Procédures sans réveil

24 lapins de cinq à six semaines subissent un lavage broncho-alvéolaire de vingt minutes qui leur provoque une détresse respiratoire, reproduisant la maladie des membranes hyalines du grand prématuré. 48 lapins en tout vont être utilisés, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, l'autre moitié sous anesthésie sans réveil, avec administration de surfactant par un nouveau dispositif d'endoscopie et trente minutes d'IRM. Le porteur écrit que les effets indésirables attendus sont faibles, dans le paragraphe même où il décrit la détresse respiratoire provoquée. Les 24 lapins du volet consacré à la distribution du surfactant sont gardés en vie et proposés à l'adoption "dans la mesure du possible", les autres sont tués.

Objectifs

L’immaturité pulmonaire à la naissance chez les nouveau-nés prématurés (maladie des membranes hyalines) requière l’administration de surfactant exogène peu après la naissance. Les techniques actuelles d’instillation de surfactant, bien que décrites comme “moins” invasives (Less Invasive Surfactant Administration LISA), nécessitent le recours à une laryngoscopie qui reste une procédure douloureuse et traumatisante pour le prématuré et complexe à apprendre et maitriser pour le personnel soignant. La sédation-analgésie représente un challenge pour ces patients, avec la nécessité de prévenir ou diminuer la douleur générée par la laryngoscopie et le besoin de conserver une respiration spontanée efficace. Les objectifs du projet portent sur le développement et la validation d’un nouveau dispositif médical basé sur l’endoscopie et l’atomisation pour l’administration de surfactant exogène chez le nouveau-né prématuré. Les bénéfices escomptés du dispositif sont de i) diminuer la douleur et le recours à une analgésie, ii) améliorer la tolérance clinique et l’efficacité de l’administration (endoscopie et atomisation du surfactant), et iii) avoir une meilleure courbe d’apprentissage que le LISA. Le développement et la validation de l’efficacité et de la sécurité du dispositif EndoSurf repose sur une collaboration multidisciplinaire. Les différentes étapes du projet incluent i) la validation du procédé d’atomisation avec la caractérisation des particules atomisées et les propriétés physicochimiques du surfactant atomisé et l’étude de la distribution pulmonaire dans un modèle ex-vivo, ii) l’étude de la distribution du surfactant et efficacité sur un modèle animal de maladie des membranes hyalines (comparaison avec la méthode LISA), iii) le développement du prototype pour industrialisation et certification pour utilisation en clinique, iv) l’évaluation de la courbe d’apprentissage en laboratoire de simulation médicale et v) une étude clinique pilote sur 20 patients prématurés (comparaison avec une cohorte historique LISA).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de la réalisation de ce projet sont la validation d’un nouveau dispositif médical pour le traitement de la maladie des membranes hyalines chez le nouveau-né prématuré. Les bénéfices escomptés de ce dispositif sont d’une part de diminuer la douleur et le traumatisme chez le nouveau-né et de réduire le recours à une analgésie et d’autre part d’améliorer la tolérance clinique et l’efficacité de l’administration (homogénéité et distalité de la distribution du surfactant). Enfin l’utilisation du nouveau dispositif devrait offrir une meilleure courbe d’apprentisassage pour le personnel soignant des services de néonatologie.

Procédures

Une partie des animaux (24) sera soumise à un lavage broncho-alvéolaire pour l’induction d’un modèle de maladie des membranes hyalines. La durée estimée de ce geste est de l’ordre de 20 minutes. L’ensemble des animaux (N=48) seront soumis à l’administration de surfactant exogène. La durée totale de ce geste est estimée à 10 minutes. La durée prévue des acquisitions IRM est de 30 minutes. Tous ces gestes sont réalisés sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont faibles. Les gestes seront réalisés sous anesthésie générale. Pour le modèle de maladie des membranes hyalines, le lavage broncho-alvéolaire induit une détresse respiratoire chez l’animal. Cette détresse respiratoire sera prise en charge aussitôt par l’administration de surfactant pulmonaire exogène. L’acquisition d’images par IRM ne présente pas d’effets indésirables notables. La charte de « transports de moins de 50 km pour les animaux vivants hébergés » sera appliquée.

Devenir

Dans le cas de l’évaluation de la distribution du surfactant selon la méthode d’administration, les animaux seront gardés en vie et proposés à l’adoption dans la mesure du possible. Pour le modèle de la maladie des membranes hyalines, les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

La validation du dispositif expérimental d’atomisation du surfactant a été en grande partie réalisée en amont sur des modèles ex-vivo provenant de pièces (poumons de lapin) d’animaux de boucherie. Cette stratégie de remplacement réalisée sur ce modèle ex vivo a permis de valider la faisabilité et la pertinence du nouveau dispositif médical et de comparer ses performances à celles de l’approche clinique standard. Le passage aux études in vivo reste nécessaire et indispensable pour se rapprocher d’une situation clinique où l’ensemble des voies respiratoires est présent avec des poumons fonctionnels, où un modèle des membranes hyalines peut être induit et où l’administration du surfactant peut être évaluée.

Réduction

Le nombre d’animaux à utiliser a été déterminé de façon à répondre aux questions auxquelles ce projet scientifique et médical financé par l’Agence Nationale de la Recherche et soutenu par un hôpital publique souhaite répondre, à savoir la validation d’un nouveau dispositif médical permettant d’améliorer l’administration de surfactant chez les enfants prématurés. Cette validation passe par l’utilisation de 6 groupes d’animaux. Nous estimons le nombre minimal d’animaux nécessaire à 8 par groupe pour obtenir des résultats permettant de répondre positivement ou négativement aux questions posées dans ce programme de recherche. Des tests statistiques seront utilisés pour valider les résultats. Les mesures qui ont été prises pour réduire le nombre d’animaux à utiliser sont conséquentes puisque qu’un modèle ex vivo utilisant des pièces de boucherie (quarante poumons de lapin) obtenus dans des abattoirs pour l’alimentation humaine a été utilisé en amont, durant plus d’un an, pour mettre en place et valider un certain nombre de points méthodologiques et instrumentaux.

Raffinement

Afin de limiter le stress et l’inconfort de l’animal, le transport et la préhension sont assurés par la même personne et celle-ci s’assure du bien-être et du comportement de l’animal avant et pendant l’expérimentation. Les lapins, par groupe de 8, seront hébergés par deux par cage, dans une batterie de 3 cages, correspondantes aux normes en vigueurs pour des animaux de 5 semaines. La batterie est localisée dans une pièce dédiée spécifiquement, isolée de tout bruit extérieur, régulée par une ventilation adéquate assurant un bon apport d’oxygène et permettant d’éliminer les poussières et les odeurs. Une température de 19 degrés Celsius et une humidité relative comprise entre 45 et 65 % sont également assurées. Chaque cage est constituée d’un plancher à maille pour l’élimination des déjections et le respect des structures ostéo-articulaires des pattes des animaux. Les cages disposent de plates-formes rigides sous et sur lesquels l’animal peut trouver refuge. L’enrichissement est constitué de paille compactée, de barreaux de bois à ronger, et de boite en carton pour s’isoler ou se dissimuler. L’enrichissement alimentaire est constitué de fibres brutes (foin) et de pellets standards et l’eau est accessible par des biberons. L’ensemble des protocoles expérimentaux est réalisé sous anesthésie générale. Un traitement permettant de réduire la douleur ou l’angoisse des animaux sera également appliqué. Un tapis chauffant, permettant de maintenir la température des animaux pendant les procédures et les sessions d’imagerie IRM, est utilisé ainsi que l’administration de gel ophtalmique afin de compenser la sécheresse oculaire. Leurs signes cliniques (température, taux d’oxygène, fréquences cardiaques et respiratoire) seront mesurés en cours de manipulation. Les lapins destinés à l’adoption seront suivis visuellement à leur réveil (apparence physique, comportement, fréquence respiratoire) et, afin de limiter tout inconfort possible post-expérimentation, ceux-ci se verront administrer un traitement pour réduire la douleur, pendant 48h, selon les signes visibles d’inconfort.

