Procédures sans réveil

Mises sous régime gras et sucré pendant seize semaines, puis privées de nourriture avant deux épreuves métaboliques de deux heures et deux heures trente, 856 souris subissent onze prélèvements de sang en deux journées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 420 d'entre elles et sans réveil pour les 436 autres. Le régime doit produire chez elles une insulinorésistance, un diabète et une obésité, avec des troubles cardiaques allant de l'arythmie à l'insuffisance. Sur la fin, une partie des animaux subit une chirurgie de dix minutes menée sous anesthésie, sans réveil. Toutes sont tuées pour prélever le foie entier et en isoler les cellules.

Objectifs

Les maladies du foie associées à un dysfonctionnement métabolique (appelées MASLD) forment un ensemble de pathologies qui commencent généralement par une stéatose hépatique (aussi appelée "foie gras") et peuvent évoluer vers des formes plus graves, comme la fibrose puis la cirrhose. Ces maladies sont aussi fortement liées à un risque accru de maladies cardiovasculaires et de cancers du foie, ce qui en fait un enjeu majeur de santé publique. Le premier stade des MASLD, la stéatose, est caractérisé par une accumulation excessive de graisses dans les hépatocytes, les cellules principales du foie. Cette accumulation est souvent liée à des troubles métaboliques comme le diabète, l’obésité ou le syndrome métabolique. Elle entraîne du stress à l’intérieur des cellules, une inflammation et une activation du processus de fibrose à l’échelle du foie ce qui fait évoluer la stéatose vers une forme plus sévère : la stéato-hépatite (MASH), deuxième étape des MASLD. L’objectif global de notre projet est d’utiliser des modèles murins pour comprendre comment les différentes cellules du foie réagissent à ces perturbations métaboliques. Nous cherchons à identifier les mécanismes qui peuvent : favoriser l’aggravation de la stéatose, ou au contraire, permettre au foie de se réparer et de retrouver un fonctionnement normal. Ce projet s’intéresse en particulier aux cellules stellaires du foie, qui jouent un rôle central dans le développement de la fibrose, une forme de cicatrisation anormale et durable du tissu hépatique. Nous cherchons à comprendre comment ces cellules réagissent au stress métabolique, en observant notamment les interactions de leurs organelles internes (les structures spécialisées à l’intérieur des cellules).

Bénéfices attendus

Les maladies du foie associées à un dysfonctionnement métabolique (MASLD) sont en pleine expansion car elles sont très associées au développement de l’obésité et du diabète de type 2. Elles affectent environ plus d'un tiers de la population mondiale et 80 pourcents de la population obèse. Ce projet va nous permettre d’étudier les modulations de contacts entre les organelles (petites structures dans les cellules) au sein de certaines cellules du foie (les cellules stellaires hépatiques: HSC) lors de la progression et la réversion de la MASLD et de déterminer si ces contacts jouent un rôle dans l’activation de ces HSC à l’origine de la composante fibrotique de ces maladies. Par ailleurs, ce projet en collaboration avec d’autres équipes vise également à déterminer si, au cours des MASLD, les cellules sanguines de nos modèles animaux ainsi que celles de patients (étude clinique réalisée dans un autre centre) présentent les mêmes caractéristiques de modulation des contacts entre organelles que les cellules du foie. La conjonction de ces études permettra potentiellement d’identifier un biomarqueur non invasif de la gravité et des changements longitudinaux dans la maladie du foie et de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Mise en place d'un régime alimentaire spécial afin de mimer les maladies étudiées pour une partie des animaux (animal vigile, pendant 16 semaines maximum en continu), certains animaux suivront des challenges métaboliques : un test de tolérance au glucose (animal vigile,1 fois, 2h30) puis un test de tolérance à l'insuline une semaine après (animal vigile, 1 fois, 2 heures). Ces tests nécessiteront des injections (animal vigile, 2 fois avec une semaine d'intervalle, quelques secondes) et des prélèvements sanguins répétés de faible volume de l'ordre d'une goutte (animal vigile, 11 prélèvements au total : 6 sur une journée, 5 sur une autre après une semaine de récupération, l'acte dure quelques secondes). Un prélèvement sanguin sera également nécessaire au cours du projet sur animal vigile (1 fois, 1 minute) puis pour certains animaux à la fin du projet sur animal anesthésié (1 fois, 1 minute). En fin de procédure l'autre partie des animaux aura une chirurgie sans réveil (animal anesthésié et analgésié, 1 fois, 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables notoires seront 1) les conséquences de la maladie hépatique engendrée par des régimes alimentaires spéciaux (insulinorésistance, diabète, obésité) et les conséquences sur le coeur (arythmie, insuffisance cardiaque) 2) les conséquences physiques engendrées par des régimes alimentaires spéciaux (prise de poids ou perte de poids) 3) le stress et la douleur légère liés à la piqûre pour les prélèvements sanguins 4) un léger stress et une douleur légère et de courte durée lors des injections pour les tests métaboliques 5) la sensation de faim pendant les mises à jeun précédent les tests métaboliques 6) dans de rares cas, une détresse cardiorespiratoire à l’anesthésie.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés en fin de procédure afin de permettre le prélèvement du foie total et d'isoler les cellules hépatiques. Ces prélèvements permettront de réaliser des analyses poussées (microscopie, fonctionnement de la cellule ou encore différenciation cellulaire) nécessaires au projet.

