Procédures sans réveil
Pré-etude dans le cadre d’une mise au point d’un capteur embarqué pour mesurer le transit instestinal chez le porc
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
Trois porcs femelles vont être anesthésiés dix heures d'affilée, puis tués sans reprise de conscience. Douze heures de mise à jeun précèdent l'intervention. Chaque animal reçoit un cathéter veineux à l'oreille, un cathéter vésical transpubien, une capsule électronique poussée jusqu'au bulbe duodénal par endoscope souple et une sonde de manométrie, avant quatre passages au scanner X dont un post-mortem suivi d'une autopsie. Le dispositif testé, une capsule de 1,2 sur 0,8 cm, vise à mesurer la vitesse du transit digestif chez des patients humains, et le porteur avance qu'il permettrait à terme de s'affranchir d'animaux non-humains opérés, tout en affirmant que le recours à l'animal est ici rendu "nécessaire" parce que rien ne peut être reproduit in vitro ou in silico.
Objectifs
Ce projet constitue une étape dans le développement d’un dispositif autonome visant à mesurer en temps réel la vitesse du transit digestif chez le patient humain, en utilisant le porc comme modèle translationnel. À terme, ce dispositif, basé sur l’ingestion d'un capteur miniature (capsule de 1,2 × 0,8 cm), a pour vocation de détecter de manière non invasive des anomalies du transit susceptibles d’indiquer des pathologies digestives. Ce système est complémentaire d'une solution commerciale déjà existante, qui permet une visualisation digestive mais nécessite une interaction humaine pour définir des points de référence. Une fois validée, cette nouvelle technologie pourrait également être utilisée chez le porc dans un contexte expérimental (études de nutrition) ou clinique. L’objectif spécifique de l’étude proposée est d’évaluer la capacité de cette technologie in vivo. La première étape expérimentale consistera à valider le franchissement du torus pyloricus, barrière anatomique spécifique du porc, avant de suivre le déplacement de la capsule dans les segments intestinaux situés en aval du pylore par scanner X, pendant une durée maximale de 10 heures.
Bénéfices attendus
Évaluer in vivo la capacité du dispositif à être localisé en temps réel dans le tube digestif d’un modèle translationnel de taille adaptée à un scanner X. Au-delà des applications en santé humaine, ces nouveaux dispositifs pourraient, à terme, permettre de s’affranchir de l’utilisation d’animaux opérés et/ou de marqueurs indigestibles pour la mesure du transit digestif.
Procédures
Le projet prévoit l’utilisation de trois porcs femelles. Chaque animal sera soumis à une procédure unique, non répétée, d’une durée maximale de 22 heures, incluant 12 heures de mise à jeun (solides uniquement) suivies de 10 heures d’anesthésie générale continue sans réveil. L’anesthésie est induite par isoflurane au masque. Elle est ensuite maintenue par perfusion de propofol en contrôle de concentration cible. Les dispositifs suivants sont mis en place : - Cathéter veineux auriculaire (pour propofol, solutés, érythromycine si besoin) - Cathéter vésical transpubien sous échoguidage (pour assurer une diurèse appropriée) - Insertion d’une capsule électronique dans le bulbe duodénal par les voies naturelles, à l’aide d’un endoscope souple - Insertion d’une sonde de manométrie pour enregistrer les contractions gastriques et duodénales Quatre examens d’imagerie (scanner X) sont réalisés : un examen initial (franchissement pylorique), deux examens intermédiaires (suivi du transit) et un post-mortem (localisation finale), suivi d’une autopsie. Aucune reprise de conscience n’est prévue. L’euthanasie est pratiquée sous anesthésie profonde par injection intraveineuse de T61.
Impact sur les animaux
Le projet sera réalisé en veillant à ce qu’aucune angoisse, douleur ou souffrance inutile ne soit ressentie lors de toute intervention sur les animaux. L’ensemble du protocole se déroulera sous anesthésie générale, avec un monitoring complet garantissant l’absence de douleur et l’absence de retour à l’état de conscience. Jeûne préalable (solide uniquement) : ce jeûne peut induire une sensation de faim susceptible de générer un inconfort temporaire. Ce risque est toutefois atténué par l’absence de jeûne hydrique. Induction et maintien de l’anesthésie générale : des effets indésirables potentiels liés à l’isoflurane et au propofol sont possibles (hypotension, hypothermie, bradycardie, dépression respiratoire). De plus, l’intubation trachéale comporte des risques d’irritation locale et de microtraumatismes des voies respiratoires. Position en décubitus ventral prolongé : malgré l’anesthésie et la surveillance, il existe un risque d’hypoventilation, d’hypoxie ou de compression des organes. Insertion des dispositifs (endoscope, sonde manométrique) : peut provoquer une irritation muqueuse ou une stimulation mécanique locale. Ces effets indésirables sont identifiables et surtout quantifiables avec les méthodes de monitoring proposées. Les solutions pour les combattre sont précisées dans le paragraphe "déroulé du projet".
Devenir
Le projet implique des procédures expérimentales lourdes, nécessitant une anesthésie générale continue de longue durée (jusqu’à 10 heures), sans interruption, ni reprise de conscience. Le sort prévu est donc l’euthanasie en fin de procédure, sans réveil.
Remplacement
Le recours à l'animal est rendu nécessaire car il s'agit de suivre le déplacement d'une capsule à visée médicale dans le tube digestif. Le déplacement de la capsule est assurée par la mobilité du tube digestif. A ce stade des travaux, cette étude ne peut pas être reproduite in vitro ou in cilico
Réduction
Le nombre d’animaux est limité à trois porcs, défini comme strictement nécessaire pour valider la faisabilité technique du protocole (franchissement pylorique, maintien du transit, imagerie). Le protocole est conçu comme une étude exploratoire, préalable à d’éventuelles études fonctionnelles. Les données issues de cette phase permettront d’optimiser les paramètres techniques et d’éviter l’utilisation ultérieure d’animaux inutiles. Chaque animal fera l’objet d’un suivi complet multiparamétrique (capsule, manométrie, imagerie), maximisant les données récoltées par individu.
Raffinement
Dans une situation où l’un des deux points limites suivants serait atteint - échec du positionnement de la capsule en raison de l’impossibilité de la placer dans le bulbe duodénal par voie naturelle, ou déséquilibre anesthésique incontrôlable entraînant des réponses incompatibles avec la stabilité physiologique nécessaire à la poursuite de la procédure-, l’essai serait immédiatement interrompu pour les animaux concernés.
Choix des espèces
Le porc est connu pour être une espèce modèle pour l'homme. Il reste un animal proche de l’Homme, avec de grandes similitudes anatomiques et physiologiques notamment pour le tube digestif Nous utiliserons des porcs conventionnels de 60 - 70 kg, car ce sont les animaux les plus couramment utilisés comme modèle de l’homme pour l’étude de la physiologie digestive.
Isolement de cellules stellaires et d’hépatocytes à partir de foie de souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Prises parmi les animaux de réforme de l'animalerie, 250 souris vont être opérées sous anesthésie générale et tuées avant tout réveil. Chaque intervention dure quinze à vingt-cinq minutes : ouverture de l'abdomen, puis perfusion du foie avec des solutions enzymatiques pour en détacher les cellules. Le porteur cherche à isoler des cellules stellaires et des hépatocytes vivants, destinés à tester en culture des molécules contre la fibrose du foie avant tout essai sur animal entier. La mort survient au cours de la procédure elle-même, par l'ouverture de l'abdomen et l'exsanguination liée au lavage du foie.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de récupérer des cellules primaires (stellaires et hépatocytes) à partir de foies de souris. Ces cellules sont impliquées dans le développement de tissu cicatriciel dans le foie, une complication fréquente des maladies chroniques du foie comme la MASLD. Elles seront utilisées pour évaluer les effets de vésicules extracellualire d’origine bactérienne sur le développement de la maladie et tester l’efficacité de nouvelles molécules en culture cellulaire, avant d’envisager des essais sur l’animal entier. Cela permet de mieux comprendre les mécanismes de la maladie et de préparer le développement de futurs traitements.
Bénéfices attendus
L’utilisation de cellules primaires (directement isolées du foie) permet une évaluation plus fiable et pertinente que les lignées cellulaires immortalisées, souvent utilisées en laboratoire mais altérées sur le plan génétique et fonctionnel. Ces cellules serviront notamment à réaliser un premier tri des molécules thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés, puis une chirurgie sera pratiquée pour accéder au foie. Une perfusion de solutions enzymatiques permettra de détacher les cellules. La mise à mort est réalisée à la suite de la procédure, sans réveil. La durée prévue de cette procédure est de 15 à 25 minutes
Impact sur les animaux
La procédure inclut une anesthésie générale, une laparotomie (ouverture de l’abdomen), une perfusion hépatique. Les douleurs liées à la chirurgie sont anticipées par l’administration d’analgésiques avant l’intervention.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en cours de la procédure, du fait de la réalisation d'une laparotomie et de l'exanguination du au lavage du foie et la récupération du foie.
Remplacement
À ce jour, il n’est pas possible d’obtenir des cellules stellaires et hépatocytaires primaires autrement qu’à partir de tissus hépatiques frais. Les modèles in vitro existants (cellules immortalisées ou cultures artificielles) ne permettent pas de reproduire fidèlement les fonctions et réponses de ces cellules. L’extraction directe reste donc indispensable pour les objectifs scientifiques de ces projets.
