Procédures sans réveil
Etude du rôle de CD99 au cours de la vascularite à anticorps anti-cytoplasme des neutrophiles (ANCA) (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système urogénital
120 souris sont tuées sous anesthésie, sans reprise de conscience, pour fournir les cellules souches du sang greffées à d'autres souris préalablement irradiées. Au total 920 souris vont être utilisées dans ce projet, toutes tuées à l'issue, 800 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les receveuses et les témoins, transportées entre deux établissements, reçoivent trois injections sur cinq jours pour déclencher une vascularite avec atteinte rénale, puis subissent deux mesures de fonction rénale avec un capteur fixé sur le dos pendant une heure et deux échographies cardiaques, avant d'être tuées douze ou trente jours plus tard. Le porteur affirme le recours aux souris "indispensable", cette maladie étant selon lui impossible à reproduire en laboratoire, et décrit sa recherche d'alternatives comme une veille bibliographique et une présence en congrès.
Objectifs
Récemment, la protéine CD99 a été identifié comme un marqueur urinaire qui aide à prédire la survenue d’une insuffisance rénale aigüe (IRA) chez les patients, ainsi qu’un facteur protecteur face à une agression des reins chez les souris. Cette protéine est présente à la surface à la fois des globules blancs et des vaisseaux. Il a été découvert (travaux non encore publiés) une localisation inconnue de cette protéine dans l’organisme : au niveau d’un type particulier de cellules rénales qui jouent un rôle central dans le déclenchement de maladies rénales sévères, comme la vascularite associées aux anticorps anti-cytoplasme des neutrophiles (ANCA). Cette maladie grave, pouvant affecter plusieurs organes (dont le rein, le poumon, le cœur et la peau), est responsable d’une défaillance rénale complète et définitive chez 20 % des patients dans les 5 ans suivant le diagnostic, et s’avère même mortelle chez près de 15 % des patients dans la première année de la maladie. Compte-tenu de ces découvertes récentes concernant CD99, il apparait pertinent de caractériser comment les deux « versions » de cette protéine (« globule blanc » et « vaisseau ») influencent le risque de vascularite à ANCA grave, avant de développer des traitements ciblant CD99. Ce projet aura lieu au sein de deux établissements utilisateurs : EU1/2 et EU2/2.
Bénéfices attendus
Mieux comprendre les mécanismes de la vascularite à ANCA. Mieux comprendre le rôle de la protéine CD99 dans l’atteinte rénale par la vascularite à ANCA, dans l’objectif de développer des traitements de la vascularite à ANCA ciblant CD99.
Procédures
Dans un premier temps, au sein de l’établissement utilisateur n°1 (EU1/2), des animaux chimériques possédant la protéine CD99 soit à la surface de leurs globules blancs, soit à la surface des vaisseaux, seront produits. Pour se faire, des souris (« receveuses ») seront irradiées durant quelques minutes puis recevront une injection de cellules souches du sang par une injection au total de 10 secondes sous anesthésie générale gazeuse. Ces cellules souches proviennent d’autres souris préalablement euthanasiées (120 « donneuses » au total). Dans un second temps, les souris « receveuses » ainsi que des souris contrôles n'ayant pas été irradiées (représentant un total de 800 animaux) seront transportées vers l’établissement utilisateur n°2 (EU2/2) pour y développer une vascularite à ANCA avec atteinte rénale, à l’aide au total de trois injections (plusieurs anticorps et une molécule pro-inflammatoire) de 10 secondes chacune sous anesthésie générale gazeuse réparties sur 5 jours. Ces animaux seront soumis à des mesures de leur fonction rénale (2 mesures par animal) : sous anesthésie générale gazeuse, un capteur est fixé sur le dos de l’animal pendant 60 minutes maximum et une molécule est administrée par une seule injection de 10 secondes. Ces animaux seront aussi soumis à des mesures non-invasive de la fonction cardiaque par échographie (2 mesures par animal) pendant 10 minutes maximum, sous anesthésie générale gazeuse, sans injection nécessaire. Les prélèvements d’urine (maximum 5 répartis sur 8 semaines) auxquels tous les animaux seront soumis se feront de façon vigile mais indolore et non-invasive, puisqu’ils reposeront sur la collecte d’urine émise de façon réflexe par l’animal lors de sa préhension. Les animaux seront mis à mort 12 jours (modèle précoce) ou 30 jours (modèle tardif) après le début de l’induction de la vascularite, avec une injection de 10 secondes sous anesthésie générale gazeuse d’un agent léthal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles de l’irradiation sont une légère baisse de l'alimentation avec perte de poids minime durant les premiers jours post-irradiation. Les animaux peuvent ressentir un léger stress du fait de l'enfermement et du bruit au cours de la procédure. L'irradiation ne procure aucune douleur. Les prélèvements sanguins et les injections des agents provoquant la vascularite à ANCA peuvent provoquer du stress ou de la douleur. Le modèle de vascularite à ANCA provoque une altération attendue de la fonction rénale. Les effets indésirables possibles sont une baisse de l’alimentation avec perte de poids modérée mais stable, et des lésions cutanées de type dermites ou ulcères (néanmoins très rarement rapportés avec ce protocole) liées à la vascularite.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure en vue de l'analyse de leur sang, de leur urine et de leurs organes.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation sur des animaux est indispensable car la glomérulonéphrite liée à la vascularite à ANCA est impossible à reproduire en laboratoire. Une veille bibliographique est réalisée régulièrement par les responsables du projet pour prendre connaissance d’éventuelles nouvelles méthodes alternatives (plateforme de référencement des publications Pubmed, journaux de néphrologie comme Kidney International, participation à des congrès annuels internationaux de recherche de néphrologie comme l’European Renal Association, etc.).
Réduction
Notre équipe a noué une collaboration avec l’équipe ayant créé et publié cette version du modèle d’atteinte rénale par vascularite à ANCA, ainsi qu’une autre collaboration avec une équipe de recherche bordelaise utilisant ce protocole en routine depuis un an, ce qui nous permet de limiter certaines étapes de mise au point coûteuses en animaux. Le nombre d’animaux utilisé est calculé au plus juste d’après notre connaissance du modèle de sorte à obtenir des résultats statistiquement pertinents pour chaque paramètre principal et secondaire. De plus, nous valorisons l'ensemble de notre élevage de souris à l’EU1, puisque nous utilisons les deux sexes. Il est prévu de recourir à un maximum de 920 souris. Les résultats seront interprétés en utilisant des tests statistiques communément utilisés en biologie.
