Procédures sans réveil
Diplôme Universitaire de microchirurgie (approche expérimentale chez le rat)
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Former une centaine de chirurgiens à la microchirurgie en cinq années suppose ici un rat par participant et par séance. 990 rats vont être utilisés, opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil. Chaque animal subit environ trois heures d'interventions successives selon la dextérité des apprenants, sutures des deux carotides, de l'aorte et des vaisseaux fémoraux, greffe rénale, greffon jugulaire. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur des vaisseaux au sang circulant, la première séance se déroulant sur des nouilles de shirataki avant le passage aux rats, et rattache l'ensemble à un diplôme universitaire délivré à des internes et des vétérinaires.
Objectifs
La microchirurgie est une discipline chirurgicale qui permet de réparer, de remplacer, de greffer des nerfs ou des vaisseaux et qui permet de disséquer des tumeurs cérébrales sans hémorragie dans un cerveau ou une moelle épinière. Son exercice n’est accessible qu’à un chirurgien rompu aux différentes techniques microchirurgicales, et dont la pratique est quotidienne. Tous les chirurgiens des centres SOS mains notamment en France exercent cette spécialité. Tous les Neurochirurgiens sont formés à la microchirurgie, comme la plupart des chirurgiens qualifiés en chirurgie plastique et reconstructrice. Cette compétence s’acquiert par ce Diplôme Universitaire de microchirurgie dans le cadre de la formation initiale du chirurgien. Le Diplôme Universitaire de microchirugie s'adresse à des chirurgiens en formation (vétérinaires ou internes des service de chirurgie) et permet à ceux-ci d'acquérir la technique , les compétences et le diplôme nécessaire pour pratiquer la chirurgie réparatrice des microvaisseaux. Pour acquérir ces gestes, il est indispensable de travailler sur des vaisseaux avec du sang circulant pour pouvoir apprendre à réparer ces veines et artères de manière à ce que celles ci soient à nouveau opérationnelles sans hémorragie et sans thrombose, une 1ère approche validée chez l'animal est donc indispensable avant l'application de ces techniques sur des patients. Une centaine de chirurgiens pourront ainsi être formés durant ces 5 années.
Bénéfices attendus
Le Diplôme Universitaire de microchirugie s'adresse à des chirurgiens en formation (vétérinaires ou internes des service de chirugie) et permet à ceux-ci d'acquérir la technique , les compétences et le diplôme nécessaire pour pratiquer la chirurgie réparatrice des microvaisseaux chez l'Homme. Une centaine de chirurgiens pourront ainsi être formés durant ces 5 années.
Procédures
Les animaux subiront une procédure chirugicale sans réveil sous anesthésie générale et analgésie. Les rats seront préanesthésiés par un anesthésique volatile dans une cage d'endormissement puis anesthésiés par injection. Une injection d'un analgésique sera réalisée simultanément. Le niveau d'anesthésie sera évalué tout au long du protocole par surveillance visuelle du rythme respiratoire et par stimuli mécaniques. En cas, de signe de réveil, l'animal se verra injecter une 1/2 dose d'anesthésiant. A la fin des procédures, les rats seront mis à mort par injection. Les interventions seron t: Dissection et exposition des différents vaissaux, Suture des 2 carotides, Suture carotide et aorte, Suture veine et artère fémorales et aorte, Greffe rénale, Suture carotide et greffe rénale, Suture carotide et greffon jugulaire sous rénale, Suture carotide, aorte, artère et veine rénale. L'ensemble des interventions aura une durée d'environ 3h selon la dextérité des apprenants.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront le stress de leur manipulation jusqu'à la chambre d'induction d'anesthésie gazeuse. Une fois endormis, l'ensemble des procédures seront sans réveil et effectuées sous anesthésie générale et analgésie adaptée.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés seront mis à mort, les procédures chirurgicale lourdes ne permettent pas le reveil des animaux.
Remplacement
Pour acquérir ces gestes, il est indispensable de travailler sur des vaisseaux avec du sang circulant pour pouvoir apprendre à réparer ces veines et artères de manière à ce que celles ci soient à nouveau opérationnelles (pas d'hémorragie et sang circulant) . L'utilisation d'animaux vivants est donc indispensable.
Réduction
Le nombre d'animaux est réduit à son minimum (1 rat par séance par participant). Plusieurs vaisseaux seront utilisés sur le même animal permettant également d'en réduire le nombre.
Raffinement
La formation concerne des chirurgiens (vétérinaires ou internes des services de chirurgie) et débutera par 5 séances théoriques portant sur la microchirurgie (matériel, méthodes), l'anatomie du rat et sur l'expérimentation animale en insistant sur les parties réglementation, bien être animal et règle des 3 R. La première séance pratique se déroulera entièrement sur du matériel inerte (nouilles chinoises "shirataki") afin d'assimiler puis de valider les gestes techniques avant d'appliquer ceux-ci sur les animaux. L'ensemble des séances suivantes débutera par du travail sur matériel inerte sur lequel le geste technique devra systématiquement être validé par le responsable de séance avant de passer sur l'animal. Les rats seront préanesthésiés par un anesthésique volatile dans une cage d'endormissement puis anesthésiés par injection. Une injection d'un analgésique sera réalisée simultanément. Le niveau d'anesthésie sera évalué tout au long du protocole par surveillance visuelle du rythme respiratoire et par stimuli mécaniques. En cas, de signe de réveil, l'animal se verra injecter une 1/2 dose d'anesthésiant.
Choix des espèces
L'espèce choisie possède des vaisseaux d'un diamètre correspondant à ceux rencontrés en microchirurgie humaine ou vétérinaire. Le rat est donc parfaitement adapté à l'apprentissage de ces techniques. Les rats utilisés seront des jeunes adultes (environ 250/300g), de taille suffisante pour que leur vaisseaux soient comparables à ceux rencontrés lors d'activités de microchirurgie humaine ou vétérinaire.
Caractérisation du rôle d’un mécanorécepteur dans l’hémostase chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
2 418 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chacune reçoit un analgésique puis un anesthésique, à sept minutes d'intervalle, avant un prélèvement de sang unique effectué soit dans le sinus rétro-orbitaire, soit directement dans le cœur après incision des parois abdominale et thoracique. L'objectif est de caractériser le rôle d'un mécanorécepteur activé par le flux sanguin dans la coagulation, sur une lignée dont le gène a été modifié pour reproduire une mutation humaine rare. Le volume de sang à prélever est trop important pour que les souris puissent rester en vie, et leurs poumons et leur moelle osseuse sont récupérés après la mort.
Objectifs
Les plaquettes sanguines, essentielles pour arrêter les saignements, peuvent aussi être impliquées dans la formation de caillots anormaux (thromboses). Leur activation est normalement très contrôlée : trop faible, le saignement persiste ; trop forte, un caillot peut se former sans raison. Ce projet étudie l’impact d’une molécule activée par les forces mécaniques du flux sanguin sur l’équilibre de l’hémostase. Certaines mutations rendent cette molécule trop active et semblent favoriser la formation de thromboses. Nous pensons que cette hyperactivité pourrait provoquer une activation anormale des plaquettes et des globules rouges. Avec un modèle de souris, nous analyserons comment cette protéine influence l’activation des plaquettes, et dans quelles conditions mécaniques elle déclenche la formation de caillots. Ces travaux pourraient apporter de nouvelles pistes pour comprendre et traiter des maladies thrombotiques, comme les accidents vasculaires cérébraux.
Bénéfices attendus
Ce projet est essentiel pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques associées à des mutations d’un récepteur à l’origine d’une maladie rare peu étudiée. A court terme, cette étude permettra d’approfondir les connaissances de la pathologie et d’améliorer son diagnostic clinique qui est aujourd’hui encore imparfait. Grâce aux données obtenues et grâce à une collaboration étroite avec 3 autres équipes de recherche, cette étude fera progresser la compréhension de la maladie, et sera bénéfique pour les cliniciens, médecins, chercheurs et surtout pour les patients. A plus long terme, l’identification des mécanismes physiopathologiques ouvrira des perspectives de solutions thérapeutiques ciblées pour les patients atteints de cette maladie. La caractérisation des mécanismes (physiques, cellulaires et moléculaires) impliqués dans l’activation du mécanorécepteur devrait également renforcer notre compréhension des thromboses survenant lors des accidents vasculaires cérébraux, ouvrant de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Au cours du projet, toutes les souris recevront deux injections successives (analgésique, puis anesthésique) avant un prélèvement sanguin unique, suivi de leur mise à mort. Ces deux injections seront réalisées en moins de cinq secondes chacune et espacées d’environ sept minutes. Dès l’obtention d’une anesthésie complète (environ dix minutes après l’injection), le prélèvement sanguin sera effectué soit au niveau du sinus rétro-orbitaire, soit par voie intracardiaque après incision des parois abdominale et thoracique. L’acte chirurgical durera moins de 10 min, et les animaux seront mis à mort immédiatement après le prélèvement, avant tout réveil.
Impact sur les animaux
La contention peut provoquer un stress chez l’animal. Les injections d’anesthésiants peuvent entrainer un stress, une hypothermie et une douleur de courte durée à l'animal.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort car le volume de sang prélevé, nécessaire à la caractérisation des différents mécanismes moléculaires impactés par le gain de fonction de la molécule, est trop important pour les maintenir en vie. De plus, à la fin des expériences des prélèvements post-mortem d'organes (poumon, moelle osseuse) seront également effectués afin d'étudier l'érythropoïèse, la mégacaryopoïèse et l’activité des cellules endothéliales
Remplacement
Toutes les expériences sont préalablement mises au point sur les plaquettes humaines en présence d’un activateur chimique de la molécule. Une fois les principaux paramètres d’études définis, il est crucial de confirmer le rôle du gain de fonction de la molécule dans l’hémostase grâce au modèle murin dont le gène qui code cette protéine a été modifié. En effet, ce modèle est plus spécifique puisqu’il reproduit le gain de fonction et permet ainsi de s’affranchir de l’activateur chimique et de ses potentiels effets non spécifiques (effets sur d’autres récepteurs et/ou d’autres cellules).
Réduction
Une réflexion a été menée en prenant en compte les outils technologiques et statistiques afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour chaque expérience. Une gestion attentive des accouplements sera effectuée afin de réduire au maximum le nombre de souris non utilisables dans nos expériences. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés. Les procédures se feront étape par étape afin de vérifier que les résultats obtenus sont en accord avec nos hypothèses de recherche. Plus particulièrement, nous nous attendons à des différences de données en fonction du sexe des souris. Si aucune différence entre mâles et femelles n’est observée, un seul groupe mixte au lieu de deux groupes homogènes sera étudié.
Raffinement
Tous les prélèvements sanguins seront effectués sur des souris prémédicalisées avec un antalgique puis anesthésiées avec un mélange d’anesthésique – analgésique. La qualité de l’anesthésie sera contrôlée régulièrement au cours de la procédure. Tout signe de douleur entrainera un renouvellement de l’injection ou l’arrêt de la procédure avec mise à mort de la souris dans les 2 min. L’hébergement se fera avec 2 à 5 souris par cage.
