Procédures sans réveil

Entre le sixième et le neuvième jour de vie, un vecteur viral est injecté dans les cochlées des jeunes gerbilles pour rendre leurs neurones auditifs sensibles à la lumière. 466 gerbilles de Mongolie vont être utilisées, 382 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 84 sous anesthésie sans réveil, toutes tuées à l'issue. Le porteur annonce comparer la transmission du signal chez des animaux "devenus complètement sourds" et chez d'autres présentant une perte auditive cachée, sans dire nulle part comment cette surdité leur est provoquée ni ce qu'elle leur fait, la liste des nuisances se limitant aux douleurs après opération et au stress des injections. La seconde intervention consiste en quatre à douze heures d'enregistrement sous anesthésie entretenue par réinjections, sans réveil, avant prélèvement des cochlées et du cerveau.

Objectifs

En 2050, près de 2,5 milliards de personnes dans le monde auront des problèmes d’audition. Pour 700 millions d’entre elles, ces problèmes seront très graves. Aujourd’hui, la meilleure solution pour les personnes qui n’entendent presque plus, c’est l’implant cochléaire électrique. C’est un petit appareil placé dans l’oreille interne. Il capte les sons et les transforme en courants électriques pour faire travailler directement les nerfs de l’oreille. Mais il y a un souci : l’électricité stimule trop large. Elle excite beaucoup de nerfs en même temps, ce qui fait perdre la précision des sons. Par exemple, dans un restaurant bruyant ou dans une classe, c’est difficile de comprendre une conversation. Pour améliorer ça, nous travaillons sur une nouvelle idée : utiliser la lumière au lieu de l’électricité. Comment ? On rend les nerfs sensibles à la lumière grâce à des petites protéines spéciales. Ensuite, on envoie de la lumière avec des mini-lampes dans l’oreille. Cette lumière active les nerfs, mais de manière beaucoup plus précise, un peu comme un rayon laser au lieu d’un éclair. Grâce à ça, on espère que les personnes entendront beaucoup mieux et comprendront les voix même dans le bruit. Notre projet veut répondre à plusieurs questions importantes avant de pouvoir utiliser cette technologie chez l’humain : 1. Comparer comment le signal passe dans le cerveau quand on stimule l’oreille par le son, l’électricité ou la lumière. 2. Faire la même comparaison chez des animaux devenus complètement sourds. 3. Tester cette approche chez des animaux ayant une perte auditive cachée. 4. Vérifier si ça marche même quand la thérapie pour rendre les nerfs sensibles à la lumière n’a pas très bien fonctionné.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, un million de personnes qui ne pouvaient plus entendre utilisent déjà des implants cochléaires électriques. Grâce à ces appareils, la plupart arrivent à comprendre la parole quand il n’y a pas de bruit, par exemple dans une pièce calme. Mais dès qu’il y a du bruit autour – dans la rue, un restaurant, une salle de classe ou un bureau – ça devient très difficile. Parfois, ils n’arrivent presque plus à comprendre ce qu’on leur dit. Et il y a un autre problème : ils ne peuvent pas vraiment profiter de la musique, car les sons sont trop simplifiés. Pour améliorer ça, nous développons un implant cochléaire qui utilise la lumière. Cette nouvelle technologie devrait permettre d’entendre plus clairement, même quand il y a du bruit, et peut-être aussi de mieux profiter des sons comme la musique. Pour que cela fonctionne, nous devons d’abord mieux comprendre comment la lumière agit sur le système auditif et vérifier que cela marche pour différents types de surdités. Ces recherches sont essentielles pour amener un jour cette nouvelle technologie aux patients et leur rendre une audition la plus naturelle possible.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux procédures chirurgicales. La première procédure consiste à injecter un vecteur viral dans les cochlées des animaux entre le sixième et le neuvième jour de vie. Cette procédure permettra de photosensibiliser les neurones cochléaires. Cette procédure nécessitera environ 30 minutes par animal, en incluant l'induction de l'anesthésie et le réveil. La seconde procédure chirurgicale sera réalisée au moins 8 semaines après l’injection du vecteur viral, lors d’une procédure durant laquelle les animaux ne se réveilleront pas. Durant cette procédure, les potentiels évoqués auditifs seront enregistrés sur une durée de 4 à 12 heures. L'état de profonde anesthésie sera maintenu par reinjection régulière d'anesthésiant durant toute la procédure.

Impact sur les animaux

Les différentes nuisances ont été identifiées: - suite à l’injection intracochléaire à 3-9 jours de vie, douleur post-opératoire; -suite à l’injection intracochléaire à 5 semaines de vie, douleur post-opératoire; - injection d’antalgiques et anesthétiques : stress

Devenir

À la fin de chaque étape, les animaux devront être euthanasiés (endormis définitivement sans douleur). C’est nécessaire car nous devons analyser leur oreille interne (cochlée) et leur cerveau pour vérifier si la thérapie génique a bien fonctionné. Pour cela, il faut prélever ces organes afin de les examiner au microscope.

Remplacement

Les travaux prévus nécessitent une organisation cellulaire extrêmement complexe, formant un réseau qui ne peut pas encore être reproduit en culture cellulaire ou dans les modèles in silico les plus sophistiqués. Une telle organisation cellulaire complexe ne peut être trouvée que chez d'autres mammifères, tels que les rongeurs. En outre, l'objectif du présent travail est de prédire les performances d'un implant cochléaire optique pour l'homme. Nous devons donc utiliser un modèle animal dont le système auditif est anatomiquement et physiologiquement aussi proche que possible de celui de l'homme. Nous avons donc choisi la gerbille de Mongolie. Les données générées seront partagées avec les scientifiques qui développent des modèles informatiques des voies auditives, ce qui permettra, nous l'espérons, d'utiliser des modèles in silico plutôt que des modèles animaux dans le cadre d'études futures.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été calculé avec soin grâce à un outil statistique. L’objectif est d’utiliser le moins d’animaux possible, tout en s’assurant que les résultats soient fiables. Pour cela, nous avons choisi des critères précis pour garantir que les expériences soient assez puissantes pour montrer un effet réel. Dans ce projet, les deux sexes (mâles et femelles) seront inclus sans faire de distinction.

Raffinement

Le bien-être des animaux est notre priorité pendant toute la durée du projet. Si un animal se retrouve seul, nous ferons en sorte qu’il ne reste pas isolé en le mettant avec d’autres animaux. Au début, un séparateur percé sera utilisé pour qu’ils puissent s’habituer les uns aux autres sans risque. Nous savons que manipuler les animaux peut être stressant pour eux. C’est pourquoi nous allons les habituer doucement à venir d’eux-mêmes sur la main des chercheurs, plutôt que d’être attrapés. Après l’injection (faite très tôt après la naissance), les animaux seront surveillés tous les jours et recevront des médicaments contre la douleur pendant deux jours. Ces médicaments seront donnés après une courte anesthésie (moins de 5 minutes) pour éviter tout stress. Si nous voyons qu’un petit n’est pas bien (par exemple, s’il n’est plus soigné par sa mère), il recevra des soins supplémentaires après avis d’un vétérinaire. Si malgré tout son état ne s’améliore pas, il sera endormi sans douleur. De même, si un animal montre des signes de souffrance plus tard, nous utiliserons une grille d’évaluation spéciale et, après avis du vétérinaire, il recevra des soins ou sera euthanasié sans souffrance si nécessaire.