Raffinement
Les études sont optimisées d’après la littérature et les observations réalisées par nos collaborateurs ayant créé ou importé ce protocole de vascularite à ANCA. Les animaux seront hébergés dans des services de zootechnie agréés par le ministère, par groupes de 4 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec alimentation et eau à volonté. Ils seront observés scrupuleusement (apparence générale, comportement, absence de plaies...) afin de s’assurer de leur bien-être, et pesés deux fois par semaine. Pour les changes et les manipulations, les souris seront tenues dans la main de l’expérimentateur mais ne seront jamais suspendues par la queue. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale. Les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures, euthanasie si signes de souffrance irrémédiables). Une échographie cardiaque permettra de dépister une atteinte du cœur de façon précoce. Concernant le transport (maximum 20 minutes) des animaux entre l'EU1/2 et l'EU2/2, il sera effectué sur des souris aptes à supporter le voyage et dans des conditions telles qu’elles ne puissent être blessées ou subir des souffrances inutiles. Le transport sera effectué suivant une procédure déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport), impliquant une société agréée qui effectue de manière régulière la navette entre l'EU1/2 et l'EU2/2.
Choix des espèces
L’espèce utilisée permet d’utiliser le moins d’animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. Nous utilisons le plus souvent la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données scientifiques et qu’il existe un nombre important de modèles de souris adaptés à l’étude de maladies affectant le rein. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 7 à 13 semaines au début du protocole expérimental. À cet âge, les reins sont pleinement développés, ce qui permet de modéliser au mieux les conditions cliniques adultes.
Protocole de détermination par imagerie ultrasonore ultrarapide des pressions critiques d’autorégulation cérébrale et des mécanismes d’autorégulation cérébrale chez l’ovin en débit sanguin variable pulsatile non pharmacologique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
Déterminer à quelle pression artérielle le cerveau cesse de réguler son propre débit sanguin, en poussant cette pression de 20 à 180 mmHg par paliers : 15 brebis vont être utilisées dans ce protocole, opérées sous anesthésie générale et tuées avant tout réveil. Chacune reçoit une ouverture de quelques centimètres de la boîte crânienne pour laisser passer les ultrasons, des cathéters à ballonnet posés dans l'aorte et la veine cave par l'aine, et dix prélèvements de sang, pour une procédure d'environ six heures. Le porteur reconnaît ne pouvoir fonder l'effectif sur aucune estimation statistique, faute de données sur la survie des animaux et la qualité des acquisitions. Aucune brebis ne se réveille, la craniectomie et les variations extrêmes de pression les exposant à des lésions cérébrales que le porteur juge incompatibles avec leur bien-être.
Objectifs
L’autorégulation cérébrale est un phénomène physiologique de régulation du débit sanguin cérébral par variation du diamètre des vaisseaux cérébraux. Elle permet la protection du système nerveux central en assurant un transport stable et continu d’oxygène jusqu’aux neurones dans des conditions de pressions artérielles très variables. En effet, grâce à l’autorégulation cérébrale, le débit sanguin cérébral reste stable dans la zone comprise entre 50 mmHg et 150 mmHg de pression artérielle moyenne. Au-delà, les vaisseaux cérébraux se dilatent à l’excès ou se collabent arrêtant le flux sanguin cérébral. Dans différentes situations, l’autorégulation cérébrale peut-être perturbée ; anesthésie générale, chirurgie cardiaque sous circulation extra-corporelle, cardiopathie congénitale… Par ce modèle de variation de pression artérielle pulsatile non pharmacologique par ballon de pression intravasculaire, nous permettons d’approcher les phénomènes physiopathologiques rencontrés en pratique clinique en limitant les biais liés à l’expérimentation. Les techniques de surveillance du débit sanguin cérébral en routine tels que l’oxymétrie tissulaire cérébrale par spectrométrie proche infrarouge (NIRS), ou bien le Doppler transcrânien (DTC) n’ont une visualisation du débit sanguin cérébral qu’indirect et parcellaire. L’imagerie ultrasonore ultrarapide est une technique utilisée en recherche translationnelle en cours de développement, dont plusieurs études ont validé des données dans l’étude de la perfusion cérébrale. Cette technique permet de visualiser la perfusion cérébrale dans sa globalité, à haute résolution temporelle et spatiale. L’objectif du projet est de déterminer les pressions de perfusion cérébrale critiques dans un régime de pression artérielle pulsatile, au-delà desquelles les systèmes d’autorégulation cérébrale sont dépassés et où le débit sanguin cérébral n’est plus stable, grâce à l’imagerie par ultrasons ultrarapides. Cette imagerie nous renseignera sur des paramètres jusque-là jamais décrits à propos de l’autorégulation cérébrale, notamment les variations territoriales de cette autorégulation, l’importance et le rôle des territoires artériels et veineux.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette recherche permettront de comprendre les phénomènes physiologiques et les mécanismes de l’autorégulation cérébrale. Ils pourront ensuite être utilisés pour interpréter des situations physiopathologiques chez l’homme, et plus particulièrement chez l’enfant en période néonatale et périopératoire de chirurgie cardiaque congénitale.
Procédures
Les animaux seront hébergés en période pré-procédurale au sein de l’animalerie. Le jour de la procédure ils seront d’abord sédatés par voie intramusculaire, une fois sédatés ils seront emmenés jusqu’au bloc opératoire où ils seront perfusés. L’anesthésie générale est alors administrée par voie intra-veineuse et permet une sédation complète et un contrôle complet de la douleur. Une fois anesthésiés une assistance respiratoire est posée car l’anesthésie générale qui est un puissant dépresseur respiratoire. Sous anesthésie générale sera réalisée dans un premier temps une ouverture de quelques centimètres de la boite crânienne pour permettre l’apposition et la transmission des ondes ultrasonores au travers du système nerveux central, et ainsi pouvoir réaliser les mesures d’échographe ultrasonore ultrarapide. Ensuite, nous mettrons en place le modèle de variation tensionnelle non médicamenteuse pulsatile par technique mini-invasive d’occlusion de l’aorte et de la veine cave inférieure par des cathéters à ballonnet intra-vasculaires mis en place par abord mini-invasif à l’aine. Par variation du volume des ballons intra-vasculaires, nous ferons varier la pression artérielle moyenne entre 20 mmHg et 180 mmHg par paliers progressifs, lors desquels nous réaliserons des acquisitions par IUU échographie Doppler transcrânien standard et oxygénation tissulaire cérébrale par spectrométrie en proche-infrarouge (NIRS). Pour s’affranchir de la dérégulation cérébrale liée aux variations de concentration de CO2 contenu dans le sang artériel influencé par la circulation extracorporelle, une analyse sanguine sera régulièrement réalisée (2 ml par prélèvement, réalisé 10 fois au total par animal soit 20ml). Nous estimons la durée totale de procédure d’environ 6h par animal. A la fin de procédure, sous anesthésie générale, une euthanasie médicamenteuse par thiopental sera réalisée selon les recommandations en vigueur.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables potentiels incluent : le stress pré-procédural, le risque de saignement lié à la circulation extra corporelle et au retrait de la part d’os crânien, les troubles du rythme ou dysfonctions cardiaques.
Devenir
L’ensemble des animaux seront euthanasiés sous anesthésie générale. En effet, la craniectomie ainsi que les variations extrêmes de pression artérielle exposeraient les animaux à un risque important de lésions cérébrales, compromettant significativement leur confort et leur bien-être.
