produire les embryons sont prépubères car elles répondent mieux aux traitements hormonal de superovulation. (réduit le nombre de femelles donneuses utilisées) Les mères-porteuses utilisées sont de jeunes adultes matures. La souche choisie est connue pour être d’excellentes mères, très calmes, qui peuvent donner naissance à de grandes portées de nouveau- nés, ce qui permet de réduire significativement le nombre de femelles mères porteuses utilisées.
Immuno-virothérapie du cancer du foie 3/3 MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
882 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie d'entre elles subit une anesthésie de vingt minutes, une incision abdominale d'un centimètre et une injection de cellules tumorales directement dans le foie, puis jusqu'à sept nouvelles anesthésies en six semaines pour des imageries, et jusqu'à six injections de traitement. La preuve de concept recherchée, associer un vaccin à ARNm et un virus tueur de cellules cancéreuses contre le carcinome hépatocellulaire, reste une hypothèse de laboratoire, quand les tumeurs greffées, elles, grossissent réellement dans le foie des souris. Le porteur mentionne des organoïdes et des organes sur puce qu'il emploiera pour la toxicité, puis conclut à la "nécessité" d'un modèle animal pour le reste.
Objectifs
Le projet concerne un nouveau traitement du cancer du foie, une des causes les plus courantes de décès liés au cancer avec une incidence en constante augmentation (830 000 décès dans le monde en 2020). L’absence de traitement efficace et les difficultés de diagnostic précoce en font un cancer de mauvais pronostic par le plan stratégique national décennal de lutte contre le cancer (survie à 5 ans de seulement 18%). Le carcinome hépatocellulaire représente plus de 80% des cancers primitifs du foie et se développe fréquemment sur un fond de maladie hépatique chronique causée par l'alcool, l'hépatite virale B ou C chronique ou le syndrome métabolique associé à un excès de poids et au diabète. Le carcinome hépatocellulaire est souvent diagnostiqué tardivement et se prête mal à un traitement curatif. L'objectif du projet est d’apporter la preuve de concept du bénéfice de l’association d’une vaccination antitumorale avec l’action de virus capable d’éliminer préférentiellement des cellules cancéreuses dans un contexte de cancer du foie. Pour la formule de vaccin, nous utiliserons de l’ARNm comportant des modifications moléculaires qui ont démontré leur valeur dans les vaccins ARNm actuellement très utilisés dans la pandémie COVID. L’effet protecteur et curatif de la vaccination, ainsi que l’apport d’un traitement combinant le vaccin et le virus ciblant les cellules cancéreuses, seront évalués. Ce projet est réparti sur 3 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les traitements du carcinome hépatocellulaire restent insatisfaisants. Ils reposent essentiellement sur des interventions lourdes ou des thérapies peu efficaces. L’immunothérapie est basée sur la stimulation du système immunitaire du patient et reste une option thérapeutique de choix, mais en l’état elle doit être améliorée pour atteindre un niveau d’efficacité satisfaisant. Les vaccins en cours de test contre le cancer du foie utilisent surtout de petits morceaux de protéines fabriqués en laboratoire pour apprendre au système immunitaire à reconnaître et attaquer les cellules cancéreuses. De récentes avancées dans l’utilisation de l’ARNm et des nanoparticules ouvrent la voie à une nouvelle génération de vaccins contre le cancer. Par exemple, des essais sur le cancer de la peau ont montré qu’associer une immunothérapie ciblée avec un vaccin à ARNm transporté par des nanoparticules lipidiques pouvait renforcer la réponse du système immunitaire contre la tumeur. Le projet présenté ici innove en combinant deux approches puissantes : d’une part, des virus spéciaux qui attaquent directement la tumeur et facilitent l’accès du système immunitaire aux cellules cancéreuses, et d’autre part, un vaccin à ARNm qui entraîne le système immunitaire à reconnaître les cellules tumorales. Cette stratégie combinée vise à : (1) apprendre au système immunitaire à cibler précisément la tumeur grâce au vaccin, et (2) intensifier la destruction des cellules cancéreuses par l’action des virus, tout en stimulant davantage la réponse immunitaire.
Procédures
Un lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 5 minutes puis une injection de 30 secondes, réalisé dans l’EU1. Un autre lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre, puis une injection (30 secondes) dans le foie (réalisé dans l’EU1 ou l’EU2), puis 7 anesthésies d'environ 5 à 20 minutes chacune afin d'effectuer à chaque fois une échographie et/ou une imagerie, sur une durée totale de 6 semaines (5 imageries réalisées dans l’EU2 et 2 échographies réalisée dans l’EU3). D’autres lots d’animaux auront une anesthésie d'environ 5 minutes puis une injection de 30 secondes, suivi de 3 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection), avec anesthésie (5 minutes pour l’injection) pour la moitié des animaux, entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). Un 5ème lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre, puis une injection (30 secondes) dans le foie (réalisé dans l’EU1 ou l’EU2), suivi de 3 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection) sous anesthésie (5 minutes) entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). 5 anesthésies d'environ 5 à 20 minutes chacune seront réalisées afin d'effectuer à chaque fois une imagerie, sur une durée totale de 6 semaines (réalisées dans l’EU2). Un 6ème lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 5 minutes puis une à deux injections de 30 secondes selon la pousse tumorale, suivi de 6 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection), dont 3 réalisées avec anesthésie (5 minutes pour l’injection), entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). Un 7ème lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre, puis une à deux injections (30 secondes) dans le foie (réalisé dans l’EU1 ou l’EU2), suivi de 6 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection), dont 3 réalisées avec anesthésie (5 minutes pour l’injection), entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). 5 anesthésies d'environ 5 à 20 minutes chacune seront réalisées afin d'effectuer à chaque fois une imagerie, sur une durée totale de 6 semaines (réalisées dans l’EU2).
Impact sur les animaux
Un stress peut intervenir lors de la préhension de l'animal dans le cadre des différentes interventions (injection, anesthésie, mesure de la taille des tumeurs) et une douleur légère peut apparaitre au point d'injection (cellules tumorales et traitement). La chirurgie pour injecter les cellules tumorales dans le foie peut entrainer une douleur post-opératoire au niveau de la suture, voire une infection locale. Le niveau de nuisance dû à la croissance tumorale peut augmenter avec la taille de la tumeur.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chacune des procédures et leurs organes prélevés en post-mortem pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Le foie est un organe complexe composé de nombreux types de cellules, dont les hépatocytes et des cellules immunitaires. Les modèles classiques en laboratoire, comme les cultures de cellules, ne permettent pas de reproduire cette complexité. Des modèles plus avancés, comme les organoïdes ou les organes sur puce, imitent mieux certaines fonctions du foie et seront utilisés pour évaluer la toxicité des traitements. Cependant, ce projet repose sur des interactions complexes entre les cellules tumorales, le système immunitaire et l’environnement du foie. Aucun modèle de laboratoire ne permet aujourd’hui de recréer cette dynamique, d’où la nécessité d’utiliser un modèle animal
Réduction
Les traitements seront analysés et présélectionnés par une série d’essais in vitro sur cellules immunitaires et hépatiques en culture. Cette sélection in vitro des meilleurs traitements contribuera à réduire le nombre d’individus inclus dans le projet et permettra d’affiner les protocoles en fonction du type de réponses immunitaires désiré. Seuls les traitements présentant un intérêt seront testés chez la souris. Un suivi au cours du temps, sur un même individu, de la taille des tumeurs sera réalisé et permettra de réduire drastiquement le nombre d'animaux qui aurait été utilisé pour obtenir des courbes de croissance de la tumeur par mise à mort des animaux à chaque temps étudié. Enfin, un calcul des effectifs nécessaires nous permettra d'atteindre une significativité des résultats avec un minimum d'animaux.