Remplacement

Avant de commencer l’étude proposée ici, nous avons mené des expériences sur des lignées de cellules stellaires hépatiques (HSC) de souris et d’humains cultivées en laboratoire. Ces travaux nous ont permis d’identifier les traitements capables d’activer les cellules stellaires hépatiques en général. Cependant, les lignées cellulaires utilisées en culture ne reflètent pas entièrement le comportement réel des cellules dans l’organisme. Elles présentent déjà un état partiellement activé, ce qui limite leur intérêt pour comparer précisément un foie sain à un foie malade. Il est donc essentiel de pouvoir isoler et étudier les HSC primaires et de moduler leur état d'activation en culture. Par ailleurs, les maladies du foie associées à un dysfonctionnement métabolique (appelées MASLD) sont des pathologies complexes, qui ne touchent pas seulement le foie mais aussi d’autres organes comme le tissu adipeux. Elles impliquent aussi de nombreuses interactions entre différents types de cellules présentes dans le foie. L'étude à l'échelle de l'organisme est donc essentielle et notre modèle permet également de prendre en compte l’impact d’un régime alimentaire spécifique ainsi que l’effet d’une amélioration de l’alimentation sur l’évolution de la maladie. Nos partenaires travaillent actuellement sur un modèle d’organoïde de foie (un mini-foie en 3D) qui inclut plusieurs types de cellules du foie, mais ce modèle n’est pas encore totalement fonctionnel. C’est pourquoi, pour comprendre de manière globale et précise les mécanismes de ces maladies et tester notre hypothèse dans un environnement complet, l’utilisation du modèle murin reste indispensable.

Réduction

Dans le cadre de ce projet, le nombre total d’animaux a été estimé avec rigueur afin de garantir la robustesse scientifique des résultats tout en respectant pleinement le principe des 3R, notamment celui de la Réduction. 856 animaux seront utilisés. 100 animaux seront utilisés dans le cadre d’une étude pilote, essentielle pour valider les conditions expérimentales et ajuster les protocoles. Cette étape permettra ainsi d’optimiser les procédures et d’éviter une utilisation excessive d’animaux dans les procédures suivantes. 336 animaux seront utilisés pour l’isolement de cellules hépatiques, en particulier les hépatocytes. Les cellules isolées feront l’objet d’analyses approfondies incluant la microscopie, l’évaluation de l’activité énergétique cellulaire et l’étude de leur potentiel de différenciation. Les protocoles sont conçus pour maximiser les données obtenues à partir de chaque animal, en utilisant plusieurs approches complémentaires sur les mêmes prélèvements. Enfin, 420 animaux seront utilisés dans un contexte pathologique. Les hépatocytes issus de ces modèles seront ensuite analysés selon les mêmes axes méthodologiques. L’ensemble de ces estimations a été établi en cohérence avec les résultats attendus, les standards de la littérature et la faisabilité technique des analyses. Des regroupements d’analyses et des optimisations de protocoles seront systématiquement recherchés pour limiter le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la validité statistique des résultats. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs ventiles avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum) et l'hébergement individuel est évité au maximum. Les animaux sont acclimatés à l’animalerie pendant une semaine si ils proviennent d'un fournisseur et sont habitués à être manipulés. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Un bâton à ronger est systématiquement mis en place pour les animaux sous régime alimentaire spécifique mou. Ce régime est renouvelé régulièrement pour éviter son oxydation et le changement de cage sera augmenté si l'aliment s'effrite trop afin de réduire l'inconfort des animaux. Les prélèvements sanguins seront réalisés par des personnes compétentes et formées. Pour les plus grands volumes, les prélèvements seront réalisés sous anesthésie. Lors des challenges métaboliques, les animaux seront étroitement surveillés et les animaux bénéficieront toujours d'un temps de récupération adapté. La perfusion hépatique sera réalisée sous anesthésie et analgésie. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