Remplacement
Aucune méthode de modélisation sur ordinateur n’existe pour le moment par manque de connaissance sur les mécanismes d’autorégulation cérébrale étudiés par cette procédure. La brebis adulte par sa taille et son poids est un mammifère couramment utilisé pour modéliser la physiopathologie humaine, ses particularités cérébrales proche de l’homme permettent une bonne valeur prédictive des résultats qui seront retrouvés.
Réduction
Le nombre d’animaux a été estimé pour permettre de tenir compte du risque d’intolérance hémodynamique de l’animal, des risques liés à la craniotomie, et enfin au risque d’aléa d’acquisition technique des données ultrasonores sur un système de recherche, parfois de qualité insuffisante pour permettre leur interprétation. Ainsi 15 animaux au total sont prévus pour ce projet. Nous savons par le résultat d’étude cliniques par imagerie ultrarapide ultrasonore, que le taux d’acquisitions interprétables est de 90%. Cependant pour cette expérimentation nous n’avons pas de données concernant la survie des animaux et la fiabilité d’acquisitions d’imagerie, il n’est donc pas possible de réaliser une estimation statistique du nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
L’animal est place dans les conditions d’hébergement initial avec les méthodes de raffinement adéquat a son espèce : groupe social, pierre a sel et jouets Les animaux sont suivis quotidiennement par du personnel formé. Pour l’intervention, l’animal sera prémédiqué. Sous anesthésie générale, le niveau de sédation et d’anti-douleur sera adapté aux besoins de l’animal L’ensemble des gestes invasifs, douloureux ou pourvoyeur de stress seront réalisés ensuite sous anesthésie générale. A l’issue de la procédure, toujours sous anesthésie générale, les animaux seront euthanasiés. Si un des points limites est atteint et qu’aucune mesure ne permet un retour à l’état basal, le protocole sera interrompu et l’animal euthanasié.
Choix des espèces
Les brebis adultes ont été sélectionnées pour leur similitudes morphologiques et physiologiques en termes de poids taille et caractéristiques neurologiques avec l’homme.
Etude du rôle d’un canal protéique spécifique dans l’épilepsie et la maladie d’Alzheimer à l’aide de modèles murins.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
775 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 145 d'entre elles et modéré pour 546, les 84 dernières étant opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Une partie subit à sept à dix jours d'âge un prélèvement de l'extrémité de la queue sur animal vigile pour le génotypage, et un autre groupe une chirurgie de deux heures suivie, au moins dix jours plus tard, d'une seconde chirurgie sans réveil. Les souris porteuses des mutations Alzheimer sont tuées à six mois, avant l'apparition du phénotype dommageable, une perte de poids, que la lignée développe avec l'âge. Le bénéfice annoncé, une nouvelle stratégie thérapeutique pour les patients, est renvoyé au long terme et conditionné à des résultats concluants, alors que le porteur a déjà éprouvé ses hypothèses en culture cellulaire et sur un modèle biophysique de neurone.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est une pathologie neurodégénérative affectant 15 pourcents de la population après 80 ans. L’épilepsie, caractérisée par la présence de crises et d’activités épileptiformes visibles à l’aide d’électroencéphalogramme, est une comorbidité fréquente de cette maladie. Or, les patients atteints des deux pathologies voient leurs capacités cognitives se dégrader plus rapidement. Il a été décrit, qu’un canal protéique, responsable du passage d’ions potassium à travers la membrane cellulaire, est impliqué dans certains types d’épilepsie : les encéphalopathies épileptiques. Cependant le rôle de ce canal dans le contrôle de l’activité neuronale n’est que partiellement connu. Ce projet a pour objectif de vérifier si les modifications de l’expression, de localisation et de fonction de ce canal pourraient contribuer à la suractivité des neurones, observée précocement dans la maladie d'Alzheimer et dans l'épilepsie, participant ainsi à l'altération du tissu nerveux et des fonctions cérébrales.
Bénéfices attendus
Bien qu’il existe des traitements visant à réduire l’excès d’activité neuronale et les crises dans les encéphalopathies épileptiques, ces traitements n’améliorent pas véritablement les fonctions cognitives. De même, dans la maladie d’Alzheimer les traitements existants ont des résultats qui restent modestes. Notre projet vise à proposer une alternative thérapeutique ciblée sur la restauration de l’activité normale des neurones responsables de l’apprentissage et la mémoire. Ainsi à plus long terme, si les résultats s’avèrent concluants, ce projet pourrait participer à l’identification d’une nouvelle stratégie thérapeutique pour les patients atteints de la maladie d’Alzheimer et donc améliorer leur prise en charge.
Procédures
Afin de connaitre leur patrimoine génétique une partie des souris aura un petit prélèvement de l’extrémité de la queue, réalisé sur l’animal vigile (une fois, moins d’une minute). Un groupe de souris sera ensuite euthanasié au cours d’une chirurgie sans réveil (durée inférieure à 15 minutes) sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Un autre groupe sera soumis à une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée (2 heures maximum, une fois). Au moins 10 jours après elles seront euthanasiées au cours d’une chirurgie sans réveil (durée inférieure à 15 minutes) sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Le prélèvement à l’extrémité de la queue pour connaitre le patrimoine génétique des animaux induit une brève douleur lors du prélèvement et un léger saignement est possible. Les manipulations et contentions nécessaires au cours des procédures pourront générer un stress chez les animaux. Les injections peuvent induire une légère douleur et un inconfort au point d’injection. Les anesthésies peuvent provoquer une détresse respiratoire, une sécheresse des yeux et une perte de chaleur de l’animal (hypothermie). Les chirurgies seront associées à un risque d’inconfort et de douleurs pendant quelques jours. Nous utilisons une lignée de souris génétiquement modifiées qui peuvent présenter un phénotype dommageable à partir de l’âge de 6 mois (perte de poids), cependant nous les euthanasierons avant son expression.
Devenir
A l’issue du projet, tous les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire soit pour réaliser les prélèvements d’intérêts pour répondre à notre question scientifique, soit parce qu’ils ne pourront pas être replacés ou réutilisés du fait de leur modification génétique spécifique.