Réduction
Seules des souris de réforme issues de l’animalerie seront utilisées, ce qui évite l’élevage d’animaux supplémentaires. La méthode d’extraction choisie permet un rendement cellulaire élevé à partir de peu d’animaux, limitant le recours à des prélèvements multiples. Par ailleurs, le recours à des phases de test en culture cellulaire en amont des essais in vivo permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires à moyen terme.
Raffinement
La douleur et le stress sont pris en charge à chaque étape : analgésie préventive, anesthésie générale, anesthésie locale aux points d’incision. La procédure est courte, réalisée par du personnel expérimenté. Les souris sont hébergées en groupe, dans un environnement enrichi (cabanes, papier, tubes…), respectant les besoins comportementaux de l’espèce.
Choix des espèces
La souris est l’espèce de référence pour l’étude des maladies du foie, en raison de ses similarités physiopathologiques avec l’humain. Les animaux utilisés seront des souris adultes de plus de 12 semaines, issues des lots de réforme de l’animalerie. Ce choix permet de disposer de foies matures tout en valorisant des animaux qui ne sont utilisés dans d’autres projets.
Etude des mécanismes neuronaux de l’apprentissage moteur itératif chez la Souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
200 souris vont être utilisées, chacune subissant une chirurgie du crâne de quatre-vingt-dix minutes puis, jusqu'à deux mois durant, trente minutes par jour la tête fixée dans un dispositif. Une partie d'entre elles est opérée sous anesthésie et tuée avant tout réveil, les autres relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées pour prélever leur cerveau. L'apprentissage étudié consiste à souffler de l'air sur l'œil de l'animal après un signal lumineux, jusqu'à ce qu'il ferme la paupière au signal seul. Le porteur situe ce travail dans la recherche fondamentale et renvoie à un repérage seulement "possible" de pathologies de l'apprentissage.
Objectifs
Le cerveau est composé de très nombreuses cellules nerveuses qui communiquent entre elles via des synapses. La recherche fondamentale en neurosciences vise à comprendre comment ces éléments relativement simples mais nombreux peuvent se concerter pour assurer les fonctions complexes du cerveau. Ce projet s'intéresse à l'apprentissage de gestes par la répétition, un processus présumé impliquer une partie du cerveau appelé le cervelet. Il existe plusieurs théories qui tentent d'expliquer la concertation des cellules nerveuses pour permettre ce type d'apprentissage. L'objectif de ce projet est de mener des mesures au cours d'un apprentissage progressif chez la souris pour tester les théories concurrentes. L'apprentissage étudié consiste en un clignement de la paupière en réponse à un petit souffle d'air dirigé vers l'oeil. Si de façon répété le souffle d'air est précédé par un signal lumineux, initialement sans effet, l'animal développe un clignement suite au signal lumineux avant même que le souffle n'ait lieu. Il est connu que le cervelet intervient dans cet apprentissage. Nous mesurerons l'activité des cellules nerveuses pendant l'apprentissage. Dans d'autres expériences, nous influencerons leur activité pour voir si et comment l'apprentissage est modifié. En parallèle, nous quantifierons le nombre de certaines protéines d'intérêt aux synapses du cervelet. Ces mesures et manipulations nous permettront de tester l'adéquation des théories différentes et si besoin était en proposer de nouvelles. L'apprentissage est un processus primordial dans le fonctionnement du cervelet et notre projet vise à approfondir nos connaissances des mécanismes sous-jacentes.
Bénéfices attendus
Le fonctionnement détaillé du cerveau reste largement inconnu et constitue aussi un chantier central pour la compréhension de cerveau ainsi que de ses dysfonctionnements. Notre projet vise à comprendre au niveau synaptique, cellulaire et du réseau l'apprentissage et optimisation de mouvements par la répétition. Au delà de l'importance de cette problématique spécifique et l'intérêt de ce type de travail pour la recherche fondamentale, il est possible qu'à terme la compréhension des mécanismes de l'apprentissage nous permettrait d'identifier des pathologies liées aux dysfonctionnements de l'apprentissage et/ou proposer des thérapies basées sur l'apprentissage.
Procédures
Une partie des animaux seront impliqués dans une chirurgie (90 minutes) au niveau du crane et du cerveau sous anesthésie et analgésie. Après récupération ils suivent un protocole d'apprentissage et des mesures d'activité neuronale (30 minutes par jour) pendant une période allant jusqu'à 2 mois. D'autres animaux sont impliqués dans une procédure (45 minutes) sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus ou envisageables sont les suivants. Stress (estimé faible) lié à l'hébergement, à la manipulation, à la contrainte d'être maintenue tête fixe, au jet d'air, au gêne dû à l'implant. Pendant la chirurgie, des évènements rares : anesthésie insuffisante, détresse respiratoire, douleur, écart de température, saignement. En période post-opératoire, des évènements rares : douleur, écart de température, infection, notamment des plaies autour de l'implant, signe neurologiques dus à l'implantation de l'électrode ou l'injection de virus. Avant l'euthanasie, des évènements rares : anesthésie insuffisante, douleur, détresse respiratoire, saignement.
Devenir
L'euthanasie de tous les animaux dans toutes les procédures est nécessaire afin de permettre le prélèvement du cerveau pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Le projet vise à comprendre les l'apprentissage moteur. Une analyse théorique préalable a permis de faire des hypothèses précises, mais les tester nécessite des mesures lors du comportement, in vivo. Des techniques de modélisation seront utilisées pour analyser les résultats et pour concevoir les expériences suivantes. Cela optimisera le rendement de l'expérimentation animale. Les expériences in vitro visent à étudier l'implication du cervelet dans cet apprentissage et nécessitent de prélever le tissu chez l'animal après l'apprentissage in vivo. Des méthodes de culture ne sauraient reproduire la structure 3-dimensionnelle du cervelet ni l'influence de l'expérience de l'animal.
Réduction
En total 200 souris seront nécessaire pour ce projet. Les effectifs ont été estimés suivant un calcul de puissance basé sur des expériences précédentes. Une analyse statistique optimisée sera appliquée pour interpréter de manière fiable les résultats.
Raffinement
Les animaux commandés auprès d'un fournisseur agréé externe bénéficient d'une semaine d'acclimatation suivant leur arrivée. Tous les animaux sont hébergés dans une animalerie respectant l'ensemble de normes sur la température (régulée à 22 C), ventilation (salle d'hébergement centrale en surpression), hygrométrie (55 pourcent), nourriture et eau ad libitum, change de litière (hebdomadaire), socialisation (plusieurs souris par cage, maximum 6), vérification quotidienne. Enrichissement avec papier Kraft ou de type igloo. Avant la chirurgie, les animaux sont habitués progressivement à la présence de et à la manipulation par l'expérimentateur (4 séances minimum). La chirurgie a lieu sous anesthésie et avec administration d'un analgésique péri- et postopératoire. L'ensemble des interventions ont été regroupées afin de pratiquer une seule chirurgie. La récupération post-opératoire est aidée par un tapis chauffant. Les animaux opérés bénéficient d'un temps de récupération (minimum une semaine). Avant les expériences comportementales, les animaux sont habitués progressivement au poste expérimental. Un comportement où le renforcement n'est que légèrement aversif (un bref jet d'air vers l'oeil) a été sélectionné. Pour l'euthanasie avant le prélèvement du cerveau, une anesthésie profonde est pratiquée. Des points limites adaptés ont été définis pour l'ensemble des phases du projet et seront appliqués.
Choix des espèces
La Souris représente un modèle important des mammifères, fournit une grande partie des travaux de la littérature existante sur lesquels le projet se base, offre des outils génétiques optimisés. Les procédures expérimentales ont été optimisées chez la Souris pour réduire la souffrance des animaux. Le projet utilise des souris adultes exclusivement, âgées au 2--3 mois. Le projet vise à comprendre les mécanismes d'apprentissage de l'adulte.
Etudes d’un gène impliqué dans la génération et la disparition des neurones transitoires chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
4 140 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs organes, dans des procédures allant de l'anesthésie sans réveil à un niveau de souffrance modéré. L'essentiel se joue sur des souriceaux de sept à dix jours, coussinets des phalanges tatoués, bout de queue coupé, puis pour certains une chirurgie du cerveau sous anesthésie et analgésie profondes. Le bénéfice annoncé est d'étendre les connaissances sur le rôle des deux formes d'un gène dans l'apparition et la disparition des neurones transitoires, sans application thérapeutique évoquée. Le porteur justifie le chiffre de 4 140 par une seule phrase, l'emploi du minimum d'animaux déterminé par une approche statistique adaptée, sans donner ce calcul.
Objectifs
Le projet porte sur les neurones transitoires qui sont essentiels pour un développement correct du cerveau, ils permettent de coordonner la mise en place des circuits neuronaux. Le rôle d’un gène qui est fortement exprimé dans ces neurones, et qui peut s’exprimer sous deux formes, sera étudié. L'expression de ces deux formes alterne au cours du développement. Le projet vise ainsi à étudier les deux formes du gène afin de comprendre leur impact sur la génération des neurones, leur survie au cours du développement et sur la mort cellulaire après la naissance.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est d’étendre nos connaissances sur la physiologie des neurones transitoires ainsi que sur le rôle des deux conformations de notre gène d’intérêt dans le développement du cerveau
Procédures
Les souriceaux subiront un tatouage des coussinets des phalanges et une biopsie à la queue, ses actes seront réalisés avec une contention de l’animal de quelques secondes. Certains animaux subiront une injection intrapéritonéale pour anesthésie et analgésie profonde sous contention pendant quelques secondes suivie d'une intervention chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie profonde.