Le choix de la souris est lié à plusieurs considérations : 1) le mécanisme de communication dans les cellules sont conservés chez la souris et l'Homme ; 2) les effets des régimes alimentaires sont parfaitement caractérisés chez la souris ; 3) la souris permet des modifications génétiques permettant dans ce projet d'identifier par fluorescence spécifiquement les cellules du foie étudiées. Les modèles murins proposés présentent plusieurs avantages notamment la possibilité d’étudier le fonctionnement du foie dans un contexte physiologique où il communique avec tous les organes ainsi que d’étudier la réponse du foie et de l’organisme aux pathologies. Dans le cadre du projet, les animaux entreront en procédure à partir de 8 semaines de vie, âge qui permet d'atteindre un stade de développement, y compris neuronal, complet, qui ne risque pas d'être impacté par la mise sous régimes spéciaux et qui permet également d'atteindre la maturité sexuelles des animaux avec la stabilisation des régulations hormonales. De plus, ceci est cohérent avec le fait que nous nous intéressons ici à une pathologie qui se développe principalement chez l'humain adulte.

85 souris sont opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, pour fournir la peau greffée aux autres. 400 receveuses vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis tuées pour prélever leurs tissus. Chaque greffe de peau pleine épaisseur dure une vingtaine de minutes, suivie de trente jours au plus de traitements immunosuppresseurs testés, de clichés sous anesthésie légère tous les deux jours et d'une imagerie de fluorescence par semaine. Le porteur reconnaît des douleurs postopératoires, des infections possibles du greffon et des pertes de poids liées aux molécules testées, et conclut que le rôle des souris reste "crucial et irremplaçable".

Objectifs

Le rejet de greffe reste un obstacle central en transplantation, nécessitant des traitements immunosuppresseurs souvent lourds et aux effets secondaires significatifs. Ce projet a pour objectif d’utiliser un modèle murin de greffe de peau pleine épaisseur afin d’évaluer des approches innovantes pour inhiber efficacement le rejet et prolonger la survie des greffes. L’un des objectifs principaux est d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules et formulations qui ciblent spécifiquement les voies métaboliques critiques des lymphocytes T activés. Ces cellules immunitaires, responsables du rejet, reprogramment leur métabolisme en faveur de la glycolyse, de la phosphorylation oxydative et du métabolisme de la glutamine pour répondre à leurs besoins énergétiques. Ce projet vise à tester des inhibiteurs de ces voies, individuellement ou en combinaison, afin de déterminer leur capacité à moduler la réponse immunitaire et à prolonger la survie des greffes. Une attention particulière sera portée à l’optimisation des conditions d’administration des molécules étudiées. Le projet explorera différentes stratégies de dosage et de fréquence d’administration afin de maximiser l’efficacité tout en minimisant les effets secondaires. Ces efforts visent à établir des protocoles thérapeutiques mieux tolérés par les sujets, garantissant un équilibre entre immunosuppression et tolérance immunitaire. Enfin, ce projet ambitionne d’explorer les interactions potentielles entre les inhibiteurs métaboliques et d’autres approches immunomodulatrices, telles que les traitements par co-stimulation ou la déplétion cellulaire. L’objectif est de développer des combinaisons thérapeutiques capables de générer une immunosuppression robuste et synergique, tout en minimisant les risques de rejet aigu et en favorisant une tolérance durable. À travers cette démarche, ce projet contribuera à l’élaboration de stratégies novatrices et transposables en clinique, offrant des perspectives prometteuses pour améliorer les résultats des greffes et la qualité de vie des patients.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche ambitionne de transformer la gestion du rejet de greffe en se concentrant sur la découverte de nouvelles approches thérapeutiques. En évaluant des molécules innovantes et en testant des formulations ciblant les voies métaboliques clés des lymphocytes T activés, il vise à élargir le répertoire des traitements disponibles en transplantation. Un des principaux bénéfices attendus est l’identification de nouvelles molécules capables d’inhiber sélectivement les mécanismes immunitaires responsables du rejet, tout en limitant les effets secondaires courants associés aux traitements immunosuppresseurs conventionnels. Ces découvertes permettront de mieux comprendre les interactions complexes entre métabolisme cellulaire et réponses immunitaires, ouvrant ainsi la voie à des interventions plus spécifiques et efficaces. Ce projet se distingue également par son approche novatrice de combinaison thérapeutique. En explorant les synergies potentielles entre deux molécules ou plus, il sera possible de maximiser l’effet immunosuppresseur tout en réduisant les doses nécessaires, diminuant ainsi la toxicité et les risques pour les patients. Cette démarche pourrait générer des stratégies thérapeutiques robustes et durables, adaptées à des contextes cliniques variés. Enfin, l’optimisation des doses et des schémas d’administration constituera un bénéfice clé. Grâce à une évaluation rigoureuse des relations dose-réponse, ce projet permettra d’identifier les protocoles les plus sûrs et les plus efficaces, minimisant les complications et maximisant les chances de succès des greffes. En résumé, ce projet s’inscrit dans une dynamique d’innovation centrée sur la découverte et l’optimisation de traitements de nouvelle génération, offrant des perspectives prometteuses pour améliorer la gestion du rejet de greffe et la qualité de vie des patients transplantés.