Choix des espèces

Notre objectif est de savoir si l’implant cochléaire optique pourrait bien fonctionner chez l’être humain. Pour cela, nous devons faire des tests sur un animal qui a une oreille très semblable à celle de l’homme. Nous avons choisi la gerbille de Mongolie, un petit rongeur. Elle entend presque comme nous et sa grande oreille facilite l’accès à la cochlée pour y mettre un implant ou injecter le vecteur viral. Le vecteur viral (qui sert à rendre les nerfs sensibles à la lumière) sera injecté quand les petits ont entre 6 et 9 jours. Pourquoi ? Parce que le traitement marche beaucoup mieux à cet âge. Parce qu’à cet âge, l’os autour de l’oreille n’est pas encore formé, ce qui permet de faire l’injection sans opération lourde. Après 10 jours, cet os se durcit et il faudrait une chirurgie beaucoup plus invasive. Enfin, les mesures (tests) seront faites au moins 8 semaines plus tard, quand les animaux seront adultes et que leur système nerveux sera complètement développé.

408 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés, chacune passant jusqu'à 24 semaines sous un régime riche en graisse et en sucre. Un lot enchaîne six heures de jeûne, l'administration d'une solution puis cinq à six prélèvements sanguins en deux heures, et 72 heures d'hébergement individuel en cage métabolique. Un troisième lot reçoit un régime conçu pour déclencher une inflammation et une fibrose du foie, alors que le porteur écrit n'attendre l'apparition d'aucun signe clinique. Deux cents autres, réparties en quatre groupes de cinquante, sont opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil pour qu'on prélève leurs cellules de foie et les mette en culture.

Objectifs

Les maladies du foie associées à un dysfonctionnement métabolique (MASLD) débutent par la stéatose (une accumulation de graisse dans le foie) et peuvent progresser vers la stéato-hépatite (MASH) qui présente un état inflammatoire et un début de fibrose au niveau du tissu hépatique, et ce jusqu’à la fibrose/cirhhose. Au-delà des dysfonctionnements métaboliques du foie, ces pathologies sont également associées à la mortalité d’origine cardiovasculaire et à la survenue de carcinomes hépato-cellulaires. Il est donc important de comprendre les mécanismes qui amènent à leur progression. De nombreuses études soulignent un rôle de l’activité des mitochondries (organites intra-cellulaires entre autres responsables de la production d’énergie) dans le métabolisme du foie et dans la progression des MASLD. Mais la manière dont l’activité mitochondriale est potentiellement responsable de la progression des MASLD n’est pas clairement élucidée. Nous disposons d’un modèle dans lequel l’absence d’une protéine située au niveau de la membrane des mitochondries dans les hépatocytes de souris mâles a la capacité d’intensifier le processus de respiration mitochondriale couplée à la production d’énergie dans ces cellules et est corrélée avec une protection de ces animaux vis-à-vis de l’apparition d’une stéatose induite par un régime riche en graisse. Notre objectif est à présent de vérifier si ces résultats, initialement obtenus chez des mâles, peuvent également être confirmés chez des souris femelles, ce qui nous parait particulièrement important dans un contexte clinique où la survenue des MASLD a une fréquence différente en fonction du sexe des patients. Nous cherchons également à déterminer si une modulation de l’activité respiratoire mitochondriale, une fois la stéatose hépatique installée, a des vertus curatives, ce qui permettra d’envisager des voies thérapeutiques dans l’avenir. Enfin nous souhaitons déterminer si cette modulation de l’activité respiratoire mitochondriale a des vertus préventives également vis-à-vis de la progression de la stéatose en MASH. Enfin nous utiliserons des hépatocytes primaires en culture, afin d’élucider les mécanismes à l’origine des observations effectuées in vivo.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément l’importance de notre protéine d'intérêt pour la fonction du foie. Ils permettront également de mettre en évidence des différences de réponses cellulaires entre mâles et femelles vis-à-vis de la progression des MASLD (maladies du foie liées à un dysfonctionnement métabolique), en particulier comment survient l’apparition d’un foie dit gras et comment cela peut évoluer en un foie inflammé et fibrosé . Nous résultats pourraient également permettre le développement de nouveaux médicaments ciblant les mitochondries, permettant ainsi de prévenir ou freiner le développement des maladies métaboliques et hépatiques chez les patients.

Procédures

(MODIFICATION) Un premier lot d’animaux sera soumis à un régime riche en graisse et en sucre (animal vigile, 24 semaines), période au cours de laquelle une moitié d’entre eux sera soumise à deux tests métaboliques pendant que l’autre moitié sera soumise à un test métabolique et à une mesure de la dépense énergétique. Les tests métaboliques sont tous précédés d’une mise à jeun de 6h et sont constitués d’une administration d’une solution (animal vigile, 5 sec, 1 fois), suivie de 5 à 6 prélèvements sanguins de faible volume sur une période de 2h. La mesure de la dépense énergétique implique un hébergement individuel temporaire (animal vigile, 72h). En fin de procédure, tous les animaux de ce premier lot seront soumis à un prélèvement sanguin (animal anesthésié, 1 min, 1 fois) pour la mesure de leurs paramètres biochimiques. Un second lot d’animaux sera soumis à un régime riche en graisse (animal vigile, 16 semaines), période au cours de laquelle chaque animal sera soumis à un prélèvement sanguin (animal vigile, 30 sec, 1 fois), à une injection intra-veineuse (animal anesthésié, 30 sec, 1 fois), et à un hébergement individuel (animal vigile, 72h). En fin de procédure, chacun des animaux du lot sera soumis à un prélèvement sanguin (animal anesthésié, 1 min, 1 fois). Un troisième lot d’animaux sera soumis à un régime riche en graisse capable d’induire une inflammation et une légère fibrose du foie (animal vigile, 16 semaines). Il sera également soumis à un prélèvement sanguin (animal anesthésié, 1 min, 1 fois). Enfin un quatrième lot d’animaux sera soumis à une procédure chirurgicale sans réveil (animaux sous anesthésie générale et analgésie, 1 fois 20 min). (MODIFICATION) Une modification de projet sans augmentation du nombre d'animaux est nécessaire car un régime alimentaire induisant une obésité et une résistance à l'insuline est remplacé par un régime entrainant une maladie du foie en plus de ces syndrômes métaboliques.

Impact sur les animaux

(MODIFICATION) Les régimes spéciaux peuvent engendrer une maladie du foie, de l'obésité et une résistance à l'insuline ce qui peut induire une douleur modérée, une modification de leur déplacement et de leur mobilité. Les tests métaboliques peuvent entrainer des hyper ou hypoglycémies transitoires chez les souris. L'hébergement individuel de courte durée en cage métabolique peut induire un stress chez les animaux. Les prélèvements de sang peuvent induire une douleur légère de courte durée. Les injections intrapéritonéales et intraveineuses peuvent engendrer une douleur légère de courte durée au site d'injection. Enfin, les procédures d’anesthésie peuvent engendrer un risque cardio-respiratoire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire pour des analyses post-mortem. Concernant les 3 premiers lots d’animaux, les foies entiers seront collectés et leur analyse nous permettra d’évaluer la santé du foie en réponse aux différents régimes alimentaires et aux traitements à visée curative. Concernant le quatrième lot, une procédure chirurgicale sans réveil, réalisée sous anesthésie et analgésie, nous permettra d’isoler les cellules du foie pour effectuer des analyses plus poussées sur le fonctionnement de ces cellules, en présence ou absence de notre protéine d’intérêt. Ces résultats complémentaires devraient nous permettre d’expliquer les différents états de santé du foie observés chez les animaux.