Impact sur les animaux
La biopsie à la queue et le tatouage des phalanges provoque une légère douleur de courte durée. Les injections de l’anesthésie peuvent induire une légère douleur de courte durée. Les étapes d’anesthésie et de contention peuvent également provoquer un stress chez l’animal.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure pour prélèvement d'organes et analyses prévus dans le projet
Remplacement
Il s’agit d’études portant sur le développement et le fonctionnement du cortex cérébral, qui ne peuvent être reproduites que dans le contexte du mammifère. À ce jour, aucun modèle in vitro ne peut reproduire l’ensemble des étapes de son développement dans toute leur complexité, ni la richesse des interactions entre les nombreux types cellulaires qui y participent.
Réduction
Les expériences sont réalisées avec le nombre minimum d’animaux nécessaire à l’obtention d’un résultat significatif déterminés par une approche statistique spécifique adaptée.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi avec accès illimité à l’eau et à la nourriture et sont gardés en groupe social. La souffrance des animaux sera réduite au maximum par l'utilisation d'anesthésie et analgésie adaptée. Pour toutes les expériences des points limites strictes adaptés ont été mis en place pour assurer le bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement et le fonctionnement du système nerveux, principalement en raison de la similarité du cerveau entre les rongeurs et l’Homme. Pour le marquage et la biopsie, les souriceaux ont entre 7 et 10 jours, âge auquel on peut tatouer les coussinets des phalanges. Les femelles gestantes sont des adultes. La chirurgie est menée sur des stades postnataux pour nous permettre de suivre la génération et la migration des neurones et d’observer leur disparition après la naissance et les conséquences éventuelles à long terme.
Evaluation de traitements susceptibles d’augmenter les taux de facteurs de la coagulation dans des pathologies hémorragiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Des souris génétiquement modifiées pour être déficientes en facteurs de coagulation, donc exposées à saigner, elles sont 1 210, dans des procédures allant de l'anesthésie sans réveil à un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une partie du protocole, biopsie de l'oreille, jusqu'à quatre injections réparties sur cinq semaines, jusqu'à trois prélèvements sanguins. Le test central consiste à sectionner les trois derniers millimètres de leur queue sous anesthésie et à mesurer pendant trente minutes le sang qui s'écoule, avant de les tuer sans les réveiller. Le porteur écrit que toutes sont tuées en fin de procédure en raison du volume de sang prélevé ou perdu, pour une approche destinée aux patients dont la forme de la maladie est jugée trop modérée pour justifier les traitements existants.
Objectifs
La coagulation sanguine représente l'ensemble des mécanismes mis en jeu lors d'une blessure, aboutissant à la formation d'un caillot sanguin qui va permettre l'arrêt du saignement en réparant le ou les vaisseau(x) sanguin(s) lésés. Ce processus fait intervenir de nombreuses protéines, appelées facteurs de coagulation. Il existe plusieurs maladies hémorragiques congénitales caractérisées par un défaut dans l'un ou l'autre de ces facteurs. Des traitements existent et ont démontré leur efficacité pour les patients atteints des formes graves de ces pathologies. Du fait de la lourdeur de ces traitements, ils ne sont pas administrés aux patients, plus nombreux, qui présentent des formes plus modérées. Ces patients ont en général un défaut partiel en facteur de la coagulation (et non un déficit total comme pour les formes graves). En absence de solution adaptée à leurs besoins bien spécifiques, les patients avec les formes modérées voient leur qualité de vie significativement altérée. L'idée du projet est donc de tester une nouvelle approche thérapeutique dédiée à ces populations de patients, basée sur l'idée d'utiliser leurs facteurs de coagulation résiduels et d'en augmenter la disponibilité.
Bénéfices attendus
Ce projet a vocation à améliorer la prise en charge des patients souffrant de formes modérées de différentes pathologies hémorragiques. Une approche similaire dans une pathologie autre que celles faisant l'objet du projet présenté ici devrait être testée prochainement chez des patients, ouvrant la voie à des essais cliniques à moyen terme pour les patients avec maladies hémorragiques congénitales.
Procédures
Les souris seront soumises à plusieurs interventions pendant la durée des procédures mais chaque souris individuelle ne subira qu'une partie de ces gestes: 1) 1 biopsie à l'oreille. Ce geste dure 2 secondes. 2) 1 ou plusieurs injections. Le nombre maximal est de 4 injections réparties sur 5 semaines. Chaque injection va durer 1-2 secondes. 3) 1 ou plusieurs prélèvements sanguins sous anesthésie. En cas de plusieurs prélèvements, leur nombre maximum sera de 3 dont le dernier qui sera terminal suivi d'une euthanasie par les méthodes réglementaires. Ces prélèvements durent entre 5 et 45 secondes. 4) 1 test de saignement sur souris anesthésiées, test consistant à couper les 3 derniers millimètres de la queue de la souris et à mesurer la quantité de sang perdu en 30 minutes, suivi d'une euthanasie par les méthodes réglementaires sans retour préalable à la conscience
Impact sur les animaux
Lors de la procédure d'élevage, un stress lors de la contention des animaux afin de réaliser le génotypage peut être généré. Les injections peuvent être associées à une légère douleur transitoire, de courte durée. Le prélèvement sanguin peut être associé à une douleur moyenne et une légère hémorragie, nécessitant d'exercer un point de compression. Le test de saignement est réalisé sous anesthésie pendant 30 minutes et les souris sont sous surveillance permanente.
Devenir
En fin de procédure et en raison du volume sanguin prélevé ou perdu, tous les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires et le constat de mort sera établi par des signes évidents de mort.
Remplacement
Le système de la coagulation est complexe et nécessite absolument un organisme vivant entier pour pouvoir être étudié de manière pertinente. Actuellement, il n'existe pas de techniques qui pourraient éviter le recours à l'animal.
Réduction
Seules 3 associations de molécules seront testés in vivo. Une dizaine de combinaisons sera produite et caractérisée in vitro et seules les combinaisons avec les profils biochimiques les plus prometteurs seront injectés aux animaux. Cela permet de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés. Par ailleurs, une analyse mathématique de puissance a permis d'établir le plus petit nombre d'animaux nécessaires au projet tout en s'assurant d'obtenir des résultats robustes et fiables.
Raffinement
Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes d’anesthésie et d'analgésie. L’ensemble des expériences seront effectuées par une personne habilitée à expérimenter sur animaux. Les souris seront surveillées pendant toute la durée de la procédure afin de s'assurer qu'elles ne montrent pas de signes de souffrance auquel cas un calcul de score permettra de définir les mesures à mettre en place.
Choix des espèces
Ce projet fait appel à des modèles murins déjà développés qui ont prouvé leur pertinence dans de nombreuses publications scientifiques. Il s'agit d'animaux génétiquement modifiés qui sont déficients pour différents facteurs de la coagulation, reproduisant ainsi les pathologies humaines. Pour ce projet, uniquement des animaux adultes des deux sexes seront utilisés, représentant au mieux la population humaine, susceptible de souffrir de ces pathologies.
Manipulation pharmacologique d’agents anti-agrégats chez un modèle murin du syndrome d’Ondine (MODIFICATION)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
1 182 souris porteuses de la mutation du syndrome d'Ondine vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures allant de la mise à mort sous anesthésie sans réveil à un niveau de souffrance modéré. Les nouveau-nées et les juvéniles sont anesthésiées puis tuées pour prélever une partie de leur système nerveux central. Les autres reçoivent des solutions dans le nez sous anesthésie et dans l'abdomen en vigile, avant soixante minutes enfermées dans une enceinte de mesure respiratoire, jusqu'à trois fois. Le porteur note que ces souris supportent mal l'anesthésie et risquent alors une défaillance respiratoire, tout en pratiquant sous anesthésie les administrations intranasales qui peuvent obstruer leurs voies aériennes.
Objectifs
Les syndromes d’hypoventilation alvéolaire centrale (SHAC) sont des pathologies associées à une dérégulation du fonctionnement du système nerveux autonome. Ces SHAC sont associées à une altération de la respiration et surviennent dès la naissance. Ces pathologies s’accompagnent d’une réduction voire d’une absence de réponse respiratoire à l’hypercapnie (trop de CO2 dans l’air inspiré) Cette réponse est vitale et nécessaire pour éliminer le CO2 de l’organisme. Elle est produite par les neurones du cerveau qui composent la commande respiratoire. L’endormissement et le sommeil s’accompagnent d’irrégularités respiratoires pouvant conduire à une situation d’hypercapnie. Ainsi, les personnes atteintes de ce syndrome doivent tout au long de leur vie supporter une aide ventilatoire dès qu’elles s’endorment. Le bon fonctionnement des cellules de la commande respiratoire, sensibles aux variations de CO2, dépend de l’expression d’un gène codant pour une protéine spécifique. Si le gène est muté, la protéine a une mauvaise structure et forme des assemblages protéiques anormaux (les agrégats) non fonctionnels. Les expérimentations seront réalisées chez des souris mutantes modèle d’un SHAC. Des approches utilisées chez des souris nouveau-nées et juvéniles permettront d’étudier la commande centrale respiratoire, d’identifier l’agent anti-agrégats le plus efficace et d’enregistrer l’activité des neurones respiratoires avec ou sans agents anti-agrégats, qui participent à la détection du CO2 dans l’organisme et à la mise en place de la réponse respiratoire à l’hypercapnie. Chez des mêmes souris juvéniles puis adultes, l’approche utilisée est non invasive. Elle permettra de déterminer l’effet bénéfique d’agents anti-agrégats sur la respiration. In fine, les données obtenues devraient donc permettre de mieux comprendre comment les agrégats impactent la respiration. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) permettront le développement de nouvelles pistes thérapeutiques dans le cadre des SHAC. MODIFICATION : l'ajout d'administration de molécule et de test physiologique nécessite une modification du projet initial sans ajout d'animaux.