Procédures

Les animaux donneurs seront prélevés selon une procédure chirurgicale sans réveil durant approximativement 20 minutes, puis seront mis à mort. Les animaux receveurs recevront les gerffes de peaux des donneurs lors d'une procédure chirurgicale durant approximativement 20 minutes, puis seront suivis pendant une période pouvant aller jusqu'à 30jours. Les animaux seront surveillés journalièrement la 1ère semaine, puis tous les 2 jours pour évaluer leur état et réaliser un scoring de prise de greffe. les animaux seront traités avec des traitements de référence et des traitements tests pour comparer l'efficacité de nouvelles thérapeutiques. L'évaluation de la prise de greffe se fera aussi par imagerie non invasive (prise de clichés sous anesthésie légère tous les 2 jours et imagerie de fluoresence une fois par semaine).

Impact sur les animaux

Ce projet, bien que conçu pour minimiser l'impact sur les animaux, peut entraîner certaines nuisances ou effets indésirables inhérents à la mise en œuvre d’un modèle de transplantation cutanée et aux traitements testés. L’intervention chirurgicale nécessaire pour réaliser les greffes de peau constitue une source potentielle de douleur et d’inconfort postopératoires. Cependant, ces effets seront atténués grâce à une prise en charge rigoureuse, incluant l’utilisation d’anesthésiques pendant l’opération et d’analgésiques (par exemple, la buprénorphine) pour soulager la douleur après l’intervention. Des complications locales, telles que des infections au site de greffe ou un retard de cicatrisation, peuvent survenir. Ces risques seront contrôlés par des mesures prophylactiques, comme l’administration d’antibiotiques, et une surveillance attentive des animaux pour détecter rapidement toute anomalie. Les traitements administrés dans le cadre de l’étude (inhibiteurs métaboliques ou molécules immunosuppressives) pourraient entraîner des effets secondaires dose-dépendants, tels qu’une perte de poids, une fatigue ou des altérations métaboliques. Ces manifestations seront étroitement surveillées grâce à un suivi clinique quotidien des animaux, incluant l’évaluation de leur comportement, de leur alimentation et de leur état général. Des ajustements de dose seront effectués si nécessaire pour limiter ces effets.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux donneurs seront mis à mort. A l'issue de chaque procédure, les animaux receveurs seront mis à mort afin de prélever les tissus et réaliser des analyses ex vivo.

Remplacement

La recherche menée dans ce projet vise à développer des approches thérapeutiques innovantes pour inhiber le rejet de greffe, en s’appuyant sur un modèle murin de transplantation cutanée. Bien que le recours aux animaux soit limité aux cas où aucune alternative équivalente n’existe, leur utilisation demeure essentielle pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. Les modèles in vitro et les simulations informatiques constituent des alternatives précieuses et seront exploitées dans les phases préliminaires. Les cultures cellulaires, par exemple, permettront d’évaluer les interactions moléculaires et les effets directs des traitements sur les lymphocytes T. De même, des outils de modélisation informatique seront utilisés pour prédire les propriétés pharmacocinétiques et les interactions potentielles entre les molécules. Ces méthodes contribueront à réduire le nombre d’animaux nécessaires en éliminant en amont les composés inefficaces ou toxiques. Cependant, ces approches ne peuvent pas reproduire les processus biologiques complexes d’un organisme vivant, tels que les interactions immunologiques, la vascularisation des greffes ou les effets systémiques des traitements. Le rejet de greffe implique des mécanismes dynamiques qui ne peuvent être modélisés de manière fiable qu’en étudiant un système immunitaire fonctionnel dans son intégralité. Les souris, grâce à leur génétique bien caractérisée et leur similitude immunologique avec les humains, constituent le modèle le plus adapté pour explorer ces phénomènes de manière rigoureuse et reproductible. En outre, le modèle murin de greffe de peau permet une observation directe et précise des effets des molécules testées, notamment par l’évaluation visuelle et histologique des greffes. Ce niveau de précision est indispensable pour garantir la robustesse et la transposabilité des résultats à un contexte clinique. Enfin, l’utilisation des animaux sera strictement encadrée par des protocoles respectant les principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement). Tous les efforts seront faits pour réduire leur nombre au strict minimum nécessaire et pour limiter leur inconfort par des soins appropriés et des critères d’arrêt clairs. Ainsi, bien que des alternatives soient intégrées au projet pour limiter l’utilisation des animaux, leur rôle reste crucial et irremplaçable pour répondre aux questions scientifiques complexes liées au rejet de greffe et au développement de traitements innovants.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé sur la base d’analyses statistiques rigoureuses. Les tests utilisés incluent des méthodes telles que l’analyse de puissance statistique, permettant de calculer le nombre minimal d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives entre les groupes expérimentaux avec une probabilité donnée (généralement 80 %) et un seuil de signification de 5 %. Ces calculs tiennent compte de la variabilité attendue des réponses, basée sur des études antérieures dans le domaine de la transplantation.