Choix des espèces
La souris permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux tests ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, la souris permet d’obtenir suffisamment de sang, de cellules endothéliales et de progéniteurs hématopoïétiques nécessaires à l’étude ex vivo de l’hémostase et de la mégacaryopoïèse. Souris adultes âgées d’au moins 11 semaines. Ce stade de développement a été choisi par analogie avec la littérature.
Formation et habilitation du personnel à des techniques d’administration et de prélèvements chez les rongeurs
- Formation professionnelle
Rats : 1500
Pour habiliter du personnel à injecter et à prélever du sang, 1500 souris et 1500 rats vont être utilisés, 750 sous anesthésie sans reprise de conscience et 2250 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est mobilisé pour deux techniques au maximum et trois prélèvements, puis tué immédiatement après. Le porteur indique que les gestes durent de dix secondes à deux minutes chez une personne non expérimentée, et reconnaît que leur réalisation par du personnel en formation peut augmenter le stress, l'angoisse et la douleur. Il présente le recours à des animaux surnuméraires, déjà destinés à être tués, comme une mesure éthique.
Objectifs
Ce projet vise à former les professionnels de la recherche à des gestes techniques indispensables lors de l’utilisation de rats et de souris dans des protocoles scientifiques. Il s’agit notamment d’apprendre à administrer des substances ou à réaliser des prélèvements sanguins de manière maîtrisée, précise et respectueuse du bien-être animal. Dans un souci éthique, la formation d'une journée repose sur la réutilisation d’animaux surnuméraires (non sélectionnés ou reformés), initialement destinés à l’euthanasie. Cela permet de limiter le nombre total d’animaux utilisés tout en garantissant que chaque procédure est réalisée avec compétence et attention. Un fichier recensant toutes les techniques pratiquées sur les espèces modèles permet de définir les besoins individuels en formation, et ainsi d’adapter le programme à chaque apprenant. La formation est encadrée par des pairs expérimentés et comprend une validation théorique et pratique systématique, consignée dans le livret de compétences du personnel formé. Il n’existe pas de méthodes alternatives pour l’apprentissage de ces gestes techniques (administration, les prélèvements, l’anesthésie ou l’euthanasie). Lorsque certains gestes peuvent entraîner une douleur ou une gêne, des anesthésiques ou des analgésiques sont utilisés pour préserver le bien-être de l’animal. En garantissant que chaque intervenant est compétent et formé, ce projet contribue à améliorer la qualité des recherches tout en respectant les principes de protection animale.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra aux professionnels d’améliorer leurs compétences techniques grâce à une formation encadrée, incluant un système de tutorat et de validation des acquis. Chaque geste technique appris auprès d’un pair expérimenté sera évalué avant d’être pratiqué en autonomie. Un personnel bien formé limite les risques d’erreur technique, évite les biais pouvant fausser les résultats d’une étude, et diminue le risque de devoir recommencer une procédure. La traçabilité des compétences assure la conformité du projet aux exigences réglementaires. La maîtrise des gestes réduit significativement le temps de manipulation, le stress et la douleur pour les animaux. Les protocoles prévus dans ces formations sont conçus pour s’adapter à chaque technique. La formation continue des expérimentateurs permet de maintenir un haut niveau de compétence, de suivre les évolutions techniques, et de mettre en place de nouvelles méthodes toujours plus respectueuses du bien-être animal
Procédures
Les animaux, vigiles ou sous anesthésie seront soumis à des injections ou prélèvements par plusieurs voies. Le nombre d’actions est limité à : • 2 techniques maximum par animal • 3 prélèvements au maximum (quels que soient les volumes prélevés). Les animaux engagés dans le projet de formation seront euthanasiés après les limites d’utilisation ci-dessus ou en cas d’atteinte des points limites. Les gestes pourront durer entre 10 secondes et 1 minute pour l’administration ou jusqu’à 2 minutes pour les prélèvements, induction de l’anesthésie exclue, chez une personne non expérimentée en début de tutorat. L’objectif est de pouvoir réaliser ces gestes le plus rapidement possible pour arriver à terme à une durée de 10 à 30 secondes. Si la technique le permet des animaux anesthésiés seront d’abord utilisés avant de passer sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un léger stress durant quelques minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : contention, anesthésie... Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors des injections et des prélèvements sanguins. La réalisation de procédures expérimentales par des personnels en formation peut induire une augmentation du stress, une angoisse et/ou une douleur.
Devenir
A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés, qu’ils soient issus de l’élevage ou réutilisés d’un projet précédent.
Remplacement
Dans un souci d’éthique et de respect du principe de remplacement, la formation débutera par une phase théorique présentant en détail la technique concernée avec des modes opératoires et des vidéos. Cette introduction sera suivie d’une mise en pratique sur mannequins, notamment pour l’apprentissage des techniques de contention. Comme notre animalerie possède une activité d’élevage et doit donc pratiquer du tri génétique, des animaux euthanasiés dans ce cadre seront utilisés pour poursuivre le développement des compétences sans recourir immédiatement à l’animal vivant. Néanmoins, dans le cadre de cette formation axée sur les gestes techniques spécifiques, le recours à l’animal vivant sera indispensable pour acquérir les réflexes et la précision nécessaires à une manipulation correcte. Ce recours est limité à la phase finale du processus, après une préparation rigoureuse, afin d’assurer un apprentissage progressif et respectueux du bien-être animal
Réduction
• Le recours à des animaux surnuméraires d’élevage ou la réutilisation d’animaux provenant d’un autre projet, dans le respect de la réglementation permet de limiter significativement le nombre de nouveaux animaux mobilisés pour cette formation. • L’identification précise des besoins en formation permet une planification efficace, évitant toute manipulation non nécessaire. Le formateur est une personne compétente maîtrisant le geste technique et ayant les capacités de transmettre ses connaissances. Afin de réduire le nombre d’animaux et la souffrance, dans un premier temps, la personne en formation observera son formateur puis elle s’entraînera sur des animaux anesthésiés ou morts.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes sociaux dans un hébergement conventionnel avec un accès libre à l’eau et à la nourriture. Leur environnement sera enrichi par des matériaux pour la nidification et par exemple, des bâtons de bois à ronger pour favoriser leur bien-être . Lorsqu’il s’agit d’animaux dédiés à la formation, une période d’acclimatation de 5 jours dans leur nouvelle salle d’hébergement sera respectée pour réduire le stress. Deux semaines avant le début des séances, les animaux seront également habitués à des manipulations douces et à l’immobilisation, dans le but de minimiser leur anxiété. Les stagiaires seront formés à des techniques conformément aux réglementations et aux recommandations internes par des formateurs expérimentés et habilités. Un formateur pour 3 stagiaires assurera la supervision constante des manipulations. Cela garantit des gestes rapides et précis, réduisant le temps d’immobilisation et les effets indésirables. L’usage systématique d’anesthésiques locaux et d’anesthésie générale permettra une gestion optimale de la douleur et du stress. Chaque animal sera mobilisé pour l’apprentissage de deux techniques maximum, afin d’éviter toute sur-sollicitation, puis sera euthanasié immédiatement après le prélèvement. Des points limites ont été établis afin de réduire le stress et la douleur des animaux, ils seront appliqués pour chacune des procédures.
Choix des espèces
Les rats et les souris adultes sont les modèles d’étude couramment utilisés dans notre unité de recherche. Ainsi, l’apprentissage des bonnes pratiques se fera sur des animaux d’espèce et âge identiques.
Amélioration de la greffe d’îlots par thérapie génique chez le rat dans le cadre du traitement du diabète- MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Rendus diabétiques par une injection de streptozotocine, molécule toxique pour les cellules du pancréas qui produisent l'insuline, une partie des rats est tuée pour son pancréas et l'autre reçoit la greffe. 298 rats vont être utilisés au total, dont 48 opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque receveur porte une mini-pompe à insuline implantée sous la peau du dos, reçoit un vecteur viral dans le sang, subit une greffe d'îlots pancréatiques de trente à quarante minutes, des immunosuppresseurs, et des piqûres de glycémie quotidiennes pendant dix jours puis trois fois par semaine. La modification ajoute 180 rats, 52 animaux non rendus diabétiques seront gardés vivants et versés à d'autres projets, les autres sont tués pour l'analyse de leurs organes.
Objectifs
Le diabète de type 1 est une maladie chronique qui apparaît souvent avant l'âge de 20 ans. Il survient lorsque le pancréas ne fabrique plus d'insuline, du fait d’une réaction anormale du système immunitaire qui conduit à l’élimination des cellules productrices. Il s’agit donc d’une maladie auto-immune. Le diabète est caractérisé par la présence d’un excès de sucre dans le sang, appelé hyperglycémie. Le projet vise à établir les bases expérimentales d'une nouvelle approche de greffe de cellules insulino-sécrétrices dans le foie chez les rongeurs, applicable en clinique humaine. Actuellement, des cellules du pancréas de donneurs ou des cellules productrices d’insuline dérivées de cellules souches humaines sont greffés, nécessitant une immunosuppression importante avec des effets secondaires sévères et une durée de survie limitée des cellules greffées. Comme les cellules greffées sont transplantées dans le foie du receveur, notre approche originale est de rendre le foie receveur tolérant aux cellules greffées. Pour cela, notre stratégie consiste à importer dans les cellules du foie le gène d'une molécule qui bloque la réponse anti-immunitaire et l’inflammation. Pour ce faire, un vecteur viral adéno-associé (AAV) sera utilisé pour transférer le gène dans les cellules hépatiques. Ce vecteur sera injecté avant la greffe des îlots. Nous espérons que grâce au vecteur, les cellules du foie pourront recevoir les greffes de cellules du pancréas sans les rejeter. Le succès de cette stratégie pourrait grandement améliorer les greffes de cellules du pancréas ou de cellules souches pour le diabète de type 1 chez l’Homme, résolvant le problème du faible nombre de donneurs disponibles et rendant les greffes accessibles à plus de patients. Le pancréas est un organe vital, vivre sans est possible, mais cela oblige à prendre chaque jour des traitements lourds, ce qui explique le fait de ne pouvoir prélevé sur donneur vivant. Des essais de greffes intra-hépatiques utilisant des cellules souches différenciées pour produire de l’insuline sont par ailleurs en cours, mais nécessitent des immunosuppresseurs puissants pour éviter le rejet. Ce projet propose une solution pour améliorer la tolérance immunitaire des cellules greffées dans le foie, répondant ainsi à un besoin crucial dans le traitement du diabète de type 1. CE NOUVEAU DOCUENT RESULTE D UNE DEAMNDE DE MODICATION DE PROJET; DES AJUSTEMENTS IMPORTANTS ETAIENT NÉCESSAIRES DANS L’ÉTABLISSEMENT DU MODÈLE.