Bénéfices attendus
Les souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine que nous utilisons dans ce projet sont porteuses d’une mutation sur un gène dont la protéine est exprimée dans une population de neurones indispensables à la réponse respiratoire à l’hypercapnie. A la naissance, ces souris ne présentent pas de réponse respiratoire à l’hypercapnie. Cette dernière est partiellement restaurée chez les souris adultes. L’inhibition de la formation d’agrégats protéiques pourrait potentiellement : 1/améliorer la respiration des souris nouveau-nées, juvéniles ou adultes. 2/restaurer une réponse respiratoire à l’hypercapnie chez les souris nouveau-nées ou juvéniles. 3/restaurer ou potentialiser la réponse respiratoire à l’hypercapnie des souris adultes. De plus, nous souhaitons 1/identifier les cibles cellulaires et moléculaires des agents anti-agrégats au niveau de la commande respiratoire et 2/déterminer si ces cibles évoluent selon l’âge des souris mutantes dont certaines récupèrent naturellement une faible réponse respiratoire à l’hypercapnie. In fine, les données obtenues devraient permettre de mieux comprendre comment les agrégats impactent la commande respiratoire. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) devraient permettre d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques chez les patients.
Procédures
Les souris mutantes et contrôles, nouveau-nées et juvéniles sont anesthésiées (quelques minutes) puis euthanasiées afin d’isoler rapidement une partie du système nerveux central. D’autres souris juvéniles (1 fois entre 12 et 15 jours) puis adultes (3 fois entre 1-6 mois) recevront une administration de deux solutions (48 heures séparent les 2 administrations) selon deux techniques : une sur animal sous anesthésie générale (10 minutes maximum) et l’autre sur animal vigile (moins de 10 secondes). Une mesure non invasive de la ventilation sera réalisée 1 fois chez les souris juvéniles puis 3 fois chez ces souris adultes pendant 60 min à chaque fois (1 fois par jour pendant 2 jours) dans une enceinte hermétiquement fermée et alimentée par un flux d’air en continu. L’acclimatation des animaux à ces enceintes a lieu pendant 1 heure par jour pendant les 5 jours qui précèdent l’enregistrement (hors week end). L’hébergement individuel des animaux est limité au maximum.
Impact sur les animaux
Les données de la littérature mettent en évidence une sensibilité exacerbée à l’anesthésie chez ces souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine ce qui conduit à un risque accru de défaillance respiratoire. L’administration intranasale des deux solutions peut entraîner une altération de la ventilation par obstruction des voies aériennes supérieures, sous anesthésie générale. L’administration intrapéritonéale (au niveau de l’abdomen) des deux solutions apparaît comme une source de douleur/un stress de courte durée. L'acclimatation aux enceintes de pléthysmographie et les mesures de ventilation pourront entrainer un stress social de courte durée chez les animaux.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des actes en vue des prélèvements et analyses nécessaires.
Remplacement
L’utilisation de neurones isolés en culture ne permet pas d’appréhender les relations entre les structures neuronales et de mettre en évidence le développement de réseaux substitutifs nécessaires à la correction de la pathologie. La fonction respiratoire nécessite l’utilisation de modèles murins ex vivo et in vivo. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande centrale respiratoire et aux neurones qui élaborent cette commande, dans des conditions qui ne peuvent être obtenues autrement que par un travail réalisé à partir de souris vivantes. L’étude de l’influence d’agents anti-agrégats sur la commande centrale respiratoire nécessite de conserver ex vivo un réseau vivant et fonctionnel de neurones et donc l’utilisation de souriceaux. L’étude des corrections des variables respiratoires par le(s) agent(s) anti-agrégats ne peut être réalisée que sur des souris vigiles, non contraintes et non anesthésiées.
Réduction
Nous utilisons aussi bien les souris mâles que les femelles (1182 animaux au total) dans nos travaux afin de limiter le nombre d’animaux mutants et sauvages (contrôles). La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et permet de mettre en évidence des différences biologiquement significatives dans les variables respiratoires. Des tests statistiques seront réalisés a posteriori pour procéder à une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes. L'isolement est évité au maximum. Le milieu des animaux est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. L’habituation aux enceintes de pléthysmographie (technique permettant de mesurer de manière non invasive la ventilation de la souris in vivo) se traduit par la disparition des épisodes d’augmentation anormale de la fréquence respiratoire et de toilettages des souris lorsqu’elles sont dans un nouvel environnement. Après 5 jours d’habituation, les souris sont calmes et leur respiration est régulière dès le placement dans l’enceinte. Les souris mutantes présentent une sensibilité exacerbée à l’anesthésie ce qui conduit à un risque accru de troubles respiratoires mortels lors des administrations intranasales sous anesthésie. Lors des administrations intranasales d’agents pharmacologiques, sous anesthésie gazeuse, avant l’enregistrement de leur ventilation, les souris sont sous surveillances accrue, jusqu’à leur réveil complet pour ainsi éviter l’arrivée de points limites (irrégularités respiratoires, obstruction des voies aériennes, arythmie cardiaques) et prévenir le décès non souhaité des animaux.
Choix des espèces
Les rongeurs (rats et souris) sont depuis de nombreuses années les espèces animales de choix pour l’étude de la respiration et de son contrôle nerveux. Le modèle animal de la pathologie sur laquelle nous travaillons, n’existe, de nos jours, que sur modèle de souris mutées pour le gène responsable de la maladie. Ces souris mutantes ont été validées par des études antérieures. Le projet nécessite d’avoir accès, chez ces souris mutées, au réseau de neurones qui contrôle la respiration à différents âges (stade nouveau-né et juvénile) pour l’étude de l’influence des agents anti-agrégats sur l’activité de ce réseau ; et d’étudier la respiration des souris (juvéniles et adultes) vigiles et de l’effet des agents anti-agrégats sur celle-ci, appliqués de deux façons différentes aux souris.
Projet matrice témoin chez les rongeurs
- Production de routine
- Tests réglementaires
Rats : 90
Saignés à blanc sous anesthésie puis tués, 900 souris et 81 rats fournissent du sang et du plasma exempts de molécule active, destinés à calibrer des méthodes de dosage. 100 souris et 9 rats, placés jusqu'à 24 heures en cage individuelle pour un recueil d'urine et de fèces, sont gardés vivants et réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur écrit qu'il est "indispensable" de disposer de cette matrice témoin et qu'aucune méthode alternative ne permet de la produire. Il précise qu'aucune approche statistique n'a été faite pour réduire le nombre d'animaux, le seul levier étant d'abaisser le seuil de quantification de la méthode analytique.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de fournir la matrice témoin (par exemple du sang, du serum, du plasma, urine , fécès) en utilisant les animaux contrôles et/ou les animaux de remplacement afin de permettre le dosage des échantillons. Si ces animaux ne sont pas suffisants pour recueillir les quantités nécessaires, exceptionnellement des animaux pourront être commandés dans ce but et devra être préalablement validé par la SBEA. Il est indispensable d'avoir à disposition de la matrice témoin, exempte de molécule active, pour pouvoir valider la méthode de dosage et valider les dosages.
Bénéfices attendus
Les matrices témoins permettent de réaliser une gamme ou des contrôles qualités pour quantifier la molécule dans le même type d'échantillon pour éviter un "effet matrice" (réponse de la molécule différente selon l'échantillon). Ainsi la moléculde d'intérêt se comporte de la même manière dans les échantillons qui servent à quantifier que dans ceux qui doivent être dosés. Cela valide le rendement d'extraction de la molécule d'intérêt et permet d'assurer l'exactitude de la méthode. Pour ce projet, il est envisagé d'utiliser environ 90 rats, 1000 souris sur 5 ans soit 18 rats et 200 souris par an. Cela représente environ 6 études rats et 20 études souris par an. C'est le nombre d'animaux minimal pour pourvoir fournir les quantités des différentes matrices témoins nécessaires.
Procédures
Pour un prélèvement de sang: Les animaux seront soumis à une anesthésie générale (anesthésie gazeuse) et un prélèvement terminal sera réalisé. Les animaux seront euthanasiés à la suite du prélèvement. La durée du prélèvement sera de l'ordre de la minute. Ce prélèvement sanguin servira à fournir de la matrice témoin en plasma ou en sang. Pour générer de la matrice témoin de féces ou d'urine, la collection d'échantillons se fera de manière individuelle dans des hébergements dédiés, sans manipulation. Les échantillons d'urine et de fecès seront collectés sans aucune manipulation des animaux, en individuel dans une cage prévue pour une durée maximale de 24h.
Impact sur les animaux
Pour réaliser le prélèvement de sang terminal, le placement de l'animal dans la boite d'anesthésie peut engendrer du stress. Pour effectuer des recueils d'urine ou de fècès de façon individuelle, l'animal sera placé dans une cage de recueil prévu à cet effet. Il aura un contact visuel et olfactif avec ses congénères et la durée maximale inférieure à 24h. Cela peut également engendrer un stress pour l'animal.
Devenir
Les animaux ayant eu un prelèvement sanguin terminal seront tous mis à mort. Le prélèvement terminal correspond à un prélèvement sanguin trop important correspondant la l'exsanguination de l'animal. La survie des animaux et leur réutilisation n'est pas possible. Le prélèvement sanguin terminal sera réalisé selon les bonnes pratiques vétérinaires et la réglementation en vigueur. Les animaux ayant eu seulement un recueil d'urine et de fèces pourront être gardés en vie et être réutilisés dans un autre projet ou pour générer de la matrice témoin sang, plasma, serum.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de générer de la matrice témoin, il est indispensable de recourir à l’animal. En effet la non utilisation de matrice témoin entraine un biais dans la méthode. Si l'échantillon qui permet la quantification est différent de celui à quantifier, la méthode n'est pas exacte.