Raffinement

Raffinement des conditions d’hébergement et de manipulation : Les souris sont maintenues dans des conditions optimales, adaptées à leur statut sanitaire : Utilisation de cages spécifiques avec filtration d’air pour réduire le risque d’infections. Température (20-24 °C) et humidité (40-60 %) contrôlées, essentielles pour éviter les perturbations cutanées. Enrichissement environnemental adapté (matériaux stériles comme tunnels ou abris) pour éviter tout traumatisme mécanique sur les greffes. Minimisation de la douleur et de la détresse : Anesthésie générale des animaux lors des chirurgies et analgésie préventive et postopératoire : Administration d’anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et antibiothérapie. Techniques chirurgicales optimisées : Utilisation d’instruments microchirurgicaux pour minimiser les traumatismes tissulaires et surveillance stricte de l’asepsie pour prévenir les infections postopératoires. Monitoring du bien-être : Mise en place d’une grille d’évaluation régulière incluant des paramètres comportementaux, physiologiques (perte de poids, température corporelle), et spécifiques (aspect de la greffe). Suivi longitudinal par imagerie non invasive : Utilisation de technologies telles que la fluorescence ou la tomographie optique cohérente (OCT). Ces outils permettent de suivre en temps réel l’état des greffes sans euthanasier les animaux à différents temps.

Choix des espèces

Le modèle murin a été retenu pour ce projet en raison de ses nombreux avantages scientifiques et pratiques. Les souris possèdent un système immunitaire bien caractérisé et similaire à celui des humains, permettant une extrapolation pertinente des mécanismes immunologiques étudiés. La disponibilité de lignées inbred et transgéniques facilite l’exploration des réponses immunitaires spécifiques et des mécanismes d’action des molécules testées. La transplantation cutanée chez la souris est un modèle robuste, largement documenté et reproductible, idéal pour évaluer le rejet de greffe. La petite taille des souris et leur gestion pratique réduisent les coûts et permettent des études efficaces avec un nombre minimal d’animaux. Malgré l’utilisation d’alternatives in vitro pour réduire leur nombre, les souris restent indispensables pour étudier les réponses immunitaires systémiques et les interactions complexes in vivo, essentielles pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet. Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris adultes, âgées de 8 à 10 semaines. Ce stade de développement est privilégié car il correspond à la maturité immunologique, nécessaire pour étudier les mécanismes de rejet de greffe et les réponses aux traitements immunosuppresseurs. Les souris adultes présentent des systèmes immunitaire, métabolique et vasculaire pleinement fonctionnels, ce qui garantit la fiabilité des résultats et leur transposabilité aux humains. De plus, à cet âge, les animaux sont suffisamment robustes pour supporter les procédures chirurgicales tout en minimisant les risques de complications liés à l’immaturité ou à la sénescence. L’utilisation de souris au même stade de développement permet également de réduire la variabilité des résultats, en limitant les différences physiologiques liées à l’âge.

Jusqu'à 39 prélèvements sanguins par animal à raison d'un par semaine pendant quatre mois, ou huit heures d'anesthésie continue ponctuées de 21 prises de sang et six mesures dans le muscle, 60 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue. 28 d'entre eux sont opérés puis maintenus sous anesthésie et tués sans réveil, les 32 autres relevant de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous reçoivent sous la peau un implant censé libérer en continu une molécule protectrice des neurones, dispositif que le porteur veut valider avant un essai chez des personnes atteintes de la maladie de Parkinson. Le lapin a été retenu pour sa taille, seule compatible selon lui avec ce prototype clinique, plus gros que celui déjà testé sur des rats.

Objectifs

Ce projet a pour but d'étudier les effets d’un dispositif ayant des propriétés protectrices contre la mort des neurones impliqués dans des maladies comme la maladie de parkinson. Avant de pouvoir tester ce dispositif chez des patients atteints de la maladie de parkinson, une validation chez un modèle animal de plus grande taille que le rongeur est nécessaire. Le lapin est le modèle animal le plus adapté pour cette phase de validation. Ce projet a comme objectifs de : (1) vérifier la faisabilité de l’implantation du dispositif, (2) vérifier la production de la molécule thérapeutique libérée en continu (3) évaluer le bon fonctionnement du dispositif sur le court et long terme. Pour atteindre ces objectifs, le projet nécessite une modification (rajout d'une mesure de la molécule thérapeutique dans le cerveau) sans changement du nombre d'animaux. Ces objectifs permettront d’avancer le projet vers un essai clinique chez les patients parkinsoniens.