Bénéfices attendus
En cas de succès du projet chez le modèle rongeur, nous aurons obtenu une première preuve de concept d’un procédé permettant de rendre le foie d’un patient diabétique tolérant aux îlots (ou aux cellules souches qu’on lui greffera). La thérapie génique par vecteurs viral AAV étend actuellement ses applications à de nombreuses maladies humaines. La biodistribution et la tolérance de ces vecteurs ont été largement étudiées chez l’homme et ne représenteront pas d’effets inattendus dans notre projet clinique. Nous comptons de plus, employer de petites doses de vecteur chez le rat. On pourra donc, en cas de succès, anticiper une forte probabilité de transfert aux patients diabétiques de type 1, chez lesquels les greffes sont actuellement très restreintes du fait du peu de donneurs et des complications de l’immunosuppression.
Procédures
6 animaux subiront 1 seule injection de vecteur sous anesthésie gazeuse sur une durée d’environ 15 secondes (temps d’induction anesthésie gazeuse environ 4 minutes ). Ils seront euthanasiés en fin de procédure à l’aide d’une injection léthale sous anesthésie à l’isoflurane (temps d’induction anesthésie gazeuse environ 4 minutes à 4%, temps d’injection pour l’euthanasie environ 3 secondes), et couverts par une analgésie (injection d’environ 3 sec). Un prélèvement (durée : 15 sec) puis une perfusion (durée : 30 sec) conduiront rapidement à la mort de l’animal par arrêt cardiaque. Les animaux modèles, des rats, seront rendus diabétiques par une injection unique de streptozotocine (injection d’environ 3 sec), une molécule chimique naturelle, particulièrement toxique pour les cellules bêta du pancréas produisant l’insuline chez les mammifères. Ils seront traités à l’insuline à l’aide d’une mini-pompe implantée sous la peau dans le dos sous anesthésie /analgésie (durée approximative de l’intervention: 20 min). Un mois après l’administration intraveineuse du vecteur (1 seule injection d’environ 15 sec après l’induction d’une anesthésie gazeuse pendant 4 min), la greffe de cellules pancréatiques sera réalisée par chirurgie sous anesthésie et analgésie (durée approximative de l’intervention : 30 à 40 min). De plus, les modèles animaux recevront un traitement immunosuppresseur 16 h avant intervention chirurgicale et pendant 1 semaine après la greffe, afin d’éviter un rejet aigu (injections qui prendront environ 3 sec). Leur glycémie sera surveillée pendant toute la durée du projet par des micro-prélèvements sanguins d’une durée d’1 sec, quotidiennement pendant les 10 jours suivant l’injection de streptozotocine, puis 3 fois par semaine jusqu’à la fin de la procédure. En fin de procédure, les modèles animaux seront euthanasiés après anesthésie générale (4 min environ), analgésie locale (injection d’environ 3 sec) et générale (injection d’environ 3 sec) avant injection léthale (injection d’environ 3 sec).
Impact sur les animaux
De manière générale, toutes les autres interventions pourront entraîner douleur, perte de poids, inactivité/mobilité réduite, et stress induisant par ailleurs un comportement anormal des animaux, nous serons donc très attentifs aux points limites, et prendrons les mesures nécessaires le cas échéant. L’induction du diabète, modèle de glycémie connu, pourrait induire des hyperglycémies non contrôlées ET UNE PERTE DE POIDS IMPORTANTE. Les prélèvements répétés à la queue pour la mesure de la glycémie pourront éventuellement générer douleurs et stress. La transplantation des cellules du pancréas peut entrainer localement des saignements assez abondants. . Il est néanmoins possible qu'un léger saignement persiste après suture et réveil de l'animal. Également, les traitements immunosuppresseurs entraineront une diminution de l’immunité des animaux traités qui pourraient alors être plus sensibles aux infections.
Devenir
Les animaux utilisés pour définir la dose minimale de vecteur nécessaire seront euthanasiés à la fin de la procédure. Les animaux donneurs de cellules pancréatiques seront euthanasiés pour don du pancréas. Les animaux receveurs de cellules pancréatiques seront euthanasiés à la fin du protocole pour l’analyse de leurs organes et l’établissement de la preuve de concept. Une partie des animaux seront gardés en vie si non rendus diabétiques et réutilisés dans d’autres projets.
Remplacement
Le projet a pour objectif général l'amélioration de la transplantation de cellules pancréatiques humaines. Il n'existe à ce jour aucune méthode alternative efficace permettant de mimer les conditions physiologiques propres à l'organe et à l’organisme receveurs. L'emploi d'animaux est donc essentiel à notre projet.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été réduit à son minimum pour obtenir des conclusions statistiquement satisfaisantes. En nous fixant un niveau de confiance de 95%, une puissance statistique supérieure à 80%, il faut prévoir au minimum 4 animaux par groupe pour mettre en évidence une différence statistique significative entre les groupes. Le choix est donc orienté sur 7 animaux-receveurs traités et 5 animaux-receveurs non traités par groupe pour pallier toute défaillance technique, pour l’établissement du modèle. Les tests statistiques seront ceux utilisés pour l'analyse de petits échantillons. L’AJOUT DE 180 ANIMAUX EST NECESSAIRE POUR TESTER DIFFERENTES CONDITIONS DE GREFFE ET GARANTIR QUE LA TECHNIQUE SOIT PARFAITEMENT MAITRISEE ET FIABLE AVANT DE L’UTILISER DANS L’ETUDE PRINCIPALE, CE QUI PERMETTRA DE REDUIRE LES ECHECS ET D’EVITER D’UTILISER DES ANIMAUX INUTILEMENT PAR LA SUITE. Il EST PRÉVU 12 LOTS DE 15 ANIMAUX POUR DÉTECTER DES EFFETS BIOLOGIQUES IMPORTANTS ET POUR GARANTIR UN NOMBRE D’ANIMAUX EXPLOITABLE PAR CONDITION. SI LES PREMIERS LOTS MONTRAIENT UNE VARIABILITÉ INFERIEURE, LES EFFECTIFS SERONT RÉÉVALUÉS POUR RÉDUIRE LE NOMBRE D’ANIMAUX UTILISÉS.
Raffinement
Une période d’au minimum 7 jours d'adaptation sera appliquée à chaque animal entrant dans le protocole. S’en suivra alors une petite période d’habituation pour limiter le stress (manipulation + boîte de contention). LES ANIMAUX DIABÉTIQUES QUI NE SERONT PAS TRAITÉS À L’INSULINE ET QUI PRODUIRONT UNE QUANTITE ANORMALEMENT ELEVEE D’URINE, VERRONT LE CHANGE DE LEUR CAGE PASSÉ DE 1 À 2 FOIS PAR SEMAINE POUR LEUR CONFORT. Lors des différentes chirurgies (sous anesthésie gazeuse), il sera administré au préalable une analgésie locale à l’endroit de l’incision ainsi qu’une analgésie générale pour le post-opératoire. Celle-ci sera renouvelée pendant 2 jours après l’intervention la plus lourde à savoir la transplantation des îlots dans le foie. On veillera que la paire de rats hébergés dans la même cage soit opérée le même jour de façon à limiter les interactions et ainsi le barbering (épilation des poils par l’animal lui-même ou un compagnon de la même cage) pour garder une plaie saine. On veillera lors des différentes interventions chirurgicales à assurer une asepsie stricte dans les conditions les plus stériles possibles pour éviter l’infection.
Choix des espèces
A la suite d’expériences antérieures sur des souris, nous avons préféré les rats pour notre étude. En effet, le rat est un modèle animal idéal pour tester notre stratégie : - Techniquement, il permet de réaliser des greffes d’ilôts de Langerhans dans le foie, comme cela est fait chez l’homme. Par ailleurs, du fait de sa taille, le rat est compatible avec une perfusion des ilôts via la veine porte ce qui ne peut être effectué chez la souris, ou en tout cas avec peu de succès. - Le rat aura besoin d’assez peu de vecteur, comparé à de plus gros animaux tels que porcs (30 kg), chiens (>3 kg) ou singes (>2,5 kg). - Des souches de rats sont disponibles pour la transplantation allogénique. - L’utilisation de rats évite l’utilisation de gros animaux, éthiquement plus problématique dans l’absolu et au vu du nombre d’animaux nécessaires. Les rats utilisés auront entre 8 et 12 semaines afin : - d’optimiser la quantité d’îlots extraits des donneurs d’après la littérature - de minimiser le poids des rats receveurs pour diminuer la quantité de vecteur à injecter - de faciliter la chirurgie chez les receveurs
Etude du vieillissement du globule rouge chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une transfusion sanguine par voie rétro-orbitale, pratiquée sur animal éveillé, avec un risque de complications oculaires et de surcharge de volume pouvant provoquer une insuffisance respiratoire : 2 007 souris vont être utilisées dans l'étude du vieillissement du globule rouge. 1 147 sont opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, les 860 autres relèvent d'un niveau de souffrance modéré et subissent sept prélèvements de sang éveillées sur vingt et un jours. Toutes sont tuées pour que leur sang soit prélevé et analysé. Les donneuses, âgées de dix à douze semaines, sont choisies pour leur poids et le volume de sang qu'on peut leur retirer, afin de constituer ce que le porteur appelle des "banques de sang", les receveuses ayant six à huit semaines.
Objectifs
Les globules rouges sont responsables du transport d'oxygène dans le sang et ne sont pas touché par les altérations courantes liées au vieillissement des autres cellules puisque constitués presque exclusivement de protéines. L'objectif général de ce projet est de caractériser, dans un modèle de souris, l'impact de drogues modulant la capacité de dégradation de protéines abîmées sur le viellissement du globule rouge en circulation.
Bénéfices attendus
Les mécanismes moléculaires et cellulaires du vieillissement des globules rouges déterminent leur durée de vie en circulation et sont donc des objets d’études cruciaux dans plusieurs contextes physipathologiques qui mènent à l'anémie. De plus, une étude de preuve de concept déterminera l'impact d'une molécule ayant le potentiel de retarder le vieillissement des globules rouges, avec pour objectif à long terme d'améliorer la qualité de circulation des globules rouges en physiologie et de traiter l'anémie dans le contexte physiopathologique de la bêta-thalassémie.
Procédures
Injection sous-cutanée pendant 5-10 secondes, suivie 20 minutes plus tard, d'une injection intra-péritonéale pendant 5-10 secondes, puis quelques minutes plus tard par un prélèvement intracardiaque (sous analgésie et anesthésie générale) pendant 1 minute, effectués une seule fois. Transfusion sanguine rétro-orbitale sur animal vigile pendant 5-10 secondes, effectuée une seule fois. Prélèvement de sang sur animal vigile pendant quelques secondes, effectué 7 fois sur 21 jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables des procédures sur les animaux sont modérés. Stress induit par la contention, l'analgésie, la piqûre d'anesthésie, la mise en anesthésie, la transfusion et les prélèvements sanguins. L'anesthésie peut causer une hypothermie. La transfusion peut entraîner des complications oculaires et correspond à un apport aigu d’un volume circulant supplémentaire pouvant entraîner une surcharge volémique avec insuffisance respiratoire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de prélever du sang qui sera analysé.