Remplacement

Selon la règle des 3R, la caractérisation de notre protéine d'intérêt a d’abord été réalisée in vitro et dans un modèle invertébré. Ces modèles n’étant pas basés sur des pathologies des grands systèmes chez l’humain, ils ne permettent pas d’étudier son importance in vivo. Certaines questions d'intérêt scientifique nécessitent des expériences sur les animaux. Bien que nous réalisions des expériences sur les hépatocytes primaires de souris maintenus en culture, ainsi que l’exploration de certains mécanismes par simulation informatique, nous ne pouvons pas étudier la physiopathologie des maladies mitochondriales ex vivo car les phénomènes sont multifactoriels. Les modèles animaux sont nécessaires pour évaluer in vivo au cours de plusieurs mois le développement des altérations pathologiques propres aux organes en question.

Réduction

408 animaux seront utilisés pour ce projet. L’utilisation de souris génétiquement modifiées permettra de démontrer l’importance hépatique de notre protéine d'intérêt et son rôle potentiel dans la progression des maladies du foie associées à un dysfonctionnement métabolique (MASLD pour metabolic-associated steatotic liver disease) à la fois chez les mâles et femelles. Pour chaque condition de régimes, des groupes de 8 à 10 souris seront créés afin d’obtenir une puissance satisfaisante à la fin de l’étude pour des résultats significatifs. Pour l’isolement d’hépatocytes et leur mise en culture, 4 groupes de 50 animaux seront nécessaires afin de reproduire de manière fiable une variété d’expériences en culture cellulaire.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs ventiles avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Les animaux sont acclimatés à l’animalerie et sont habitués à être manipulés avec un suivi de poids hebdomadaire qui permet de s’assurer du bon état de santé des animaux. Les animaux sont observés quotidiennement et tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne responsable du projet. Nous n’attendons l’apparition d’aucun signe clinique. En particulier, les régimes alimentaires, déjà testés par notre équipe, ont été développés en vue de circonvenir aux effets délétères des précédents régimes qui engendraient d’importantes pertes de poids chez les animaux. Néanmoins, nous veillerons à détecter les premiers signes de douleurs visibles, de détresse ou de signes de toxicité qui pourraient être induits : respiratoire, abattement, perte de poids, dysfonctionnement hépatique. Nous appliquerons strictement les points limites définis dans le projet et la douleur sera limitée à son maximum. Lorsque cela est nécessaire une grille de score adaptée à la procédure sera mise en place. Les prélèvements sanguins et les injections seront réalisés sous anesthésie locale ou générale. La procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie/analgésie.

Choix des espèces

Le choix de la souris est lié à deux considérations : 1) tous les gènes de la dynamique mitochondriale sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction ; 2) la souris est le modèle de choix pour les techniques qui visent à introduire des mutations. Les modèles murins proposés présentent plusieurs avantages notamment la possibilité d’étudier le fonctionnement du foie dans un contexte physiologique où il communique avec tous les organes ainsi que d’étudier la réponse du foie et de l’organisme aux stress hépatiques comme la fibrose hépatique dans le cadre des MASLD (maladies du foie associées à un dysfonctionnement métabolique) et le diabète. Les souris seront mises en conditions expérimentales à partir de l’âge adulte de 8-10 semaines pour ne pas interférer avec leur développement.

Tuées sans jamais se réveiller pour 378 d'entre elles, 438 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, les 60 autres dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Aucune ne peut survivre au prélèvement de sang dans l'aorte, et celles qui passent par la chirurgie sont mises à mort pour éviter, selon le porteur, toute souffrance au réveil. Chaque souris subit une mesure du temps de saignement par section du bout de la queue, quarante minutes durant, ou une chirurgie de prélèvement aortique, ou une expérience de thrombose de cinquante minutes, sous anesthésie profonde. Le porteur compte comme réduction le fait de réutiliser les souris passées par le temps de saignement pour en prélever le sang, et annonce qu'il renoncera aux expériences de thrombose in vivo si les essais en microfluidique ne montrent rien.

Objectifs

Les plaquettes sanguines jouent un rôle clé dans l'hémostase pour éviter les hémorragies mais à l'inverse sont aussi responsables des thromboses artérielles. Lors de lésions ou de thromboses, les plaquettes sont activées, agrègent et forment un clou plaquettaire (hémostase) ou thrombus (thrombose), partiellement ou totalement occlusif. Les plaquettes sont les acteurs principaux des thromboses artérielles. Depuis une dizaine d'année, on sait que les forces mécaniques sont ressenties par des récepteurs spécialisés présents dans la membrane des cellules et modifient le comportement des cellules. L'objectif est de décrypter le rôle de ces récepteurs encore peu étudiés afin de trouver de nouveaux traitements pour éviter les hémorragies et prévenir les thromboses. Pour cela, nous effectuerons des expériences de thrombose sur souris génétiquement modifiées pour ces récepteurs.

Bénéfices attendus

Ces expériences nous permettront de comprendre dans quelle mesure ces récepteurs sont impliquées en hémostase normale ou en thrombose. De manière plus générale, les perspectives de ce projet sont pour l'instant essentiellement fondamentales mais le cas échéant ouvrent à terme des perspectives cliniques et thérapeutiques intéressantes pour de nouveaux traitements anti-thrombotiques ou anti-hémorragiques.

Procédures

Contention et piqûre pour les anesthésies (moins d'une minute). Mesure du temps de saignement par section de l'extremité de la queue (1 mesure par souris, durée totale 40 minutes), chirurgies pour prélèvements de sang au niveau de l'aorte (durée totale 10 minutes, 1 prélèvement par souris) et expériences de thromboses (durée totale 50 minutes, 1 expérience par souris), l'ensemble de ces procédures se faisant sur souris profondément anesthésiées.

Impact sur les animaux

Pour toutes les procédures, une complication attendue est le risque de saignement au site d’injection ou d’incision. Les piqures pour l’injection des anesthésiants entrainent une douleur légère de courte durée au point d’injection. La section de l’extrémité de la queue induit une légère douleur au réveil, de courte durée.

Devenir

Les animaux ne peuvent survivre à l'issue des prélèvements de sang en aorte. A l'issue des procédures chirurgicales, les animaux sont mis à mort pour éviter toute souffrance au réveil. De plus, ayant déjà subi une intervention cardiovasculaire, ils ne pourraient être réutilisés pour des raison de fiabilité des résultats scientifiques.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’étudier le rôle de protéines plaquettaires dans l’hémostase et la thrombose artérielle. Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle d’hémostase in vitro. Cependant, il existe des modèles de perfusion de sang dans des chambres microfluidiques qui miment partiellement les mécanismes de la thrombose artérielle. Ils seront également utilisés pour visualiser l’impact de l’inactivation des gènes dans la souris. Les processus d’hémostase et de thrombose étant particulièrement complexes et faisant intervenir plusieurs types cellulaires (plaquettes, globules rouges, protéines plasmatiques) ainsi que les conditions de flux sanguin, les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour en reproduire toute la complexité.