Bénéfices attendus

Ce projet aura pour bénéfice d’apporter les dernières preuves de sécurité d'un dispositif implantable sous la peau avec un effet protecteur des neurones. Ce dispositif représente une opportunité unique de ralentir, voire d’arrêter, la progression de la maladie dès ses premiers stades. Valider son fonctionnement sur le modèle lapin, plus grand que les rongeurs, est une étape essentielle avant les essais cliniques. L’objectif est d’apporter une solution thérapeutique innovante, capable d’améliorer durablement la qualité de vie des patients et de ralentir l’évolution des patients vers des stades de plus en plus handicapants.

Procédures

1) Tous les animaux subiront une chirurgie d’implantation du dispositif sous la peau (environ 30-45 minutes, incluant l'anesthésie). 2) La moitié des animaux restera sous anesthésie pendant 8 heures au maximum après l'implantation. Ils subiront des prélèvements sanguins et des mesures dans le muscle qui seront répétés à différentes temps de l'expérience (1 minute par prélèvement, 21 prélèvements sanguins , 6 mesures dans le muscle). MODIFICATION: 2 mesures dans le cerveau seront effectuées sous anesthésie générale et analgésie générale et locale. 3) L’autre moitié des animaux sera surveillée pendant 4 mois au maximum après l’implantation du dispositif. Ils subiront des prélèvements sanguins en vigile ou sous anesthésie (1 minute par prélèvement, une fois par semaine, 39 prélèvements au maximum).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables suivants peuvent être observés. Implantation du dispositif sous la peau : elle peut induire une douleur locale sous la peau et une légère perte de poids en période post-chirurgicale. Une inflammation locale au niveau de la peau peut parfois survenir suite à un rejet du dispositif par le corps. Très rarement, une infection de la peau ou des problèmes de cicatrisation peuvent se manifester. Prélèvements sanguins : ils peuvent induire une légère chute de tension et un stress de courte durée dû à la manipulation ainsi qu'une légère douleur locale.

Devenir

Une partie des animaux sera mise à mort afin de prélever les cerveaux et organes pour analyses ou à la fin de l'expérience planifiée. Le reste des animaux sont mis à mort pour les expériences sans réveil de prélèvements de sang. Les prélèvements finals (sang, organes) ne permettent pas que les animaux soient gardés en vie.

Remplacement

Il n'existe pas de méthodes alternatives, n'impliquant pas d'animaux vivants, qui permettent d'évaluer l'impact du dispositif sur l'organisme entier. Il est nécessaire d’effectuer des études dans des animaux afin d'assurer le bon fonctionnement du dispositif dans un organisme entier avant l’implantation chez l’homme. Les dispositifs sont d’abord testés in vitro avant d’être utilisés dans des animaux. Les premières mises au point ont déjà été effectuées dans des rongeurs mais la réglementation impose des tests du dispositif clinique dans une espèce animale plus grande avant qu’il puisse être utilisé dans des patients humains.

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet. Si les résultats sont suffisants pour mettre en évidence un bon fonctionnement du dispositif, il ne sera pas nécessaire de tester la totalité des animaux. Aucun groupe contrôle supplémentaire n’est requis pour cette phase car chaque animal est son propre contrôle grâce aux mesures effectuées avant l'implantation du dispositif. Les animaux seront utilisés pour effectuer différentes analyses biologiques afin de réduire le nombre d'animaux nécessaire pour chaque analyse.

Raffinement

Une semaine d’acclimatation est prévue à l’arrivée des lapins avant l’expérience. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Cela permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Le projet implique une chirurgie pour implanter le dispositif sous la peau qui sera effectuée sous anesthésie générale et analgésie préopératoire. Afin de prévenir toute douleur post-opératoire, une injection d’un anesthésique local sera effectuée avant incision ainsi qu’une injection d'un anti-douleur toutes les 12 à 24 heures. Suite à la chirurgie, les animaux sont placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Pour les prélèvements sanguins, la zone de prélèvement sera alternée entre chaque prélèvement. Des solutions salines seront injectées fréquemment pour éviter une déshydratation. Les animaux auront accès à une nourriture hypercalorique et hydratée fournie par l’animalerie. Afin de réduire le plus possible toute douleur ou détresse que les animaux pourraient ressentir, ils seront observés au moins une fois par jour par le personnel compétent impliqué dans la réalisation des procédures expérimentales et/ou dans le soin des animaux. Une échelle de cotation de douleur basée sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d'évaluer l'état général de chaque animal et de définir les points limites, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l'animal.