Raffinement
Pour limiter la souffrance animale, la taille des tumeurs sera suivie afin qu’elles ne dépassent jamais les limites acceptées en recherche sur le cancer. Nous améliorerons aussi notre protocole en nous appuyant sur des études montrant que les nanoparticules utilisées sont bien tolérées et que le moment de la journée où la greffe est réalisée peut influencer son succès. Ainsi, nous choisirons le moment le plus adapté. L’utilisation d’analgésique et d’anesthésique sera réalisée lorsque nécessaire et des points limites prédictifs et précoces, basés sur des grilles score adaptés aux interventions sur l’animal, avec des critères d’arrêt seront mis en place afin de réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal. Les animaux seront transportés par un expérimentateur compétant suivant la réglementation, dans des cages occultées, contenant de l'enrichissement et des croquettes mouillées.
Choix des espèces
Le développement de tumeur par greffe chez la souris est facilement réalisable, reproductible et est un modèle de référence dans le domaine de l’immuno-oncologie. Les lignées de souris présentent l'intérêt d'être génétiquement homogènes, réduisant ainsi la variabilité des réponses immunitaires. Nous emploierons des souris de deux souches différentes qui présentent l'avantage d'être bien connues dans leur capacité de réponse immunitaire. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines pour les greffes, ainsi que décrit dans la littérature. C’est aussi le stade de développement auquel leur immunité est effective.
Test d’activité sérologique de produits immunologiques chez les rongeurs.
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
6 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chacune pour une seule injection et une seule prise de sang. Quatorze jours après la vaccination, elles sont anesthésiées puis saignées par ponction intracardiaque, un prélèvement dont le volume interdit toute survie. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro reconnue par les autorités ne permet ce contrôle, et présente le test sérologique comme un raffinement par rapport au test létal inscrit à la pharmacopée. L'enjeu déclaré reste la libération commerciale de lots de vaccins antirabiques pour chiens et chats, avec les contrôles de stabilité au stockage qui l'accompagnent.
Objectifs
Le projet a pour objectif de décrire l’activité de produits immunologiques destinés à la prévention de la rage chez les carnivores domestiques. L’activité des produits sera évaluée au travers de la mesure de la réponse immunitaire induite chez la souris par l’analyse du taux d’anticorps sérique (test sérologique) en comparaison avec le taux d'anticorps sérique obtenu avec le vaccin de la Préparation Européenne de Référence (PER).
Bénéfices attendus
Garantir l’efficacité des lots de vaccins contre la rage et permettre ainsi leur commercialisation au travers des phases de libération pharmaceutique et des tests associés aux mesures de stabilité, ceci à différentes températures de stockage (Analyses ponctuelles en cas d’excursion thermique).
Procédures
Les souris sont vaccinées à J0 (injection d'une durée d’environ 3 secondes) Les souris témoins sont vaccinées avec le vaccin de référence (PER) (injection d'une durée d’environ 3 secondes). 14 jours après la dernière vaccination, les 2 groupes (vaccinés et témoins) sont anesthésiés (une injection, durée d’environ 5 secondes) Prélèvement sanguin intracardiaque terminal. A l'issue de la procédure tous les animaux sont euthanasiés (Durée d’environ une minute)
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus chez les animaux incluent un stress bref lié à la contention et une douleur transitoire lors des injections (vaccination et anesthésie).
Devenir
Le volume sanguin requis étant important, le prélèvement prévu ne permet pas une récupération de l’animal. Le prélèvement est terminal, l’euthanasie est réalisée dans la foulée de la procédure.
Remplacement
Il n’existe pas à ce jour de méthode alternative in vitro, reconnues par les autorités des pays concernés, permettant de vérifier l’activité des vaccins testés.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, chaque fois que cela est possible, les témoins peuvent être mutualisés entre plusieurs vaccins de lots différents.
Raffinement
Les animaux sont hébergés par groupe. Une période d’acclimatation d’au moins 5 jours est respectée. Les installations sont suivies en températures, en hygrométrie et les animaux sont hébergés dans des portoirs ventilés. Toute anomalie sur les installations est directement remontée à un poste de garde (24h/24h) permettant une intervention rapide y compris les weekends. La procédure par sérologie constitue un raffinement comparativement à l’alternative proposée dans la pharmacopée, soit un test létal (réduction du nombre et réduction des manipulations). Les animaux sont observés quotidiennement et de manière biquotidienne si l’état de santé d’un animal l’exige. Aucun signe clinique n'est attendu, cependant nous nous référerons aux points limites généraux mis en place et appliqués dans cette étude.
Choix des espèces
La souris est le modèle imposé pour la libération des vaccins par la pharmacopée des pays où sont commercialisés les vaccins Les souris utilisées sont des souris adultes car le test nécessite que leur système immunitaire soit mature.
Le raccourcissement des télomères affecte l’intestin et le comportement du poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une partie des poissons zèbres utilisés porte une mutation de la télomérase qui les fait vieillir prématurément : dès six à neuf mois, ils perdent en fertilité et en mobilité, maigrissent et développent infections et cancers. 4 976 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 1 280 d'entre eux relevant du niveau sévère. Ils subissent des gavages, des traitements antibiotiques, des transplantations de microbiote fécal, des injections, des prélèvements sanguins et des tests d'endurance, de fertilité et de cognition, une partie étant suivie jusqu'à la mort. Tous sont tués, avec ou sans prélèvement, pour savoir si l'intestin déclenche le vieillissement du reste du corps.