Réduction

Les animaux utilisés pour les modèles de temps de saignement seront réutilisés pour le prélèvement de sang pour thrombose in vitro afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Au cas où nous n'aurions aucune différence en thrombose in vitro, nous ne ferons pas les expériences de thrombose in vivo. Nous avons utilisé des tests statistiques adaptés pour déterminer un nombre d’animaux qui nous permettra d’atteindre l’objectif de notre projet.

Raffinement

Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués : - Par l’hébergement en groupes sociaux. Les cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui permet aux souris d’organiser leur environnement selon leurs besoins. - Par une anesthésie générale de l’animal avant toutes les procédures et une analgésie adaptée à chaque procédure, maintien de l'animal sur tapis chauffant pour éviter l'hypothermie, l’application de gel hydratant sur les yeux pour éviter la sécheresse oculaire. - Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites, s'ils sont atteints, permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris car nous disposont de souris génétiquement modifiées avec inactivations de gènes. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte, entre 8 et 18 semaines, à l'exception des expériences de thrombose sur mésentère qui nécessitent des souris de 3 semaines, au delà le dépot de graisse entraine des résultats peu fiables. Mâles et femelles seront évalués.

16 porcs de 70 à 100 kilos vont être utilisés, tous tués à l'issue, six d'entre eux opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, les dix autres dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'opération dure deux heures : ouverture de l'abdomen, isolement temporaire d'un rein de la circulation générale, perfusion de ce rein avec un vecteur de thérapie génique. Ceux qui se réveillent passent 48 à 72 heures en soins intensifs, seuls en box pendant trois à cinq jours, puis trois semaines de suivi avec dix prélèvements de sang. Le porteur compte trois porcs de plus, qu'il appelle des animaux "de substitution", au cas où une chirurgie tourne mal, et précise qu'ils seront "épargnés" s'ils ne servent pas.

Objectifs

Les podocytopathies héréditaires sont des maladies rares du rein qui touchent des cellules essentielles à sa fonction de filtration, appelées podocytes. Ces maladies entraînent souvent une perte importante de protéines dans les urines et peuvent mener à une insuffisance rénale sévère dès l’enfance. À ce jour, aucun traitement spécifique n’existe. L’objectif de ce projet est de tester une nouvelle méthode pour délivrer localement un traitement génique directement dans le rein, en utilisant une machine de perfusion habituellement employée en transplantation. Cette méthode permettrait de mieux cibler les cellules malades, d’utiliser moins de produit, et de limiter les effets indésirables sur d’autres organes. À terme, cela pourrait ouvrir la voie à un traitement pour ces maladies actuellement incurables. La 1ère étape du projet consistera à mettre au point l'approche chirurgicale pour cibler localement l'injection du rein, isolé de façon transitoire de la circulation générale. La 2ème étape du projet consistera ensuite à valider l'efficacité de cette approche chirurgicale avec des vecteurs de thérapie génique transportant un gène "rapporteur" (gène capable de produire un composé fluorescent visible ensuite au niveau des tissus).

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer une méthode plus ciblée pour délivrer un traitement génique dans le rein, en particulier vers les cellules appelées podocytes, qui sont altérées dans certaines maladies rares. Grâce à une machine de perfusion, on espère améliorer l’efficacité du traitement tout en réduisant les doses nécessaires et en évitant les effets secondaires sur d’autres organes. À plus long terme, cette approche pourrait non seulement ouvrir la voie à une thérapie pour des maladies génétiques du rein actuellement incurables, mais aussi permettre d’agir sur des mécanismes généraux (comme l’inflammation ou la fibrose) impliqués dans de nombreuses maladies rénales chroniques.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Une procédure chirurgicale unique sous anesthésie générale, comprenant une ouverture abdominale et une perfusion rénale, d'une durée de 2 heures, suivi soit d'une euthanasie immédiate (1ère étape de mise au point de l'approche chirurgicale), soit suivie d'une prise en charge en soins intensifs pour une observation post-opératoire de 48 à 72 heures, puis un suivi sur 3 semaines post-injection du (2ème étape d'évaluation de l'efficacité du vecteur de thérapie génique). Des prélèvements sanguins seront réalisés à différents moments, avant, pendant et après la procédure chirurgicale, selon les points suivants : 2 semaines avant l'intervention, au moment de l'incision, puis à 10 min, à 20 min, à 30 min, et à la fin de la chirurgie. Des prélèvements supplémentaires seront effectués pour les animaux suivis après injection (2ème partie du projet): jour 1, Jour 7, Jour 14 et Jour 21. Chaque prélèvement nécessite 5 minutes. Des traitements post-opératoires seront administrés sur des animaux vigiles (durée entre 5 et 10 minutes). Les animaux seront anesthésiés de manière générale avant l'euthanasie de fin de protocole.

Impact sur les animaux

Un stress lié à l’injection intramusculaire réalisée en pré-médication peut être généré (durée 2-3 minutes). Une douleur pourrait survenir si la couverture analgésique est insuffisante (durée de quelques minutes). Une douleur post-opératoire due au traumatisme chirurgical peut survenir (durée de quelques minutes). En cas de rupture de l'asepsie lors de l'intervention chirurgicale, malgré l'antibiothérapie préventive, une infection du site opératoire accompagnée d'hyperthermie, de perte d'appétit et de douleur légère peut être observée. Un stress lié à la manipulation de l’animal pour l’administration des traitements et des prises de sang sera généré (durée inférieure à 5 min). La stabulation individuelle de l'animal en phase post-opératoire immédiate sera obligatoire (pendant 3 à 5 jours).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de ce projet. Des prélèvements de divers organes et tissus, y compris les reins seront effectués pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Les podocytes, qui jouent un rôle clé dans la fonction rénale, présentent une grande complexité, ce qui les rend difficilement reproductibles de manière parfaite en dehors d’un organisme vivant. Malgré les progrès biotechnologiques, notamment le développement des organoïdes (structures cellulaires créées en laboratoires imitant les caractéristiques et les fonctions des organes), permettant de recréer des conditions tissulaires simplifiées, ceux-ci ne suffisent pas à eux seuls pour étudier la pathophysiologie et le transfert des gènes dans une étude globale. Si un maximum d’informations a été obtenu à partir d’organoïdes rénaux et de cultures cellulaires en laboratoires avant de passer à cette étude sur des êtres vivant, l’utilisation de modèles animaux reste indispensable pour développer ce mode d’administration sur un organisme entier avec un système vasculaire. En effet, compte tenu de la complexité du rein, tant structurelle que fonctionnelle, les paramètres issus de processus complexes qui doivent être contrôlés lors de la perfusion rénale ne peuvent pas être simulés par des modèles cellulaires ou d’organes isolés. D’autre part, l’étude de la transduction du rein par le vecteur de thérapie génique en comparaison avec la transduction d’autres organes non-ciblés permettant d’évaluer l’efficacité et la sécurité du futur produit thérapeutique ne peut être réalisée que sur un organisme entier, et donc sur animal vivant.