Remplacement
Nous avons déjà étudié les effets de la surexpression du canal protéique de phénotype sauvage et muté dans des cultures cellulaires et nous avons également utilisé un modèle biophysique de neurone pour pourvoir prédire l’effet sur les phénomènes de plasticité (capacité du cerveau à se réparer et se restructurer). Cependant, le test de ces prédictions nécessite l’utilisation d’un modèle animal de la maladie d’Alzheimer ou une injection de virus permettant d’exprimer les mutants du canal protéique chez l’animal. En effet, il n’existe pas à notre connaissance de modèles autres que les souris transgéniques permettant d’atteindre les objectifs du projet. C’est-à-dire de caractériser le canal protéique dans un modèle se rapprochant le plus possible de la physiologie réelle d’un mammifère et permettant une bonne transposition des résultats obtenus à ce que l’on attendrait chez l’humain.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans les procédures expérimentales est réduit au maximum, la taille des groupes d’animaux étant définie pour obtenir une puissance statistique suffisante. Il sera en effet nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Nous analyserons nos résultats avec les tests statistiques appropriés. Nous estimons devoir utiliser 775 animaux au total dans le cadre de ce projet. Nous élèverons les souris génétiquement modifiées mais ne produirons que le nombre strictement nécessaire d’animaux pour permettre de réaliser les procédures expérimentales.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes et disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification, d’un bâtonnet de bois à ronger. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Tout le long des procédures, nous assurerons une prise en charge anesthésique et analgésique adaptée. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Nous nous assurerons de maintenir la température tout au long de l’anesthésie. Un gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux pour éviter tout dessèchement des cornées. Après les chirurgies, les souris seront surveillées et gardées au chaud pendant la phase de réveil avant d’être remises en groupes sociaux. L’observation des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance et l’analgésie est maintenue sur 48h après l’opération. Nous évaluerons la possibilité de remplacer la chirurgie sans réveil par une procédure réalisée après une euthanasie médicamenteuse de l’animal. Dans le cas d’euthanasie médicamenteuse l’animal sera sédaté au préalable pour éviter tout stress. Concernant la lignée de souris modélisant la maladie d’Alzheimer, les animaux sont euthanasiés à 6 mois avant l’apparition d’un phénotype dommageable. Pour la partie élevage seuls les mâles seront susceptibles de développer un phénotype dommageable. Les animaux sont mis en accouplement en trio afin d’utiliser moins de mâles à phénotype dommageable. Le prélèvement de la queue pour génotypage est un geste rapide et maitrisé, fait chez l’animal très jeune pour limiter la douleur et favoriser une cicatrisation rapide. Sa taille est réduite au strict nécessaire. Le matériel utilisé est propre et désinfecté entre chaque animal pour éviter tout risque de contamination. Le geste est réalisé au calme dans une pièce dédiée. Une surveillance des animaux prélevés est assurée immédiatement après le geste, puis 30 minutes environ après.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix afin d’étudier le développement du cerveau ainsi que les connexions neuronales chez l’adulte. En effet il s’agit d’un modèle présentant des similarités du développement du système nerveux entre la souris et l’humain. De plus, l’organisation du cerveau chez l’adulte est très similaire chez la souris et l’humain. Nous disposons par ailleurs d’outils adaptés à cette espèce ainsi que d’une expertise sur ce modèle. Pour la partie du projet portant sur la maladie d’Alzheimer (MA), nous utiliserons comme modèle de la pathologie des souris transgéniques dans lesquelles des mutations responsables de la MA chez l’humain ont été insérées. C’est un modèle largement utilisé et validé pour la recherche fondamentale sur cette pathologie. Dans le cas du modèle transgénique de la MA, l’augmentation de l’expression de la protéine d’intérêt a été observé chez des jeunes souris d’un mois. Cependant, les conséquences de cette augmentation sur l’activité neuronale n’ont pas encore été explorées dans ce modèle. De plus, les études réalisées aux stades très précoces de la MA sont limitées. Nous avons donc choisi la fenêtre de 1 à 3 mois. Nous utiliserons les mêmes âges pour étudier les effets dus aux mutations de la protéine d’intérêt pour comparer les résultats entre eux. Les animaux sont prélevés pour connaitre leur patrimoine génétique à l’âge de 7 à 10 jours afin de bénéficier de la cicatrisation rapide observée chez les jeunes animaux et de connaitre leur génotype avant leur sevrage pour l’inclusion dans les procédures expérimentales.
Etude de l’implication de l’activateur tissulaire du plasminogène et des récepteurs NMDA dans le développement du réseau vasculaire rétinien et du tractus visuel
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
2 600 souris vont être utilisées, 1 400 anesthésiées sans être réveillées et 1 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur rétine et leur tractus visuel. Chaque acte a son effectif, 1 040 poses de cathéter intraveineux caudal de quinze minutes, 600 séances d'échographie d'une heure, 360 fonds d'œil avec électrorétinogramme de quarante-cinq minutes, 200 IRM de quatre-vingt-dix minutes et 360 chirurgies terminales. 360 souris passent quatre tests comportementaux de cinq minutes portant sur l'acuité visuelle, le réflexe oculomoteur et la perception de la profondeur. Le bénéfice avancé, dépister au fond d'œil des lésions cérébrales chez les nouveau-nés prématurés, est renvoyé à d'éventuels projets ultérieurs, alors que les souris sont utilisées dès le troisième jour après leur naissance.
Objectifs
Au cours du développement du système nerveux central (SNC), les vaisseaux sanguins se développent en même temps que la formation des neurones. De nombreuses études ont mis en évidence que les petits vaisseaux sanguins soutiennent la migration neuronale. Cependant les mécanismes moléculaires sous-jacents à cette interaction sont encore mal connus. Il a été montré que des récepteurs présents sur les cellules des vaisseaux sanguins sont nécessaires à la bonne migration des neurones corticaux. Ce processus est également régulé par une molécule (protéase), qui régule plusieurs fonctions comme la formation du cortex (corticogenèse) et la plasticité neuronale. Cette protéase exerce ces fonctions en interagissant avec ces mêmes récepteurs des cellules des vaisseaux sanguins. De plus, cette interaction régule les fonctions de la barrière hémato-encéphalique (BHE) située entre le sang et le cerveau et composée par des vaisseaux sanguins particuliers. Au sein du SNC, la rétine, miroir du cerveau, apparait comme particulièrement intéressante pour des études neuro-développementales. En effet, la rétine présente de multiples similitudes avec le cerveau comme une origine embryonnaire commune et la formation simultanée de réseaux neuronaux et vasculaires. Au même titre que la corticogenèse, la rétinogenèse ou développement de la rétine, est régulée par de nombreux facteurs, dans laquelle nous supposons que cette protéase et les récepteurs des vaisseaux sanguins, avec lesquels elle intéragit, puissent être des acteurs clés. Bien que cette protéase soit exprimé dans les cellules de la rétine et les cellules des vaisseaux sanguins du SNC, à ce jour aucune étude n'a exploré leur interaction dans le développement rétinien. L'objectif de ce projet est de déterminer ces deux acteurs influencent le développement de la rétine et du système visuel, en étudiant différentes étapes du développement des vaisseaux sanguins de la rétine jusqu'à l'âge adulte, à l’aide de souches de souris génétiquement modifiées.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de démontrer que les problèmes de développement des vaisseaux sanguins dans la rétine des nouveau-nés reflètent des anomalies similaires dans le cerveau. Si cela se confirme, l'examen du fond d'œil chez le nouveau-né pourrait devenir un outil clé pour détecter précocement des problèmes vasculaires et neuronaux dans le cerveau, notamment chez les bébés prématurés, et ainsi repérer les enfants à risque de développer des lésions cérébrales. Dans ce projet, nous proposons de déterminer l'expression de deux nouvelles cibles thérapeutiques, un récepteur présent sur les cellules des vaisseaux sanguins de la rétine et du cerveau ainsi qu'une molécule exprimée par les cellules et vaisseaux sanguins de la rétine et du cerveau. Nous évaluerons également ces effets thérapeutiques sur les atteintes visuelles, l'inflammation et les dysfonctionnements des vaisseaux sanguins au cours de maladies rétiniennes ou d'anomalies développementales. Cette étude nous permettrait d'améliorer nos connaissances sur les mécanismes de développement et de fonctionnement de la rétine ainsi que les troubles pouvant survenir au cours du développement et/ou à l'âge adulte. A terme, cela pourrait déboucher sur d'autres projets permettant d'évaluer le potentiel thérapeutique de ces acteurs dans des rétinopathies liées à des problèmes de circulation, des accidents vasculaires cérébraux (AVC), la prématurité ou encore les maladies neurodégénératives.