Objectifs
Le raccourcissement des extrémités des chromosomes, appelées télomères, est lié au vieillissement et favorise l'apparition de maladies liées à l’âge. Ces télomères jouent un rôle essentiel dans la protection de notre matériel génétique. L’enzyme télomérase aide à ralentir leur raccourcissement, mais son action devient moins efficace avec l’âge. Des recherches ont montré que chez la souris, une augmentation temporaire de la télomérase peut allonger la durée de vie sans effets secondaires importants. Cependant, d’autres études indiquent qu’une activation permanente de cette enzyme pourrait favoriser le développement de cancers. Cela montre que la manière dont la télomérase est utilisée est cruciale : une activation ponctuelle semble bénéfique, alors qu’une stimulation continue peut-être risquée. Le vieillissement d’un organe peut aussi affecter l’ensemble du corps, mais ce phénomène reste encore mal compris. Le poisson zèbre est un modèle idéal pour étudier ces mécanismes, car son vieillissement ressemble à celui de l’être humain. Dans notre laboratoire, nous avons développé un modèle de vieillissement accéléré en modifiant la télomérase. Les poissons affectés par cette mutation montrent dès 6 à 9 mois une baisse de fertilité et de mobilité, une perte de poids importante, ainsi qu’un risque accru d’infections et de cancers. Chez les poissons non modifiés, ces signes apparaissent plus tard, vers 18 à 24 mois. L’intestin est l’un des premiers organes touchés par ce vieillissement.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de définir si l’intestin possède un rôle central d’initiateur du vieillissement. En repoussant le vieillissement, ce projet permettra ainsi d'approfondir la compréhension du rôle du microbiote et des télomères dans le vieillissement et de tester de nouvelles approches thérapeutiques, en particulier à travers la manipulation du microbiote et des métabolites, pour ralentir le déclin comportemental lié à l’âge.
Procédures
Les poissons-zèbres seront soumis à différentes interventions au cours de l’étude. Certains recevront une modification génétique unique visant à activer ou inactiver le gène tert dans les cellules intestinales. Des analyses ponctuelles seront réalisées sur l’intestin ainsi que sur des organes périphériques comme les testicules, le cerveau, les muscles et le foie. Les animaux participeront également à des tests fonctionnels : l’endurance et la fertilité seront évaluées vers l’âge de six mois, les capacités cognitives à l’âge adulte, et la longévité sera suivie tout au long de la vie. Le microbiote intestinal sera modifié soit par gavage, soit par traitement antibiotique sur quelques jours, soit par transplantation de microbiote fécal ; chaque poisson sera exposé à une ou deux de ces interventions, généralement autour de deux mois d’âge. Certains groupes recevront des molécules anti-inflammatoires, administrées par gavage ou ajoutées dans l’eau, sur des durées variables selon le protocole. Enfin, les animaux pourront être soumis à des manipulations courantes comme des injections, des prélèvements sanguins, des transports ou des tests comportementaux.
Impact sur les animaux
Les interventions prévues peuvent entraîner différents effets secondaires. Les injections et prélèvements sanguins provoqueront une douleur locale ponctuelle et un inconfort transitoire, parfois accompagnés de stress aigu. Les manipulations répétées, telles que la contention, pourront générer un stress, une agitation ou une détresse comportementale. Le transport et les changements d’environnement risquent d’entraîner une désorientation et une anxiété passagère. Les tests comportementaux peuvent causer de la fatigue et du stress liés à l’exposition à des environnements nouveaux ou stimulants. Enfin, l’administration de substances expérimentales peut provoquer des effets secondaires tels que de la léthargie, une perte d’appétit ou une réduction de l’activité.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort avec ou sans prélèvements.
Remplacement
Les études faites en laboratoire sur des cellules (appelées "in vitro") ont permis de mieux comprendre le vieillissement des cellules. Mais ces modèles ne permettent pas d’étudier comment les différents organes interagissent entre eux dans un corps vivant. Comme nous nous intéressons aux maladies liées à l’âge, qui touchent tout l’organisme, il est nécessaire d’utiliser un animal vivant pour faire ces recherches. Nous avons donc choisi un poisson comme modèle, car il vieillit de façon similaire à l’humain, notamment à cause du raccourcissement de ses télomères (des structures liées au vieillissement des cellules).
Réduction
Nous utilisons des modèles génétiques spéciaux qui permettent d’avoir, dans une même portée, à la fois les poissons testés et les poissons témoins (non traités). Cela garantit qu’ils ont exactement le même patrimoine génétique, ce qui rend les résultats plus fiables et évite d’avoir besoin de poissons témoins en plus. Cela permet donc de réduire le nombre total d’animaux utilisés. Après la fin des expériences, plusieurs analyses seront faites sur différents organes d’un même poisson. Cela permet d’obtenir un maximum d’informations sans avoir à utiliser plus d’animaux. Le nombre de poissons nécessaires a été estimé à partir de nos expériences précédentes, et confirmé à l’aide de logiciels statistiques. Ces outils nous aident à calculer le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats fiables dans nos tests scientifiques.
Raffinement
Toutes les expériences pouvant causer une douleur aux poissons seront faites sous une anesthésie générale de courte durée (5 à 10 minutes). Après les expériences, les poissons seront suivis tous les trois jours par les chercheurs, en plus d’un contrôle quotidien effectué par le personnel de l’animalerie. Pour s’assurer du bien-être des poissons, une grille d’observation spécifique à chaque procédure sera utilisée. Elle permet de repérer des signes de souffrance ou de malaise, comme des problèmes de nage, de respiration, d’alimentation, ou des saignements. Si un poisson montre des signes de détresse importants ou atteint un certain niveau de souffrance, il pourra recevoir un traitement antidouleur ou être endormi de façon définitive, pour éviter toute souffrance prolongée. Certains poissons présentent des problèmes de santé liés à leur âge ou à des caractéristiques génétiques. Si ces problèmes apparaissent (comme un arrêt de l’alimentation ou un état affaibli prolongé), cela sera également considéré comme un signal pour mettre fin à leurs souffrances, selon les mêmes procédures.
Choix des espèces
Nous nous intéressons aux effets du vieillissement de l’intestin sur l’ensemble du corps, en particulier sur le risque de développer des maladies comme le cancer, et à leur lien avec la longueur des télomères, des structures situées à l’extrémité des chromosomes. Pour explorer ces mécanismes, nous avons besoin d’un organisme dont le vieillissement reflète celui de l’être humain, notamment en ce qui concerne le raccourcissement des télomères avec l’âge. Le poisson-zèbre est un modèle particulièrement pertinent pour cette recherche. Nos travaux antérieurs ont montré qu’il présente de nombreuses similarités avec l’humain en matière de vieillissement, notamment le développement de cancers liés à l’âge. Contrairement à la souris, qui est pourtant souvent utilisée dans les études sur le vieillissement mais qui ne présente pas de raccourcissement progressif de ses télomères, le poisson-zèbre possède des télomères de longueur comparable à ceux des humains et qui se raccourcissent naturellement avec le temps. C’est pourquoi nous avons choisi d’utiliser le poisson-zèbre pour mieux comprendre l’impact des télomères sur le vieillissement. Les manipulations expérimentales seront réalisées uniquement chez les poissons adultes, car c’est à ce stade que nous pouvons étudier les effets du vieillissement. Certaines études nécessiteront le suivi des poissons tout au long de leur vie pour évaluer leur fertilité, leur durée de vie et l’apparition de tumeurs. D’autres examens impliqueront l’analyse de tissus à différents âges clés, notamment à 3, 9 et 18 mois, ce qui nécessitera l’euthanasie d’un certain nombre de poissons à ces moments-là pour effectuer des prélèvements. Les plus jeunes poissons, comme les embryons et les larves, ne seront utilisés que pour produire les lignées adultes nécessaires aux expériences.