Réduction

Pour la 1ère étape du projet, le nombre d’animaux a été réduit au minimum sachant que le but est de valider le transfert d’une méthode chirurgicale d’une animalerie à une autre (formation des chirurgiens, validation de l’équipement utilisé et du suivi à spécifiquement mettre en place). Pour la 2ème étape du projet, le vecteur de thérapie génique testé dans ce projet a été validé au préalable, pour sa capacité à infecter des cellules rénales, dans des organoïdes rénaux et des cultures cellulaires. Par cette approche, nous avons réduit le nombre d'animaux à évaluer en perfusion rénale avec le vecteur de thérapie génique à 5 au maximum + maximum 2 animaux contrôles en perfusion rénale avec sérum physiologique + 3 animaux contrôles injectés par voie artérielle (systémique). Ce nombre a été déterminé en accord avec notre expérience antérieure, qui a montré qu'il était suffisant pour obtenir des résultats d'analyse fiables et interprétables, ainsi qu'une évaluation de la variabilité inter-animaux. Les reins étant très vascularisés, toute intervention chirurgicale, même peu invasive, reste délicate et entraine un risque accru pour l’animal. Il en résulte la possibilité d’une interruption prématurée de l’expérience et le risque de ne pas avoir assez d’animaux soumis à une perfusion rénale complète. Ainsi, nous avons compté 2 animaux « de subtitution » pour la partie perfusion rénale avec le vecteur de thérapie génique et 1 animal « de subtitution » pour la perfusion rénale avec sérum physiologique. En l’absence de nécessité, ces animaux « de subtitution » seront épargnés. Les résultats obtenus dans les différents groupes expérimentaux (notamment perfusion rénale avec le vecteur de thérapie génique versus voie artérielle avec le vecteur de thérapie génique) seront comparés à l’aide d’un test statistique non paramétrique.

Raffinement

La chirurgie sera réalisée par un vétérinaire assisté d’un chirurgien vasculaire, et l'anesthésie sera supervisée par un vétérinaire également. Toutes les interventions chirurgicales sur les animaux seront effectuées sous anesthésie générale, accompagnée d'une anesthésie locale renforcée si nécessaire, ainsi que de compléments analgésiques appropriés et d'un soutien hémodynamique tout au long de l'intervention, afin de minimiser la contrainte sur les animaux. Un soutien thermique (couverture chauffante) sera assuré durant toute la durée de l'anesthésie, et les fonctions vitales seront surveillées. La surveillance des paramètres métaboliques et biochimiques sera mise en place selon les besoins. Des critères d'arrêt seront appliqués pour permettre une intervention immédiate dès les premiers signes de souffrance ou de défaillance physiologique, afin d'administrer des traitements antalgiques et/ou de soutien hémodynamique appropriés, ou de décider de l'euthanasie si nécessaire. Les conditions d'hébergement sont conformes à la réglementation et les animaux disposent de nourriture et d'eau ad libitum. Pour leur bien-être, les animaux sont hébergés à deux par box dans un milieu enrichi comprenant des enrichissements alimentaires, physiques, sonores et visuels variés (box équipés de planche anti-démangeaisons, mise à disposition d’objets d’enrichissement en matériaux flexibles, destructibles et aisément manipulables (e.g. balles à secouer et faire rouler, Kong dental…)) et l’enrichissement sera renforcé quand un animal est hébergé seul.

Choix des espèces

Le porc est un modèle animal répandu dans la recherche médicale de par certaines caractéristiques physiologiques, anatomiques et génétiques proches de celles de l’être humain. C’est notamment le cas de ses fonctions cardiaques, pulmonaires et rénales. Le choix du porc est donc optimal pour le développement d'une méthode de perfusion rénale, qui est transférable à l'homme du fait de son anatomie, de sa taille et de la possibilité d’utiliser un matériel identique à celui utilisé chez l’homme et donc permettant de favoriser rapidement son utilisation thérapeutique potentielle chez le patient. Des animaux d’environ 4-5 mois d’âge (pesant 70 à 100 kg) seront choisis. Bien que leur poids élevé rende leur manipulation plus complexe par rapport à d'autres modèles porcins, nous avons opté pour des animaux dont la taille des reins et des vaisseaux, entre autres, présentent une taille comparable à celle des patients humains. Cette sélection vise à optimiser la transposition des techniques chirurgicales.

Comprendre pourquoi les maladies cardiovasculaires frappent davantage les femmes âgées passe ici par l'ablation des ovaires de souris et le prélèvement de leur cœur. 1 900 souris sont concernées par ce premier volet, 700 opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 1 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La chirurgie dure quinze minutes, s'y ajoutent deux prélèvements sanguins et une privation de nourriture, et le porteur reconnaît des risques d'hémorragie, d'adhérences internes, de sutures arrachées et de perte de poids supérieure à 10 %. Cette privation dure quinze heures trente, sans que le RNT explique pourquoi cette durée chez un animal nocturne, alors qu'il en attend une perte de poids rapide, de l'hyperactivité, des comportements d'auto-mutilation et un isolement social.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de décès en Europe, avec 4 millions de morts par an. Elles représentent plus de 50 % des cas et touche davantage les femmes âgées. Ces maladies sont associées à des facteurs comme l’obésité et le diabète de type 2, mais leur diagnostic reste complexe et aucun traitement spécifique n’existe. Cela est dû au manque de connaissances sur les mécanismes de relaxation du cœur. Des laboratoire de recherche ont récemment découvert une nouvelle phase de maturation du cœur après la naissance, caractérisée par l’apparition de structures appelées « crêtes » à la surface des cellules cardiaques. Ces crêtes hébergent des mitochondries spécifiques appelées mitochondries subsarcolemmales (SSM), qui jouent un rôle clé dans la fonction cardiaque. Nous avons, ainsi, développé une méthode spécifique de prélèvement du cœur chez la souris permettant de préserver ces crêtes et leurs mitochondries SSM. Grâce à cela, nous avons identifié les marqueurs moléculaires de la relaxation cardiaque et montré l’influence des œstrogènes et du métabolisme foie sur ces structures. De plus, nos travaux récents indiquent que le rythme circadien (cycle jour/nuit) pourrait également être impliquer dans la régulation de ces structures cardiaque. L’objectif de ce projet est d’explorer plus en détail l’impact des hormones sexuelles, du métabolisme foie et du rythme circadien sur ces crêtes/SSM et sur la fonction cardiaque, en utilisant différents modèles de souris. Nous étudierons aussi les différences entre mâles et femelles pour mieux comprendre pourquoi les MCV touche davantage les femmes âgées. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

L’étude des oestrogènes et du métabolisme du foie en respectant le rythme circadien permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires régulant la fonction cardiaque physiologique. Ceci apportera des informations indispensables pour mieux comprendre l’apparition des MCV en physiopathologie, et pour, à termes, permettre un diagnostic plus précoce et une meilleure prise en charge (médecine personnalisée homme/femme, moment de la journée le plus propice pour détecter les anomalies diastoliques) de ces patients.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur : chirurgie de 15min - 2 prélèvements sanguins de 10 sec - 1 mise à jeun de 15h30 - mise à mort terminale. Dans le second établissement utilisateur : la mise à mort terminale.

Impact sur les animaux

Pour l’ovariectomie : comme toutes chirurgies, les risques attendus sont majoritairement des complications postopératoires comme des infections, hémorragie, des adhérences internes et des problèmes de cicatrisation (fils cassés). De plus, même si la prise en charge de la douleur est totale lors de cette procédure, l’animal peut ressentir une gêne temporaire lors du réveil dont les signes sont : poils hérissés, isolement des congénères, perte de poids supérieure à 10%. Enfin, des fils de suture peuvent être arrachés les jours suivant l’opération. Un suivi attentif sera réalisé pour limiter ces risques et intervenir rapidement en cas de complication. Concernant la mise à jeun : Le jeun prolongé peut entraîner une perte poids rapide, une augmentation du stress et de la nervosité chez les animaux. Les signes de stress liés à la mise à jeun peuvent inclure une hyperactivité, des comportements d’auto-mutilation ou un isolement social accru. Un suivi strict sera effectué pour minimiser ces effets et garantir que les animaux ne subissent pas de déshydratation excessive ou de détresse importante.