Choix des espèces

Le lapin est le modèle animal habituel pour reproduire la maladie des membranes hyalines du nouveau-né prématuré. Dans ce projet, de jeunes (5 à 6 semaines) lapins blancs de Nouvelle-Zélande (poids entre 1000 et 1500 grammes) seront utilisés pour se rapprocher des dimensions des poumons chez les prématurés.

Gavées à quatre reprises pendant leur gestation, parfois opérées sous anesthésie pour qu'une molécule soit injectée directement à leurs embryons, les femelles sont ensuite tuées et leurs embryons refroidis jusqu'à l'hypothermie avant d'être tués à leur tour. 1 294 souris vont être utilisées, 1 078 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 216 sous anesthésie sans réveil. Le porteur indique que le gavage peut provoquer des lésions de l'œsophage et que la chirurgie sur femelle gestante peut entraîner des saignements et des mises bas prématurées. Toutes sont tuées, au terme de la période de maintien ou plus tôt si un point limite est atteint, pour que leurs cerveaux soient prélevés.

Objectifs

L’objectif de notre projet est de mieux comprendre la mise en place d’un organe complexe tel que le cerveau des mammifères. En effet, il a été montré que des défauts de son développement contribuent à l’étiologie de plusieurs maladies neurologiques et psychiatriques (troubles du spectres autistique, schizophrénie ou troubles bipolaires). Il apparaît donc essentiel de progresser dans la connaissance des mécanismes qui contrôlent le développement du cerveau. Notre projet vise à déterminer le rôle de l’activité neuronale précoce embryonnaire dans la mise en place des circuits cérébraux et en particulier sur une structure cruciale impliquée dans le contrôle des mouvements volontaires. Ainsi, nous caractériserons l’impact d’une absence permanente ou transitoire de l’activité neuronale embryonnaire sur la mise en place des cricuits cérébraux et analyserons les mécanismes moléculaires impliqués.

Bénéfices attendus

Les maladies neuropsychiatriques trouvent souvent leur origine dans des perturbations complexes du développement cérébral, notamment au cours de périodes critiques allant de la vie prénatale à l'adolescence. Il est connu que l’activité neuronale après la naissance, joue un rôle clé dans le developpement et la fonction du cerveau, mais sa contribution pendant la vie embryonnaire reste encore à élucider. Nos études en cours au laboratoire révèlent que l’activité neuronale avant la naissance joue un rôle majeur dans le développement de structure cérébrale impliqué dans le contrôle des fonctions motrices, de l’apprentissage et de la formation des habitudes. En combinant des approches génétiques et pharmacologiques, ce projet vise à approfondir notre compréhension du rôle de l’activité précoce neuronale dans des processus développementaux clés de la formation du cerveau. Cela nous permettra d’avancer dans la compréhension générale des troubles neuropsychiatriques, ouvrant la voie à la stratification des patients et à des approches thérapeutiques adaptées.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à différents gestes techniques selon les questions scientifiques : i)Les femelles gestantes vigiles recevront à différents stades de gestation des administrations orales (4 fois, quelques minutes) ou par injection (1 fois, quelques secondes) de molécules permettant d’induire les modèles expérimentaux. Certaines femelles ne recevront aucune molécule. ii) Certaines femelles gestantes analgésiées et anesthésiées subiront une unique chirurgie afin d’administrer une molécule aux embryons in utéro (1 fois, 20 minutes, sous anesthésie et analgésie). iii) Par la suite, les femelles seront euthanasiées par une méthode réglementaire et les embryons seront anesthésiés par hypothermie avant de procéder à une euthanasie (durée quelques minutes). iv) les souriceaux seront analgésiés et anesthésiés avant de procéder à une euthanasie à différents stades (durée quelques minutes).

Impact sur les animaux

Les injections effectuées pourront induire un stress pendant la contention ainsi qu’une douleur légère de courte durée consécutive à l’introduction de l’aiguille ainsi que la possibilité de saignement. L’anesthésie peut quant à elle provoquer des effets secondaires comme : un stress thermique, une hypotension ou une détresse respiratoire. La molécule administrée par gavage aux femelles gestantes peut avoir un impact sur le déroulement de la gestation des femelles, provoquer des mises bas prématurées ou des difficultés de mise bas et avoir aussi un impact sur les embryons et les nouveaux-nés. De plus, la méthode d’administration par gavage peut induire un stress pendant la contention, des lésions de l’œsophage ou de l’inflammation. La chirurgie requise sur femelle gestante analgésiée et anesthésiée pour l’injection in utero de molécules peut avoir un impact sur i) le déroulement de la gestation des femelles en provoquant des saignements vaginaux ou au site d’incision abdominale ; ii) sur le développement des embryons conduisants à des mises bas prématurées et des difficultés de mise bas.

Devenir

L'ensemble des animaux impliqués dans ce projet (1294) seront euthanasiés à la fin de la période de maintien prévue ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites. Pour l'ensemble du projet, les cerveaux des souris seront prélevés afin de réaliser des analyses histologiques, immunohistochimiques ou d’imagerie.

Remplacement

L’étude du rôle de l’activité neuronale embryonnaire dans la mise en place des circuits cérébraux pendant le développement nécessite impérativement l’utilisation d’un organisme complet. Ce processus dépend en effet d’une multitude de signaux corporels qui influencent directement le comportement des cellules neuronales et leurs interactions avec le tissu. Des signaux hormonaux ou immunitaires émanent du système endocrinien, de la circulation sanguine, de l’environnement maternel ou des neurones en développement. Ces processus, hautement coordonnés et dépendants de variations systémiques, ne peuvent être reproduits ni par des systèmes in vitro, qui présentent des limitations spatiales et temporelles, ni par des organoïdes, qui manquent de la diversité cellulaire et des interactions systémiques nécessaires. Les simulations in silico, quant à elles, se limitent aux molécules bien caractérisées et ne permettent pas d’étudier les mécanismes encore largement inconnus qui régissent les phases précoces de développement des circuits neuronaux. De plus, nos travaux s’inscrivent dans la continuité de nos recherches antérieures sur les processus développementaux intégrés au développement de circuits neuronaux complexes. L’utilisation d’un modèle mammifère in vivo est indispensable pour observer ces mécanismes dans leur environnement physiologique.