Développement de nouveaux modèles génétique d’une maladie métabolique du foie chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Des femelles gestantes gavées cinq fois de suite, des nouveau-nés injectés à 36 et 72 heures de vie, des biopsies de queue prélevées sur des petits éveillés entre le septième et le dixième jour : 912 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance majoritairement modéré. Les petits qui développent la maladie présentent une jaunisse et un retard de croissance, et sont tués à 14 ou 21 jours. Le projet vise à créer des lignées de souris reproduisant une malformation des voies biliaires plus tôt dans le développement que les modèles déjà publiés. Le porteur écrit que les nouveau-nés sont tués parce qu'ils sont "nécessaires" à l'étude, et renvoie l'effectif de 912 animaux à des "tests statistiques adaptés" dont il ne donne pas le détail.
Objectifs
l’objectif de ce projet est la création de nouveaux modèles génétiques de la malformation des voies biliaires lors du développement embryonnaire. Cela permettra d’étudier le développement de la maladie à des âges plus précoces par rapport aux publications précèdentes.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra le développement de nouveaux modèles génétiques de la malformation des voies biliaires chez la souris. Ils permettront d’étudier les mécanismes métaboliques et inflammatoires menant aux symptômes de la maladie. Cette étude se fera en parallèle avec l’utilisation de cellules du foies dérivées de biopsies de patients. Cela permettra de valider les mécanismes moléculaires impliqués et de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques qui pourront être testés sur nos nouveaux modèles de souris par la suite.
Procédures
Toutes les interventions sont réalisées sur animal vigile. Les nouveaux-nés subiront une contention d'une minute pendant laquelle une biopsie de queue de 1 à 2 millimètres sera prélevé pour le génotypage entre 7 et 10 jours après la naissance. Gavages répétés, 5 fois pendant 30sec, chez la femelle gestante entrainant une douleur modérée et passagère . Injections répétées, 2 fois pendant 10sec, aux nouveaux nés 36h et 72h après la naissance engendrant une douleur légère et passagère.
Impact sur les animaux
Risque de saignement vaginal et perte de poids pour la femelle gestante. Lors des procédures le gavage est un mode d’administration entrainant une douleur modérée et passagère. l’injection entraine une douleur légère et passagère sur un nouveau-né. Dans le cas où les animaux développent la maladie les symptômes seront une jaunisse et un retard de croissance (poids moins élevés).
Devenir
Tous les nouveaux nés seront mis à mort à 14 ou 21 jours d'âge car ils sont nécessaires pour notre étude et tous les animaux adultes des croisements seront également mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Nous utilisons des modèles cellulaires en parallèle de nos modèles de souris pour ce projet. Néanmoins les cultures cellulaires ne peuvent pas remplacer les études in vivo pour l'étude du développement du foie et de la mise en place de la fibrose et de l'inflammation et l'étude de l'arbre biliaire lors de l'embryogénèse.
Réduction
Dans un souci de réduction des animaux nous utiliserons les deux sexes car nos études précédentes n’ont pas montré de différence en fonction des sexes pour le développement de cette maladie. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Pour les nouveaux nés l’utilisation d’une lampe chauffante durant les pesées permettra de limiter la perte de chaleur des animaux. L’injection et le gavage seront réalisés avec des sondes et des aiguilles adaptées à la taille de l’animal seront utilisés. Des points limites spécifiques ont été établis.
Choix des espèces
Le choix de la souris est lié à la similarité du métabolisme et du développement du foie entre l'humain et la souris. En particulier, le développement des canaux biliaire est similaire entre les deux espèces. Par ailleurs, nous disposons également de nombreux outils spécifiques pour la souris. Les femelles gestantes seront gavées à différents âges de la gestation : 10 et 12 jours de gestation (développement du foie et formation de la vésicule biliaire et du canal biliaire extrahapétique) ainsi que 14 et 16 jours de gestation (maturation du canal biliaire extrahépatique et formations des canaux intrahépatiques). Les nouveaux nés développent les symptômes visibles de la maladie à la naissance comme chez l’Homme. Nous utiliserons donc les animaux entre 1 et 21 jours après la naissance pour évaluer le développement de la maladie.
Étude de l’impact de la sénescence du compartiment vasculaire sur les capacités cognitives après radiothérapie cérébrale chez la souris 3/3
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
648 souris de trois à quatre semaines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent jusqu'à quatre séances d'irradiation cérébrale sous anesthésie générale, puis jusqu'à trois séries de tests portant sur la motricité, la vision, l'anxiété et la mémoire épisodique, des séances d'IRM de deux heures sous anesthésie et jusqu'à dix administrations de molécules étalées sur douze mois. L'objet du travail est de mesurer le vieillissement accéléré des vaisseaux du cerveau après radiothérapie. Le porteur décrit des modèles de culture en trois dimensions déjà développés par son consortium, les juge "largement insuffisants" pour reproduire la cognition, et conclut que le passage par un organisme vivant est "indispensable".
Objectifs
Notre équipe étudie l’impact de la radiothérapie sur le vieillissement accéléré (ou sénescence) du cerveau, dans le contexte des cancers du cerveau chez l’adulte (glioblastome) mais également chez l’enfant (gliome, médulloblastome). Le médulloblastome est la tumeur cérébrale maligne la plus fréquente chez l’enfant et la majorité de ces tumeurs surviennent avant l’âge de 10 ans. La combinaison de la chirurgie et d’une radiothérapie agressive a permis d’obtenir une survie à 5 ans de l’ordre de 50%. La surveillance à long terme des patients qui ont survécu plus de 5 ans sans récidive a montré qu’un tel traitement entraîne fréquemment de lourdes séquelles notamment cognitives. Des données de la littérature indiquent que la radiothérapie cérébrale induirait un vieillissement accéléré d’un certain type de cellules dans le cerveau, notamment celles impliquées dans sa vascularisation. Le rôle joué par ce vieillissement sur l’apparition des déficits cognitifs n’est pas connu. L’objectif de ce projet est donc d’étudier l’ampleur de ce vieillissement accéléré induit par une radiothérapie et son impact sur les troubles cognitifs. Notre étude sera réalisée dans 3 établissements utilisateurs différents sur des modèles animaux : de jeunes souris recevront une dose d’irradiation équivalente à celle d’un protocole de radiothérapie. Des tests comportementaux et des examens d’imagerie seront réalisés. Une étude en histologie du cerveau des animaux complétera le protocole. Toujours à l’aide d’un modèle murin, nous évaluerons la capacité de molécules pharmacologiques à limiter l’apparition des lésions cérébrales et des déficits cognitifs liés à la radiothérapie.