Procédures
Les animaux seront soumis à : 1. 4 tests comportementaux (5 minutes par test, n =360). Ces tests permettront d’étudier l’acuité visuelle, le réflexe oculomoteur et la perception de la profondeur dans l’espace des animaux, 2. Pose d'un cathéter intraveineux caudal (15 minutes, n=1040), 3. Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) (90 minutes, n=200), 4. Imagerie par ultrasons (60 minutes, n=600), 5. Imagerie de fond d'œil et examen de l'activité de la rétine ou électrorétinogramme (45 minutes, n=360), 6. Chirurgie terminale (10min/animal, n= 360).
Impact sur les animaux
Selon la procédure, des nuisances ou effets indésirables sont susceptibles d'apparaitre chez les animaux. Les procédures d'évaluation comportementale ou d’imagerie sont indolores, mais peuvent engendrer un léger stress qui ne perdure pas dans le temps, dû soit à un nouvel environnement soit à l’isolement social. Les animaux retournent à un état basal dès qu’ils sont de retour dans leur cage et leur boxe de stabulation. Des douleurs per-opératoires induites suite à l'injection de molécules, incision de la peau ou lors de l'exsanguination ; ainsi que des douleurs post-opératoires suite à la pose d'un cathéter veineux peuvent avoir lieux. C’est pourquoi les animaux seront toujours soumis à une couverture analgésique et anesthésique appropriées aux gestes à effectuer et à la sévérité de chaque procédure entamée. Ces effets sont connus dans l’expérimentation au laboratoire. Une surveillance accrue sera réalisée à chacune de ces étapes. L’animal sera gardé en vie uniquement dans le cas où une personne compétente atteste de l’état de bien-être de l’animal suite à chaque étape de la procédure.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant l'étude de l'intégrité anatomique et vasculaire de la rétine d'une part et du tractus visuel d'autre part.
Remplacement
Nous ne pouvons souscrire au principe de remplacement dans ce protocole. En effet, il est nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de notre projet. Les procédures expérimentales pour mener à bien celui-ci ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Cette étude repose sur une bibliographie solide, rendant cette étude sérieuse et fondée sur des bases scientifiques existantes. De plus, la chronologie du développement de la rétine et de son réseau vasculaire est bien connue chez la souris et permet d'étudier des mécanismes similaires à ceux présent in utero chez l'Homme. Ce modèle est largement utilisé et documenté dans la littérature scientifique, ce qui en fait un choix pertinent pour notre étude. En effet, il s’agit d’étudier des mécanismes de développement des vaisseaux sanguins dans la rétine et le cerveau ainsi que le développement des capacités visuelles.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, selon nos travaux précédents publiés et des données de la littérature. A partir de ces données, nous avons utilisé des outils statistiques afin de déterminer le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. 2600 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude, et l’utilisation de tests comportementaux et d’outils d’imagerie non invasive permettant d'évaluer l'intégrité anatomique et vasculaire in vivo du tractus visuel permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. L'utilisation d'un animal pour un enchainement de procédures légères et modérées réduit également le nombre total d'animaux.
Raffinement
Pour respecter le principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et recevront des analgésiques adaptés au niveau de sévérité du geste, durant chaque procédure pour minimiser la douleur. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. En effet, en fonction des gestes réalisés des points limites adaptés ont été défini et seront appliqués tout au long de la vie de l'animal afin de veiller à son bien-être et l'absence de souffrance par une prise en charge adaptée. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7 et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et les animaux auront un accès libre à l’eau et à la nourriture. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux, notamment par l'hébergement en groupes sociaux de 5 ou 6 animaux et l'enrichissement de leur environnement en particulier avec du matériel nécessaire à la fabrication d'un nid. Tout sera mis en œuvre pour réduire le stress, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du développement et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le métabolisme. Cette espèce est aussi moins sensible que des modèles plus complexes, tout en gardant une organisation suffisamment proche de celle de l’Homme pour pouvoir y être comparée. Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques où l'expression des molécules d'intérêt est déficiente de manière globale dans leur organisme ou spécifiquement dans les vaisseaux sanguins. Les animaux seront utilisés à des stades post-nataux précoces et au stade de jeunes adultes. En effet c'est à ces stades du développement que les animaux sont classiquement utilisés dans la littérature pour l'étude de l'intégrité anatomique et fonctionnelle du tractus visuel car ils correspondent aux stades de développement du tractus visuel chez l'Homme, rendant notre étude plus appropriée pour une étude translationnelle et sa transposition à des atteintes pathologiques telles que la rétinopathie du prématuré ou encore l'accident vasculaire rétinien ou cérébral. Ainsi, les animaux utilisés seront âgés de 3, 5, 15, 30 et 60 jours postnataux, correspondant respectivement aux stades P3, P5, P15, P30 et adultes. En effet, les stades P3, P5 et P15 correspondent à des stades clés du développement du réseau vasculaire rétinien et le stade P30 se situe à un stade intermédiaire de la maturation du système visuel c'est à dire dans la période critique du développement de ce dernier. Le stade P60 correspond au stade adulte où le système visuel est considéré comme mature. Ces différents stades permettront ainsi de déterminer le rôle de chacune de nos cibles d'intérêt dans le développement du réseau vasculaire rétinien et du tractus visuel.
Formation aux techniques d’administration et de prélèvement sur souris et rats
- Formation professionnelle
Rats : 200
Tous destinés à la "réforme" avant même d'entrer dans le projet, 2 000 souris et rats issus du tri génétique de l'animalerie seront tués à l'issue. 400 d'entre eux sont anesthésiés sans être réveillés et 1 600 subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit au maximum cinq gestes sous anesthésie, injections ou prélèvements sanguins, ou trois gestes sur animal vigile, injections, gavages ou prélèvements urinaires, pour que des personnels s'entraînent ou se réentraînent. Le porteur écrit que l'utilisation d'animaux est "indispensable" pour cette formation, tout en indiquant que des queues artificielles de souris et de rats peuvent remplacer une partie des exercices.