Remplacement
Veille bibliographique permanente pour éviter toute expérimentation inutile ou redondante. L’expérimentation animale est indispensable pour évaluer in vivo, dans un modèle préclinique, l’impact de drogues sur le vieillissement des globules rouges, puisqu’il est dépendant des contraintes réelles subies qu'il subit dans la circulation, qui ne peuvent pas être substituées par des approches in vitro. De plus, la clairance du globule rouge sénéscent est réalisée par plusieurs tissus et types cellulaires dont l’activité dépend aussi du contexte physiologique global et complexe d’un individu.
Réduction
Le nombre de souris utilisé sera réduit au minimum tout en permettant une analyse statistique fiable des résultats. Les tests statistiques utilisés rigoureusement permettent l’analyse d’échantillons de petites tailles. Notre expertise du modèle de transfusion sanguine chez la souris ainsi qu’une analyse statistique utilisant un logiciel nous informent que des groupes de 10 souris sont nécessaires pour générer des résultats robustes. Certaines méthodes ont été optimisées afin d'être réalisées sur de très faibles volumes de sang prélevé, et sur plusieurs marqueurs en parallèle, permettant un suivi longitudinal sur le même animal.
Raffinement
Les transfusions et prélèvements de petits volumes de sang (5µL) sur souris vigiles seront effectués par du personnel expérimenté qui maîtrisent les gestes techniques. Hébergement adapté des animaux, enrichissement de l’environnement. Lorsque l’approche expérimentale le permet, l'analgésie et l'anesthésie est utilisée pour réduire l'inconfort de l'animal. Un protocole de surveillance régulier du bien-être est défini a priori et appliqué pour chaque procédure, avec définition de points-limites basés sur un score composite d’items d'observations cliniques (apparence physique externe, changement de comportement des animaux, complications liées à la transfusion).
Choix des espèces
Les lignées de souris consanguines présentent une faible variabilité biologique, augmentant la sensibilité de détection de processus physiologiques et permettant de diminuer le risque d’incompatibilité transfusionnelle. Les souris femelles adultes "donneuses" utilisées seront âgées de 10 à 12 semaines pour la réalisation des banques de sang maximisant le poids des souris et le volume à prélever. Des souris femelles jeunes adultes "receveuses" âgées de 6 à 8 semaines seront utilisées dans tous les modèles de transfusion permettant d’homogénéiser les groupes en terme de volume circulant et d’âge.
Evaluation du profil pharmacocinétique d’un candidat médicament chez le rat MODIFICATION
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
3 532 rats vont être utilisés pour mesurer le devenir de candidats médicaments dans le sang, 3 500 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 32 sous anesthésie sans réveil. Ils subissent des chirurgies de vingt à quarante-cinq minutes pour l'implantation de cathéters dans les veines ou les artères ou d'une minipompe, des administrations par voie orale, intrapéritonéale, intradermique, intramusculaire, trachéale ou intraveineuse, des jeûnes pouvant atteindre vingt heures et des prélèvements sanguins sous la langue, à la carotide ou à l'artère fémorale. Certains reçoivent une perfusion intraveineuse sous anesthésie pendant trois heures et demie, au terme de laquelle ils sont tués. Le porteur indique que 875 rats pourront être transférés vers d'autres projets, dont des formations, à condition que la gravité réellement subie soit restée légère ou modérée.
Objectifs
Le projet consiste à étudier le devenir dans l'organisme d'un candidat médicament chez le rat (éveillé ou anesthésié), grâce à des prélèvements répétés dans le temps d'échantillons de sang après administration du produit à tester ainsi qu'un prélèvement terminal de liquide cephalo-rachidien.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la maladie humaine qui est visée par le/les produit(s) testé(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouveaux médicaments. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques de l’espèce utilisée (le rat) et le développement de méthodes pour améliorer le bien-être des animaux. Ces méthodes sont de plus en plus adaptées à l’espèce animale la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.
Procédures
Les rats de ce projet pourront subir une chirurgie pour introduire un tube très fin dans les veines et/ou les artères ou bien introduire une minipompe qui libère progressivement le produit (20 à 45 minutes) ou une chirugie pour l'administration du candidat médicament dans l'intestin (20-30 min). Les rats seront administrés (moins de 2 minutes) avec les produits à tester par différentes voies: orale, intrapéritonéale (au niveau de l'abdomen), sous-cutanée, intradermique, intramusculaire, dans la trachée, ou intraveineuse (avec une dose unique ou par injection lente). [AJOUT] Certains rats seront administrés par voie intraveineuse sous anesthésie sur une période n'excédant pas 3h30 et seront euthanasiés à la fin de l'administration. Les animaux pourront être mis à jeun la veille de l'administration pour une durée qui est dépendante du produit à tester (maximum 20h). Des prélèvements de sang (moins de 2 minutes) pourront être réalisés: - Au niveau de la veine sous la langue de l’animal transitoirement anesthésié - Au niveau de la veine de la queue, du cou ou des pattes sur l’animal actif au moyen d'un maintien adapté de l'animal - Au niveau de l'artère qui distribue le sang du coeur vers la tête (carotide) ou de l'artère de la cuisse (fémorale) sur animal préalablement implanté d'un tube très fin.
Impact sur les animaux
Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l'initiation du projet. Ils font donc l'objet d'échange avec les responsables Bien-Être Animal pour adapter les outils d'observation des animaux afin de mettre en place des traitements de potentiels signes cliniques. Les contentions des animaux vigiles pour induire l'anesthésie et administrer le produit peuvent engendrer un stress mineur à l'animal. Les chirurgies peuvent induire des douleurs post-chirurgicales qui seront réduites au maximum grâce à une anesthésie, analgésie et un protocole de soins post-opératoire. Post-chirurgie, les animaux pourront être hébergé individuellement: 5 jours maximum post chirurgie. Cet hébergement individuel engendra un stress de durée moyenne et d'intensité modérée (désocialisation). Cependant en contrepartie, l'hébergement individuel permettra aussi d'accélérer la récupération post-chirurgicale Les rats de ce projet pourront subir un stress lié à la privation de nourriture et à l'hébergement individuel en cage de mise à jeun. Ils pourront aussi subir un stress lié à une douleur équivalente à la piqûre d'une aiguille lors de l'administration du produit ainsi qu'une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins.
Devenir
Les animaux seront mis à mort si réalisation de prélèvements terminaux, suite à des effets marqués des produits testés, si non utilisés pour d’autres projets ou si implantés avec les dispositifs médicaux. Certains animaux (ex: témoins, animaux ne présentant pas d'effets marqués après traitement) pourront être réutilisés pour d'autres projets (ex: formation) si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée et si les volumes sanguins prélevés et la période de récupération sont respectés.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (en milieu artificiel ou par informatique) pour évaluer la pharmacocinétique d’un nouveau produit. Ou si ces méthodes existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses pharmacocinétiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse pharmacocinétique : 5 par groupe.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le rat est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour la réalisation d’études de pharmacocinétique permettant d’étudier le devenir (absorption, distribution, métabolisation, élimination), d’un produit testé, dans le sang. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Formation pratique aux techniques de microchirurgie vasculaire sur modèle rat
- Enseignement supérieur
Anciens reproducteurs pesant de 350 à 600 grammes, et pour partie transférés depuis d'autres projets après avis du vétérinaire, 1 300 rats vont être opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil. Chacun subit quatre heures de microchirurgie vasculaire, sutures, pontages et anastomoses sur des vaisseaux de très petit calibre, avec deux à quatre injections d'anesthésique pendant l'intervention. Ces séances servent à entraîner des internes en chirurgie humaine, des vétérinaires et des expérimentateurs, à raison de vingt séances par apprenant, sans produire de connaissances. Le porteur affirme qu'aucun modèle artificiel ne reproduit les flux et les pressions sanguins, tout en indiquant que le premier contact des stagiaires se fait sur un rat en plastique et que les gestes sont filmés pour les formations suivantes.
Objectifs
La formation a pour objectif d'entraîner les internes en chirurgie humaine à la microchirurgie vasculaire, et de parfaire la formation en chirurgie de vétérinaire et/ou d'expérimentateurs disposant d'une habilitation réglementaire à cette pratique. Ces procédures de microchirurgie réalisées sur des artères et des veines sont nécessaires à tous les types de macrochirurgie (chirurgies maxillo-faciale, plastique, orthopédique, cardiaque ...) au cours desquelles il faudra nécessairement réaliser des sutures, des pontages, ou des anastomoses de vaisseaux sanguins.
Bénéfices attendus
L’objectif est d'entraîner les internes en chirurgie humaine de différentes spécialités (ORL, Gynécologie, Neurologie, Orthopédie…), les vétérinaires et les expérimentateurs à la microchirurgie vasculaire avant d'exercer chez l'humain. Le travail avec le rat permettra aux stagiaires de s'entraîner à l'aide d'un 'modèle représentatif de l'humain en terme de microchirurgie afin d'acquérir une maîtrise du geste sur des vaisseaux de très petit calibre. L'exercice de la chirurgie nécessite de travailler avec des animaux vivants de façon à appréhender toutes les contraintes liées à cette pratique : conditions d'aseptise, induction et maintien de l'anesthésie, sang circulant...L'aquisition complexe des gestes et techniques de la microchirurgie sur l'animal permettront de garantir une formatin de haut niveau pour pouvoir ensuite exercer chez l'humain.
Procédures
Chaque animal recevra une première injection en vigile durant quelques secondes puis entre 2 et 4 injections sous anésthésie durant 4 heures. Les chirurgies de vaisseaux sanguins seront réalisées sous anesthésie générale sans réveil pendant ces 4 heures.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent ressentir un léger stress et une douleur passagère lors de la contention pour réaliser l’injection de l’anesthésique. Les animaux peuvent ressentir une douleur brève musculaire au point d’injection de l’anesthésique. Une application des points limites stricts et spécifiques du projet sera réalisée en particulier en cas de réapparition inattendue de la sensibilité lors de l'anésthésie.
Devenir
Euthanasie des animaux sous anesthésie générale à la fin de chaque geste de chirurgie vasculaire vérifié. Il est impossible de laisser en vie des animaux avec des muscles ayant subits une dissection et des sutures de vaisseaux incomplètes ou non perméables
Remplacement
L'exercice de la chirurgie nécessite de travailler avec des animaux vivants de façon à appréhender toutes les contraintes liées à cette pratique : conditions d'aseptise, induction et maintien de l'anesthésie, sang circulant, pression du sang... Il n’existe actuellement pas de modèle artificiel permettant de reproduire les flux sanguins, les pressions et les tissus des vaisseaux pour se former au plus proche d’une intervention humaine. Néanmoins, Le premier contact avec l’animal vivant endormi se fait après avoir manipulé un rat en plastique, les encadrants montrent les incisions à faire sur un animal en plastique. Nous réaliserons également des vidéos lors des premières séances pour montrer les principaux gestes à réaliser sur les rats. Ces vidéos seront montrées aux étudiants lors des formations suivantes.
Réduction
Nous souhaitons former des apprenants à la réussite d’une anastomose de vaisseau sanguin. Il est donc nécessaire d’utiliser plusieurs rats pour se former. Les expériences en matière de formation ont montré qu’il était nécessaire d’avoir recours à 20 séances par apprenant pour garantir un maximum de chance de succès dans la réussite des gestes techniques. Des rats provenant d’autres DAP pourront être réutilisés sur ce projet après autorisation du vétérinaire.