Bénéfices attendus
Le projet a pour objectif une meilleure connaissance du rôle du vieillissement accéléré (ou sénescence) sur les troubles cognitifs après radiothérapie. Les résultats obtenus seront exploités pour permettre de proposer de nouveaux traitements visant à protéger au mieux les fonctions cognitives. L’utilisation de notre modèle pour étudier et traiter les troubles cérébraux radio-induits doit permettre une rapide application aux jeunes patients souffrant des médulloblastomes traités par radiothérapie. À plus long terme, les connaissances qui découleront de notre étude devront également bénéficier à d’autres cancers du cerveau aussi bien chez l’adulte (glioblastome) que chez l’enfant (gliome).
Procédures
Le projet se déroule dans 3 établissements utilisateurs nommés EU1, EU2 et EU3. Les animaux recevront une dose d’irradiation équivalente à celle d’un protocole de radiothérapie utilisé en clinique dans l’EU2, sous anesthésie générale gazeuse, à raison de quatre séances maximum espacées de 24h (séance d’une durée de de 5 min maximum). Les tests comportementaux réalisés dans l’EU1 sur une partie des animaux se focaliseront sur les capacités motrice et visuelle, l’anxiété et la mémoire épisodique. Ils seront répétés 3 fois maximum sur 12 mois et entraîneront environ une quinzaine de jours d’expérimentation (au maximum, 3 à 4 tests par animal, avec une phase d’entraînement et des phases de récupération, chaque test durant moins de 30 minutes par jour). Une partie des animaux recevront un examen d'imagerie par résonance magnétique dans l’EU3, examen d’une durée maximale de 2 heures réalisé sous anesthésie générale. Une partie des animaux recevra un traitement pharmacologique visant à limiter les effets de la radiothérapie. Le traitement se fera dans l’EU1 en plusieurs prises, entre 2 et 10 selon la molécule testée, sur une période de 12 mois maximum. L’administration dure moins d’une minute). Enfin des prélèvements de fluides biologiques seront réalisés en fin d’expérimentation, sur animaux anesthésiés, dans les EU1 ou EU3.
Impact sur les animaux
L’irradiation seule ne provoque pas de nuisance immédiate chez l’animal mais peut engendrer un stress léger du fait de la contention pour l’anesthésie (placement dans la chambre d’induction). Cette nuisance liée à l’induction de l’anesthésie sera légère et de courte durée. De plus, l’irradiation et les protocoles d’imagerie étant réalisés sous anesthésie légère, les potentiels effets indésirables sont une hypothermie légère transitoire et un risque faible d’arrêt respiratoire. Les déplacements pourront provoquer un stress modéré et éventuellement l’apparition d’agressivité. Cet effet pourra perdurer jusqu’au retour au lieu d’hébergement initial. Cependant, ces changements d’environnement seront les plus courts possible et il n’y aura pas de modifications des groupes sociaux. Les différentes études de comportement seront précédées d’une phase d’habituation à l’expérimentateur et à l’environnement de travail afin de limiter au maximum l’apparition de stress pour les animaux. Les administrations de molécules pharmacologiques pourront provoquer un stress léger lors de la contention et des effets secondaires. Les injections, quant à elles, entraînent une douleur légère de courte durée. Cependant, ces administrations étant répétées lors des semaines de traitements, la douleur pourrait passer de légère à modérée lors des phases de traitement. Enfin, avant la mise à mort des animaux, les prélèvements biologiques (sang et/ou liquide céphalo-rachidien) seront réalisés sous anesthésie générale et analgésie complète (l’injection pourra provoquer une douleur légère de courte durée).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin d’étude afin de corréler nos résultats obtenus in vivo avec des analyses histopathologiques.
Remplacement
Notre consortium a développé de nombreux modèles de culture cellulaire afin de pouvoir étudier les effets de l’irradiation in vitro. Ces modèles 2D ont été récemment complétés par le développement de modèles 3D multicellulaires (bioprint, organes sur puces). Ces modèles 3D permettent de recréer des conditions tissulaires simplifiées et ainsi étudier les effets de l’irradiation pour trier certaines conditions expérimentales et molécules pharmacologiques. Cependant ces modèles in vitro sont encore préliminaires et sont largement insuffisants pour reproduire la complexité d’organisation du cerveau et étudier des processus aussi compliqués que la cognition. Ainsi, le passage par un organisme vivant complexe est indispensable.
Réduction
L’utilisation des modèles in vitro 2D et 3D permet d’optimiser le design expérimental de nos études in vivo, et ainsi de limiter l’utilisation des animaux à leur stricte nécessité. Des études préliminaires nous ont permis d’optimiser la mise en place de notre modèle. Nous avons ainsi pu réduire la gamme de certaines modalités d’irradiation (doses, fréquence) pour lesquelles un effet ne serait pas suffisamment détectable. Différentes études statistiques ont été menées et ont permis de déterminer un nombre réduit d’animaux pour chaque procédure : entre 10 et 16 animaux par lot selon la procédure. Enfin, nous procéderons à une analyse statistique après chaque expérience qui sera stoppée dès que la significativité sera atteinte.
Raffinement
Les animaux seront hébergés selon des conditions d’hébergements réglementaires au sein de l’établissement utilisateur, à savoir : hébergement en groupe sociaux dans des cages de taille adaptée sur portoir ventilé (avec hygrométrie, température et cycle jour/nuit 12h/12h contrôlés). Les animaux auront de l’eau et de la nourriture à disposition à volonté et auront également à disposition dans leur environnement deux éléments d’enrichissement à minima : papier kraft pour la constitution du nid, tunnel en polycarbonate rouge et/ou une maison en cellulose pour l’abri. Les transports vers l’irradiateur ou l’IRM se feront par transporteur et véhicule agréés. Le confort et la sécurité des animaux seront garantis durant toute la durée du transport (aliment et eau à volonté, sans modifications des groupes sociaux, présence d'enrichissement). Une période d'acclimatation à l'arrivée sera observée pour garantir aux animaux une période de repos. Les irradiations seront réalisées sous anesthésie générale. Afin de limiter l’hypothermie due à l’anesthésie, les animaux seront placés sur tapis chauffant jusqu’au réveil complet. Un suivi clinique approfondi des animaux sera fait dans les 24h suivant l’irradiation, puis deux fois par semaine, ce qui permettra d’évaluer sur le long terme l’apparition éventuelle de points cliniques limites. Une phase d’habituation (à l’environnement, l’expérimentateur et la préhension) sera réalisée dans les 15 jours précédant les tests cognitifs afin de limiter le stress. L’imagerie IRM est réalisée sous anesthésie, dans un berceau chauffé, avec contrôle de la respiration et de la température. Lors d’une acquisition IRM, si la respiration sort des limites prévues, l’examen est immédiatement interrompu et l’animal est mis sous surveillance accrue jusqu’à sa récupération. Les prélèvements de fin d’expérimentation ainsi que les mises à mort des animaux seront réalisés sous anesthésie générale et analgésie complète.