Réduction

Un total de 1294 souris sera nécessaire à la réalisation de ce projet. Notre projet est conçu pour minimiser le nombre de souris utilisées tout en garantissant des résultats scientifiquement robustes. La taille de chaque stade d’analyse a été optimisée pour pouvoir utiliser le test statistique approprié et obtenir des résultats statistiquement fiables. En effet, à cause des variabilités inter-animals et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Ainsi, grâce à notre expérience préalable dans des projets similaires, nous avons déterminé que 8 animaux (4 de chaque sexe) constituent la taille optimale par groupe expérimental. Cela équilibre le besoin de robustesse statistique et la réduction du nombre d'animaux. Les procédures exprérimentales ont été établies pour éviter l’utilisation inutile de souris. De plus, après le sevrage des souriceaux, les mères non traitées pourront être réutilisées dans de nouveaux accouplements. Enfin, dans nos différentes conditions expérimentales, si un résultat n’est pas concluant lors de la première analyse (immunohistochimie), alors les autres expériences prévues ne seront pas réalisées. Cette stratégie contribue significativement à la réduction du nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les mesures de raffinement qui seront mises en œuvre sont liés aux aspects des procédures et concernent l’établissement de points limites, l’hébergement et l’enrichissememnt de l’environnement des souris. Nous réduirons au maximum l’inconfort ces souris car les procédures que nous mettons en œuvre sont établies afin de limiter la douleur, l’angoisse ou le stress. Nous appliquerons des soins et ou actes nécessaires. Durant les procédures, nous utiliserons les analgésiques et anesthésiques appropriés pour limiter au maximum l’inconfort des animaux et des séances d’habituation à la manipulation des animaux pourront être anticipées afin de limiter le stress de contention lors des injections ou des gavages. Nous examinerons le comportement et l’apparence des souris ayant subi une procédure ou dont la mère aura subi un traitement pour détecter tout inconfort et un analgesique pourra être injecté. La présence de points limites définis et adaptés pour chacune des procédures nous permettra de détecter toute souffrance chez la souris. En cas d’atteinte de points limites et de souffrance grave ne pouvant être traitée, l’animal sera immédiatement retiré du projet et euthanasié sur décision de l’expérimentateur ou du personnel de l’animalerie, si l’expérimentateur n’est pas joignable. Les animaux sont hébergés dans des conditions respectant la réglementation en vigeur : hébergement en surpression, portoirs avec des cages ventilées individuellement, stabulation en nombre limité par cage, eau et nourriture à volonté, change litière et biberons hebdomadaires, vérification quotidienne, température et hygrométrie contrôlées, intensité et durée d’éclairage définies, enrichissement du milieu : papier kraft, coton et maison en carton. L’ensemble des procédures seront toujours réalisées par des personnes formées et compétentes.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux de laboratoire largement utilisées pour étudier le fonctionnement du corps et les effets de ses dysfonctionnements à différents niveaux, que ce soit au niveau du comportement, du fonctionnement physiologique ou des organes. Elles sont également essentielles pour créer des modèles qui nous aident à mieux comprendre certaines maladies humaines. Leur grande similarité génétique avec l'homme, combinée à la possibilité d'utiliser un grand nombre de souris modifiées génétiquement, en fait un excellent choix pour répondre à nos questions de recherche. En outre, leur cycle de reproduction rapide et leur petite taille facilitent leur gestion tout en permettant d’étudier une espèce ayant un développement proche de celui des humains. La courte période de gestation des souris, ainsi que le nombre élevé d’embryons, nous permettent de générer suffisamment d'animaux pour mener plusieurs expériences à partir de quelques parents seulement. Dans le cadre de nos recherches en cours et pour tirer parti des outils génétiques disponibles dans notre laboratoire, nous continuerons à utiliser ce modèle de souris. Dans le cadre de notre projet, les animaux seront utilisés à différents stades de développement, adaptés aux objectifs expérimentaux spécifiques allant de l’embryon jusqu’a quelques jours après la naissance. Ainsi, les cerveaux seront analysés à 2 stades embryonnaires, en fin de gestation, stades critiques pour l‘élaboration du cerveau. Les cerveaux des souriceaux seront étudiés à 2 stades après la naissance, des périodes critiques pour la maturation du cerveau. Ce choix stratégique garantit une compréhension globale des processus allant de la formation fœtale à la maturation et au maintien des circuits dans des contextes normaux et pathologiques.

Un cathéter intraveineux est implanté chez 396 rats pour qu'ils s'auto-administrent de la cocaïne au cours de dix sessions de six heures, à raison d'une par jour. Sur les 638 rats du projet, 242 subissent une chirurgie crânienne de deux à quatre heures sans réveil, avec enregistrement de l'activité des neurones, et les 396 autres relèvent d'un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués pour prélèvement et analyse du cerveau, l'objet déclaré étant de comprendre le rôle du cortex insulaire dans la rechute après arrêt de la drogue. La période d'abstinence et d'isolement est qualifiée de "léger stress pendant 60 jours", quand le même document indique un isolement pouvant durer jusqu'à 77 jours.

Objectifs

L’addiction aux drogues est une maladie qui touche la santé mentale et qui a des effets importants sur la vie des individus et sur la société dans son ensemble. Une caractéristique de cette maladie est le risque de rechute, même après avoir arrêté la drogue pendant un long moment, en raison de changements durables dans le cerveau causés par la consommation de drogues. Il est donc essentiel de comprendre ces changements pour créer de nouvelles solutions pour aider les personnes qui souhaitent s’en sortir. Notre équipe se concentre sur deux zones du cerveau : le cortex insulaire (ou insula) et l’aire tegmentale ventrale. L'insula est impliquée dans la perception de notre corps, la gestion de nos émotions et la prise de décisions, et joue un rôle important dans les comportements de dépendance. L'aire tegmentale ventrale est quant à elle liée à nos mécanismes de récompense, de motivation et d'apprentissage, et des changements dans son activité ont souvent été observés après une consommation prolongée de drogues. Le but de notre projet est de comprendre comment l’insula et l’aire tegmentale ventrale interagissent. Nous pensons que les variations dans l’activité de l’insula peuvent influencer l’activité des neurones de l’aire tegmentale ventrale, soit directement, soit par l’intermédiaire d’autres zones du cerveau qui régulent nos émotions, comme l’amygdale ou le noyau du lit de la strie terminale. Pour tester cette idée, nous allons modifier l’activité de l’insula grâce à des traitements médicamenteux, puis observer comment cela affecte l’aire tegmentale ventrale. Nous commencerons par des rats sains, puis nous étudierons des rats ayant été exposés à la cocaïne. En ajustant l’activité de l’insula, nous pourrons voir si cela induit des changements spécifiques dans le cerveau des rats dépendants à la cocaine. Par la suite, nous simulerons des traitements comme la stimulation transcrânienne, qui agit sur l’insula, pour tester l’efficacité de ces approches. Ce projet pourrait ouvrir la voie à de nouvelles façons de traiter l'addiction et ses effets sur le cerveau.

Bénéfices attendus

À brève échéance, une meilleure compréhension des mécanismes de l'addiction est envisagée, tandis qu'à moyen terme, cette progression devrait conduire à une optimisation des traitements contre l'addiction.

Procédures

- chirurgie d’implantation de cathéter intraveineux (durée : 15minutes par animal, 396 animaux) pour permettre l’auto-administration. - chirurgie crâniale sans réveil avec enregistrement de l’activité des neurones : 1 fois (2-4 heures par animal, 638 animaux). Sur animaux vigiles : - 10 sessions d’auto-administration (10 sessions de 6 heures, 1 session / jour, 396 animaux) suivies d’une période d’abstinence de 45 jours maximum (animal isolé jusqu'à 77 jours).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour ce projet sont : -Chirurgies pour placer le cathéter: inconfort ( maximum 1 heure) au réveil, et douleurs post-opératoire minorée par des antalgiques (pendant 2 jours) -Cathéter intraveineux : gène légère pendant la durée de l’expérience (10 fois 6 heures) - Auto-administration de cocaïne : stress modéré (maximum 8 heures) chez certains rats - Abstinence et isolement : léger stress pendant 60 jours

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements et analyse des cerveaux.

Remplacement

Ce type de recherche vise à comprendre les bases d'un processus psychobiologique et peut-être uniquement mené sur un animal vivant. En effet, nous étudions les bases comportementales et neurobiologiques impliquées dans l’addiction. L’étude de ce processus nécessite la présence de réseaux neuronaux intacts et fonctionnels qui sont uniquement accessibles dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires pour ce projet est basé sur des calculs permettant de définir le nombre suffisant par groupe pour détecter des différences biologiques importantes. Les expériences seront réalisées par étape. Le résultat d'une étape conditionne les étapes suivantes. Il est possible que toutes les étapes ne soient pas réalisées. En tout, un maximum de 638 rats sera nécessaire pour ce projet, et les ajustements du nombre d'animaux se feront selon les résultats obtenus.