Raffinement
Un analgésique et un tapis chauffant sont utilisés en période per-chirurgicale. Les animaux sont tous opérés sous anesthésie générale chimique. En cas de signes de réveil, la chirurgie est suspendue, une dose est réinjectée en intra-musculaire et la chirurgie reste suspendue le temps que l’animal n’est plus de réflexe de retrait au pincement de la patte. Une application des points limites stricts et spécifiques du projet sera réalisée en particulier en cas de réapparition inattendue de la sensibilité lors de l'anesthésie.
Choix des espèces
La taille de l’artère Aorte sous rénale du rat correspond à une artère de doigt d’un Homme adulte Les rats seront des rats adultes anciens reproducteurs, ils ont un poids moyen de 450-600g pour les mâles et 350-430g pour les femelles. Ils ne sont plus en phase de croissance et correspondent à l’âge adulte chez l’homme
Impact du neurodéveloppement dans la maladie de Huntington chez un modèle murin MODIFICATION
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Des injections intracérébrales sont pratiquées sur les embryons, par chirurgie de trente à quarante-cinq minutes sur les femelles gestantes anesthésiées, et le liquide céphalorachidien est prélevé sous anesthésie avant mise à mort. 6 150 souris vont être utilisées, dont 120 opérées sans réveil, 3 790 au niveau de souffrance léger et 2 240 au niveau modéré, avec deux séries de cinq tests comportementaux à trois et six mois, dont une privation de nourriture de vingt-quatre heures. Le porteur indique que la mutation de la maladie de Huntington peut provoquer des difficultés locomotrices, une prostration et une perte de poids à partir de douze mois, et prévoit de tuer les souris entre six et huit mois, avant l'apparition de ce phénotype. La mise à mort sert à récupérer les tissus et à prélever les embryons, ou vient de ce que les animaux génétiquement modifiés ne peuvent être ni réutilisés ni replacés.
Objectifs
La maladie de Huntington est une maladie génétique incurable causée par une mutation dominante, si un parent porte une version de la mutation il sera atteint et la transmission à sa descendance sera de 50 pour cent. Cette mutation entraîne le dysfonctionnement et la dégénérescence de sous-populations neuronales. Plus spécifiquement, plusieurs étapes du développement cortical sont modifiées. Cependant, les mécanismes physiopathologiques développementaux observés dans la maladie de Huntington, restent méconnus. En particulier, comment des modifications précoces auront des conséquences sur la dégénérescence du cerveau. Dans ce projet, nous évaluerons les conséquences de cette maladie sur la génération des différents types cellulaires du cortex en développement et du cortex adulte, ainsi que les stratégies de compensations qui pourraient se mettre en place pour pallier aux effets délétères de la mutation. Cette étude permettra la découverte de marqueurs permettant de suivre l’évolution de la maladie à des stades très précoces et d’identifier des cibles thérapeutiques pour retarder ou atténuer cette maladie neurodégénérative. MODIFICATION : L’étude de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique dans le modèle de la maladie implique une modification du projet initial pour injection de traceur sans ajout d’animaux.
Bénéfices attendus
L’étude des mécanismes sous tendant le développement de la maladie de Huntington permettront à long terme de mettre en évidence des biomarqueurs qui représentent les différents stades d’évolution de la maladie. Après identification de ces différents stades, l’objectif sera de développer des cibles thérapeutiques adaptées afin de retarder ou limiter les symptômes associés à cette pathologie.
Procédures
La mutation génétique portée par certains animaux peut générer des souffrances à partir de l’âge de 12 mois : difficultés locomotrices, prostrations et perte de poids. Pour déterminer la présence de la mutation (génotypage), un prélèvement de l’extrémité terminale de la queue sera effectué, rapidement et une seule fois sur chaque animal vigile (moins d'une minute par animal). Nous réaliserons des injections de produits pharmacologiques ou de vecteurs viraux, dans des zones spécifiques du cerveau des embryons en intra utérin. Ces injections nécessitent une chirurgie sous anesthésie générale des femelles gestantes (30-45 minutes, 1 fois). Chaque embryon reçoit une injection intracérébrale. Les animaux impliqués dans les analyses comportementales réaliseront 2 séries (l’une à 3 mois, la deuxième à 6 mois) de 5 tests comportementaux vigiles sur une période d’un mois. Lors du test de privation de nourriture les animaux seront mis à jeun sur une période de 24 heures. Le prélèvement du liquide céphalorachidien implique une chirurgie sous anesthésie générale, une seule fois pour chaque animal pendant 5 minutes maximum. Pour étudier la perméabilité de la barrière entre le système nerveux et le système sanguin une partie des animaux recevra une injection d’une molécule fluorescente (une seule fois, vigile, durée inférieure à 1 minute) puis seront euthanasiés au maximum 2 heures après. L’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire appropriée, efficace et reproductible.
Impact sur les animaux
Le prélèvement pour génotypage est réalisé sur animaux vigiles. Cet acte peut générer une légère douleur chez l’animal. L’acte d’injection pratiqué sous anesthésie peut générer de la douleur lors de la chirurgie et en post opératoire pendant quelques jours. Il y a un risque lors de l’anesthésie (dépression cardiorespiratoire, hypothermie), ainsi qu’un risque infectieux et hémorragique. Le prélèvement de liquide céphalorachidien réalisé sous anesthésie sera suivi d'une euthanasie, il n'y aura donc pas de douleurs post-opératoires associées. Les tests comportementaux peuvent générer du stress chez les animaux liés à leur manipulation et aux changements de pièces. Le test de suppression de nourriture peut également induire un état de stress et de fatigue chez les animaux. Ce test nécessite une privation de nourriture pendant vingt-quatre heures et met en évidence une activité de type antidépressive. L’injection d’une molécule pour évaluer la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique sera associée à une légère et brève douleur au point d’injection, qui pourra être suivie d’un inconfort de courte durée. La mutation génétique portée par les animaux des 2 lignées peut générer des souffrances à partir de l’âge de 12 mois (phénotype dommageable) : difficultés locomotrices, prostrations et perte de poids.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les souris seront euthanasiées afin de récupérer les tissus post-mortem, prélever des embryons, ou parce qu'il ne sera pas possible de les réutiliser ou replacer du fait de leur modification génétique.
Remplacement
L’étude du cerveau en développement nécessite le recours à un modèle animal car il permet de préserver l’environnement du développement utérin (impliquant différents types cellulaires qui interagissent entre eux, ce qui ne peut être reproduit en culture cellulaire). L’influence d’un développement cérébral anormal sur le cerveau adulte ne peut se faire qu’avec un modèle de mammifère qui permet de suivre l’évolution du cerveau tout au long du développement et de la vie de l’animal. Le développement cérébral et la génétique de la souris présentent des similarités avec ceux de l’Homme. Ces éléments font de la souris un modèle indispensable pour notre étude. Nous utiliserons des cultures cellulaires afin de valider les outils moléculaires qui seront ensuite injectés chez l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au minimum pour pouvoir atteindre l’objectif scientifique fixé. Il a été déterminé en réduisant au plus petit nombre le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats significativement exploitables. Pour cela nous utiliserons des tests statistiques adaptés en fonction du type d’analyses réalisées. Afin d’extraire le plus de données possibles sur un nombre minimum d’animaux, le matériel biologique récupéré sera utilisé au maximum et différentes expériences seront combinées. Si les résultats sont concluants avant l’utilisation de tous les animaux alors ils ne seront pas tous utilisés. Pour la totalité du projet nous estimons que nous utiliserons au maximum 6150 animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils bénéficient d’eau et de nourriture adaptée à leur stade physiologique à volonté et sont observés quotidiennement. Les animaux seront euthanasiés à 6-8 mois, avant apparition du phénotype dommageable, excepté pour les quelques animaux gardés jusqu’à 12 mois pour certaines procédures, qui seront particulièrement surveillés pour détecter des difficultés locomotrices et une prostration, 2 signes caractéristiques liés à la mutation. Nous réaliserons des accouplements avec des souris non génétiquement modifiées afin d’éviter toute dérive génétique. La biopsie de queue pour le génotypage sera réalisée sur de jeunes animaux (cicatrisation rapide) et limitée au strict minimum. Le geste est rapide, parfaitement maitrisé, et réalisé dans un endroit dédié au calme. Une surveillance adaptée du souriceau est mise en place après le geste. Cette technique de prélèvement permet d’obtenir une quantité suffisante d’ADN pour le génotypage sans risque d’induire des effets indésirables majeurs pour l’animal. En effet sur un animal si jeune il ne serait pas possible d’obtenir la quantité de poils suffisante, un prélèvement de sang pourrait induire un choc hypovolémique et la biopsie d’oreille n’est pas possible avant 2 semaines du fait de la petite taille des oreilles. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Afin d’améliorer le bien-être de la mère dans les cages post chirurgie ajout d’une maison, d’un nid en coton et d’une nourriture enrichie (hydrogel, nourriture facile d’accès). Les chirurgies sont réalisées le matin afin d’observer les animaux le soir et administrer les médicaments nécessaires. Une liste d’observation post opératoire sera remplie. Après les chirurgies, les animaux seront observés (infections, mauvaise cicatrisation, prostration ou d’agitation et perte de poids anormaux) 2 fois par jour par l’équipe, et chaque jour par l’animalerie. Une grille de scoring de la douleur sera utilisée. Les nouveaux nés post chirurgie seront suivis durant les premiers stades de vie pour s’assurer que la modification induite par la chirurgie n’entraine pas de modification développementale dommageable. Une grille de score clinique sera utilisée dès la naissance. Un protocole d’analgésie sera utilisé lors de l’euthanasie des souris afin qu’elle se fasse sans douleur.
Choix des espèces
Il n’existe pas d’autre méthode expérimentale n’impliquant pas d’animaux vivants et permettant d'étudier le développement et la complexité du cerveau. Ces analyses nécessitent l'utilisation de souris : le comportement des neurones diffère selon leur environnement, ils adoptent un comportement migratoire in vivo et de croissance neuritique en culture; l'organisation laminaire du cortex (zone spécifique du cerveau), et les connexions neuronales qui y sont formées ne peuvent être reproduits en culture; la complexité des interactions entre les différents types cellulaires du cortex. Ainsi les modèles in vitro sont insuffisants pour étudier la complexité et la mise en place des réseaux neuronaux corticaux. La souris est un modèle de choix pour la transgénèse et les organismes génétiquement modifiés et nous avons à disposition plusieurs modèles murins de la maladie de Huntington. Nos modèles de souris ont été décrits comme reproduisant de nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine. Le but de ce projet étant de suivre l’impact des modifications ayant lieu au stade embryonnaire sur les stades tardifs, nous allons nous focaliser sur les âges suivants : chez l’embryon (jour de gestation 14 et 16) pour observer l’effet direct de la modification pendant l’établissement des couches du cortex cérébral, à un stade juvénile pour étudier la continuité du développement post-natal ; particulièrement à l’âge de 30 jours et à l’âge de 12 mois pour analyser la perméabilité de la barrière entre le sang et le liquide céphalorachidien; et à 3, 6, 8 et 12 mois pour évaluer les conséquences au stades adultes de la modification embryonnaire, en comparant le phénotype des souris traitées à celui des souris modèles de la maladie. Nous utiliserons des animaux reproducteurs adultes afin de générer les animaux nécessaires pour nos procédures. Les animaux générés seront prélevés pour connaitre leur patrimoine génétique à l’âge de 7 à 10 jours.