Objectifs
Ce projet est un projet éducatif qui intègre différentes techniques d’administration et de prélèvement dont les utilisateurs peuvent avoir régulièrement besoin pour leurs expérimentations. Ces formations s’adressent aux personnels concepteurs ainsi qu’à toute personne appliquant des procédures expérimentales et/ou souhaitant se ré-entrainer pour un ou des gestes techniques. Ces techniques seront utilisées sur demande des utilisateurs et dans le cadre d’un besoin pour leur expérimentation et par conséquent leur saisine. Elles pourront également être utilisées dans le cadre de formations plus générales aux bonnes pratiques des techniques d’administrations et de prélèvements.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de former ou re-former les utilisateurs (novices ou plus anciens pour des réentrainements) sur des techniques générales qui ne nécessitent en général pas d’entrainement dans les saisines sur lesquelles travaillent ces utilisateurs (Par exemple, une personne nouvellement arrivée dans un projet comprenant des utilisateurs déjà formés au geste en question). Il permet donc d’avoir du personnel bien formé, connaissant les bonnes pratiques d’administrations et de prélèvements chez les rongeurs et donc de travailler dans de bonnes conditions avec les animaux.
Procédures
Sous anesthésie générale, les animaux pourront être soumis à 5 gestes maximum comprenant des injections de produits ou des prélèvements sanguins à raison de 20 secondes/gestes. Sur animaux vigiles, nous pourrons réaliser au maximum 3 gestes incluant soient des injections, des gavages ou des prélèvements urinaires à raison de 20 secondes/gestes. Les animaux qui seront sous anesthésie générale, le seront pour 1 seule fois avec 30 minutes d’anesthésie maximum.
Impact sur les animaux
Concernant les gestes d’administration avec utilisation d’aiguilles, les animaux peuvent subir un léger stress dû à la contention et une douleur légère au site d’injection. Concernant le gavage par voie orale, une douleur, un stress ou un inconfort léger peut être ressenti par les animaux. Concernant les prélèvements sanguins et urinaires, ils peuvent entraîner un léger inconfort
Devenir
Tous les animaux de cette saisine sont initialement destinés à la réforme. Ils seront donc tous euthanasiés en fin de procédure.
Remplacement
Dans ce projet, l’utilisation d’animaux est indispensable pour former les utilisateurs aux différents gestes techniques et leur permettre de s’entrainer. Pour certains gestes, l’utilisation de mannequins pourra être proposée au préalable et remplacera donc partiellement l’utilisation d’animaux (par exemple queues artificielles de souris ou de rats pour les administrations par veine de la queue). De plus, étant situé dans une animalerie à forte valence d’élevages et donc à une contrainte forte de tri génétique, des animaux euthanasiés dans ce cadre, pourront être utilisés pour faire des autopsies et aller voir les organes d’intérêt.
Réduction
Pour certains gestes, l’utilisation de mannequins pourra être proposée au préalable (par exemple queues artificielles de souris ou de rats pour les administrations par veine de la queue). De plus, étant situé dans une animalerie à forte valence d’élevages et donc à une contrainte forte de tri génétique, des animaux euthanasiés dans ce cadre, pourront être utilisés pour faire des autopsies et aller voir les organes d’intérêt. Cette utilisation permet donc un moindre besoin en animaux ‘vivants’. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous utiliserons des animaux de réforme issus de nos élevages (animaux destinés à la mise à mort suite au tri génétique). S’il n’y a pas d’animaux de réforme à disposition, nous pourrons éventuellement commander des animaux auprès de fournisseur agréé en leur demandant le plus possible, des animaux de réforme. Les animaux ne seront utilisés qu’une seule fois mais plusieurs gestes peuvent être réalisés au cours de cette utilisation.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux harmonieux dans des cages avec enrichissement (frisottis, tunnels/igloos). Afin de réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse, les animaux seront analgésiés pré-anesthésie puis anesthésiés chimiquement ou à l’aide de gaz. Des anesthésiques locaux pourront également être administrés pour certains prélèvements ou administration. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués tout au long de l’étude.
Choix des espèces
La souris et le rat sont les modèles d'étude des utilisateurs de l'animalerie. Ces derniers souhaitent être formés et/ou se ré entrainer sur ces modèles. L’utilisateur ne pourra être formé que sur la technique d’intérêt de son étude et dans l’espèce concernée. Les animaux sont utilisés à partir de 4 semaines et jusqu'à une 30aine de semaines en fonction des mises à mort programmées dans l'animalerie (animaux de réforme issus des élevages ou de fournisseurs agréés).
Mise en place de la technique de PV loop (pressure-volume loop) chez les rongeurs (souris et rat)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 20
Intubés, cathétérisés par la veine jugulaire puis ouverts au thorax pour qu'un cathéter soit poussé dans le ventricule gauche, 50 souris et 20 rats sont opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Le porteur reconnaît que l'introduction du cathéter dans le cœur peut provoquer douleur, traumatisme des tissus cardiaques et inflammation locale, avant d'écrire que le bien-être des animaux non-humains demeure une priorité absolue. Ces interventions ne visent aucun résultat biologique propre, le projet consistant à mettre au point la technique de mesure pression-volume chez le rongeur. Le taux d'échec ou de mortalité chirurgicale, que le porteur estime à 15 ou 20 %, a été intégré par avance dans l'effectif.
Objectifs
Les maladies du cœur restent l'une des principales causes de décès et de problèmes de santé dans le monde. Trouver de nouveaux traitements est donc un vrai défi. Grâce aux progrès en génétique, les chercheurs peuvent aujourd’hui repérer de nombreux gènes qui pourraient jouer un rôle dans l’apparition de ces maladies. Mais comme le cœur est un organe très complexe, il est important de tester ces découvertes dans des animaux vivants pour vérifier leur impact réel. Il existe plusieurs méthodes pour évaluer comment fonctionne le cœur. Mais une technique en particulier, appelée boucle pression-volume (ou Pressure-Volume loop), permet de mesurer en même temps la pression et le volume dans le cœur, ce qui donne une image très précise de son activité pendant un battement. Le but de ce projet est de mettre en place cette technique chez la souris et le rat. Cela permettra d'étudier de manière très détaillée la façon dont le cœur fonctionne, en mesurant des éléments clés comme sa force de contraction, sa capacité à se détendre, et sa souplesse.
Bénéfices attendus
Aujourd’hui, la meilleure méthode pour analyser en détail le fonctionnement du cœur est l’étude des relations entre la pression et le volume dans le ventricule. Cette approche est considérée comme la plus fiable pour évaluer le cœur dans son ensemble, sans l’isoler. Grâce aux progrès technologiques, il est maintenant possible d’utiliser cette méthode même chez de très petits animaux, comme les souris. Cela a permis aux chercheurs d’étudier avec précision le cœur de souris génétiquement modifiées, de tester des traitements, ou encore d’explorer les effets de certaines maladies. Ce qui rend cette méthode particulièrement utile, c’est qu’elle fournit des informations très précises sur le ventricule gauche du cœur (la partie qui envoie le sang dans tout le corps), tout en étant peu influencée par les variations de la pression sanguine dans les vaisseaux, ce qui permet une analyse plus fiable de la performance réelle du cœur.