Réduction
Pour ce projet, il est envisagé d'utiliser environ 90 rats et 1000 souris sur 5 ans soit 18 rats et 200 souris par an. C'est le nombre d'animaux minimal pour générer de la matrice témoin sur une durée de 5 ans. Aucune approche statistique n'a été faite pour réduire le nombre d'animaux dans ce projet. La seule méthode pour réduire ce nombre est de diminuer le seuil de quantification de la méthode analytique ce qui diminue les besoins en matrice et donc les besoins en animaux. Pour chaque demande, un formulaire justifiant les volumes et le nombre d'animaux nécessaire est demandé au Donneur d'Ordre.
Raffinement
Le prélèvement terminal et la mise à mort des animaux seront réalisés sous anesthésie générale en absence d'autres congénères. Les animaux sont placés dans le compartiment d'anesthésie un par un et le délai entre la mise dans le compartiment et le moment de l'endormissement de l'animal est inférieur à 2 minutes. La mise à mort des animaux se fait dans une autre salle pour éviter tout contact visuel ou olfactif chez les autres animaux en attente d'anesthésie, pouvant provoquer un stress pour eux. Pour les recueils d'urine ou de fécès, les animaux seront placés en cage de recueil individuellement mais auront toujours un contact visuel et olfactif entre eux. Une attention particulière sera portée à l'enrichissement du milieu. Les animaux hébergés en groupe auront, dans leurs hébergements, la présence d'enrichissements variés et renouvelés (buchettes et balles en bois, cachettes, tunnels ...). Un visite des hébergements est réalisée à minima 1 fois par semaine par le vétérinaire responsable. Dans ce projet les points limites sont : - Animal présentant une perte de poids supérieur à 20 % par rapport à son poids basal; - Animal ayant un comportement inhabituel (prostré, poils ébouriffé, signes d'agressivités); - Animal présentant des fèces liquides, diarrhéiques. Si l'un des points limites est atteint, alors l'animal sera exclu du projet et sera pris en charge par le vétérinaire désigné. L'animal pourra être euthanasié, décision prise par le vétérinaire désigné, conformément aux bonnes pratiques vétérinaires.
Choix des espèces
Dans les études précliniques, le rat et la souris sont les espèces de référence pour les études réglementaires, il est très souvent nécessaire d'avoir de la matrice témoin (sang, serum, plasma, excretas). Ceci est indispensable pour pouvoir valider la méthode de dosage et valider les dosages. Jeunes adultes ayant un âge entre 7 et 12 semaines environ. Cela dépendra des objectifs de l'étude pour laquelle la ou les matrices témoins seront collectées.
Mise au point expérimentale d’un poumon artificiel
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
Opérés six heures sous anesthésie puis tués avant tout réveil, 25 cochons sont utilisés dans les essais aigus d'un poumon artificiel portatif. Dix autres, opérés trois heures pour la pose d'une canule, sont ensuite maintenus vingt-huit jours dans un trolley-hamac qui restreint leurs mouvements afin d'empêcher l'arrachement du dispositif, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les 35 cochons sont tués pour prélever cœur, poumons, foie et reins. Le porteur écrit qu'aucun effet indésirable ni nuisance ne sont attendus pour les animaux opérés sans réveil, et décrit pour les autres une perte de poids possible, une déshydratation, une infection du site de ponction et une défaillance multiorgane.
Objectifs
L'intérêt d'un poumon artificiel portatif est de permettre à des patients inscrits sur liste de transplantation pulmonaire de pouvoir attendre la transplantation dans les meilleures conditions en leur permettant de marcher, de s'asseoir, de bouger, de faire des exercices donc de préparer au mieux leur transplantation alors que leur organe ne fonctionne plus. La machine comporte une canule innovante insérée dans une grosse veine du corps permettant d'extraire le sang désoxygéné, de le faire passer dans un circuit miniaturisé comportant un moteur et un oxygénateur puis de réinjecter le sang oxygéné au niveau de l'oreillette gauche. Il s'agit d'ajouter un 3e poumon, totalement artificiel, lui permettant d'assumer les fonctions d'oxygénation, de décarboxylation et permettant au cœur droit de fonctionner normalement.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont : A court terme, valider les résultats obtenus sur banc d'essai et sur la simulation du cœur imprimé 3D et obtenir des résultats préliminaires venant compléter le dossier pour le comité de protection de la personne humaine en vue d'une étude clinique chez l'homme (phase 1). A moyen terme, permettre aux patients en attente de transplantation pulmonaire, sous assistance cardio-respiratoire externe, de bénéficier d'une thérapeutique moins invasive avec la canule double flux développée dans ce projet. En effet, cette canule ne nécessite qu'un unique abord vasculaire haut, ce qui diminue le risque de complications vasculaires et offre plus de mobilité aux patients, leur permettant de s'installer en position assise. Ainsi, le déconditionnement des patients sera limité, et leur forme physique et psychologique sera meilleure que sous assistance cardio-respiratoire classique. Cela devrait mener à de meilleurs résultats post-transplantation. À long terme, la canule développée sera associée aux autres dispositifs du poumon artificiel portatif de ce programme : un moteur miniaturisé et un oxygénateur durable. La portabilité du dispositif permettra aux patients de se mobiliser (marche, soins de kinésithérapie notamment), et sa durabilité permettra aux équipes soignantes d'avoir plus de temps pour trouver un greffon.
Procédures
Les animaux des procédures aigues (25 animaux maximum et 21 minimum) seront soumis à une seule intervention sous anesthésie générale balancée sans réveil (6 heures). Les animaux de la procédure chronique (10 animaux maximum et 6 minimum) auront, sous anesthésie générale balancée, une interventionde mise en place de la canule double flux (3h). Ces animaux auront, après leur réveil, une restriction de mouvement car ils seront installés dans un trolley-hamac afin d'empécher tout arrachement du dispositif (durée 28jours).
Impact sur les animaux
Pour les procédures aigues : s'agissant de procédures expérimentales réalisées sous anesthésie générale balancée sans réveil, aucun effet indésirable ni nuisances ne sont attendus pour l'animal qui sera euthanasié en fin de procédure ou en cas d'échec de l'anesthésie. Pour la procédure chronique, les effets indésirables prévus sont:(1) douleur légère provoquée par la procédure d'insertion de la canule (perforation de la peau); (2) altération possible de l'état général : perte de poids, déshydratation, infection du site de ponction, défaillance multiorgane; (3) stress induit par la restriction de mouvement et les manipulations quotidiennes. Ces nuisances seront réduites au maximum grâce à la réalisation des procédures sous anesthésie générale balancée (hypnose et analgésie) et l'utilisation de mesures de raffinement appropriées.
Devenir
Pour l'ensemble des procédures nous devons récupérer plusieurs organes (coeur, poumon, foie, reins) des animaux pour évaluer l'impact de la mise en place de la canule et les effets du dispositif de perfusion.
Remplacement
Des tests sur banc d'essai et coeur imprimés 3D ont permis d'éviter le recours à l'utilisation d'animaux pendant la phase de prototypage de la canule. Le recours à des animaux vivant, de taille compatible avec l'implantation et le retrait de la canule, est indispensable afin de s'assurer de la faisabilité de cette procédure sans avoir d'impact négatif sur la fonction cardiaque. De plus les essais de performance à cours et moyens terme ne sont réalisable que sur des animaux vivants.
Réduction
Afin d'optimiser la méthodologie, l'équipe de recherche adoptent des méthodes statistiques avancées qui permettent d'obtenir des résultats robustes tout en réduisant considérablement la taille des échantillons nécessaires. L'utilisation de plans factoriels représente une approche particulièrement efficace pour maximiser la quantité d'informations recueillies à partir de chaque animal utilisé dans l'expérimentation. Le partage des données entre laboratoires constitue une stratégie essentielle pour éviter la duplication inutile d'expériences coûteuses en temps et en ressources. Nos protocoles intègrent une surveillance accrue des animaux avec des réévaluations fréquentes qui permettent d'interrompre une expérience dès que les résultats deviennent statistiquement concluants. Cette approche adaptative évite de prolonger inutilement les études lorsque les objectifs scientifiques ont été atteints plus rapidement que prévu.
Raffinement
Anesthésie et analgésie adaptées : Protocole anesthésique optimisé pour éviter toute souffrance durant l'assistance cardio-respiratoire externe. Analgésie post-opératoire efficace en cas de réveil des animaux pour d’autres évaluations. Amélioration des techniques chirurgicales : Utilisation de techniques mini-invasives pour la mise en place des canules d'assisatnce cardio-respiratoire externe afin de limiter les traumatismes. Surveillance continue pour ajuster rapidement les paramètres et éviter les complications. Enrichissement et soins post-opératoires : Amélioration des conditions d’hébergement pour limiter le stress des animaux (réduction de l’isolement, environnement adapté). Équipe dédiée pour surveiller l’état de santé et ajuster les soins en fonction des besoins individuels. Critères d’arrêt et d’euthanasie : Définition de critères précis pour éviter toute souffrance inutile (signes de détresse, défaillance multi-organique irréversible). Euthanasie réalisée dans le respect des protocoles éthiques pour éviter toute douleur.