Choix des espèces

Le lapin a été choisi pour cette étude en raison de sa taille, permettant l’implantation du prototype clinique du dispositif en cours d’évaluation. Ce modèle est particulièrement adapté à l’évaluation du dispositif dans des conditions physiologiques proches de l’humain. Ce modèle permet d’obtenir des résultats pertinents tout en respectant les exigences éthiques et réglementaires relatives au bien-être animal. Nous utiliserons des lapins et lapines à l’âge de 11 semaines quand la moyenne de poids aura atteinte environ 2.5kg. En effet, nous devons respecter un poids minimum qui permettra d’implanter le dispositif clinique ayant une taille plus importante que celui utilisé en pré-clinique chez le rat. Il s’agit donc d’animaux ayant un stade de développement avancé.

Injections de fer, molécule déclenchant une anémie hémolytique, irradiation en boîte de contention, injections de globules rouges ou de bactéries : 1 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie étant anesthésiée et tuée avant tout réveil. Un groupe reçoit six injections en douze jours, un autre passe cinq à dix minutes immobilisé pour l'irradiation avant une injection sous anesthésie. Toutes finissent anesthésiées pour une prise de sang terminale puis tuées, afin de prélever foie, rate et moelle osseuse. Le porteur affirme que la complexité d'un "organisme entier" ne peut pas être recréée in vitro et conclut que l'animal "dans son intégrité" est nécessaire pour étudier le recyclage du fer par les macrophages.

Objectifs

Le fer est essentiel pour de nombreuses fonctions physiologiques, comme la synthèse de l'ADN, la production de l'hémoglobine (indispensable au transport de l’oxygène dans les globules rouges), et la production d'énergie. Il existe sous deux formes principales, à savoir le fer ferrique, peu soluble mais stable, et le fer ferreux, plus soluble mais réactif. En excès, le fer peut générer des espèces réactives de l'oxygène qui peuvent créer des dommages aux cellules et déclencher une forme de mort cellulaire appelée ferroptose. Chez l’Homme, des mutations dans un certain nombre de gènes conduit à des surcharges sévères en fer dans l’organisme induisant des lésions tissulaires. Les manifestations de cette pathologie peuvent inclure des symptômes systémiques, des dysfonctions hépatiques (pouvant favoriser le développement d’un cancer du foie), une cardiomyopathie, un diabète, ainsi que des arthropathies, parmi d’autres complications. Ces maladies héréditaires sont appelées hémochromatoses et peuvent concerner environ 1 personne sur 1000 en France. Les concentrations de fer dans le sang et les organes sont strictement régulés pour limiter sa toxicité. Les macrophages, notamment dans la rate et le foie, contribuent à recycler le fer en éliminant les globules rouges vieillissants. Les cellules de Kupffer, des macrophages (globules blancs qui ont une fonction de nettoyage et de surveillance immunitaire) situés dans le foie, sont essentielles dans ce processus de recyclage. Dans certaines pathologies, comme l’anémie hémolytique, ces cellules de Kupffer peuvent souffrir et être remplacées par des macrophages d'une autre origine. Ce remplacement a des conséquences potentielles sur l'accumulation de fer dans certains organes, pouvant entraîner des dommages aux reins. Cette étude explore le rôle d'une molécule exprimée par les cellules de Kupffer (mais également d'autres types de macrophages) pour déterminer si celle-ci contribue à la survie et au maintien de ces macrophages dans le foie en condition normale et en cas de surcharge en fer.

Bénéfices attendus

Le fer est un composant essentiel de l'hémoglobine (une protéine des globules rouges) et est essentiel au transport de l'oxygène chez les vertébrés. À l'état stable, la production de globules rouges est en équilibre avec leur élimination. Cependant, dans diverses conditions physiopathologiques, la durée de vie des globules rouges est gravement compromise, ce qui menace l'organisme d'anémie et d’une toxicité au fer. Ces anémies dites hémolytiques peuvent avoir plusieurs origines et notamment être d'origine métabolique, génétique comme pour la drépanocytose ou bien encore relever de désordres auto-immuns. Dans ce contexte, ce projet vise à mieux comprendre le rôle et l’importance que jouent les macrophages (origine, quantité tissulaire, activation, fonction) et en particulier ceux qui sont présents dans le foie, mais aussi dans la rate ou la moelle osseuse, dans le recyclage du fer et l’équilibre production-élimination des globules rouges.