Elaboration d’un système de monitorage multimodal de la moelle épinière en per-opératoire d’une chirurgie rachidienne_MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Quatre heures d'anesthésie, dont trois consacrées au relevé des mesures sur animal vivant : 10 cochons vont être opérés du rachis puis tués sans reprise de conscience. L'intervention comporte l'écartement des muscles vertébraux et, éventuellement, une laminectomie, gestes dont le porteur indique qu'ils exigeraient des soins post-opératoires lourds, raison qu'il donne pour ne pas réveiller les animaux. Il s'agit de valider le prototype d'une sonde de surveillance métabolique de la moelle épinière, destinée aux blocs opératoires humains. Le cochon est retenu pour l'épaisseur de ses vertèbres et une vascularisation médullaire proche de celle de l'humain, le porteur visant de jeunes adultes d'une quarantaine de kilos et précisant que "l'âge effectif des animaux est sans importance".
Objectifs
La moelle épinière (ME) représente l’entrée des informations sensorielles et la sortie des commandes motrices des membres et du tronc. Son atteinte par des traumatismes ou par des pathologies de nature inflammatoire ou neurodégénérative entraîne des conséquences sensorielles et motrices majeures qui affectent la qualité et l’espérance de vie des patients. La prise en charge des pathologies de la colonne vertébrale et de la ME nécessitent fréquemment de recourir à des interventions chirurgicales. Dans ce cas, le placement d’implants métalliques au plus proche de la ME, la correction de l’anatomie de la colonne vertébrale ou la chirurgie directe de la ME comportent un risque significatif de complications neurologiques et de paralysie transitoire ou définitive des membres. A ce jour, le monitoring des Potentiels Évoqués (PE) somesthésiques est la seule technique per-opératoire disponible qui permet d’avoir des informations indirectes sur l’état fonctionnel de la ME et donc la stabilité de sa fonction. Cependant, cette méthode ne permet pas toujours d’identifier un dysfonctionnement métabolique précoce, notamment liées à des phénomènes vasculaires, avant que les fonctions neurologiques ne soient affectées. Dans ce contexte, le projet dans lequel s’intègre la présente demande, a pour objet la conception et l’expérimentation d’un nouveau dispositif médical pour le suivi métabolique de la ME en période per-opératoire lors d’une chirurgie rachidienne. Comme spécifié auparavant, le chirurgien ne dispose, à l’heure actuelle, que d’une information indirecte et retardée sur la vitalité de la ME durant l’opération.
Bénéfices attendus
Le développement d’un outil de monitorage per-opératoire de la moelle épinière (ME) renforcera les moyens disponibles pour la communauté médicale et chirurgicale, nécessaire à identifier précisément les zones fonctionnellement à risque durant l’acte opératoire, mais aussi les zones atteintes après une lésion de la ME ou pour suivre leur évolution afin de mesurer l’effet de nouvelles approches thérapeutiques (chirurgicales, pharmacologiques ou de rééducation). A terme, un tel outil permettrait pour le chirurgien de disposer d’une cartographie de la perfusion sanguine de la moelle épinière et donc de définir ou de modifier en per-opératoire la stratégie chirurgicale (zones de « moindre danger »).
Procédures
Les animaux sont soumis à une intervention chirurgicale réalisée en bloc opératoire sur champ stérile sous anesthésie générale et antalgie adaptée pendant toute la durée de la procédure, avec un recueil de données avec une sonde non invasive placée sur les vertèbres. L’ensemble de l’acte chirurgical et des mesures seront réalisés sur une période d’une journée, avec un temps d’anesthésie estimé à 4 heures : l’abord chirurgical est estimé à 1 heure et le recueil des mesures à 3 h sur animal vivant anesthésié. L'animal est mis à mort en fin de procédure, sans réveil d'anesthésie.
Impact sur les animaux
Etant donné la mise à mort de l’animal à la fin de l’expérimentation, les nuisances ou effets indésirables attendus sont inexistants, mise à part l’opération chirurgicale en elle-même qui sera encadrée par un protocole d’anesthésie et d’antalgie adapté permettant, comme chez l’homme, de réaliser un acte chirurgical dans des conditions adaptées et non délétères pour l’animal. Une possible réaction allergique à l’une des substances chimiques (anesthésie, stimulation) est toutefois toujours envisageable et conduire à une euthanasie anticipée.
Devenir
Tous les animaux inclus dans l'étude sont mis à mort sans réveil, directement à la fin de la procédure pour éviter les douleurs post-opératoires. De plus, l’abord chirurgical avec l’écartement des muscles vertébraux et la réalisation d’une potentielle laminectomie nécessiteraient des soins post-opératoires conséquents et source de nuisances pour l’animal.
Remplacement
Le principe de 3R est au cœur de ce projet de recherche. L’un des objectifs d’une thèse réalisée par un doctorant du laboratoire, préalable à ce travail, est de proposer aux concepteurs de dispositifs médicaux des outils pour aider à la réduction du nombre d’expérimentations, grâce au prototypage virtuel. Pour le moment, le remplacement est malheureusement encore une perspective lointaine. En effet, aucun protocole in-vitro ou ex-vivo ne permet de reproduire fidèlement les conditions rencontrées au bloc opératoire, en particulier concernant la nature des tissus vivants et des flux sanguins. De plus, le bruit physiologique et l’ensemble de signaux parasites de l’environnement sont à considérer, sans oublier l’effet que peut avoir l’emploi des substances pharmacologiques, etc. Une première phase de test in-vitro sur banc d’essai est en cours et ramène des informations incomplètes, bien que précieuses. Des tests sur animaux sont donc inéluctables, afin notamment de calibrer nos modèles. En effet, différents biais (dans les propriétés optiques, notamment) sont présents dans ces modèles par rapport à la réalité de tests sur animaux (coagulation du sang, changement des propriétés des os suite à son retrait post-mortem, etc.). Sans expérimentation in-vivo, la validation du prototype de la sonde ne pourra être réalisée de manière certaine et son application chez l’homme ne pourra pas être entreprise. Le cochon représente le modèle animal le plus proche de l’homme en termes d’anatomie vertébrale et concernant son système cardiovasculaire.
Réduction
Nous avons d’ores-et-déjà réalisé une validation expérimentale informatique de la sonde à l’aide de logiciels/programmes développés au sein de notre laboratoire. De plus, nous avons réalisé des mesures préliminaires sur banc in-vitro. Enfin, des outils statistiques ont permis de s’assurer de la validation statistique de notre recueil futur. La validation du prototype est donc réalisée à ce jour 1) de manière informatique expérimentale et 2) in-vitro sur banc d’essai et 3) de manière statistique permettant d’envisager des résultats concluants in-vivo. Afin de limiter le nombre d’animaux, nous envisageons seulement deux (2) expérimentations pour la première phase de test du prototype de la sonde. Cela nous permettra, en premier lieu, de valider l’usage de la sonde en condition in-vivo par l’acquisition de valeurs de bases de monitorage de la ME, puis de s’assurer de la reproductibilité des mesures en comparant les jeux de données et de la viabilité en conditions in-vivo du prototype. Dans un deuxième temps, si la première phase in-vivo est concluante, une nouvelle série d’expérimentations sur un lot de de huit (8) animaux sera effectuée, sur une période de trois (3) ans, pour répondre notamment au caractère statistique et envisager le passage à l’homme.
Raffinement
Avant expérimentation, les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour assurer les meilleures conditions de confort adaptées à leur espèce, dans des boxes avec des copeaux de bois au sol et enrichis avec des jouets en plastique et quelques friandises (e.g. morceaux de pommes). Durant toutes les expérimentations, les animaux seront maintenus sous anesthésie générale, avec administration d’antalgiques puissants (fentanyl IV), tout au long de la procédure et mis à mort sans réveil. Pendant toute la procédure, les principaux paramètres vitaux (température corporelle, fréquence cardiaque, pression télé-expiratoire en oxygène, etc.) seront monitorés par un appareillage conventionnel. La survenue de marqueurs d'une dégradation majeure de la condition de l'animal amènera à une euthanasie anticipée. Celle-ci n’est pas attendue compte tenu de la surveillance de l’animal par un vétérinaire anesthésiste étant en capacité de réagir si besoin.
Choix des espèces
L’objectif de cette expérimentation chez le gros animal est de confirmer le principe de fonctionnement et la pertinence du dispositif développé pour une utilisation future sur l’humain. Certaines mesures avec le dispositif sont fortement contraintes par l’épaisseur des os et les dimensions des vertèbres. Elles doivent donc absolument être confrontées à des conditions proches de celles observées chez l'humain, que l’on retrouve chez le porc spécifiquement vis-à-vis de l’anatomie de ses vertèbres. De plus, le porc possède un système cardio-vasculaire proche de l’humain, avec une cartographie des artères responsables de l’alimentation sanguine de la ME analogue. Nous visons de jeunes animaux, adultes, d'une quarantaine de kilogrammes. L'objectif est d'avoir une ME anatomiquement proche de celle de l'homme. L'âge effectif des animaux est sans importance.
Acquisition et maintien de compétences techniques sur le rongeur MODIFICATION
- Formation professionnelle
Rats : 420
Hamsters dorés : 240
Autres rongeurs : 470
1 930 rongeurs, 800 souris, 420 rats, 240 hamsters dorés et 470 rongeurs d'autres espèces, vont être utilisés pour entraîner des apprenants aux gestes de base de l'expérimentation animale. 930 d'entre eux sont anesthésiés puis tués sans réveil, les 1 000 autres subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et sont annoncés comme réutilisables si aucun dommage n'est observé. Ils sont saisis et immobilisés cinq à dix minutes, reçoivent une injection, subissent un ou deux prélèvements sanguins, un frottis vaginal pour les femelles, et pour certains une injection terminale sous anesthésie. Le projet répond à une obligation réglementaire de formation, et le porteur affirme que ces gestes ne peuvent être réalisés que sur un animal "vivant entier", tout en indiquant qu'aucune validation des gestes n'est prévue pour l'initiation.