Choix des espèces
Le porc présente une anatomie et une physiologie du système cardio-respiratoire similaire: débits cardiaques et résistances vasculaires proches de ceux de l’humain, réponse physiologique comparable aux situations d’hypoxie et de choc cardiogénique, taille et masse corporelle adaptées, réponse inflammatoire proche. L'anatomie cardiovasculaire est adaptée à la mise en place de l'assistance cardio-respiratoire externe permettant de tester les techniques de canulation sans nécessiter d’adaptations majeures. La structure pulmonaire est comparable, les échanges gazeux et les réponses à l’oxygénation mécanique sont similaires à ceux observés chez l’homme. Les porcs de 40-100 kg ont des dimensions proches de celles des patients adultes. Cela permet l’utilisation de cannules de l'assistance cardio-respiratoire externe standardisées pour l’humain, ce qui facilite la transposabilité des résultats. Pour une question de stabulation, nous utiliserons des animaux de 60kg.
Caractérisation de souris exprimant un facteur de la coagulation muté
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une biopsie de l'oreille d'une à deux secondes pour le génotypage, une piqûre pour endormir, puis une procédure de trente à quarante-cinq minutes dont elles ne se réveilleront pas : 460 souris vont être utilisées dans des procédures classées sans réveil ou légères. Le projet porte sur l'interaction entre les plaquettes sanguines et un facteur de la coagulation muté, dans la perspective de mieux caractériser des patients atteints d'une maladie hémorragique. Le porteur affirme que la coagulation "nécessite absolument un organisme vivant entier" et qu'aucun test adapté n'éviterait aujourd'hui le recours aux animaux non-humains. Il justifie la mise à mort sans réveil par le volume de sang à prélever, trop important pour que l'animal survive, et par des tests in vivo trop invasifs ou trop hémorragiques.
Objectifs
La coagulation sanguine représente l'ensemble des mécanismes mis en jeu lors d'une blessure, aboutissant à la formation d'un caillot sanguin qui va permettre l'arrêt du saignement en réparant le ou les vaisseau(x) sanguin(s) lésés. Ce processus fait intervenir de nombreuses protéines appelées facteurs de coagulation. Il existe plusieurs maladies hémorragiques congénitales caractérisées par un défaut dans l'un ou l'autre de ces facteurs. Il est important de bien comprendre comment ces facteurs de la coagulation interagissent avec d'autres protéines pour remplir leur fonction. Dans ce projet, nous allons étudier l'interaction d'un facteur de la coagulation avec les plaquettes sanguines qui sont des cellules vitales dans l'arrêt du saignement.
Bénéfices attendus
A court-terme, cette étude va nous aider à comprendre le rôle de l'interaction entre les plaquettes sanguines et le facteur de la coagulation étudié dans l'arrêt du saignement et dans les processus de thrombose. A plus long terme, ce projet permettra de mieux caractériser certains patients souffrant d'une maladie hémorragique due à un dysfonctionnement du facteur de la coagulation étudié.
Procédures
Les souris vigiles seront soumises aux gestes suivants: 1) 1 biopsie au niveau de l'oreille. Ce geste prend 1-2 secondes 2) 1 piqûre pour induire une anesthésie générale. Cette piqûre se fait en une seconde. Tous les autres gestes se feront sous anesthésie générale et à la fin de chaque procédure d'une durée allant de 30 à 45 minutes, les animaux seront euthanasiés sans retour au préalable à la conscience.
Impact sur les animaux
Lors du génotypage, un stress peut être généré lors de la contention des animaux afin de réaliser génotypage. Lors de la biopsie pour le génotypage une douleur transitoire peut intervenir.
Devenir
En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés. En effet, pour les tests ex vivo, les prélèvements sanguins nécessaires sont d'un volume trop important pour que l'animal puisse rester en vie. En ce qui concerne les tests in vivo, ceux-ci sont soit trop invasifs soit accompagnés d'une perte sanguine trop importante, justifiant leur classification "sans réveil".
Remplacement
Le système de la coagulation est complexe, et nécessite absolument un organisme vivant entier pour pouvoir être reproduit de manière pertinente. Actuellement, il n'existe pas de tests adaptés qui pourraient éviter le recours à l'animal.
Réduction
Une partie des tests sera fait sur du sang prélevé chez les souris d'intérêt. Ces tests in vitro nécessitent moins d'animaux car ils sont plus reproductibles que les tests in vivo. D'autre part, nous avons au fil des années acquis une expérience importante sur le type de tests qui seront mis en oeuvre dans ce projet. Nous pouvons donc anticiper avec une certaine confiance le nombre minimum d'animaux qui sera nécessaire à l'obtention de résultats interprétables et robustes d'un point de vue statistique. Si les résultats des premières expériences s'avèrent encore plus discriminants que nous avions anticipé, alors nous n'utiliserons pas toutes les souris prévues et nous arrêterons les expériences plus prématurément qu'anticipé.
Raffinement
Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximun l'inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie, traitement analgésiques...). Les animaux seront observés régulièrement afin de s'assurer de leur bien-être. Pour limiter le stress des souris, les animaux seront sortis de la zone d'hébergement de l'animalerie juste avant la procédure expérimentale. Les souris sont anesthésiées pendant l'intégralité des procédures expérimentales et analgésiées pour certaines procédures.
Choix des espèces
Le choix de la souris se justifie par des raisons d'ordres scientifiques, pratiques et éthiques. Sa génétique bien connue facilite la création de modèles transgéniques. La souris est l'animal de laboratoire le plus utilisé en hémostase par la communauté scientifique internationale ce qui permet de comparer les résultats obtenus. Enfin la méthodologie envisagée dans ce projet est adaptée au modèle murin et nous avons acquis au cours des années une expertise notable et de bonnes pratiques expérimentales avec cette espèce. Des souris âgées entre 8 semaines et 1 an seront utilisées pour le projet
Production de réactifs et de tissus issus d’animaux de ferme, dans le cadre de la production et du contrôle qualité des vaccins commercialisés ou en développement.
- Production de routine
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Moutons : 60
Poules : 1500
Dindes : 50
Autres oiseaux : 30
Saignés pour produire les géloses et les réactifs qu'un laboratoire pharmaceutique utilise pour fabriquer et contrôler ses vaccins, 60 moutons, 4 chevaux, 50 dindes, 30 oies et 1 500 poules vont être utilisés dans des procédures classées sans réveil ou légères. Un mouton donne une poche de 500 mL, un cheval une à deux poches de 200 mL cinq à six fois par an, une oie ou une dinde 40 mL toutes les quatre semaines. Chaque poule, elle, est ponctionnée au cœur sous anesthésie générale et tuée sans reprendre conscience. Le porteur indique que la demande en sang de cheval est tombée de 400 poches par an à une vingtaine grâce à un procédé de substitution, affirme que le choix des espèces est "historique", et annonce que les 144 animaux non tués seront proposés à l'adoption après évaluation vétérinaire.
Objectifs
La production de vaccins bactériens nécessite la culture de bactéries sur des géloses au sang. L’emploi de ce sang est décrit dans les dossiers d’AMM. Le contrôle de vaccins nécessite l’emploi de réactifs obtenus à partir de sang d’animaux. Les réactifs obtenus sont : - des globules rouges (servant pour des tests d’hémagglutination) - du sang total sur anticoagulant pour le coulage de géloses au sang. La direction de Sanofi Pasteur a décidé de la nécessité de poursuivre les investigations scientifiques et les essais de développement. Ces études de recherche et développement de vaccins nécessitent également l’obtention de sang ou de ses dérivés.
Bénéfices attendus
Les bénéfices escomptés résident dans la mise sur le marché de vaccins destinés à prévenir un large éventail de pathologies chez l’homme.
Procédures
Les animaux sont soumis à des prélèvements sanguins. Un mouton peut produire une poche de sang de 500 mL, le prélèvement dure 5 minutes environ. Il peut être prélevé au moins 4 semaines après ce prélèvement. Un cheval peut produire jusqu’à 10 poches de 200 mL selon les besoins, mais dans les faits, il n’est prélevé que pour une à 2 poches de 200 mL, 5 à 6 fois dans l’année. Le prélèvement dure 3 minutes environ. Une oie ou une dinde peut donner environ 40 mL de sang toutes les 4 semaines. Le prélèvement dure 1 mn. Enfin, une poule donne 40 mL de sang, sous anesthésie générale, par voie intracardiaque et est ensuite euthanasiée.
Impact sur les animaux
Pas ou peu d’effets indésirables sont attendus. Les gestes techniques sont simples et maitrisés par un personnel qualifié et expérimenté. Pour l’animal, la nuisance équivaut à la pénétration d’une aiguille. La contention adaptée des animaux réduit considérablement le temps et le stress de la manipulation. Elle permet un geste précis et réduit considérablement les risques d’échec des ponctions veineuses.
Devenir
A l’issu d’un test, les animaux seront proposés à l’adoption. Une évaluation vétérinaire est toujours associée à cette décision. Ce n’est toutefois pas le cas des poules qui sont euthanasiées suite à la ponction cardiaque sous anesthésie générale
Remplacement
Lorsque la science le permet, la société utilise des réactifs « animal-free ». La société travaille activement sur des réactifs alternatifs sans produit d’origine animale. C’est le cas par exemple de la production d’Haemophilus qui jusque-là nécessitait l’emploi de sang défibriné de cheval lors de la confection des géloses au sang. La société a mis au point un nouveau procédé qui permet de substituer ce sang. La demande en sang de cheval a considérablement diminué (passant de 400 poches/an à une vingtaine aujourd’hui) couvrant uniquement des besoins spécifiques en développement. Pour autant, il existe encore des procédés ou des contrôles qui nécessitent le recours au sang animal.