Procédures

Un premier groupe d’animaux recevra une administration de fer par injection unique (animal vigile, quelques secondes de contention). Un deuxième groupe recevra une administration (injection unique, animal vigile, quelques secondes de contention) d'une molécule favorisant une anémie hémolytique. Un troisième groupe d’animaux recevra deux injections sous anesthésie générale (durée de quelques minutes) dans la journée, puis le lendemain une administration de fer par injection unique (animal vigile, quelques secondes de contention) suivie de deux prises de sang (animal vigile, durée 1-2 minutes) à quelques jours d'écart. Un quatrième groupe recevra une administration de fer par injection unique (animal vigile, quelques secondes de contention) puis 2 semaines plus tard une administration de globules rouges ou de bactéries par une injection unique sous anesthésie générale. Un cinquième groupe recevra une administration de fer par injection unique (animal vigile, quelques secondes de contention), puis des traitements par injection (animaux vigiles, quelques secondes de contention) de molécules tous les deux jours, 6 fois. Pour le dernier groupe, les animaux seront placés dans des compartiments (mouvements limités) d’une boîte transparente en même temps que d’autres congénères (contact visuel et olfactif) pour subir une irradiation de faible dose (5 à 10 mins) suivie d'une injection sous anesthésie générale. 2 semaines plus tard, une prise de sang sera effectuée (animal vigile, durée 1-2 minutes) avant une administration de fer par injection unique (animal vigile, quelques secondes de contention). En fin de procédure, tous les animaux seront anesthésiés pour permettre une prise de sang terminale puis euthanasiés (toujours sous anesthésie générale).

Impact sur les animaux

Les manipulations des animaux pourront induire un stress de courte durée. Les administrations pourront induire une brève et légère douleur au point d’injection. Les injections répétées peuvent induire un risque d'infection (cas rare). Les prélèvements sanguins pourront induire une douleur de courte durée ainsi qu’un risque faible d’hématome ou d’hémorragie. Les animaux irradiés (doses modérées) pourront être stressés au cours de l’irradiation par le maintien de courte durée (5 à 10 mins) dans une petite boîte (mais sans perte visuel ni olfactive de leurs congénères). Ils pourront aussi être plus sensibles aux infections pendant quelques jours. Les courtes anesthésies générales pour les injections pourront engendrer un stress thermique et l’injection une douleur temporaire au réveil. Certains traitements pourront induire une inflammation temporaire, ou une anémie de transitoire et être source d’inconfort et être associée à une perte de poids temporaire des animaux.

Devenir

Des prélèvements et analyses post-mortem sont nécessaires ce qui implique l’euthanasie des animaux (1360 total) à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Il n’est aujourd’hui pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires qui rentrent en jeu et la répercussion de leur activité sur le fonctionnement tissulaire en condition saine ou pathologique. Dans le cas présent, l’animal dans son intégrité est nécessaire pour étudier l’impact de l’inactivation de notre gène d’intérêt dans les macrophages (présents dans tous les organes) sur leur homéostasie mais également sur les répercussions systémiques telles que l’homéostasie du fer.

Réduction

Un total de 1360 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats significatifs et reproductibles. Sur la base de notre d’expérience utilisant des approches similaires et à l’aide d’un calcul de puissance, nous estimons que 2 lots de 8 animaux par condition seront suffisants pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. A l'issue des expérimentations, nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. Dans la mesure du possible, et quand cela est techniquement possible, les groupes expérimentaux partageant un même groupe contrôle seront analysés en parallèle afin de limiter le nombre d’animaux requis pour l'étude.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux dans les conditions réglementaires d'hébergement avec respect des cycles jour/nuit, un contrôle de l’hygrométrie et de la température. Les changes litière/nourriture sont effectués de façon hebdomadaire avec surveillance quotidienne par le personnel de l’animalerie. Les souris disposeront de lanières de kraft, favorisant la nidification et diminuant ainsi leur stress. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite), le recours à l'anesthésie si nécessaire et la mise en place de soins adaptés. Les points limites prennent en compte des critères variés tels que l’observation du comportement, l'aspect général de l’animal, son niveau d'activité, ainsi que son poids corporel. Si un animal présente des signes de détresse, des mesures immédiates sont prises pour garantir son confort et sa santé. Avant début des expérimentations les animaux seront habitués à être manipulés afin de réduire leur stress. Pour toutes les procédures, les injections, les administrations de molécules ou les prélèvements sanguins seront réalisées par une personne en charge de l'étude, habilitée à réaliser les expérimentations sur ce modèle, maîtrisant le geste et avec un matériel adapté afin de réduire le stress et la douleur des animaux.

Choix des espèces

La souris est la seule espèce de mammifère pour laquelle des invalidations géniques et spécifiques de certains tissus et cellules peuvent être facilement réalisées et notamment pour l'études des macrophages. De plus, de nombreuses lignées ont déjà été développées et sont donc disponibles pour les chercheurs. La physiologie murine est proche de celle de l’Homme, justifiant ainsi l’utilisation de cette espèce à des fins de recherche thérapeutique en médecine humaine. Les animaux utilisés devront avoir atteint l'âge adulte au début des expérimentations pour avoir un système immunitaire mature. Ils seront donc utilisés à partir de l’âge de 8 semaines.