Raffinement

Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière de l’état de santé des animaux (alimentation, apparence, comportement) et des actions seront mises en place en cas de problème(s) observé(s), avec la mise en place d’une grille de score, l’utilisation de points limites adaptés, gradés, précis et spécifiques, d’un arbre décisionnel et de critères d’intervention et d’arrêt de souffrance suffisamment précoces. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. . Les rats seront hébergés dans des cages ventilées, température et humidité contrôlées, avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation à l’animalerie de 7 jours minimum. Lors des chirurgies un recours à une anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques, ainsi que d’un maintien de la température par tapis chauffant sera effectué. Dans le cadre des chirurgies d’implantation de cathéter, un traitement antalgique sera poursuivi en postopératoire durant 48heures (faisant un total de 72heures). Une habituation à l'expérimentateur sera réalisée (manipulation (2minutes/rat) 2 fois avant la chirurgie d’implatation de cathéter.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux. En effet, les rats ont des réponses aux drogues qui sont similaires à celles de l’humain et ils s’auto-administrent toutes les drogues abusées par l’humain de façon spontanée, ce qui n’est pas le cas avec d’autres espèces, pour lesquelles la réalisation de tâches opérantes modélisant l’addiction est plus difficile à obtenir. Nous utiliserons des rats avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une certaine variabilité génétique entre les individus pour un meilleur reflet de ce que l’on trouve chez l’humain. Dans cette étude, nous utiliserons des rats de 10 semaines au début du projet, ce qui correspond au stade de développement utilisé dans l’ensemble de nos projets de recherche afin de limiter le risque de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rats en phase d’adolescence (juvéniles).

1248 souris et 424 rats vont être utilisés dans ce projet, 237 opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, les 1435 autres soumis à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut passer jusqu'à 180 jours en cage individuelle, la tête fixée pendant une à deux séances quotidiennes de tâches de décision, avec un accès à l'eau restreint jusqu'à 120 jours consécutifs et une seule journée d'eau à volonté par semaine. La chirurgie de pose du dispositif d'enregistrement dure une à deux heures, six à sept en cas d'injections bilatérales. Le porteur plafonne la perte de poids à 18 % chez la souris et 9 % chez le rat, et rattache ces expériences fondamentales à des perspectives d'optimisation des neuroprothèses sensorielles ou motrices, sans échéance.

Objectifs

Notre objectif est d’élucider comment certaines voies de communication s’organisent pour transformer des événements en décision. Les informations sensorielles, le contexte interne et la valeur des actions convergent au sein d’un maillage; les chronologies, les relais anatomiques et les mécanismes de coordination assurant une intégration rapide demeurent obscurs. Pour explorer cette dynamique, nous avons élaboré un projet utilisant des souris et des rats où les règles de choix varient entre séances : un même stimulus peut conduire, selon le contexte, à une action distincte. Durant l’apprentissage puis la performance stable, nous enregistrerons l’activité neuronale par différentes imageries en perturbant sélectivement des processus naux pour tester leur rôle causal. Nous irons au-delà de la simple cartographie des réponses. Ces expériences fourniront une vue causale et multi-échelle de la façon dont une zone du cerveau bâtit, adapte et exploite ses réseaux de communication pour convertir l’information en choix, ouvrant des perspectives fondamentales et cliniques.

Bénéfices attendus

Le bénéfice principal attendu de ces expériences est la possibilité de comprendre les bases neuronales de la prise de décision. En particulier, nous prévoyons de décrire précisément plusieurs aspects des communications entre neurones et entre réseaux de neurones. Ces différents aspects du code neuronal pourront être mis en relation avec la perception et la décision des animaux, nous permettant ainsi de répondre aux questions précédemment posées. Les retombées attendues dépassent cependant la simple connaissance fondamentale. Une meilleure compréhension des schémas de communication intra-corticaux est cruciale pour optimiser les neuroprothèses sensorielles ou motrices : toute stimulation artificielle, pour être perçue comme naturelle, doit s’insérer en suivant une circuiterie et une signalétique préexistante. Enfin, plusieurs troubles psychiatriques, dont la schizophrénie, sont associés à une dys-connexion fonctionnelle entre aires frontales et sensorielles ; en identifiant les circuits qui normalisent la circulation d’information inter-aires ou inter-hémisphères, notre travail pourra orienter de futures stratégies thérapeutiques.

Procédures

Dans cette étude, souris et rats subiront quelques procédures mineures puis une chirurgie unique sous anesthésie générale. Identification et génotypage À ≥ 3 semaines, un micro-poinçon de l’oreille unique servira à marquer chaque animal et fournira le tissu pour le génotypage. (1-2 minutes) Chirurgie Sous anesthésie (1-2 h ; 6-7 h si injections bilatérales), un dispositif d’enregistrement/stimulation sera fixé au crâne. Habituation Après ≥ 1 semaine de récupération, les animaux seront progressivement habitués à la contention tête-fixe (quelques minutes par jour pendant ~7 jours). Entraînement comportemental Les animaux suivront ensuite 1-2 séances quotidiennes de tests comportementaux (20 min-1 h) sur une période pouvant atteindre 180 jours. En dehors des séances, l’accès à l’eau sera restreint (période maximum de 120 jours consécutifs. Pauses avec accès à l’eau ad-libitum durant 1 jour, chaque semaine durant cette période de 120 jours.). Hébergement Individuel Les individus seront hébergés individuellement durant l’entrainement comportemental, et après la pose du dispositif d’enregistrement/stimulation. (max période de 180 jours). Fin d’expérience À la fin du protocole, les animaux seront profondément anesthésiés puis euthanasiés.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales prévues peuvent induire plusieurs effets indésirables sur les animaux. Une douleur et un inconfort modéré peut survenir suite à la chirurgie d'implantation et de pose de fenêtre crânienne, pouvant durer jusqu'à quelques jours après l'intervention. Les animaux pourraient manifester par ailleurs des signes de détresse, d'inactivité, de mobilité réduite, de posture anormale, de défaut de toilettage ou d'altération du comportement exploratoire, dans les quelques jours (0 à 4 jours, le plus fréquemment 1 jour) suivant la chirurgie. Durant la période de restriction hydrique, les animaux pourront présenter une perte de poids contrôlée induisant potentiellement une sensation de soif, de faim ou de malnutrition modérée. Cette restriction peut également engendrer un stress physiologique et comportemental. Enfin, les effets de l’hébergement individuel des animaux pourraient augmenter leur état d’activité motrice durant les phases normalement associées au repos, dérégler leur apport en nourriture, augmenter leur anxiété et leur mémoire. Ces effets sont cependants mitigés en dessous de 4 semaines.

Devenir

Certains animaux ne pourront pas être réutilisés entre plusieurs projets, car les modifications neuronales spécifiques mises en place pour répondre à une question scientifique précise ne permettent pas de répondre à une autre question scientifique. De plus, ilIl est sera nécessaire pour chaque animal, de combiner les résultats obtenus sur à travers l'activité de sess neurones avec une analyse anatomique détaillée de la connectivité et la localisation de ces mêmes neurones. Cette analyse anatomique de leurs cerveaux dernière étape nécessite obligatoirement la mise à mort des animaux afin de prélever leurss tissus nerveux pour analyse. Ainsi, tous les animaux participant aux expériences de physiologie, qu'ils soient réutilisés ou non sur un ou plusieurs projets, devront être mis à mort à l'issue des expériences afin de réaliser cette étude histologique indispensable.

Remplacement

L'étude approfondie des interactions neuronales complexes au sein du système nerveux et de leur rôle dans les processus décisionnels en contexte comportemental nécessite impérativement l'utilisation d'animaux vivants capables d'interagir activement avec leur environnement. Actuellement, les alternatives non animales disponibles dans ce domaine incluent principalement les cultures cellulaires et les organoïdes cérébraux. Cependant, ces modèles présentent des limites importantes qui les rendent inadaptés à l’étude des processus décisionnels. En effet, les organoïdes cérébraux ne permettent pas d'étudier l'activité neuronale au sein de leurs circuits de manière réaliste. En l’absence d’une boucle sensori-motrice fonctionnelle, il ne peut y avoir de mise en place de circuit décisionnel, associant une entrée à une sortie en se basant sur l’expérience passée, autrement dit, une perception à une d’une décision d’action.