Objectifs
Le projet vise à répondre à la réglementation française sur l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques ou éducatives qui par l'arrêté du 1er février 2013 oblige à ce que tout personnel des établissements utilisateurs qu'il soit personnel de recherche ou étudiant soient formés aux gestes et déclaré compétent pour les gestes qu'il aura à réaliser ultérieurement dans le cadre de ses activités scientifiques. L'objectif est donc de former aux gestes de bases employés en expérimentation animale sur rongeurs comme la préhension, la contention de l'animal mais également l'administration de substances et le prélèvement de sang sur animal vigile. Une partie de cette formation consistera à délivrer la partie pratique de la formation intiale niveau concepteur aux étudiants en première année de thèse : préhension, contention, injections élémentairtes et la formation dans son ensemble s'adressera aux personnels de laboratoires ou personnels zootechniques dans le cadre de leur formation lors de leur recrutement ou du maintien des compétrences tout au long de leur carrière. MODIFICATION: Pour suivre l'évolution de la demande en formation en lien avec les projets de recherche mis en oeuvre au sein de l'EU, le projet est modifié pour intégrer de nouveaux gestes techniques terminaux d'injection et de prélèvements. Le nombre d'animaux n'est pas modifié.
Bénéfices attendus
La phase pratique des séances de formations en expérimentation animale permet aux personnes d'appréhender les grands principes de manipulation et d'avoir un premier enseignement des bonnes pratiques zootechniques lors de l'utilisation d'animaux. Selon les besoins en rapport avec les projets de recherche développés ensuite dans les laboratoires, l'apprentissage des gestes réalisés avec un tuteur technique puis validé par un membre de la cellule du bien-être animal permettra de garantir la compétence acquise et au personnel ou étudiant formé de devenir autonome dans ces pratiques expérimentales. Concernant la formation continue des personnels déjà en poste le bénéfice sera de garantir le niveau des compétences requises en lien avec leurs missions zootechniques ou expérimentales. La formation continue permettra également de créer une dynamique en contribuant à faire évoluer les pratiques en expérimentation animale en tenant des évolutions éthiques notamment en terme de raffinement et donc d'inclure les méthodes alternatives développées.
Procédures
Les animaux seront soumis à une préhension et contention qui ne durera pas plus de 5-10 minutes le temps de réaliser les injections (durée 1 minute). Ils seront également soumis à 1 ou deux prélèvement sanguins sur animal vigile ou anesthésié qui ne dureront pas plus de 15 minutes, à un frottis vaginal (animaux femelles uniquement) sur animal vigile d'une durée de 2 minutes . Ils seront soumis sous anesthésie/analgésie à un prélèvement sanguin terminale d'une durée de 5 minutes. Chaque animal ne pourra subir qu'un type d'injection et deux prélèvements sanguins au cours de chaque session de formation. Les animaux seront soumis sous anesthésie/analgésie à un prélèvement sanguin terminale d'une durée de 5 minutes. AJOUT: certains animaux seront soumis à un prélèvement sanguin d'une durée de quelques minutes ou une injection terminale avec ou sans produit de contraste d'une durée de 15-20minutes, réalisés sous anesthésie.
Impact sur les animaux
La préhension et la contention peuvent provoquer un stress ponctuel pour l'animal. Les injections pourraient provoquer un saignement, un hématome, une inflammation. L'administration par voie orale (gavage) pourrait provoquer une fausse route. Le prélèvement sanguin à la queue (coupe ou incision) pourrait conduire à une inflammation . Les prélèvements sanguins pouraient entrainer une douleur aigue , un hématome. AJOUT: le prélèvement sanguin ajouté pourrait induire un saignement, une douleur légère de courte durée, un hématome qui pourrait dans de rares cas induire une diminution de la prise alimentaire avec perte de masse (5 à 10% attendu en moyenne). L'injection terminale réalisée sous anesthésie ne créera pas de nuisance à l'animal.
Devenir
A l'issu des procédures les animaux seront soit réutilisés si aucun dommage n'a été observé, soit mis à mort si les points limites ont été atteints.
Remplacement
La formation intègre des gestes techniques en lien avec l'expérimentation animale qui ne peuvent être réalisés que sur animal vivant entier car ces gestes nécessitent un organisme dans sa globalité (système cardio-vasculaire fonctionnel et intègre, cerveau...).
Réduction
Aucune analyse statistique ne sera réalisée car il s'agit de formation. Le nombre d'animaux/procédure a été estimé en fonction du niveau des apprenants et des attendus des tuteurs. Pour les formations spécifiques réglementaires, il s'agit d'une initiation aux gestes et donc il n'y a donc aucune validation des gestes. Un seul animal/apprenant suffit donc à cette initiation aux gestes. Pour l’acquisition de nouvelles compétences techniques ou la formation initiale et continue des personnels de laboratoire ou zootechniques, les gestes enseignés pourront faire l'objet d'une validation de la part des tuteurs. Nous avons alors évalué le nombre d'animaux/apprenant à N=2. Il s’agira autant que possible d’animaux de réforme. Un maximum de trois gestes seront réalisés sur un même animal réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Lorsque cela sera nécessaire, pour des raisons liées aux gestes réalisés ou à l'espèce manipulée, les animaux seront anesthésiés pour limiter le stress, la souffrance ou l'inconfort. Tous les animaux utilisés seront au préalable habitués à la préhension et contention avant chaque session de formation afin de limiter le stress lorsque ces gestes seront réalisés par les apprenants. En alternative à la préhension par la queue ou le corps , pour la souris ou le rat, la méthode du tunnel qui consiste à apprendre à l'animal à entrer de façon volontaire dans le tunnel intégré en tant qu'enrichissment dans la cage sera proposée ce qui permet de sortir les animaux de leur cage sans les manipuler au risque de les stresser. Les animaux seront maintenus en groupe dans des cages enrichies avec le matériel dédié à chaque espèce leur permettant ainsi d'exprimer des comportements naturels comme ronger et nidifier. Pour limiter la souffrance animal des points limites prédictifs ont été définis pour chaque procédure du projet.
Choix des espèces
Le rat et la souris seront les espèces animales prinicpalement utilisées dans le cadre de la formation pratique incluse dans la formation des étdudiants puisque ces deux espèces sont les plus manipulées et utilisées dasn les projets de recherche scientifiques. D'autres espèces de rongeurs plus spécifiques des domaines de recherche ciblés par les apprenants seront également utilisées afin de former les étudiants et personnels impliqués dans les projets de recherche. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte à partir de 3 mois. Selon les gestes enseignés, nous pourrions être amenés à affiner notre choix en prenant également en considérant le poids et le sexe de l'animal.
Diplôme universitaire de microchirurgie
- Enseignement supérieur
840 rats vont être anesthésiés, opérés sous microscope, puis tués avant tout réveil. Chaque animal ne subit qu'une intervention, d'une durée pouvant atteindre trois heures, sur laquelle des chirurgiens qualifiés ou en formation et des vétérinaires s'exercent aux sutures de vaisseaux et de nerfs. Aucune connaissance n'est produite : il s'agit de la partie pratique d'un diplôme universitaire de microchirurgie, après des séances sur vidéo, sur substituts et sur pièces anatomiques. Le porteur présente cette formation comme "indispensable" et cite le credo de la Haute Autorité de santé, "jamais la première fois sur le patient", sans que la protection ainsi revendiquée s'étende aux 840 rats opérés.
Objectifs
Ce diplôme universitaire (DU) a pour but l’enseignement de la microchirurgie (chirurgie qui permet de pratiquer avec un microscope opératoire et grâce à des instruments spéciaux des interventions très précises sur des organes de petites dimensions) dans le cadre de spécialité chirurgicales, pour des chirurgiens qualifiés ou en formation et des vétérinaires. Ce DU concerne de nombreuses spécialités : chirurgie maxillo-faciale, plastique, orthopédique, ophtalmologique, Orl, urologie, pédiatrie mais aussi les vétérinaires. Les applications de la microchirurgie sont nombreuses : réimplantation de membre, transplantation d’organe, réparation de lésions nerveuses et vasculaires, et les cas de reconstructions. Cette activité nécessite une formation spécifique en dehors de la formation au bloc opératoire. Après de nombreuses séances d’observation vidéo, de chirurgie sur substituts et pièce anatomiques, il est encore nécessaire de recourir à des séances de formation avec des animaux pour se retrouver dans la situation d’un tissu vivant, mobile et vascularisé et de pouvoir contrôler la perméabilité vasculaire.
Bénéfices attendus
L’acquisition des compétences à la dissection et à la suture sous microscope est grandement facilitée et sécurisée tant en chirurgie humaine que vétérinaire après une initiation suivie d’un entrainement solide sur modèle vivant. Il s’agit d’une formation indispensable pour tous chirurgiens ou vétérinaires qui se destinent à pratiquer l’une au l’autre des techniques microchirurgicales. Les compétences acquises seront applicables dès la fin de la formation.
Procédures
Les animaux sont susceptibles d’être soumis à de la contention, à une procédure d’anesthésie par injection ou par voie gazeuse, et à des procédures chirurgicales. Même si différentes techniques microchirurgicales seront enseignées à l'occasion de cette formation, chaque animal ne suivra qu'une seule procédure chirurgicale qui sera sans réveil et d'une durée n'exédant pas 3h00.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles pouvant être observés sont : contention, douleur et/ou stress liés à la réalisation de l'anesthésie des animaux (par injection ou voie gazeuze). Par ailleurs, compte tenu du caractère « formatif » de ce projet, aucune des techniques opératoires étudiées ne se clôturera par le réveil de l’animal qui pourrait l’exposer à des complications post-opératoires telles que des douleurs, des hémorragies ou la formation de caillots sanguins. Néanmoins, demeure présent en cours d’intervention, le risque de survenue d’un problème anesthésique (ralentissement cardiaque, difficulté respiratoire), d’une hypothermie, ainsi que celui d’une rupture vasculaire.
Devenir
Afin d'éviter aux animaux utilisés dans ces travaux pratiques d'être exposés à des complications post-opératoires, l'ensemble des animaux sont euthanasiés avant leur réveil.
Remplacement
Préalablement aux travaux sur les animaux, différentes techniques alternatives, ne faisant pas appel à l’utilisation d’animaux, sont mise en place. En effet, l’acquisition de la gestuelle de base en microchirurgie sera réalisée grâce à des travaux pratiques sur substituts, et pièces anatomiques, en remplacement de l’animal. L'acquisition des gestes de base par des méthodes alternatives est un pré-requis obligatoire à l'apprentissage sur animaux.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux est rendue possible par la mise en place de phase successive d'acquisition des techniques microchirurgicales : d’abord sur substituts et pièces anatomiques et enfin sur animaux, d’une part. Et d'autre part, lorsqu’une procédure chirurgicale est réalisée, plusieurs techniques microchirurgicales pourront, si cela est possible, être réalisées et/ou enseignées au cours de cette même intervention (même période anesthésique). Toutefois, chaque animal ne sera soumis qu’à une seule procédure chirurgicale et ne participera pas à plusieurs interventions distinctes. Le nombre d’animaux est limité au minimum (1 animal par étudiant par séance de TP x 12 séances de TP/an, x14 étudiants/an, x5 ans = 840 animaux). L’utilisation de substituts et pièces anatomiques lors des premières séances de TP permet d’acquérir les compétences de base en microchirurgie sans recourir directement à l’animal, contribuant ainsi à réduire le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Ce n'est qu'après la validation de l'acquisition de la gestuelle de base, que les étudiants pourront continuer leur apprentissage sur des animaux. L’entraînement sur substituts et pièces anatomiques lors des premières séances de TP contribue au raffinement des procédures, en garantissant la maîtrise des gestes de base avant leur application sur l’animal. Afin d’assurer le bien-être de ceux-ci, ils seront hébergés dans des conditions de température, d’humidité et de ventilation optimales. Ils bénéficieront d’un enrichissement varié : - tactile (buchette, litière foisonnante, tube en carton), - sociale (groupe sociaux stables), - visuel (cages transparente) - et sonore (fond musicale). Par ailleurs, toutes douleurs interventionnelles seront exclues par l’utilisation d’anesthésique et d’analgésique. Il est à noter qu’aucun animal ne fera l’objet de plus d’une procédure chirurgicale ni ne sera réveillée au terme de cette procédure. De plus, des points limites ont été définis permettant de stopper immédiatement la chirurgie et de mettre fin à la vie d'un animal si cela s'avérait nécessaire (problème respiratoires, hemorragie, lésion d'un organe).