Procédures
Les animaux seront soumis à 4 différentes interventions : 1- Administration d'un antalgique et d'un myorelaxant d'une couverture de 2 heures minimum (5min). 2- Contrôle des voies aériennes par intubation (10-30 min) 3- Mise en place d’un cathéter dans la veine jugulaire (10-15 min) 4- Thoracotomie et placement du cathéter dans le ventricule gauche (10-30 min)
Impact sur les animaux
Les principales nuisances associées à la mesure des courbes pression-volume (PV) chez les animaux sont les suivantes : 1- Le stress : une douleur lors de l’injection d’antalgique et de myorelaxant réalisé sur animal vigile avant l’anesthésie. 2- une gêne malgré l'antalgique avant l'opération lors de la procédure d'insertion du cathéter pour réaliser une intubation afin de contrôler les voies aériennes ou le cathéter qui sera introduit dans le ventricule cardiaque peut induire un stress significatif et provoquer de la douleur, notamment lors de l'introduction du cathéter dans le cœur. 3- Les risques d'infection ou de traumatisme : L'insertion d'un cathéter dans le cœur présente un risque d'infection si les mesures de stérilité ne sont pas strictement respectées. De plus, un traumatisme lors de l'insertion du cathéter peut endommager les tissus cardiaques ou les structures vasculaires avoisinantes. La présence du cathéter dans le ventricule peut aussi provoquer une inflammation locale, perturbant ainsi la fonction cardiaque et affectant les mesures obtenues. Nous minimisons ces nuisances par une préparation méticuleuse (choix approprié de l'anesthésie, techniques stériles rigoureuses, surveillance continue) et en prenant en compte ces effets lors de l'analyse des données. L'éthique expérimentale et le bien-être des animaux demeurent nos priorités absolues tout au long de cette expérience.
Devenir
Aprés l'approche chirurgical invasive et à la fin de l'expérience, les animaux (souris ou rats) seront mis à mort pour effectuer des prélévements d'organes et des analyses approfondies.
Remplacement
La chirurgie Pressure-Volume loop (PV loop) est une technique invasive permettant une évaluation directe, dynamique et précise de la fonction cardiaque (précharge, postcharge, contractilité, compliance). À ce jour, aucune méthode in vitro, ex vivo, ni de modèle informatique ne permet de reproduire la complexité de ces mesures dans un organisme entier vivant. Des alternatives telles que : - les modèles in silico de la fonction cardiaque, - les organoïdes cardiaques ou cultures de cellules myocardiques, - ou les mesures échographiques ou IRM cardiaques non invasives, ne fournissent pas les données continues en temps réel, couplées aux variations de charge, que la PV loop permet. Par conséquent, l’utilisation d’un modèle animal vivant est indispensable à ce stade pour répondre aux objectifs scientifiques du protocole.
Réduction
Ce projet a été conçu de manière à réduire autant que possible le nombre d'animaux utilisés. Forts de notre expérience dans la mise en place et la validation de protocoles chirurgicaux de ce type, nous savons que la chirurgie PV loop est invasive, avec un taux de mortalité ou d’échec technique de 15–20 %, nous inclurons donc un coefficient de sécurité pour compenser les pertes chirurgicales attendues. Nous avons prévu d'utiliser 50 souris et 20 rats dans cette étude afin d'avoir des résultats statistiquement exploitables. En revanche, les volumes cardiaques plus petits des souris entraînent des fluctuations de pression et de volume plus marquées au cours du cycle cardiaque. Cela nécessite l'utilisation d'un plus grand nombre de souris afin de satisfaire à des exigences plus strictes en matière de précision des mesures et de fiabilité des équipements utilisés pour obtenir des données fiables. La standardisation du protocole chirurgical dans ce projet, permettra à l’avenir dans les autres protocoles expérimentaux, pour un seul animal, de produire des données complètes et exploitables sur la pression, le volume et la compliance du cœur, réduisant ainsi le besoin d’animaux supplémentaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales. Une thermosonde rectale sera insérée pour surveiller la température, et des coussins chauffants ainsi que des lampes chauffantes seront utilisés afin de maintenir une température corporelle physiologique (37 °C) pendant la collecte des données hémodynamiques et tout au long de l'expérience. Pour contrer la perte de sang et de volume, une solution à 10 % d'albumine dans 0,9 % de NaCl mise à T° ambiante sera administré. Pour un rat qui pèse 250 g on ajoutera 1.6 ml (10%) de volume en solution albumine/NaCl et pour la souris 0.8 ml. Afin de limiter le stress et la douleur, nous injecterons un antalgique, comme la buprénorphine (2 mg/kg), et un myorelaxant, tel que le pancuronium (2 mg/kg), 30 minutes avant la chirurgie. Tout au long de la procédure chirurgicale, les animaux seront sous anesthésie pour minimiser la douleur aiguë. Une solution à 10 % d'albumine dans 0,9 % de NaCl sera également préparée pour contrer la perte sanguine et de volume. Lors de l'approche chirurgicale, un thermocautérisateur sera utilisé pour optimiser l'hémostase. Afin d'assurer une ventilation adéquate pour la collecte de données PV de haute qualité, les pressions inspiratoires seront limitées à
Choix des espèces
Comprendre les causes et la progression de la maladie cardiaque présente un défi important pour la communauté biomédicale. La flexibilité génétique de la souris et maintenant du rat offre un grand potentiel pour explorer la fonction cardiaque au niveau moléculaire. La petite taille de la souris et du rat présente des défis en ce qui concerne l'exécution phénotypage cardiaque détaillée. Miniaturisation et d'autres progrès technologiques ont fait de nombreuses méthodes d'évaluation cardiaque possible chez la souris et le rat. Parmi ceux-ci, la collecte simultanée des données de pression et de volume fournit une image détaillée de la fonction cardiaque qui ne sont pas disponibles par le biais de toute autre modalité. Les animaux souris et rats seront âgées de 10 semaines au début de protocole. Afin de travailler sur un modèle adulte où la fonction cardiaque est bien développée et pour suivre les recommandations de l'entreprise qui fabrique les cathéters spécifiques pour les tailles de cœur.
Bioélectronique pour la neurocardiologie dans un modèle porcin : diagnostique et thérapeutique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Un infarctus est provoqué sous contrôle radiologique pendant deux heures chez chaque cochon, suivi selon les groupes de deux IRM de deux heures, de trois cartographies électriques du cœur d'une heure trente et de stimulations nerveuses qui déclenchent des spasmes musculaires involontaires. 48 cochons vont être utilisés, 36 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 12 sous anesthésie sans réveil, tous tués pour que leur cœur soit prélevé et cartographié. Le projet vise à valider des dispositifs implantables de neuromodulation censés prévenir la mort subite cardiaque chez l'être humain. La cicatrice laissée par l'infarctus est présentée comme "non douloureuse", alors que la procédure qui la produit est classée sévère et peut déclencher des tachycardies ventriculaires.
Objectifs
4 à 5 millions de décès seraient attribuables chaque année à la mort subite cardiaque, qui est principalement la conséquence des infarctus du myocarde (70%). Dans ces pathologies, l’action du système nerveux favoriserait la survenue des troubles du rythme cardiaque (arythmies). Bien que ces affections représentent un problème majeur de santé publique, les traitements actuels restent à ce jour insuffisants, et/ou associés à des effets secondaires. Aussi, le blocage de l’activité nerveuse (ou neuromodulation) qui a déjà fait ses preuves dans le traitement des douleurs chroniques semble être une piste thérapeutique prometteuse. Le projet vise ici à 1) mieux comprendre le rôle du système nerveux (autonome) dans l’émergence et le maintien des troubles du rythme, et à 2) valider les nouveaux dispositifs implantables et nouvelles approches de neuromodulation à visée thérapeutique, dans un modèle de gros mammifère.