Choix des espèces
Le modèle retenu pour nos études est la souris car c’est une espèce couramment utilisée en neurosciences, qui présente l’avantage d’avoir une organisation des structures cérébrales relativement proche de celle de l’homme et un comportement très bien documenté dans la littérature. Ce modèle est très répandu en études pré-cliniques en cancérologie, et l'ensemble des études préliminaires du consortium (notamment de mise au point en histologie) ont été réalisées chez la souris. De plus, nous disposons de l'ensemble des équipements adaptés à cet espèce pour nos études : irradiateur, imageur IRM et enceintes pour études cognitives. . Les études seront menées sur animaux juvéniles, c’est-à-dire des animaux de 3 à 4 semaines au moment de l’irradiation. Ce stade est privilégié pour reproduire le cadre clinique des traitements du médulloblastome qui intervient durant le développement cérébral chez l’enfant âgé de 10 à 14 ans environ.
Immuno-virothérapie du cancer du foie 2/3 MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
Un centimètre d'incision dans l'abdomen pour injecter des cellules tumorales directement dans le foie, puis sept anesthésies en six semaines pour suivre la tumeur en imagerie : 882 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. 694 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 188 d'un niveau léger. S'y ajoutent trois à six injections de traitement par animal, l'objet étant de tester une virothérapie associée à une stimulation immunitaire contre le carcinome hépatocellulaire. Le porteur indique utiliser des organoïdes et des organes sur puce pour évaluer la toxicité des traitements, et affirme qu'aucun modèle de laboratoire ne permet de recréer les interactions entre tumeur, système immunitaire et foie.
Objectifs
Le projet concerne un nouveau traitement du cancer du foie, une des causes les plus courantes de décès liés au cancer avec une incidence en constante augmentation (830 000 décès dans le monde en 2020). L’absence de traitement efficace et les difficultés de diagnostic précoce en font un cancer de mauvais pronostic par le plan stratégique national décennal de lutte contre le cancer (survie à 5 ans de seulement 18%). Le carcinome hépatocellulaire représente plus de 80% des cancers primitifs du foie et se développe fréquemment sur un fond de maladie hépatique chronique causée par l'alcool, l'hépatite virale B ou C chronique ou le syndrome métabolique associé à un excès de poids et au diabète. Le carcinome hépatocellulaire est souvent diagnostiqué tardivement et se prête mal à un traitement curatif. L'objectif du projet est d’apporter la preuve de concept du bénéfice de l’association d’une vaccination antitumorale avec l’action de virus capable d’éliminer préférentiellement des cellules cancéreuses dans un contexte de cancer du foie. Pour la formule de vaccin, nous utiliserons de l’ARNm comportant des modifications moléculaires qui ont démontré leur valeur dans les vaccins ARNm actuellement très utilisés dans la pandémie COVID. L’effet protecteur et curatif de la vaccination, ainsi que l’apport d’un traitement combinant le vaccin et le virus ciblant les cellules cancéreuses, seront évalués. Ce projet est réparti sur 3 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les traitements du carcinome hépatocellulaire restent insatisfaisants. Ils reposent essentiellement sur des interventions lourdes ou des thérapies peu efficaces. L’immunothérapie est basée sur la stimulation du système immunitaire du patient et reste une option thérapeutique de choix, mais en l’état elle doit être améliorée pour atteindre un niveau d’efficacité satisfaisant. Les vaccins en cours de test contre le cancer du foie utilisent surtout de petits morceaux de protéines fabriqués en laboratoire pour apprendre au système immunitaire à reconnaître et attaquer les cellules cancéreuses. De récentes avancées dans l’utilisation de l’ARNm et des nanoparticules ouvrent la voie à une nouvelle génération de vaccins contre le cancer. Par exemple, des essais sur le cancer de la peau ont montré qu’associer une immunothérapie ciblée avec un vaccin à ARNm transporté par des nanoparticules lipidiques pouvait renforcer la réponse du système immunitaire contre la tumeur. Le projet présenté ici innove en combinant deux approches puissantes : d’une part, des virus spéciaux qui attaquent directement la tumeur et facilitent l’accès du système immunitaire aux cellules cancéreuses, et d’autre part, un vaccin à ARNm qui entraîne le système immunitaire à reconnaître les cellules tumorales. Cette stratégie combinée vise à : (1) apprendre au système immunitaire à cibler précisément la tumeur grâce au vaccin, et (2) intensifier la destruction des cellules cancéreuses par l’action des virus, tout en stimulant davantage la réponse immunitaire.
Procédures
Un lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 5 minutes puis une injection de 30 secondes, réalisé dans l’EU1. Un autre lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre, puis une injection (30 secondes) dans le foie (réalisé dans l’EU1 ou l’EU2), puis 7 anesthésies d'environ 5 à 20 minutes chacune afin d'effectuer à chaque fois une échographie et/ou une imagerie, sur une durée totale de 6 semaines (5 imageries réalisées dans l’EU2 et 2 échographies réalisée dans l’EU3). D’autres lots d’animaux auront une anesthésie d'environ 5 minutes puis une injection de 30 secondes, suivi de 3 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection), avec anesthésie (5 minutes pour l’injection) pour la moitié des animaux, entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). Un 5ème lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre, puis une injection (30 secondes) dans le foie (réalisé dans l’EU1 ou l’EU2), suivi de 3 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection) sous anesthésie (5 minutes) entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). 5 anesthésies d'environ 5 à 20 minutes chacune seront réalisées afin d'effectuer à chaque fois une imagerie, sur une durée totale de 6 semaines (réalisées dans l’EU2). Un 6ème lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 5 minutes puis une à deux injections de 30 secondes selon la pousse tumorale, suivi de 6 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection), dont 3 réalisées avec anesthésie (5 minutes pour l’injection), entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). Un 7ème lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre, puis une à deux injections (30 secondes) dans le foie (réalisé dans l’EU1 ou l’EU2), suivi de 6 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection), dont 3 réalisées avec anesthésie (5 minutes pour l’injection), entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). 5 anesthésies d'environ 5 à 20 minutes chacune seront réalisées afin d'effectuer à chaque fois une imagerie, sur une durée totale de 6 semaines (réalisées dans l’EU2).