Choix des espèces
"Jamais la première fois sur le patient", tel est le credo de la haute autorité de santé. Il est bien évident que pour des raisons de sécurité, l'apprentissage des techniques microchirurgicales ne peut s'effectuer sur le patient. Ce type de chirurgie nécessite de travailler in vivo pour maitriser les problèmes liés au sang (thrombose, hémorragie, hémostase…) et pour vérifier la perméabilité des sutures. L’animal de prédilection est le rat, tant pour sa robustesse à l’anesthésie, que pour ses dimensions et son anatomie. En effet la taille de ses vaisseaux en particulier abdominaux et carotidiens, sont comparables aux structures vasculaires observées chez l’homme. Les rats utilisés seront de jeunes adultes (rats de 7 à 9 semaines). Leur taille étant adaptée au matériel chirurgical utilisé. Et de constitution suffisamment robuste pour supporter sans difficulté une anesthésie de 3 à 4 heures.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Un cathéter est implanté dans le duodénum de chaque rat au cours d'une anesthésie d'au moins 45 minutes, pour administrer des molécules candidates directement dans l'intestin en contournant l'estomac. 725 rats vont être utilisés, 600 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 100 un niveau modéré, 25 étant anesthésiés puis tués sans réveil. Ils subissent jusqu'à huit prélèvements sanguins par 24 heures, jusqu'à trois administrations par jour pendant cinq jours, et un hébergement individuel pouvant durer huit jours, en cage à métabolisme pour certains. Tous sont tués, faute de pouvoir réutiliser des animaux dont le cathéter se bouche, alors que le porteur écrit qu'"aucune dégradation de l'état de santé de l'animal n'est attendue" et que les points limites limitent la nuisance "à un niveau de gravité modéré au maximum".
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans une stratégie globale de caractérisation de nouvelles entités en vue de la première administration chez l’homme, ou l’animal pour les médicaments vétérinaires. L’objectif du projet est de déterminer les paramètres pharmacocinétiques et/ou les concentrations tissulaires et/ou l’excrétion d’entités thérapeutiques chimiques ou biologiques après administration chez le rat par la voie intraduodénale permettant ainsi le shunt de l’estomac. Ceci facilitera l’étude d’entités thérapeutiques gastros sensibles notamment. Dans la recherche préclinique et la recherche de candidats, ces paramètres sont essentiels pour la sélection et l’évaluation des candidats médicaments. Les entités testées sont préalablement analysées lors de tests in-vitro. Une première sélection est ainsi réalisée pour n’administrer aux animaux que des entités avec des caractéristiques favorables en terme pharmacocinétique. Ces études préliminaires permettent d’objectiver les processus d’absorption, de dégradation, de distribution et d’élimination de chaque entité afin de prédire le comportement de ces entités chez l’homme ou l‘animal. Une chirurgie a été développée pour implanter un cathéter au niveau du duodénum et ainsi administrer une entité thérapeutique directement dans le duodénum en shuntant l’estomac.
Bénéfices attendus
A court terme, les expérimentations de ce projet permettront de déterminer les paramètres essentiels pour l’avancée du développement préclinique pour les entités testées. Elles peuvent aussi aboutir à l’identification des principaux métabolites et déterminer leur éventuelle toxicité. Ces résultats permettront de sélectionner les candidats potentiels ainsi que les doses et les voies d’administration les plus adaptées. A long terme, les entités sélectionnées constitueront la base pour un traitement applicable à l'Homme ou à l’animal dans le cadre de médicaments vétérinaires.
Procédures
Les gestes techniques concernent tous les animaux : •Procédure chirurgicale de pose de cathéter intraduodénale et veineux : o1 anesthésie gazeuse de 45 minutes minimum par animal oAdministration par voie sous-cutanée d’analgésique et anti-inflammatoire. Durée 30 secondes sur animaux anesthésiés. Unique. Mise en place d’une couverture analgésique sur une période de 3 jours post-opératoire o2 administrations par voie sous-cutanée d’une solution d’hydratation. Durée 30 secondes sur animaux anesthésié. • Hébergement individuel post-chirurgie : • Pesées : Durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Administrations des composés à potentiel thérapeutiques o Sur animal vigile : Durée 30 secondes. Unique ou répété max 2 à 3 fois par jour sur une durée maximale de 5 jours. • Prélèvements de sang : o Via le cathéter : Durée 30 secondes sur animal vigile. Maximum 8 fois sur 24h. o En microsampling : Durée 30 secondes sur animal vigile. Maximum 6 fois sur 24h. o En phase terminale : Durée 1 minute sous anesthésie générale gazeuse ou chimique. o Les volumes et la fréquence des prélèvements seront selon les critères de la consigne interne en vigueur. Le volume total prélevé n'excédera pas 7.5% du volume estimé de sang total de l'animal sur une période de 24 heures. • Hébergement individuel post-chirurgie ou post-traitement : o Cage individuelle avec enrichissement complet (matériaux de nidification et bâton à ronger) avec maintien du contact olfactif et visuel. Habituation pendant au moins 10 jours. Durée de l’hébergement individuel maximale de 8 jours. o Pour certaines études, Cage individuelle à métabolisme avec maintien du contact olfactif et visuel. Habituation pendant au moins 12 jours. Durée de l’hébergement individuel maximale de 24h consécutives.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont liés aux gestes techniques d’administration (maximum 3 fois sur 5 jours pendant 30sec) et de prélèvements (maximum 8 fois 30sec sur 24h), à l’acte chirurgical (maximum 1 heure) ainsi qu’aux contraintes d’hébergement individuel. Aucune dégradation de l'état de santé de l'animal n’est attendue par l’application des procédures de ce projet ou en lien avec les candidats-médicaments testés. Toutefois, la chirurgie peut amener de l’inconfort per et post-opératoire, compensé par une analgésie et anesthésie adapté (effets modérés). Et dans ces phases précoces de développement de candidat-médicaments, des effets secondaires non prédictibles peuvent survenir : perte de poids, hypo- ou hyperthermie, comportement anormal (animaux hypo- ou hyperactifs), vocalisations. Tout effet observé sera noté selon une grille spécifique et donnera lieu à une action adaptée à la gravité des signes ; les points limites anticipés permettent de limiter la nuisance à un niveau de gravité modéré au maximum.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures. Ces animaux ayant subis une chirurgie de pose de cathéter, il n’est pas possible de réutiliser les animaux pour de nouvelles études en effet la perméabiliité des cathéter est limité dans le temps.
Remplacement
De nombreux tests in silico et in vitro existent et permettent de sélectionner les entités d'intérêt uniquement sur la base de leurs caractéristiques pharmacocinétiques, notamment l'absorption et le métabolisme. Il n'existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de déterminer l'ensemble des propriétés pharmacocinétiques d'un composé d'intérêt. Seul un modèle animal peut permettre de caractériser ces entités et discriminer celles qui pourront être envisagées pour un traitement chez l’homme ou l’animal.
Réduction
Les entités thérapeutiques auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro permettant de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d'interaction du composé avec la cible d'intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). Cette approche préalable permet de réduire fortement le nombre d’entités à tester. Lors de l’administration de doses croissantes, les animaux seront traités de manière séquentielle afin de s’assurer de l’innocuité d’une dose avant de passer à une dose plus élevée. Cette organisation permet d’éviter l’administration à des doses où les nuisances seraient trop fortes, et ainsi de réduire le nombre d‘animaux. Le nombre minimal d’animaux par cohorte de traitement est réduit au minimum scientifique, c’est-à-dire 3 animaux. Ce nombre suffit pour avoir des données assez robustes pour présélectionner des candidats pour la phase pré-clinique
Raffinement
Les animaux seront dans des cages contenant de l'enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Après réalisation des chirurgies, les animaux seront hébergés individuellement dans des cages conformes à la réglementation pour permettre une bonne récupération post-chirurgicale et éviter qu’ils ne s’abiment les sorties de cathéters ou les plaies en cicatrisation. Ces cages seront équipées d’enrichissement et matériaux adaptés. Suite à l’administration de l’entité thérapeutique, dans les cas où les animaux seront hébergés individuellement dans des cages à métabolisme pour permettre le recueil des excrétas, ce temps de recueil sera limité à 24h consécutives et un temps de récupération suffisant sera appliqué avant la réalisation d’un nouveau recueil d’excrétas en cage à métabolisme pour limiter le stress des animaux. Un contact olfactif et visuel sera maintenu entre tous les congénères. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Les locaux d'hébergement font l'objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d'hébergement et d'animaux sentinelles. Des soins adaptés seront donnés aux animaux affectés, par ou sous l'autorité du vétérinaire désigné ou mis à mort selon les recommandations définies dans la consigne en vigueur. Un plan d'action sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Des critères d'arrêt anticipés seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile. Les procédures potentiellement douloureuses ou source d'inconfort ou de stress se feront sous anesthésie gazeuse. Le nombre de manipulations sur l'animal sera réduit au strict nécessaire. Le projet sera mis en œuvre par du personnel qualifié et habilité conformément à la réglementation en vigueur et ayant reçu une formation en Chirurgie Expérimentale. Une procédure spécifique permettra de continuer à travailler sur le raffinement notamment de la technique chirurgicale, de l’hébergement et de la collecte d’échantillon en vue de l’appliquer dans le cadre des études, une fois validé par le vétérinaire désigné, la Structure en charge du bien-être animal et le comité éthique de l’Etablissement utilisateur.
Choix des espèces
Le rat est une espèce couramment utilisée dans les stratégies de sélection de candidat, en réalisant des essais de pharmacocinétique préclinique. L’intérêt du modèle a été démontré dans plusieurs publications scientifiques. Le choix de l’espèce est dicté par le fait que le rat facilite par sa taille, la pose d’un cathéter intraduodénale et la pose simultanée d’un cathéter veineux. De plus, cela permet de répondre à des impératifs scientifiques : comparaison de résultats pharmacodynamiques et pharmacocinétiques chez la même espèce animale, homologie de récepteur de l’espèce choisie avec le récepteur humain. Le stade adulte sera utilisé par défaut (à partir de 7 semaines) car c’est celui qui permet de déterminer les paramètres pharmacocinétiques de l’espèce pour une entité donnée.