Réduction

Nous adoptons des taux d'erreur usuels pour ce type d’étude statistique. Les tailles d'effets sont estimées à partir d’études précédentes de l’équipe, ou d’études pilotes dans les cas où aucune donnée existante n'est publiée. Nous choisissons de comparer les stimulations qui produisent un effet comportemental observable tout en garantissant une utilisation minimale des animaux. Les propriétés statistiques des réponses neuronales et comportementales impliquent l’utilisation de tests spécifiques sur deux groupes indépendants. De manière générale, les mêmes animaux seront utilisés pour plusieurs mesures simultanées ou séquentielles, afin de réduire le nombre d’animaux au minimum.

Raffinement

Pour minimiser les nuisances sur le bien-être animal, plusieurs mesures seront appliquées tout au long du projet. Après la chirurgie, une surveillance renforcée sera maintenue pendant au moins cinq jours puis durant toute la phase expérimentale afin de détecter précocement toute infection, douleur ou détresse. Un stress hypothermique postopératoire étant possible, l’état thermique sera suivi ; la température des cages individuelles sera ajustée de 23-25 °C jusqu’à 30 °C durant la récupération. Si la détresse persiste, l’animal sera euthanasié. Des soins postopératoires adaptés seront systématiquement administrés : analgésiques et anti-inflammatoires oraux, renouvelés en cas de signes douloureux (absence de toilettage, posture anormale, perte de poids > 10 %), et antibiotiques en cas d’infection. Pendant la restriction hydrique nécessaire à la motivation, les animaux seront pesés quotidiennement. La perte de poids ne devra pas excéder 18 % (rats : 9 %) du poids de référence. Toute réduction > 18 % entraînera une double ration d’eau ou une hydratation sous-cutanée et, si le poids n’est pas rapidement rétabli, la sortie du protocole. Toute perte > 20 % conduira à l’euthanasie. Les animaux disposeront régulièrement d’un accès ad libitum à l’eau durant 24 h pour limiter l’inconfort. Pour compenser l’hébergement individuel requis par l’implantation, l’environnement sera enrichi (roue, objets à ronger, matériel de nidification, abris) et les animaux seront manipulés par les expérimentateurs plusieurs fois par jour. Lorsque seule une observation passive est nécessaire, les sessions seront regroupées sur une période maximale de quatre semaines, durée pour laquelle l’impact de l’isolement reste minime. Enfin, une veille scientifique permanente permettra d’intégrer toute nouvelle technique de raffinement validée afin d’améliorer continuellement les conditions expérimentales et le bien-être animal.

Choix des espèces

Les interventions chirurgicales de ce projet dans le cerveau de souris sont très utilisées / contrôlées, et bien décrites dans la littérature. Le grand avantage de la souris est la possibilité d'utiliser des animaux transgéniques pour étudier différents sous-types de neurones génétiquement marqués, et identifiable en microscopie. Celui du rat est sa plus grande capacité d’apprentissage et de décisions complexes lors de tâches de discrimination sensorielle. Ces considérations se traduisent par l'utilisation de souris pour certaines expériences, combinées avec celle de souris et de rats, pour d’autres. L’objectif scientifique étant d’étudier le fonctionnement neuronal normal et l’apprentissage chez l’adulte, nous utilisons des animaux mâles adultes (âge > 42 jours). Il est également important que les animaux soient adultes lorsque les implants chroniques sont placés de façon à ce qu'il n'y ait pas de tissu cicatriciel et de changements dans l'emplacement des électrodes.

12 744 souris vont être utilisées, chacune portant une plaie chirurgicale ouverte dans le dos puis contaminée par des bactéries, 12 720 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 24 sous anesthésie sans jamais être réveillées. Une partie reçoit d'abord deux injections destinées à effondrer leurs défenses immunitaires, puis les plaies infectées sont suivies par imagerie sous anesthésie à six reprises en quinze jours, avec jusqu'à deux prises de sang. Toutes sont tuées à la fin, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées parce qu'elles risquent d'être devenues porteuses asymptomatiques d'une bactérie pathogène. Les bénéfices annoncés pour les patients, une phagothérapie utilisable plus largement en clinique, restent à venir, quand la perte de plus de 20 % du poids corporel fixe déjà le seuil au-delà duquel une souris est tuée.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de développer un modèle préclinique d’infection liée à la formation de biofilm par plusieurs bactéries pathogènes et mimant les conditions d’infection chez l’homme. Il a aussi pour but de faire avancer les connaissances sur l’utilisation des bactériophages pour traiter ce type d’infection. Les bactériophages s’attaquent uniquement aux bactéries. Ils peuvent être envisagés pour tuer les bactéries résistantes aux antibiotiques notamment lorsqu’elles se développent sous forme de biofilms. Les connaissances qui seront acquises au cours de ce projet permettront de mieux appréhender le potentiel thérapeutique des bactériophages dans le but de permettre leur utilisation plus large en clinique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont d’abord la mise au point d’un modèle pertinent de plaies infectées chez la souris. De plus, le projet permettra d’étendre la compréhension des mécanismes mis en jeu lors de traitements par des bactériophages d’infections de plaies dues à différentes bactéries. Ces mécanismes comprennent à la fois les interactions entre les bactériophages et les bactéries mais aussi celles avec l’hôte et notamment son système immunitaire. Les résultats de cette étude pourraient être ainsi prédictifs de l’approche thérapeutique à déployer chez les patients. Ainsi, une meilleure compréhension de l’utilisation thérapeutique des bactériophages dans le cas de plaies infectées permettra d’envisager à terme une utilisation étendue de ce type de thérapeutiques dans des conditions optimales d’efficacité. Ceci pourrait permettre de réduire les échecs thérapeutiques de ce type d’infections lorsque les antibiotiques ont perdu leur efficacité, et ainsi augmenterait les conditions de vie des patients tout en réduisant le coût des frais hospitaliers.

Procédures

Les seules interventions sur animaux vigiles seront deux injections rapides à deux jours d’intervalles (20-30 secondes/souris) pour les souris traitées pour neutropénie. De plus, dans le cas où les souris seraient inclues dans le score 1 en termes de points limites, les souris recevront une injection (20-30 secondes/souris) d’analgésiques toutes les 8-12h jusqu’à disparition des symptômes de douleurs. Pour mimer les plaies aiguës chez l’homme, une plaie sera induite dans le cadre d’une procédure chirurgicale sous anesthésie. Elle est induite au niveau dorsal de la souris (Ensemble de la procédure 7-10min/souris). Au préalable de l’inoculation bactérienne, les souris seront traitées au niveau de la plaie par des dépôts directs au niveau plaie du produit candidat (20-30 secondes/souris). Dans les procédures 2 et 4, les souris seront suivies à J1, J2, J4, J7, J9 et J15 en imagerie sous anesthésie gazeuse (3-5min/souris). Pour suivre la réponse immunitaire, des prises de sang seront réalisées (1-2min/souris). Ainsi, au cours des expériences qui dureront au maximum 15 jours pour l’ensemble des procédures, les souris seront prélevées de leur sang au maximum deux fois (une fois par semaine).

Impact sur les animaux

Lors de nos expériences nous veillerons à impacter a minima le bien-être des souris. Les expériences consistent essentiellement à : - des injections pour l’analgésie sous anesthésie gazeuse, des prélèvements sanguins. La piqûre d'aiguille pour effectuer ces injections entraine une douleur légère de courte durée. Les prélèvements sanguins se feront en respectant le fait de faire au maximum un prélèvement sanguin par semaine et par animal en alternant les animaux prélevés. - une chirurgie pour la création de la plaie cutanée qui pourrait entraîner un stress et de la douleur. Ces gestes chirurgicaux se feront sous anesthésie gazeuse avec installation d’analgésie locale et systémique en amont et en post-chirurgie. - des protocoles infectieux qui entraîneront un inconfort et une douleur de sévérité modérée, et qui seront limités par l’utilisation d’un antalgique par voie sous-cutanée et le respect des points limites établis.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils seront mis à mort pour analyser des organes vitaux. De plus, la plupart auront été infectés par une bactérie pathogène. Cela implique que 1) leur défense immunitaire sera différente d’autres animaux non exposés à ce même pathogène et 2) ils sont potentiellement devenus porteurs asymptomatiques de cette bactérie pathogène et seraient donc susceptible de la transmettre s’ils étaient réutilisés.