Devenir

Le but à la fin de chaque procédure est d’étudier l’architecture cardiaque au niveau cellulaire et moléculaire. Par conséquent, tous les animaux seront donc euthanasiés à la suite du prélèvement cardiaque.

Remplacement

A ce jour, Il n’existe pas d'autres techniques pour étudier la fonction diastolique et sa dysfonction dans l’ICFEP chez la souris. En particulier, la régulation de la fonction diastolique par les œstrogènes et le métabolisme hépatique ne peuvent être investigués que dans un modèle animal vivant, car ces mécanismes nécessitent l’étude de l’organe en fonctionnement. Les modifications structurales et fonctionnelles causées par l’ICFEP ainsi que l’impact des facteurs environnementaux ne peuvent pas être étudiés que par le prélèvement du coeur permettant un accès direct au tissu cardiaque et à l’architecture en crêtes/SSM des cardiomyocytes mais également à son fonctionnement. En effet, grâce à des techniques d’imagerie confocale et des techniques biochimiques (western blot) sur biopsies cardiaques fraiches, nous pouvons obtenir des informations détaillées sur l’expression et la localisation spatiale de déterminants moléculaires clés des crêtes/SSM et de la fonction diastolique, tels que Ephrin-B1 et Claudine-5. Ces approches permettent une analyse quantitative en profondeur des structures et de leur régulation. De plus, grâce à ces approches d’imagerie spatiale dans le tissu cardiaque, nous pouvons suivre l’expression d'enzymes métaboliques spécifiques des SSM (CPT1b, BDH1, Hexokinase…). Enfin l’utilisation de la microscopie électronique à transmission combinée à la microscopie confocale à fluorescente sur le tissu cardiaque permet de visualiser directement l’architecture des cardiomyocytes à l’échelle cellulaire et au niveau ultrastructural. Ces analyses offrent un aperçu détaillé des processus biologiques à l'échelle tissulaire.

Réduction

L’équipe a mis au point une méthode innovante de prélèvement de biopsies cardiaques qui peuvent être analysées par plusieurs méthodes complémentaires pour étudier les crêtes/SSM. Cette approche permet d’optimiser l'utilisation des animaux, en obtenant plusieurs résultats à partir d’un seul individu. De plus, nos études antérieures ont montré que l’utilisation de 50 souris par groupe constitue le minimum nécessaire pour effectuer une analyse statistique robuste et une évaluation complète de l'architecture et du fonctionnement cardiaque en fonction des différents facteurs externes étudiés. Ce nombre permet de garantir la puissance statistique des résultats, tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Bien-être et suivi des animaux : Pour limiter le stress des souris et assurer leur bien-être, plusieurs mesures sont mises en place. Elles ont un accès permanent à la nourriture et à l’eau, évitant toute déshydratation. Leur environnement est enrichi avec du papier, du carton et des tunnels, favorisant la construction de nids, l’activité physique et les interactions sociales. Un suivi rigoureux est assuré via une grille d’évaluation élaborée avec les soignants, permettant de détecter rapidement tout signe de stress ou d’inconfort et d’adapter les conditions si nécessaire. Intervention chirurgicale (ovariectomie) : Comme toute opération, l’ovariectomie comporte des risques (infection, saignement, cicatrisation difficile). Bien que la douleur soit prise en charge, un inconfort temporaire peut survenir après le réveil. Un suivi quotidien est prévu pendant une semaine afin de s’assurer de la bonne récupération des animaux. En cas de signes de douleur ou de stress (poils hérissés, isolement, perte de poids), un traitement antidouleur sera administré en concertation avec le vétérinaire. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas, il sera retiré de l’étude. En cas de rupture des points de suture, une nouvelle anesthésie sera réalisée pour leur remplacement sous surveillance stricte afin de limiter tout inconfort supplémentaire. Mise à jeun : Le jeûne peut provoquer une perte de poids rapide et un stress accru. Pour améliorer la tolérance à cette privation, les animaux seront surveillés et leur environnement enrichi (ajout de nids pour encourager le regroupement et réduire le stress social). De plus, comme les souris sont nocturnes, le jeûne commencera en fin de journée, période où leur métabolisme est plus lent et leurs besoins énergétiques moindres, réduisant ainsi l’impact de la privation alimentaire. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Nous utilisons des souris car nous avons pu générer grâce à cette espèce de nombreux modèles transgéniques présentant une délétion dans un organe spécifique de protéine d’intérêt pour étudier la régulation de la fonction cardiaque à l’âge adulte chez le mâle et la femelle. Les animaux (les mâles et les femelles) sont tous utilisés au stade postnatal 60 jours (jeune adulte) quand le cœur a fini définitivement sa maturation ou au stade postnatal 20 jours quand le cœur va engager sa dernière phase de maturation cardiaque.

Tuées pour que leur cœur soit prélevé frais, seule façon selon le porteur de préserver les structures de surface qu'il étudie, 1 900 souris vont être utilisées dans ce volet du projet. 700 sont opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, les 1 200 autres subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie des femelles est ovariectomisée en quinze minutes, toutes passent par deux prélèvements sanguins et une privation de nourriture de quinze heures trente, avant la mise à mort dans le second établissement utilisateur. Le porteur annonce des informations "indispensables" pour un diagnostic plus précoce des maladies cardiovasculaires, quand le projet mesure d'abord l'effet des œstrogènes, du foie et du rythme jour/nuit sur l'architecture des cellules cardiaques.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de décès en Europe, avec 4 millions de morts par an. Elles représentent plus de 50 % des cas et touche davantage les femmes âgées. Ces maladies sont associées à des facteurs comme l’obésité et le diabète de type 2, mais leur diagnostic reste complexe et aucun traitement spécifique n’existe. Cela est dû au manque de connaissances sur les mécanismes de relaxation du cœur. Des laboratoires de recherche ont récemment découvert une nouvelle phase de maturation du cœur après la naissance, caractérisée par l’apparition de structures appelées « crêtes » à la surface des cellules cardiaques. Ces crêtes hébergent des mitochondries spécifiques appelées mitochondries subsarcolemmales (SSM), qui jouent un rôle clé dans la fonction cardiaque. Nous avons, ainsi, développé une méthode spécifique de prélèvement du cœur chez la souris permettant de préserver ces crêtes et leurs mitochondries SSM. Grâce à cela, nous avons identifié les marqueurs moléculaires de la relaxation cardiaque et montré l’influence des œstrogènes et du métabolisme foie sur ces structures. De plus, nos travaux récents indiquent que le rythme circadien (cycle jour/nuit) pourrait également être impliquer dans la régulation de ces structures cardiaque. L’objectif de ce projet est d’explorer plus en détail l’impact des hormones sexuelles, du métabolisme foie et du rythme circadien sur ces crêtes/SSM et sur la fonction cardiaque, en utilisant différents modèles de souris. Nous étudierons aussi les différences entre mâles et femelles pour mieux comprendre pourquoi les MCV touche davantage les femmes âgées. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

L’étude des oestrogènes et du métabolisme du foie en respectant le rythme circadien permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires régulant la fonction cardiaque physiologique. Ceci apportera des informations indispensables pour mieux comprendre l’apparition des MCV en physiopathologie, et pour, à termes, permettre un diagnostic plus précoce et une meilleure prise en charge (médecine personnalisée homme/femme, moment de la journée le plus propice pour détecter les anomalies diastoliques) de ces patients.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur : chirurgie de 15min - 2 prélèvements sanguins de 10 sec - 1 mise à jeun de 15h30 - mise à mort terminale. Dans le second établissement utilisateur : la mise à mort terminale.