Impact sur les animaux
Un stress peut intervenir lors de la préhension de l'animal dans le cadre des différentes interventions (injection, anesthésie, mesure de la taille des tumeurs) et une douleur légère peut apparaitre au point d'injection (cellules tumorales et traitement). La chirurgie pour injecter les cellules tumorales dans le foie peut entrainer une douleur post-opératoire au niveau de la suture, voire une infection locale. Le niveau de nuisance dû à la croissance tumorale peut augmenter avec la taille de la tumeur.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chacune des procédures et leurs organes prélevés en post-mortem pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Le foie est un organe complexe composé de nombreux types de cellules, dont les hépatocytes et des cellules immunitaires. Les modèles classiques en laboratoire, comme les cultures de cellules, ne permettent pas de reproduire cette complexité. Des modèles plus avancés, comme les organoïdes ou les organes sur puce, imitent mieux certaines fonctions du foie et seront utilisés pour évaluer la toxicité des traitements. Cependant, ce projet repose sur des interactions complexes entre les cellules tumorales, le système immunitaire et l’environnement du foie. Aucun modèle de laboratoire ne permet aujourd’hui de recréer cette dynamique, d’où la nécessité d’utiliser un modèle animal
Réduction
Les traitements seront analysés et présélectionnés par une série d’essais in vitro sur cellules immunitaires et hépatiques en culture. Cette sélection in vitro des meilleurs traitements contribuera à réduire le nombre d’individus inclus dans le projet et permettra d’affiner les protocoles en fonction du type de réponses immunitaires désiré. Seuls les traitements présentant un intérêt seront testés chez la souris. Un suivi au cours du temps, sur un même individu, de la taille des tumeurs sera réalisé et permettra de réduire drastiquement le nombre d'animaux qui aurait été utilisé pour obtenir des courbes de croissance de la tumeur par mise à mort des animaux à chaque temps étudié. Enfin, un calcul des effectifs nécessaires nous permettra d'atteindre une significativité des résultats avec un minimum d'animaux.
Raffinement
Pour limiter la souffrance animale, la taille des tumeurs sera suivie afin qu’elles ne dépassent jamais les limites acceptées en recherche sur le cancer. Nous améliorerons aussi notre protocole en nous appuyant sur des études montrant que les nanoparticules utilisées sont bien tolérées et que le moment de la journée où la greffe est réalisée peut influencer son succès. Ainsi, nous choisirons le moment le plus adapté. L’utilisation d’analgésique et d’anesthésique sera réalisée lorsque nécessaire et des points limites prédictifs et précoces, basés sur des grilles score adaptés aux interventions sur l’animal, avec des critères d’arrêt seront mis en place afin de réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal. Les animaux seront transportés par un expérimentateur compétant suivant la réglementation, dans des cages occultées, contenant de l'enrichissement et des croquettes mouillées.
Choix des espèces
Le développement de tumeur par greffe chez la souris est facilement réalisable, reproductible et est un modèle de référence dans le domaine de l’immuno-oncologie. Les lignées de souris présentent l'intérêt d'être génétiquement homogènes, réduisant ainsi la variabilité des réponses immunitaires. Nous emploierons des souris de deux souches différentes qui présentent l'avantage d'être bien connues dans leur capacité de réponse immunitaire. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines pour les greffes, ainsi que décrit dans la littérature. C’est aussi le stade de développement auquel leur immunité est effective.
Etude des mécanismes des réponses immunitaires spécifiques du poisson-zèbre contre des agents infectieux viraux et bactériens
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 640 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 1 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont anesthésiés puis injectés, ou plongés deux à quatre heures dans un bain contenant l'agent infectieux, certains subissant ensuite une épreuve virulente destinée à mesurer si le vaccin protège. L'infection peut provoquer une nécrose au point d'injection, une perte d'appétit, une nage erratique et la mort, et les résultats intéressent autant la recherche sur les maladies humaines que les industriels de l'aquaculture, avec une mise sur le marché en perspective. Le porteur formule le tout ainsi : "pour autant que le niveau de douleur puisse être évalué chez un poisson zèbre", il sera nul chez les témoins et sévère chez les infectés.
Objectifs
L’étude des maladies infectieuses repose sur la caractérisation de l’agent pathogène (nature, propriétés de virulence…) et de la réponse de l’animal infecté, par une combinaison d’approches expérimentales menées in vitro en culture cellulaire et in vivo chez l’animal. La complexité des mécanismes engagés nécessite la reproduction expérimentale des maladies étudiées. Cela nous permet d’aborder des études de virulence des agents pathogènes causant les infections. Ces études sont effectuées dans une perspective de comparaison entre les agents émergents qui affectent les élevages et ceux qui causent des maladies chez l’Homme. Nous disposons de multiples modèles d’infections du poisson zèbre par des agents pathogènes de poissons ou de mammifères. Les infections par injection permettent de contrôler finement la dose de pathogène administrée à chaque poisson et constituent donc un modèle d’infection reproductible. Les infections par balnéation restent une alternative importante pour reproduire la voie naturelle d’infection des poissons. Les protocoles engagés peuvent être associés à des vaccins et à des prélèvements de matériel biologique après euthanasie des animaux pour caractérisation de la réponse immunitaire induite par les infections. Les antibiotiques sont le seul moyen de lutte contre les maladies bactériennes quand il n’existe pas de vaccin efficace. Pour limiter leur utilisation et les risques associés, la mise au point de stratégies alternatives de lutte faisant appel à des immunostimulants est une solution possible pour améliorer les performances de l’aquaculture. Les objectifs de ce projet sont donc, en utilisant le poisson zèbre (1) de caractériser les mécanismes des réponses immunitaires des poissons lors d’infections par des virus ou des bactéries, (2) d’évaluer les effets protecteurs des vaccins et de comprendre les réponses immunitaires qu’ils induisent chez ces espèces, et (3) d’évaluer la capacité de nouvelles stratégies d’immunostimulations à augmenter la résistance à une infection expérimentale maîtrisée avec des pathogènes d’intérêt agronomique (Flavobactérie, virus responsable de la septicémie hémorragique virale (SHV), virus de la Nécrose hématopoïétique infectieuse (NHI), …).
Bénéfices attendus
Les résultats attendus en fin de projet sont les suivants : - Compréhension des mécanismes de réponses à l’immunisation - Compréhension des mécanismes de la pathogenèse associée aux infections - Validation expérimentale de nouveaux vaccins contre différents virus chez le poisson zèbre - Evaluation des effets immunostimulants et/ou protecteur des différentes conditions pour les industriels de la filière aquacole avec une potentielle mise sur le marché de ces nouvelles stratégies. Ces résultats seront utilisés pour valider les modèles d’étude des maladies infectieuses, des mécanismes de réponses associés, et des stratégies de prévention ou de lutte contre ces maladies. Ces éléments sont essentiels pour le développement du modèle poisson zèbre en infectiologie, qui permet de remplacer en partie les modèles mammifères et qui peut offrir un contexte expérimental particulièrement pertinent. Ces résultats seront utilisés pour prévenir les maladies ou réduire leur impact, et donc améliorer le bien-être des poissons en élevage. La prévention des pathologies est un élément essentiel du développement d’une aquaculture plus « durable ».