Remplacement

Les modèles in vitro actuels sont malheureusement inappropriés pour reproduire la complexité d’un organisme entier et sa réponse à l’infection (système immunitaire). Il est donc primordial d’obtenir des résultats dans un modèle qui reproduit l’ensemble de la complexité d’un organisme entier. Concernant les bactériophages, l’utilisation de modèles mathématiques ne permet pas de refléter les éléments pharmacocinétiques.

Réduction

Des expériences in vitro seront réalisées en amont des expériences conduites chez l’animal afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires. D’autre part, autant que possible, le nombre maximal de paramètres sera collecté pour chaque animal de façon à limiter le nombre total d’animaux utilisés. Un maximum de 6 souris par groupe sera utilisé afin d’assurer une représentativité statistique minimale. Au maximum 3 répétitions seront réalisées de façon indépendante pour valider les résultats expérimentaux et augmenter la puissance des analyses statistiques. Pour les données quantitatives, la distribution normale et la variance des variables seront vérifiées et les tests statistiques appropriés seront alors choisis. Pour les variables qualitatives d’autres tests seront effectués. Les éventuels effets confondants (sexe et cage par exemple) seront pris en compte au moment de l’analyse. L’outil de bioluminescence sera utilisé pour évaluer l’évolution longitudinale de l’infection in situ, pour suivre le même animal au cours du temps, limiter les variations inter-individuelles et ainsi diminuer le nombre d’animaux requis.

Raffinement

Les animaux seront élevés en communauté selon les normes d’hébergement dans des cages ventilées avec enrichissement et au minimum du coton, avec maximum 6 souris par cage pour un meilleur confort et moins de stress. Ces conditions ne risquent pas d'augmenter les difficultés de cicatrisation ni les comportements agressifs. Une visite sera faite quotidiennement pendant l'acclimatation et après la chirurgie et l'infection. La surveillance des critères de douleur inclut l'état physique externe, les comportements (hyperactivité, isolement, indifférence), les réponses aux stimuli, et des pesées/journées de températures spécifiques. Une variation de poids supérieure à 20% sera un point limite. Une grille d’évaluation permettra de suivre l'état de santé des animaux. Sur le plan pharmacologique, des anesthésiant locaux et anti-douleur seront administrés avant et après la chirurgie, renouvelés tous les 8-12h pendant trois jours. Un anti-douleur sera aussi utilisé, le cas échéant après infection. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie gazeuse pour un réveil rapide et moins traumatisant. De plus, les animaux recevront du gel hydrique après la chirurgie. Ils seront accueillis dans des cages avec de la litière douce. Un bandage sera apposé sur les plaies. Nous appliquerons aussi un chauffage des cages par chaufferettes après chirurgie. L’ensemble de ces éléments nous permettront d’éviter l’hébergement individuel.

Choix des espèces

Dans la recherche préclinique, les modèles murins permettent d’intégrer un grand nombre des caractéristiques de la pathologie humaine. Le modèle murin est notamment considéré comme un bon modèle pré-clinique pour l’évaluation de stratégies visant à améliorer la guérison de plaies infectées. De plus, à ce stade expérimental du développement de la phagothérapie, la souris représente l’espèce la plus pertinente pour l’évaluation des paramètres pharmacocinétiques et l’innocuité du traitement. Il s’agit d’un mammifère dont le système immunitaire est bien connu et comporte de très grandes analogies avec celui de l’homme. L’utilisation d’autres animaux plus proches de l’homme (primates) ou de références en pharmacocinétique (porc) ne peuvent représenter des animaux de première intention à ce stade de nos travaux. Dans tous les cas, seuls des animaux adultes seront utilisés (>= à 7 semaines) car leur système immunitaire est arrivé à maturité au contraire d’animaux plus jeunes.

Génétiquement modifiées pour que le développement d'un cancer de la thyroïde puisse être suivi par imagerie, 60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. 20 sont opérées sous anesthésie sans jamais être réveillées, 40 subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection dans la thyroïde au cours d'une chirurgie unique de moins de vingt minutes, précédée et suivie de contentions courtes pour les injections d'anesthésique et d'analgésiques. Le projet se limite à vérifier que le geste fonctionne, et le porteur écrit ne pas pouvoir quantifier statistiquement une démarche qu'il qualifie d'exploratoire, retenant vingt animaux au motif que sept réussites sur dix suffiront à comparer ses méthodes.

Objectifs

Les cancers thyroïdiens représentent la tumeur endocrine la plus fréquente en Europe. Ces cancers sont majoritairement représentés par des carcinomes liés à des mutations dont le rôle est bien établi. Le ciblage thérapeutique et vaccinal de nouveaux mécanismes cellulaires récemment identifiés constitue des approches prometteuses dans plusieurs pathologies tumorales. Leur mise en application nécessite toutefois de bien comprendre les cellules tumorales à cibler. Actuellement, l’identification et la validation du rôle de ces nouvelles cibles dans les cancers thyroïdiens restent mal connus et doivent être étudiés dans des modèles souris pertinents pour l’Homme. Dans ce contexte, notre projet vise à mettre au point de nouveaux modèles pré-cliniques de cancers thyroïdiens. Notre demande a pour but de tester la faisabilité d’un modèle d’injection de composés pour induire le cancer de la thyroïde. Il sera mis au point sur un modèle de souris qui permet de suivre le développement cancéreux par imagerie.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à développer de nouveaux modèles murins pour l’étude des cancers de la thyroïde.

Procédures

Les animaux subiront de courtes contentions (inférieures à 30 secondes), 1 lors de l’injection de l’anesthésique et 3 lors des injections d’analgésiques. Ils seront également soumis à un acte chirurgical court et unique sous anesthésie de moins de 20 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront plusieurs contentions courtes qui pourront entrainer un stress. Ils subiront des injections sous-cutanées (anesthésie, pré et post antalgie) pour la réalisation d’une chirurgie sous anesthésie. Ces gestes pourront entrainer une légère douleur. Les animaux seront également soumis à un acte chirurgical sous anesthésie qui pourra induire des nuisances, comme du stress physique, thermique et de la douleur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales réalisées. Nous procéderons à des analyses histologiques et moléculaires complémentaires permettant d’exploiter au mieux nos résultats.

Remplacement

La caractérisation du fonctionnement hormonal et des mécanismes de cancérogenèse des organes endocrines comme la thyroïde ne peut pas, à l’heure actuelle être modélisée par des modèles cellulaires même complexes. Il en est de même pour les mécanismes de cancérogenèse qui du fait de leur complexité et leur hétérogénéité entre individus requièrent l’utilisation de modèle comme la souris. Des mises au point préliminaires ont été faites sur animaux morts afin d’éviter l’utilisation d’animaux vivants et maitriser le geste qui sera réalisé.

Réduction

Pour la mise au point de nos injections dans la thyroïde, notre démarche reste exploratoire et complexe à quantifier statistiquement. Nous n’utiliserons pas plus de 20 animaux pour la mise en place des gestes que nous proposons. Ce nombre nous permettra d’évaluer le taux de succès de nos approches. Ces travaux nous permettront également d’ajuster nos gestes pour limiter les contraintes expérimentales chez les animaux et de réduire leur nombre. Nous considérons que 7 animaux sur 10, correctement injectés nous permettront de quantifier et comparer l’efficacité de nos méthodologies. Ces travaux exploratoires et les quantifications qu’ils nous permettront d’obtenir, nous assureront de mieux définir le nombre d’animaux nécessaires à réaliser de futures études précliniques de médicaments.