Impact sur les animaux

Pour l’ovariectomie : comme toutes chirurgies, les risques attendus sont majoritairement des complications postopératoires comme des infections, hémorragie, des adhérences internes et des problèmes de cicatrisation (fils cassés). De plus, même si la prise en charge de la douleur est totale lors de cette procédure, l’animal peut ressentir une gêne temporaire lors du réveil dont les signes sont : poils hérissés, isolement des congénères, perte de poids supérieure à 10%. Enfin, des fils de suture peuvent être arrachés les jours suivant l’opération. Un suivi attentif sera réalisé pour limiter ces risques et intervenir rapidement en cas de complication. Concernant la mise à jeun : Le jeun prolongé peut entraîner une perte poids rapide, une augmentation du stress et de la nervosité chez les animaux. Les signes de stress liés à la mise à jeun peuvent inclure une hyperactivité, des comportements d’auto-mutilation ou un isolement social accru. Un suivi strict sera effectué pour minimiser ces effets et garantir que les animaux ne subissent pas de déshydratation excessive ou de détresse importante.

Devenir

Le but à la fin de chaque procédure est d’étudier l’architecture cardiaque au niveau cellulaire et moléculaire. Par conséquent, tous les animaux seront donc euthanasiés à la suite du prélèvement cardiaque

Remplacement

À ce jour, il n’existe pas d’autre méthode permettant d’étudier le fonctionnement du cœur et ses dysfonctionnements dans les maladies cardiovasculaires chez la souris. En particulier, le rôle des œstrogènes et du métabolisme du foie dans la régulation du cœur ne peut être exploré que dans un organisme vivant, car ces mécanismes nécessitent d’observer le cœur en pleine activité. L’évolution des maladies cardiovasculaires et l’impact des facteurs extérieurs ne peuvent être étudiés qu’en prélevant le cœur. Cela nous permet d’accéder directement aux tissus cardiaques et à leurs structures spécifiques (crêtes/SSM), tout en analysant leur fonctionnement. Grâce à des techniques d’imagerie et d’analyse biochimique sur des échantillons frais, nous pouvons examiner en détail les éléments moléculaires essentiels au bon fonctionnement du cœur. Ces approches permettent aussi d’observer et de mesurer avec précision la structure et la régulation du tissu cardiaque. En combinant différentes méthodes d’imagerie, nous pouvons non seulement suivre l’expression d’enzymes spécifiques aux mitochondries des crêtes/SSM, mais aussi visualiser directement l’organisation des cellules du cœur. Ces analyses apportent ainsi une compréhension approfondie des processus biologiques en jeu à l’échelle du tissu cardiaque.

Réduction

L’équipe a mis au point une méthode innovante de prélèvement de biopsies cardiaques qui peuvent être analysées par plusieurs méthodes complémentaires pour étudier les crêtes/SSM. Cette approche permet d’optimiser l'utilisation des animaux, en obtenant plusieurs résultats à partir d’un seul individu. De plus, nos études antérieures ont montré que l’utilisation de 50 souris par groupe constitue le minimum nécessaire pour effectuer une analyse statistique robuste et une évaluation complète de l'architecture et du fonctionnement cardiaque en fonction des différents facteurs externes étudiés. Ce nombre permet de garantir la puissance statistique des résultats, tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Bien-être et suivi des animaux : Pour limiter le stress des souris et assurer leur bien-être, plusieurs mesures sont mises en place. Elles ont un accès permanent à la nourriture et à l’eau, évitant toute déshydratation. Leur environnement est enrichi avec du papier, du carton et des tunnels, favorisant la construction de nids, l’activité physique et les interactions sociales. Un suivi rigoureux est assuré via une grille d’évaluation élaborée avec les soignants, permettant de détecter rapidement tout signe de stress ou d’inconfort et d’adapter les conditions si nécessaire. Intervention chirurgicale (ovariectomie) : Comme toute opération, l’ovariectomie comporte des risques (infection, saignement, cicatrisation difficile). Bien que la douleur soit prise en charge, un inconfort temporaire peut survenir après le réveil. Un suivi quotidien est prévu pendant une semaine afin de s’assurer de la bonne récupération des animaux. En cas de signes de douleur ou de stress (poils hérissés, isolement, perte de poids), un traitement antidouleur sera administré en concertation avec le vétérinaire. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas, il sera retiré de l’étude. En cas de rupture des points de suture, une nouvelle anesthésie sera réalisée pour leur remplacement sous surveillance stricte afin de limiter tout inconfort supplémentaire. Mise à jeun : Le jeûne peut provoquer une perte de poids rapide et un stress accru. Pour améliorer la tolérance à cette privation, les animaux seront surveillés et leur environnement enrichi (ajout de nids pour encourager le regroupement et réduire le stress social). De plus, comme les souris sont nocturnes, le jeûne commencera en fin de journée, période où leur métabolisme est plus lent et leurs besoins énergétiques moindres, réduisant ainsi l’impact de la privation alimentaire. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Nous utilisons des souris car nous avons pu générer grâce à cette espèce de nombreux modèles transgéniques présentant une délétion dans un organe spécifique de protéine d’intérêt pour étudier la régulation de la fonction cardiaque à l’âge adulte chez le mâle et la femelle. Les animaux (les mâles et les femelles) sont tous utilisés au stade postnatal 60 jours (jeune adulte) quand le coeur a fini définitivement sa maturation ou au stade postnatal 20 jours quand le coeur va engager sa dernière phase de maturation cardiaque.

Ôter un rein, une thyroïde ou un autre organe pour fabriquer un animal malade, puis l'expédier au laboratoire qui l'a commandé : 4 000 souris et 2 500 rats vont être utilisés dans ce catalogue de modèles chirurgicaux. 200 d'entre eux seront opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, les 6 300 autres subiront une opération de dix minutes à une heure suivie d'un réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec jusqu'à six injections par jour et un isolement en cage pouvant durer douze jours. Une partie des animaux sert à former et à requalifier les chirurgiens, de trois à vingt-cinq individus par technicien pour une acquisition, jusqu'à dix pour un maintien de compétence. Les autres sont, selon les mots du porteur, "à la demande, expédiés chez les scientifiques", donc versés à des projets dont le RNT ne dit rien.

Objectifs

L’objectif du projet est d’opérer des animaux afin de leur enlever un organe. Cela permet de mimer des maladies humaines ou animales (par exemple, enlever le rein et mimer une défaillance du rein, enlever la thyroïde et mimer une absence de thyroïde,...) afin de pouvoir mieux comprendre comment elles évoluent. Ces modèles animaux opérés sont aussi très importants pour tester l’efficacité de nouveaux médicaments.