Procédures
Les immunisations ou infections expérimentales réalisées par injection sont réalisées sous anesthésie et une injection est réalisée par des personnes compétentes en moins de 15 secondes. L’immunisation des poissons par injection implique une ou deux injections (si rappel nécessaire) effectuées sous anesthésie. Le cas échéant, les prélèvements de mucus sous anesthésie seront effectués une ou deux fois, à un intervalle de temps d’au moins 3 jours. L’anesthésie associée est courte (de l’ordre de la minute) comme pour les injections. L’immunisation des poissons par balnéation implique une séance de 2 à 4 heures éventuellement réalisée de nouveau une seconde fois si rappel nécessaire, l’injection nécessite une anesthésie de 1-2 minutes. Les infections par injection ou par bain correspondent à une unique intervention de mise en contact avec le pathogène. Dans le cas d’épreuve virulente post immunisation, pour tester l’efficacité d’un vaccin, l’infection correspond à une unique intervention de mise en contact avec le pathogène.
Impact sur les animaux
Le stress lié à la manipulation (tri, pesée, transfert, injection, imagerie) est compensé par anesthésie par bain. Pour autant que le niveau de douleur puisse être évalué chez un poisson zèbre, il sera nul chez les contrôles non infectés, très modéré chez les animaux immunisés et sévère chez les animaux infectés chez qui l’infection peut conduire à la mort. Le niveau de douleur sera modéré chez les animaux vaccinés/immunostimulés et protégés, même après infection. L’infection peut conduire chez certains individus à une perte d’appétit, un excès d’excrétion de fèces, une nécrose au point d’injection et une nage erratique.
Devenir
Tous les animaux de ce projet entreront dans un protocole d'infectiologie et ne pourront être réutilisés pour d'autres finalités, ils seront donc mis à mort en fin d'expérience.
Remplacement
Il n’existe pas de modèles cellulaires permettant d’étudier les réponses immunitaires systémiques des poissons. La compréhension de la pathogenèse liée à l’infection, la quantification des réponses immunitaires à l’échelle de l’organisme entier et en particulier la protection induite par les vaccins/immunostimulants, les migrations des lymphocytes B ou T responsables de la protection et de la mémoire immunitaire, plus généralement la compréhension des interactions hôte-agent infectieux nécessitent de soumettre l’animal à une immunisation ou à une infection expérimentale. Le projet associé à cette DAP chez le poisson zèbre ne peut donc être réalisé avec des méthodes alternatives. Seul un animal ayant un système immunitaire adaptatif permet d’évaluer l’induction d’une réponse spécifique de l’antigène par les lymphocytes B ou T, ou l’efficacité d’un vaccin/immunostimulant lors d’une épreuve d’infection expérimentale en quantifiant la protection apportée.
Réduction
Les infections par balnéation ou par injection, et les expériences de vaccination/immunostimulation permettent de comparer plusieurs conditions expérimentales (différents génotypes, différents agents infectieux, différents protocoles d’immunisation/immunostimulation, etc). Les effectifs requis pour la mise en évidence de différences significatives de survie et de réponses entre les conditions dépendent de l’homogénéité des réponses et de la mortalité, et sont calibrés sur la base de notre connaissance de la sensibilité du poisson zèbre à chaque virus, chaque fois que cela est possible. Les groupes peuvent être de 10 à 15 individus, selon les informations disponibles. Les effectifs sont fixés pour l’obtention de résultats statistiquement représentatifs permettant d’apporter des résultats interprétables dans nos études. Des tests statistiques sont utilisés La taille des groupes (10-15 individus) a été fixée pour permettre à la fois d’évaluer des taux de survie ou de protection et de réaliser les échantillonnages pertinents sur un nombre suffisant d’individus. Un effectif minimal de 15 poissons permet de mettre en évidence une protection qui doit assurer 90 à 100% de survie pour une vaccination efficace. Par ailleurs, les groupes de 15 poissons permettent d’évaluer la mortalité induite par un agent pathogène chez des poissons non vaccinés ou stimulés, en utilisant un minimum d’animaux et en gardant des conditions d’effectif standardisées. Cet effectif permet de réaliser des prélèvements en nombre suffisants pour étudier la réponse immunitaire induite par une immunisation, une infection, ou une vaccination/stimulation chez les survivants. Un effectif de 10 à 15 permet en effet, pour un même groupe de poissons, de consacrer 3 à 5 poissons entiers à des expériences d’histologie et 7 à 10 à des prélèvements de tissus pour des études d’expression ; il doit être noté que la taille du poisson zèbre peut imposer pour certains tissus, de réaliser des pools de prélèvements de 2 individus. Des groupes de 10-15 individus permettent donc de travailler dans des conditions reproductibles (même taille de groupe, mêmes conditions expérimentales par exemple, même taille d’aquarium), et correspondent à des effectifs minimums, des groupes plus petits ne permettraient pas de fournir, de manière systématique et standardisée, les échantillons et informations requises pour nos projets de recherche. Ainsi ces effectifs permettent une utilisation optimale des animaux.
Raffinement
Le stress lié à la manipulation et à l’injection est compensé par anesthésie jusqu’à sédation pour une durée < 2 min. Tout au long de leur vie, les poissons sont élevés dans les meilleures conditions possibles. Ils sont nourris 2 fois par jour. Ils sont toujours en présence de congénères. L’enrichissement mécanique dans ce type d’expérimentation n'est sera pas sans impact sur les résultats (blessure avec voie d’entrée du pathogène, difficulté d’observation des poissons situés dans les caches, développement de biofilm, …). Sous les aquariums, nous positionnerons un poster imitation « substrat ». Les animaux sont observés au moins deux fois par jour. Les individus atteignant le point limite défini dans le projet sont sortis du protocole et euthanasiés.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre est un modèle d’étude important des relations hôte-pathogène. La transparence des premiers stades de développement de cette espèce facilite la mise en œuvre des techniques d’imagerie in vivo. Des outils de manipulations de l’expression des gènes, de nombreux mutants, et la séquence complète du génome de cette espèce concourent aussi à son succès. De nombreux modèles de maladies humaines ont été développés chez le poisson-zèbre, non seulement chez la “larve” ou le jeune alevin, mais aussi aux stades plus tardifs. Le modèle poisson zèbre est aussi un modèle de criblage de drogues. Il est donc important de comprendre les mécanismes et modalités des réponses immunitaires contre des agents infectieux, dans ce modèle. Pour l’étude des réponses immunitaires spécifiques et de la protection vaccinale/immunostimulant, le système immunitaire des poissons doit être mature, et ils sont donc utilisés au stade adulte, à 4-6 mois. L’étude des réponses immunitaires innées et de la pathogenèse sera effectuée à différents stades, chez les juvéniles (3 à 8 semaines) et chez l’adulte (4-6 mois)