Réduction
Le nombre d’animaux donneurs est calculé en fonction des besoins estimés. Les besoins des utilisateurs sont variables et dépendants de la production des vaccins, que ce soit pour la fourniture de gélose ou pour la fourniture de réactif pour les tests de contrôle qualité ou de R&D et amélioration continue. De ce fait, un effectif minimal est nécessaire pour assurer les besoins.
Raffinement
Les protocoles de prélèvement de sang sur animaux vigiles sont classés en léger. Le stress durant l’hébergement est limité par l’hébergement en groupe des animaux et l’enrichissement de leur environnement. Les protocoles de prélèvements terminaux sont classés « sans réveil ». La souffrance est réduite par le recours à l’anesthésie. Les animaux sont systématiquement prélevés dans des installations séparées des zones d’hébergement.
Choix des espèces
Le choix des espèces est historique. Le choix de l’animal est lié à l’acquisition de données par le passé. Par exemple : Certaines bactéries se développent mieux dans du sang de mouton que dans du sang de cheval, d’où le choix de l’espèce ovine. Certains tests de contrôle qualité (par hémagglutination) ne fonctionnent qu’avec des globules rouges d’oie, de dinde ou de poules adultes. Les volailles représentent des espèces de choix concernant les tests d’hemagglutination. Le choix de l’espèce des volailles dépend du type de tests réalisés. Les gros animaux ont été retenus en priorité pour les volumes importants de prélèvements qu’ils permettent. (Chevaux, moutons). Les procédés de production et de contrôle sont déposés dans les dossiers d’enregistrement. Les animaux sont adultes. Ils sont nécessaires afin de recueillir leurs globules rouges, utilisés dans un test d’hémagglutination très spécifique.
Impact d’une manipulation des contrôles inhibiteurs des neurones dopaminergiques en modèles de maladie de Parkinson EU2/2 (MODIFICATION)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Transportées d'un établissement à l'autre pour y passer deux examens d'IRM de deux heures sous anesthésie, 996 souris vont être utilisées dans ce projet sur la maladie de Parkinson, dont 320 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 160 opérées sous anesthésie puis tuées avant tout réveil. Elles subissent une biopsie de queue sur animal vigile vers le sixième jour de vie, une chirurgie d'une heure trente à quatre heures, puis jusqu'à trente-six tests comportementaux de dix à quarante-cinq minutes répartis sur vingt semaines, avant d'être toutes mises à mort pour prélèvement de tissus. Le porteur indique que la lésion dopaminergique entraîne une perte de poids et des déficits moteurs, et que les altérations des seuils de douleur "ne peuvent être soulagées car c'est l'objet de l'étude". Sur le remplacement, il affirme que la structure cérébrale visée n'a été localisée que chez les mammifères, ce qui exclut selon lui tout autre modèle.
Objectifs
MODIFICATION: La perte des neurones dopaminergiques dans la maladie de Parkinson s’accompagne d’un dysfonctionnement de certains circuits cérébraux et de symptômes moteurs et non-moteurs qui restent difficiles à prendre en charge. La lésion d’une région cérébrale incluant une structure qui est un contrôle de ces neurones dopaminergiques peut améliorer certains symptômes. L’identification récente d’un marqueur moléculaire sélectif de cette structure permet désormais d’étudier les conséquences d’une modulation de l’activité de cette structure dans un modèle de la maladie de Parkinson. L’objectif du projet est ainsi de tester si l’inhibition sélective de cette structure peut soulager les symptômes nociceptifs, moteurs, cognitifs et anxiodépressifs. Les patients Parkinsoniens présentent par ailleurs des altérations structurelles et fonctionnelles de leur réseaux cérébraux, visibles par imagerie par résonance magnétique (IRM). Ces altérations de la connectivité cérébrale pourraient être modifiées par l’inactivation de notre structure d’intérêt. L’identification des changements de connectivité cérébrale et la mise en évidence de l’implication de zones spécifiques au niveau du cerveau pourraient aider la recherche préclinique et clinique, et accélérer les stratégies thérapeutiques. Ce projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateur: EU1 et EU2. La nécessité de procéder à des séances d'imagerie par IRM conduit à l'ajout de 40 animaux .
Bénéfices attendus
La structure cérébrale ciblée par ce projet exerce un contrôle inhibiteur sur les systèmes dopaminergiques, qui dégénèrent dans la maladie de Parkinson. Ce projet doit permettre de tester si une inhibition de cette structure peut améliorer les symptômes nociceptifs, moteurs, cognitifs et anxiodépressifs, apportant ainsi une preuve de concept sur le potentiel thérapeutique de cette cible anatomique. La maladie de Parkinson est la seconde maladie neurodégénérative la plus fréquente. Connue pour ses symptômes moteurs, cette maladie a aussi des conséquences délétères non-motrices, incluant douleur, troubles de l’humeur et déficits cognitifs. Les patients présentent en moyenne 14 symptômes dans les phases précoces de la maladie et plus de 20 dans des phases plus tardives, mettant en évidence le besoin de prendre cette complexité en considération dans la recherche préclinique.
Procédures
MODIFICATION Les animaux sont soumis à une biopsie de tissu pour réaliser leur génotypage, cette biopsie est effectuée sur animal vigile autour de 6 jours postnatal, ou à défaut sur animal sous anesthésie à partir de 12 jours postnatal. Les animaux sont soumis à une biopsie de tissu pour réaliser leur génotypage, cette biopsie est effectuée sur animal vigile autour de 6 jours postnatal, ou à défaut sur animal sous anesthésie à partir de 12 jours postnatal. Des animaux sont soumis à 1 chirurgie d’au maximum 1h30 ou 4h, et un maximum de 36 tests comportementaux de 10 à 45 minutes chaque, répartis sur 20 semaines avec au moins un jour de repos entre chaque test. Les animaux sont soumis à deux examens IRM sous anesthésie, incluant chacun au plus une séquence d'IRM fonctionnelle de 16min, une d'IRM anatomique de 10 min et une d'IRM de diffusion de 60 min (TOTAL=2 heures maximum par examen) (EU2).
Impact sur les animaux
MODIFICATION Une douleur légère et de courte durée peut être provoquée par la biopsie de tissus. La chirurgie peut entraîner une perte de poids transitoire, une douleur postopératoire modérée, une inflammation locale transitoire autour du dispositif des points de suture (peau du crâne). Les tests comportementaux peuvent s’accompagner d’un stress léger. Les lésions dopaminergiques modélisant la maladie de Parkinson peuvent entrainer une perte de poids sur les 10 premiers jours après la lésion. Des déficits moteurs liés à la modélisation de la maladie de Parkinson sont également attendus, ainsi que des altérations sensorielles des seuils de douleur qui ne peuvent être soulagées car c’est l’objet de l’étude. Le transport et l’environnement inconnu de la nouvelle animalerie peuvent également entrainer un stress chez les animaux au moment du changement d’EU.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvements de tissus.
Remplacement
MODIFICATION Compte tenu du sujet du projet, il est impossible de remplacer le modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, les comportements étudiés et la connectivité cérébrale nécessitent un système nerveux complet et un animal entier, vivant et vigile. L’existence et la localisation de la structure cérébrale étudiée n’ont pour l’instant été établies que chez les mammifères, ne permettant donc pas en l’état actuel des connaissances d’utiliser un autre modèle animal.
Réduction
Les expériences sont menées en cherchant à limiter le nombre d'animaux, tout en obtenant l’information scientifique recherchée. Pour les diverses expériences, ce nombre d'animaux nécessaire pour tirer des conclusions scientifiques statistiquement fiables est défini sur la base de notre expertise, de l'analyse de la littérature et de calculs de power analyse.
Raffinement
MODIFICATION Les animaux sont hébergés en groupe sociaux dans des cages enrichies (bâton, tunnel, coton et frisure) favorisant leur comportement naturel (ronger et faire des nids). Ils sont acclimatés aux conditions d’hébergement et habitués aux expérimentateurs. Ils sont habitués à la manipulation avant la chirurgie, ainsi qu’aux environnements des tests comportementaux avant leur réalisation. Les animaux seront suivis pour déceler tout signe de mal-être. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont utilisées, la température maintenue (tapis chauffant) et les yeux protégés par du gel oculaire. Après la chirurgie, une grille d’évaluation est utilisée pour le suivi des animaux. Des soins, une administration d’antalgique ou d’anti-inflammatoire et/ou une séparation des animaux seront réalisés si besoin après concertation avec le vétérinaire ou la cellule chargés du bien-être animal. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures pour limiter ou soustraire l’animal à la souffrance. Le transport entre les 2 EU se fera dans des cages sécurisées avec nourriture et eau gélifiée et une période de 1 semaine sera respectée avant le début des examens IRM. Durant celui-ci, une anesthésie sera utilisée pour réduire au maximum le stress de l'animal. Leurs yeux seront protégés du dessèchement par l’application d’un gel de protection. La température et la respiration des animaux seront en permanence surveillées par un système de monitorage et maintenue par un système de chauffage du berceau de l’IRM et un tapis chauffant. En cas de chute de la température et/ou d’une respiration altérée, l'acquisition en cours sera immédiatement interrompue et l'animal sorti de l'IRM et pris en charge. Il sera placé dans une enceinte chauffante jusqu'à son réveil, sous surveillance. Des points limites ont été établis afin de soustraire les animaux à la douleur.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris modifiées génétiquement pour cibler sélectivement les neurones de la structure cérébrale étudiée. Ceci implique l'utilisation de souris spécifiques et ne permet pas l'utilisation d'autres espèces. Étant donné que les études nécessitent des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés. Le génotypage est prioritairement effectué entre 6 et 8 jours, et la chirurgie à partir de 8 semaines d’âge.