Bénéfices attendus

Des modèles de maladies sont créés chez le rat ou la souris pour aider la recherche à mieux comprendre certaines pathologies humaines et à tester de nouveaux médicaments. Ces modèles permettent d’observer comment un traitement agit dans le corps et d’étudier le rôle des organes ciblés. Les chirurgiens qui réalisent ces modèles suivent des protocoles précis et doivent être bien formés, afin de garantir des résultats fiables, de limiter la souffrance animale et de proposer des modèles standards, prêts à l’emploi pour les chercheurs.

Procédures

Tous les animaux analgésiés, anesthésiés et non réveillés ou analgésiés, anesthésiés puis réveillés, dans le cadre de ce projet, seront soumis à une procédure chirurgicale unique d’une durée de dix minutes à une heure, sous anesthésie générale. Selon le modèle et en cas de besoin (besoin scientifique, douleur, récupération post opératoire difficile), les animaux pourront être soumis à des injections (maximum 6 injections par jour, comprenant les injections suite à la mise en place du protocole d’analgésie et de raffinements). Selon les besoins des scientifiques, un prélèvement sanguin maximum (durée de l’acte de maximum une minute) est possible. Un hébergement isolé peut être nécessaire pour les besoins du projet pour une durée maximale de 12 jours.

Impact sur les animaux

Douleur, stress et perte de poids dus aux contentions, aux procédures chirurgicales et à la récupération post-opératoire (48-72h). Hébergement individuel sur une partie ou sur toute la durée de la procédure si l'intégrité du modèle le nécessite.

Devenir

Les animaux sont à la demande, expédiés chez les scientifiques ou sont mis à mort dans le cas d’atteinte d’un point limite, acquisition ou maintien des compétences ou pour contrôle qualité du modèle.

Remplacement

Les modèles chirurgicaux créés dans le cadre de ce projet permettent de mimer des maladies humains ou animales par l’absence d’un organe dans leurs corps. Cela permet de comprendre les liens qu’il y a entre cet organe et le reste de l’organisme. Cela permet également de comprendre comment de nouveaux médicaments peuvent aider à soigner cette maladie. Ces interactions ne sont pas des phénomènes isolés et par conséquent ne peuvent pas être étudiées in vitro sur un seul type de cellule. Pour l’acquisition et le maintien des compétences techniques, avant tout entraînement sur un modèle animal, une formation théorique basée sur l’utilisation de supports papiers et vidéos est effectuée. Lorsque cela est possible, l’entrainement pour certains gestes techniques pourront être réalisés sur des supports inertes (mannequin de formation). Pour les différents modèles, la validation du chirurgien sera évaluée sur la technique dans un temps imparti, sur la viabilité et la fonctionnalité du modèle dans le temps : cette partie ne peut être réalisé in vitro.

Réduction

Basé sur les expériences précédentes, le nombre d’animaux a été calculé le plus juste possible en fonction des chirurgies et permettant d’atteindre les objectifs scientifiques. Le nombre d’animaux surnuméraires opérés est suivi, calculé et ajusté à la baisse autant que possible en fonction des lots précédents. Pour l’acquisition et le maintien des compétences, le nombre d’animaux défini dans notre procédure est basé sur la criticité et la technicité du modèle (faible / moyen / forte) ainsi que les expériences précédentes. Ce nombre est composé d’un minimum (3 pour l’acquisition, 1 pour le maintien) et d’un maximum (de 25 pour l’acquisition, 10 pour le maintien) afin de pouvoir qualifier le chirurgien lorsque la technique est maîtrisée, dès lors que le nombre minimum est atteint. Cela nous permet également d’avoir un nombre maximum au-delà duquel le technicien n’est pas considéré comme formé. L’acquisition ou le maintien des compétences s’arrête dès lors qu’un taux de réussite de 100% est atteint pour un lot de 3 ou 1 animaux respectivement, même si le nombre maximum d’animaux n’a pas été effectué. Lors d’une acquisition ou maintien des compétences sur cadavre ou sur animal analgésié, anesthésié et non réveillé, nous pouvons utiliser un animal pour l’entraînement de plusieurs gestes techniques de plusieurs modèles, ce qui contribue à réduire le nombre d’animaux utilisés. Ces animaux peuvent être les surnuméraires non opérés de commandes ou surplus de stock, ce qui contribue aussi à la réduction. Pour l’acquisition des compétences des modèles, les premiers entrainements se feront sur cadavre puis sur animal analgésié, anesthésié et non réveillé. Dès lors que les gestes sont maîtrisés, la chirurgie est réalisée sur animal analgésié, anesthésié et réveillé. Pour le maintien des compétences, l’utilisation d’animaux supplémentaire n’est pas systématique. Les différents modèles ont été classé selon leur difficulté et leur criticité. Pour ceux dont la difficulté et la criticité est considéré comme faible, le maintien des compétences se fera sur animaux de lots demandés par les scientifiques, sous supervision du formateur et/ou du responsable du service, avec au préalable, une relecture de la procédure et/ou le visionnage d’une vidéo de la technique.

Raffinement

Les animaux utilisés seront hébergés dans un environnement adapté à l’espèce, au nombre et à l’âge, et dans un milieu enrichi et les interactions se font selon les bonnes pratiques de manipulation. Des points limites spécifiques au modèle seront appliqués. Toutes les interventions sont réalisées sur animaux anesthésiés, qui sont préalablement préparés de manière aseptique. Les chirurgies sont réalisées selon des procédures standardisées et adaptées aux spécificités de souche, sexe, âge et poids. Après évaluation de la douleur possible induite par le modèle (paliers de douleur définis pour chaque modèle en collaboration avec l’équipe vétérinaire et la SBEA), le contrôle de la douleur est réalisé par une administration d’analgésique avant la chirurgie et lors du post-opératoire ainsi qu’en cas de besoin (signes de douleur individuelle, d’inconfort ou absence de fèces). L’utilisation complémentaire d’anesthésique local (Lidocaine 2%, 1 ml/kg, dilution par 4, posologie de 16.22 mg/kg) peut être réalisée selon le palier de douleur de la chirurgie (procédure interne de classification validée par l’équipe vétérinaire et la SBEA). Une injection systématique sous-cutanée de sérum physiologique de réhydratation est pratiquée pour tous les animaux avant réveil. Une observation quotidienne de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Des soins spécifiques sont apportés en cas de signes cliniques (traitements médicamenteux, soins locaux, ajout d’enrichissement, mesures de réhydratation ou de réchauffement, ajout d’aliment, de gel hydratant, de litière ou d’eau complémentée ou non directement dans la cage afin d’en améliorer l’accès). En cas de détection d’un point limite terminal, l’animal est immédiatement mis à mort. Des points limites spécifiques sont établis et raffinés au fur et à mesure des observations. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score et document qualité d’enregistrement permettant une traçabilité.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce et de la souche est très généralement effectué par le scientifique mais l’équipe de chirurgie se réserve le droit de proposer des changements de modèles sur la base de son expérience (si le taux de succès ou de survie est très bas par exemple sur le choix fait par le scientifique). Le rat et la souris sont des animaux couramment utilisés dans ce type de projet. Ce sont des mammifères dont l’anatomie et la physiologie sont proches de l’homme, la disponibilité de données historiques chez ces espèces permet d’obtenir des informations fiables et pertinentes. Sont concernés les animaux sevrés à partir de 3 semaines, dont la taille et le poids sont compatibles avec le modèle d’intérêt, selon les recommandations éthiques en vigueur.