Raffinement

Les gestes chirurgicaux seront faits sous anesthésie pour limiter tout stress et douleur. Nous mettrons en place une surveillance adaptée et individuelle des animaux afin d’assurer qu’ils ne subissent aucune souffrance inutile grâce à des observations des animaux (identification de signes évocateurs de mal-être ou de souffrance) pendant la chirurgie et sur les 48h qui suivront la chirurgie. La gestion de la douleur sera effectuée avec l’administration d’analgésique avant, pendant et après les gestes chirurgicaux. Afin de limiter la mobilité des animaux suite à l’opération, du gel d’hydratation et des croquettes seront mis à disposition directement dans la cage. Nous mettrons également en place des points limites pour éviter toute souffrance. L’observation attentive des animaux permettra également de mettre en place des soins nécessaires que nous n’aurions pu anticiper.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris modifiées génétiquement. Ces souris nous permettront de suivre l’efficacité de nos gestes expérimentaux et valider l’activation des mutations oncogènes que nous voulons étudier dans les cancers thyroïdiens. Les protocoles d’injection seront réalisés sur des souris âgées de 12 à 20 semaines, ce sont des âges où les souris sont passées à l’âge adulte (maturité physiologique) sans être trop avancés afin d’éviter les altérations dues au vieillissement.

380 souris vont être utilisées, toutes tuées, dont 152 saignées par ponction du cœur sous anesthésie sans réveil pour constituer des poches de sang. Les 228 autres subissent une transfusion et huit prises de sang en sept jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la transfusion pouvant provoquer une surcharge de volume avec insuffisance respiratoire et des complications oculaires. L'objet du projet est de trouver des marqueurs du dopage sanguin des sportifs, et cette version ajoute 128 animaux au protocole initial. Le porteur écrit qu'une étude de transfusion chez des volontaires humains serait "nécessaire" mais "complexe et coûteuse", et juge l'expérimentation animale "indispensable".

Objectifs

La transfusion sanguine est un moyen interdit mais très simple et efficace d'améliorer les performances sportives. En effet, un simple don de sang, sa conservation au froid et sa réinfusion quelques semaines plus tard augmentent le volume des globules rouges et la capacité d'oxygénation. Cette transfusion est difficile à détecter car le sang du donneur et du receveur sont très souvent identiques et le volume transfusé est faible: des méthodes très sensibles sont donc nécessaires pour la détecter. Une étude de transfusion avec des volontaires humains est nécessaire pour explorer les différents paramètres chez le receveur après la transfusion. Les études humaines sont toutefois complexes et coûteuses. L'utilisation d'un modèle animal permettra d'évaluer plusieurs paramètres en même temps chez le receveur. À cet égard, le modèle de souris a déjà été utilisé pour de nombreuses études dans le contexte transfusionnel. Au cours des dernières années, de nombreuses études et diverses approches ont été testées pour identifier les marqueurs de la transfusion. Pour ce faire, il est possible de caractériser les globules rouges dans la circulation du receveur après la transfusion, à la recherche des altérations bien connues des globules rouges qui se produisent pendant le stockage au froid en banque de sang. En effet, au cours de cette période, une série de modifications qui altèrent les globules rouges ont été décrites; ce qui pourrait permettre de détecter de très faibles niveaux de globules rouges préalablement stockés dans la circulation du receveur. Le besoin de nouveaux groupes expérimentaux nécessite une modification du projet initial avec ajout de 128 animaux

Bénéfices attendus

Le dopage reste un défi majeur dans le sport. Dans ce contexte, l'identification de nouvelles méthodes de détection est une priorité de l'Agence Mondiale Antidopage pour améliorer l'efficacité de la lutte contre le dopage. Ceci est particulièrement évident dans le contexte des transfusions sanguines pour lesquelles il n'existe actuellement aucune méthode de détection directe. Ainsi, ce projet permettra de valider de nouvelles méthodes. En cas de résultats encourageants dans cette étude animale, ce projet constituera une excellente base pour des études ultérieures, notamment avec des sujets humains ayant récemment reçu une transfusion sanguine. Ces méthodes pourraient facilement être mis à la disposition des laboratoires antidopage en cas de résultats prometteurs.

Procédures

Analgésie pendant 20min, puis anesthésie générale pendant 5 minutes, effectuée une seule fois. Prélèvement intracardiaque d'une souris analgésiée sous anesthésie générale pendant 1 minute, effectuée une seule fois. Transfusion sanguine sur animal vigile pendant 5-10 secondes, effectuée une seule fois. Anesthésie générale pendant 5 minutes, effectuée une seule fois. Prélèvement de sang sous anesthésie générale pendant 1 minute, effectué 1 seule fois. Prélèvement de sang sur animal vigile pendant quelques secondes, effectué 8 fois sur 7 jours.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables des procédures sur les animaux sont modérés. Stress induit par la contention, l'analgésie, la piqûre d'anesthésie, la mise en anesthésie, la transfusion et les prélèvements sanguins. L'anesthésie peut causer une hypothermie. La transfusion peut entraîner des complications oculaires et correspond à un apport aigu d’un volume circulant supplémentaire pouvant entraîner une surcharge volémique avec insuffisance respiratoire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de prélever du sang qui sera analysé.

Remplacement

Veille bibliographique permanente pour éviter toute expérimentation inutile ou redondante. L’expérimentation animale est indispensable pour évaluer in vivo, dans un modèle préclinique, l’impact de la transfusion sur les paramètres sanguins et biochimiques et les propriétés des globules rouges du receveur. Les expérimentations sur animal vigile ne peuvent pas être substituées par des approches in vitro, qui par ailleurs ne peuvent reproduire les conditions de dopage par réinfusion de sang.

Réduction

Le nombre de souris utilisé sera réduit au minimum tout en permettant une analyse statistique fiable des résultats. Les tests statistiques utilisés rigoureusement permettent l’analyse d’échantillons de petites tailles. Notre expertise des modèles de transfusion sanguine chez la souris ainsi qu’un test statistique nous informent que des groupes de 12 souris sont nécessaires pour générer des résultats robustes. Pour chaque souris transfusées le sang sera analysé par de multiples paramètres pour obtenir un maximum d'informations (numération formule sanguine, plusieurs marqueurs biochimiques, plusieurs propriétés du globule rouge). Certaines méthodes ont été optimisées afin d'être réalisées sur de très faibles volumes de sang prélevé, permettant un suivi longitudinal sur le même animal.

Raffinement

Les transfusions et prélèvements de petits volumes de sang (5µl) sur souris vigiles seront prélevées par du personnel expérimenté qui maîtrisent les gestes techniques. Hébergement adapté des animaux, enrichissement de l’environnement. Lorsque la procédure expérimentale le permet, l'analgésie et l'anesthésie est utilisée pour réduire l'inconfort de l'animal. Un protocole de surveillance du bien-être est défini a priori et appliqué pour chaque procédure, avec définition de points-limites basés sur un score composite d’items d'observations cliniques (apparence physique externe, changement de comportement des animaux, complications liées à la transfusion).

Choix des espèces

L'utilisation du modèle de banque de sang de souris déleucocyté et stocké pendant 14 jours reproduit les conditions de stockage d’une banque de sang chez l’homme et ceci est transposable aux dommages observés lors du stockage à froid pendant 42 jours d’une poche de sang humaine. Des souris jeunes adultes âgées de 6 à 8 semaines seront utilisées comme "receveuses" dans tous les modèles de transfusion permettant d’homogénéiser les groupes en terme de volume circulant et d’âge. Des souris adultes âgées de 10 à 12 semaines seront utilisées comme "donneuses" pour la réalisation des banques de sang maximisant le poids des souris et le volume à prélever.