Bioréacteur pancréatique implantable
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Quarante-cinq rats seront anesthésiés puis tués sans reprise de conscience pour qu'on leur prélève les îlots pancréatiques destinés à la greffe. 55 autres reçoivent une ou deux injections d'une molécule qui les rend diabétiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et 10 servent de témoins, pour un total de 110 rats dont 90 seront tués et 20 réutilisés. Les rats diabétiques subissent 28 mesures de glycémie la première semaine, puis un suivi quotidien pendant huit semaines, une chirurgie dorsale de trente minutes pour implanter un pancréas bio-artificiel, onze prélèvements sanguins et un test de tolérance au glucose de deux heures avec treize gouttes de sang. Le porteur prévoit qu'un quart des rats ne développeront pas le diabète : ceux-là, comme les surnuméraires, sont versés aux travaux pratiques de formation du laboratoire.
Objectifs
L'objectif du projet est de déterminer si un pancréas bio-artificiel (encapsulation de cellules sécrétrices d'insuline dans une matrice de composition standardisée) améliore l'efficacité de la greffe d'îlots pancréatiques en vue de la mise en place d'essais cliniques.
Bénéfices attendus
Si les résultats sont positifs et mettent en évidence un avantage thérapeutique de la greffe d'îlots dans la matrice, nous prévoyons de proposer une suite au projet à travers la continuité de tests précliniques ainsi que des validations réglementaires en vue d’un essai clinique (first in man), pour évaluer la sécurité et la fiabilité de cette approche thérapeutique innovante. Le développement d'un tel dispositif permettrait d'améliorer considérablement la prise en charge du diabète de type I en augmentant le nombre de patients éligibles à une greffe d'ilots de Langerhans. De plus, les dispositifs testés pourraient permettre de réduire voir d'arrêter la prise d'immunosuppresseurs des patients ainsi greffés, ce qui participerait à une augmentation de leur qualité de vie et à une diminution des risques induits par ces traitement (e.g. cancers, insuffisance rénale,..).
Procédures
55 rats seront recevront 1 ou 2 injections d’une molécule les rendant diabétiques (30 sec). Afin de suivre leur glycémie et donc leur état diabétique, une goutte de sang sera prélevée de façon bi-quotidienne la première semaine puis tous les jours pendant 2 semaines, soit 28 prélèvements sanguins d’une durée de 1 minute chacun. Lors de la greffe d’îlots, des animaux considérés comme "donneurs" seront euthanasiés afin de fournir les cellules sécrétrices d'insuline aux animaux diabétiques. Les animaux diabétiques seront ensuite anesthésiés, recevront un analgésique par injection, et auront une chirurgie dorsale (30 min) pour implanter les pancréas bio-artificiels qui contiendront les cellules sécrétrices d'insuline. La glycémie continuera d'être suivie quotidiennement jusqu'au sacrifice des animaux (8 semaines post-greffe). 10 gouttes de sang seront prélevées toutes les semaines pendant 11 semaines, soit 11 prélèvements sanguins d’une durée de 3 minutes chacun. Un test de tolérance au glucose sera réalisé durant 120 minutes à 35 jours post-greffe. Cela consiste à faire ingérer du glucose par gavage oral (30 sec) puis à mesurer la glycémie à différents temps (13 gouttes de sang prélevées durant les 120 minutes du test). A l'issue de l'étude, les animaux seront anesthésiés et recevront une analgésie afin d'etre euthanasiés (durée totale de la procédure 20 minutes).
Impact sur les animaux
Les inconforts prévisibles liés à la technique d'induction du diabète sont i) le risque d’hypoglycémie pouvant survenir dans les 48h suivant l’injection de la molécule et ii) un risque d'hyperglycémie apparaissant une fois les que les animaux ont développé le diabéte de type I. De plus ce modèle d'induction du diabète est à l'origine de pertubations de la prise alimentaire qui peut entrainer une perte de poids des animaux. La greffe d'ilots en sous-cutanée peut aussi être à l'origine d'une gêne pour les animaux au niveau de l'incision dorsale, un traitement antalgique sera utilisé pour éviter cela.
Devenir
Les rats non répondant à l'injection de la molécule induisant le diabète ne seront pas considérés comme naïfs, ils permettront l'enseignement de techniques expérimentales au sein du laboratoire par et pour les personnes formées à l'expérimentation animale. Les 50 animaux ayant suivi l'étude (10 contrôles, 10 diabétiques, 10 diabétiques greffés d'îlots, 10 diabétiques greffés avec le pancréas bio-artificiel 1 et 10 diabétiques greffés avec le pancréas bio-artificiel 2) seront mis à mort à la fin de celle-ci pour prélever les organes et faire des analyses moléculaires. Les rats inclus dans la procédure d'isolement d'ilots seront euthanasiés lors du prélèvement jusqu'à l'obtention des 40 000 ilots équivalents nécessaires à cette étude. Si nous obtenons le nombre d'ilots nécessaire avant l'utilisation des 45 animaux prévus, ils seront considérés comme naïfs et permettront l'enseignement de techniques expérimentales au sein du laboratoire par et pour les personnes formées à l'expérimentation animale.
Remplacement
Les tests ont été préalablement faits sur des lignées cellulaires et îlots isolés avant l'approche in vivo. Cette étape est essentielle après le test sur les lignées et avant la clinique (îlots humains). Cela représente le modèle le plus fiable avant la clinique. Il est nécessaire de pouvoir étudier l'effet de la greffe d'îlots dans cette matrice sur un organisme entier et pas uniquement sur des cellules isolées avant l'utilisation chez l'humain.
Réduction
Pour ce projet, nous prévoyons d'utiliser 50 animaux qui nous permettrons de constituer les 5 groupes nécessaire pour tester l'efficacité de nos pancréas bio-artificiels. Chaque groupe sera constitué de 10 animaux comme cela est classiquement utilisé dans la littérature pour obtenir la puissance statistique recherchée pour détecter une restauration de la régulation de la glycémique par la greffe d’ilots. Au total ce projet nécessite l'usage de 110 rats qui correspondront à : 1) isolement d'îlots (n=45); 2) le groupe contrôle (n=10) ; 3) l'obtention des 4 groupes de rats diabétiques (n=55 pour en obtenir minimum 40, en prévoyant une efficacité de 75% de l'injection de la molécule inductrice du diabiète en rapport avec notre expérience et les données de la littérature). Grace à l'optimisation du protocole d'induction du diabète de type I l'efficacité est de 75% de réussite ce qui nous permet de réduire le nombre d'animaux 55. De plus, nous stopperons la procédure d'induction du diabète lorsque les 40 animaux nécessaires à ce projet seront atteints et les rats surnuméraires (non injectés) seront affectés à un autre projet (notamment enseignements pratiques nécessitant l'utilisation d'animaux).
Raffinement
Dans un objectif de raffinement, plusieurs mesures seront mises en place: 1) Amélioration de l’hébergement des animaux par un milieu enrichi; 2) Observation quotidienne (pesée, glycémie, comportement, aspect, détection de toute souffrance) durant toute la période d'hebergement des animaux leur état général sera évalué selon des critères précis et adaptés qui nous permettrons de determiner si les animaux atteignent des points limites gradés qui correspondent à un critère d'arret de l'étude; 3) Dans les 48h suivant les injections de la molécule inductrice du diabète nous mettrons à disposition de l'eau avec 10% de sucre pour réduire le risque d'hypoglycémie; 4) Suivi régulier de la glycémie des animaux diabétiques et injection d'une unité d'insuline rapide si celle-ci dépasse les 3g/L; 5) Change fréquent des animaux diabétiques car celui-ci augmente la diurèse (toutes les 48h ou plus si nécessaire); 6) La chirurgie sera faite sous anesthésie volatile en association à une analgésie préopératoire, du gel occulaire pour réduire le dessèchement de la cornée, et les animaux seront placés sur un tapis thermostaté afin d'éviter tout risque d'hypothermie; 8) Lors du suivi post-opératoire, les animaux seront maintenus sous lampe chaude jusqu'à leur réveil complet, de la nourriture semi-liquide sera mise à leur disposition et nous utiliserons une litière en cellulose pour plus de propreté; 9) Une analgésie pré et post-opératoire sera réalisée par injection toutes les 12h durant 48h.
Choix des espèces
Nous avons choisi d'utiliser un modèle de rats car celui-ci est classiquement utilisé pour l'isolement d'ilots pancréatiques, ainsi que pour étudier le diabète de type I. L'utilisation de ce modèle nous permettra donc de comparer nos résultats aux données de la littérature ainsi qu'aux résultats antérieurs obtenus au sein du laboratoire d'accueil. La souche de rats choisie est non-consanguine ce qui nous permettra d'étudier l'efficacité des pancréas bio-artificiels à isoler les ilots de Langerhans greffés de la réponse inflammatoire des receveurs. Enfin la souche de rats choisie est classiquement utilisée dans les projets ayant attraits à des tests de greffe ainsi que des protocoles d'études pré-cliniques ciblant les maladies métaboliques, ce qui correspond exactement à l'objectif de ce projet. Les animaux utilisés pour l'isolement des ilots de Langherans et l'induction du diabète auront un poids corporel compris en 300-350g (age: 50-60 jours) ce qui correspond a un stade post-pubertaire à partir duquel toutes les grandes fonctions de l'organisme sont matures.