120 souris sont tuées sous anesthésie pour prélever leurs cellules souches sanguines, injectées ensuite à des congénères irradiées afin de fabriquer des animaux portant la protéine CD99 soit sur leurs globules blancs, soit sur leurs vaisseaux. 920 souris au total vont être utilisées, aucune ne restant en vie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour les 800 receveuses et témoins. Trois injections réparties sur cinq jours déclenchent chez elles une vascularite avec atteinte rénale, suivie de mesures de la fonction rénale, un capteur restant fixé sur leur dos jusqu'à une heure, d'échographies cardiaques et de recueils d'urine, avec perte de poids modérée et parfois des ulcères cutanés. Les souris sont tuées 12 ou 30 jours après le déclenchement de la maladie pour analyser leur sang, leur urine et leurs organes.

Objectifs

Récemment, la protéine CD99 a été identifié comme un marqueur urinaire qui aide à prédire la survenue d’une insuffisance rénale aigüe (IRA) chez les patients, ainsi qu’un facteur protecteur face à une agression des reins chez les souris. Cette protéine est présente à la surface à la fois des globules blancs et des vaisseaux. Il a été découvert (travaux non encore publiés) une localisation inconnue de cette protéine dans l’organisme : au niveau d’un type particulier de cellules rénales qui jouent un rôle central dans le déclenchement de maladies rénales sévères, comme la vascularite associées aux anticorps anti-cytoplasme des neutrophiles (ANCA). Cette maladie grave, pouvant affecter plusieurs organes (dont le rein, le poumon, le cœur et la peau), est responsable d’une défaillance rénale complète et définitive chez 20 % des patients dans les 5 ans suivant le diagnostic, et s’avère même mortelle chez près de 15 % des patients dans la première année de la maladie. Compte-tenu de ces découvertes récentes concernant CD99, il apparait pertinent de caractériser comment les deux « versions » de cette protéine (« globule blanc » et « vaisseau ») influencent le risque de vascularite à ANCA grave, avant de développer des traitements ciblant CD99. Ce projet aura lieu au sein de deux établissements utilisateurs : EU1/2 et EU2/2.

Bénéfices attendus

Mieux comprendre les mécanismes de la vascularite à ANCA. Mieux comprendre le rôle de la protéine CD99 dans l’atteinte rénale par la vascularite à ANCA, dans l’objectif de développer des traitements de la vascularite à ANCA ciblant CD99.

Procédures

Dans un premier temps, au sein de l’établissement utilisateur n°1 (EU1/2), des animaux chimériques possédant la protéine CD99 soit à la surface de leurs globules blancs, soit à la surface des vaisseaux, seront produits. Pour se faire, des souris (« receveuses ») seront irradiées durant quelques minutes puis recevront une injection de cellules souches du sang par une injection au total de 10 secondes sous anesthésie générale gazeuse. Ces cellules souches proviennent d’autres souris préalablement euthanasiées (120 « donneuses » au total). Dans un second temps, les souris « receveuses » ainsi que des souris contrôles n'ayant pas été irradiées (représentant un total de 800 animaux) seront transportées vers l’établissement utilisateur n°2 (EU2/2) pour y développer une vascularite à ANCA avec atteinte rénale, à l’aide au total de trois injections (plusieurs anticorps et une molécule pro-inflammatoire) de 10 secondes chacune sous anesthésie générale gazeuse réparties sur 5 jours. Ces animaux seront soumis à des mesures de leur fonction rénale (2 mesures par animal) : sous anesthésie générale gazeuse, un capteur est fixé sur le dos de l’animal pendant 60 minutes maximum et une molécule est administrée par une seule injection de 10 secondes. Ces animaux seront aussi soumis à des mesures non-invasive de la fonction cardiaque par échographie (2 mesures par animal) pendant 10 minutes maximum, sous anesthésie générale gazeuse, sans injection nécessaire. Les prélèvements d’urine (maximum 5 répartis sur 8 semaines) auxquels tous les animaux seront soumis se feront de façon vigile mais indolore et non-invasive, puisqu’ils reposeront sur la collecte d’urine émise de façon réflexe par l’animal lors de sa préhension. Les animaux seront mis à mort 12 jours (modèle précoce) ou 30 jours (modèle tardif) après le début de l’induction de la vascularite, avec une injection de 10 secondes sous anesthésie générale gazeuse d’un agent léthal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles de l’irradiation sont une légère baisse de l'alimentation avec perte de poids minime durant les premiers jours post-irradiation. Les animaux peuvent ressentir un léger stress du fait de l'enfermement et du bruit au cours de la procédure. L'irradiation ne procure aucune douleur. Les prélèvements sanguins et les injections des agents provoquant la vascularite à ANCA peuvent provoquer du stress ou de la douleur. Le modèle de vascularite à ANCA provoque une altération attendue de la fonction rénale. Les effets indésirables possibles sont une baisse de l’alimentation avec perte de poids modérée mais stable, et des lésions cutanées de type dermites ou ulcères (néanmoins très rarement rapportés avec ce protocole) liées à la vascularite.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure en vue de l'analyse de leur sang, de leur urine et de leurs organes.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation sur des animaux est indispensable car la glomérulonéphrite liée à la vascularite à ANCA est impossible à reproduire en laboratoire. Une veille bibliographique est réalisée régulièrement par les responsables du projet pour prendre connaissance d’éventuelles nouvelles méthodes alternatives (plateforme de référencement des publications Pubmed, journaux de néphrologie comme Kidney International, participation à des congrès annuels internationaux de recherche de néphrologie comme l’European Renal Association, etc.).

Réduction

Notre équipe a noué une collaboration avec l’équipe ayant créé et publié cette version du modèle d’atteinte rénale par vascularite à ANCA, ainsi qu’une autre collaboration avec une équipe de recherche bordelaise utilisant ce protocole en routine depuis un an, ce qui nous permet de limiter certaines étapes de mise au point coûteuses en animaux. Le nombre d’animaux utilisé est calculé au plus juste d’après notre connaissance du modèle de sorte à obtenir des résultats statistiquement pertinents pour chaque paramètre principal et secondaire. De plus, nous valorisons l'ensemble de notre élevage de souris à l’EU1, puisque nous utilisons les deux sexes. Il est prévu de recourir à un maximum de 920 souris. Les résultats seront interprétés en utilisant des tests statistiques communément utilisés en biologie.

Raffinement

Les études sont optimisées d’après la littérature et les observations réalisées par nos collaborateurs ayant créé ou importé ce protocole de vascularite à ANCA. Les animaux seront hébergés dans des services de zootechnie agréés par le ministère, par groupes de 4 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec alimentation et eau à volonté. Ils seront observés scrupuleusement (apparence générale, comportement, absence de plaies...) afin de s’assurer de leur bien-être, et pesés deux fois par semaine. Pour les changes et les manipulations, les souris seront tenues dans la main de l’expérimentateur mais ne seront jamais suspendues par la queue. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale. Les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures, euthanasie si signes de souffrance irrémédiables). Une échographie cardiaque permettra de dépister une atteinte du cœur de façon précoce. Concernant le transport (maximum 20 minutes) des animaux entre l'EU1/2 et l'EU2/2, il sera effectué sur des souris aptes à supporter le voyage et dans des conditions telles qu’elles ne puissent être blessées ou subir des souffrances inutiles. Le transport sera effectué suivant une procédure déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport), impliquant une société agréée qui effectue de manière régulière la navette entre l'EU1/2 et l'EU2/2.

Choix des espèces

L’espèce utilisée permet d’utiliser le moins d’animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. Nous utilisons le plus souvent la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données scientifiques et qu’il existe un nombre important de modèles de souris adaptés à l’étude de maladies affectant le rein. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 7 à 13 semaines au début du protocole expérimental. À cet âge, les reins sont pleinement développés, ce qui permet de modéliser au mieux les conditions cliniques adultes.