Bénéfices attendus
A long terme, ce projet contribuera à la mise au point et à la validation des capteurs et des modulateurs implantables chez le patient, capables de détecter les anomalies qui précèdent la survenue des troubles du rythme, et d’agir en conséquence sur le système nerveux, pour prévenir la mort subite cardiaque.
Procédures
Un infarctus du myocarde sera induit chez les animaux (2h, une fois par animal), de manière guidée par rayon X (fluoroscopie), qui génèrera une cicatrice non douloureuse dans le muscle. Les animaux du modèle chronique seront aussi concernés par la pose d’un boitier de suivi ECG (1h, 1 fois par animal) pour monitorer l’activité cardiaque chez l’animal éveillé, après la création de l’infarctus. Avant, pendant et après l’induction de l’infarctus, les activités cardiaques et nerveuses seront étudiées par des procédures non invasives et mini-invasives utilisées en clinique, sous anesthésie générale, avec l’administration d’une procédure antidouleur adaptée. Les animaux seront concernés par : - un IRM 1.5T (2h par examen, 2 fois par animal du modèle chronique), - de la cartographie de contact (1h30 par examen, 3 fois par animal des modèles chroniques, 1 fois par animal du modèle aigu) - un monitoring de la pression cardiaque (toute la durée de l’expérience sous anesthésie, 3 fois par animal des modèles chroniques, 1 fois par animal du modèle aigu), - une stimulation cardiaque programmée (environ 1h, 2 fois par animal des modèles chroniques, 1 fois par animal du modèle aigu), - une stimulation bloquant l’activité nerveuse (1h, 2 fois par animal des modèles chroniques, 1 fois par animal du modèle aigu), - un prélèvement de sang dans le sinus coronaire (environ 10 min, 4 fois par animal des modèles chroniques, et 2 fois pour le modèle aigu) - un prélèvement de sang systémique (environ 5 min, 4 fois pour chaque animal des modèles chroniques et 2 fois par modèle aigu) - une coronarographie 3D (30-45 min, 2 fois par animal des modèles chroniques et 1 fois par animal du modèle aigüe). - des prélèvements tissulaires (30 min par prélèvement, 1 fois par animal)
Impact sur les animaux
Les animaux seront mis à jeûn à minima 12h avant l’opération. La création du modèle d’infarctus provoquera la mise en place d’une cicatrice cardiaque non douloureuse. La chirurgie nécessitera l’introduction de cathéters dans les veines/artères, ce qui pourra provoquer une douleur légère et des saignements au moment de leur pose et de leur retrait. Les anesthésies générales peuvent impacter légèrement le bien-être animal en induisant une légère désorientation ou un état léthargique transitoire lors du réveil. Lors des procédures d’imagerie non-invasive (IRM) ou mini-invasive (cartographie de l’activité électrique cardiaque : cartographie de contact), le bien-être animal peut être également impacté par la pose de cathéters (douleur légère et saignement) : au niveau de la patte avant (pour la perfusion de médicaments), au niveau de la veine fémorale et de l’introduction sous le sternum (guide pour la cartographie). La création d’infarctus et les procédures de cartographie de contact peuvent comporter des effets indésirables cardiaques tels que des déclenchements de tachycardie ventriculaire. La stimulation des ganglions nerveux peut provoquer des spasmes musculaires involontaires. Le positionnement du stimulateur sur les ganglions sera rectifié jusqu’à la disparition des spasmes. Le prélèvement du cœur après la mise à mort requiert une ouverture du thorax préalable chez l’animal endormi, soit un acte chirurgical provoquant une douleur intense (palier 3). Une analgésie proportionnelle à l’intensité de la douleur (légère versus intense) sera mise en place.
Devenir
Dans le but de mieux comprendre et caractériser le rôle du système nerveux dans le déclenchement et le maintien des troubles du rythme associés aux infarctus, les cœurs seront prélevés pour cartographier l’activité électrique et ainsi obtenir des données complémentaires à celles enregistrées chez l’animal vivant.
Remplacement
Compte tenu de la visée thérapeutique du projet, les données récoltées nécessitent un modèle proche du patient, et donc l’utilisation de gros mammifère. D’autre part, agir sur la relation système nerveux-cœur implique de l’étudier dans son contexte naturel car cette relation fait appel à des réflexes qui s’établissent de manière complexes à l’intérieur du corps, et passe aussi par la sécrétion de molécules dans la circulation sanguine qui seront dosées. Aujourd’hui, il n’existe pas d’alternative non animale qui permette de reproduire ce degré de complexité et cette ressemblance, ce qui exclue la possibilité de remplacer les animaux. Les résultats obtenus dans ce projet permettront cependant d’enrichir la base de données pour créer des modèles informatiques de cœurs pathologiques grâce à la modélisation, et ainsi à terme de limiter l’utilisation de l’expérimentation animale.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre d’animaux, plusieurs méthodes d’analyses seront mises en œuvre afin d’obtenir le maximum de données expérimentales dans ce projet tels que l’IRM, les mesures de l’activité cardiaque (électrique, capacité de contraction, etc…). Les animaux ont été répartis en 4 groupes de 12 individus, soient les animaux contrôles reproduisant la procédure mais sans obstruction des vaisseaux, commun pour les 3 modèles d’infarctus (les infarctus dits reperfusés pour lesquelles l’obstruction du vaisseau est transitoire, les infarctus reperfusés pendant que l’activité neuronale liée au cœur est abolie, et les infarctus dits non reperfusés pour lesquels le blocage d’un vaisseau est définitif). L’utilisation de protocoles expérimentaux identiques permettra également de comparer les groupes entre eux, et ainsi de réduire le nombre d’animaux. L’étude sera pratiquée selon un suivi longitudinal (c’est-à-dire au cours du temps, en plusieurs étapes successives) chez chaque animal, de manière à faire correspondre les paramètres obtenus de leur vivant avant et après l’infarctus, et après avoir prélevé le cœur chez tous les individus. La taille des groupes envisagée est aussi le résultat de précédentes expérimentations menées au laboratoire sur le même modèle animal, pour lesquelles il a été constaté que ce nombre était suffisant pour faire valoir des différences statistiques, lorsque les effets observés ne sont pas dus au hasard. La taille de cette cohorte prend également en compte un risque de perte (10-20%) lié à la procédure chirurgicale, pour laquelle des fibrillations ventriculaires peuvent survenir, induisant le décès de l’animal. Les paramètres mathématiques des données (moyennes, percentiles, écarts standards à la moyenne) seront analysés afin de déterminer le test statistique adéquat à appliquer en suivant.
Raffinement
La prise en compte du bien-être animal s’effectue à plusieurs niveaux. La création des modèles et les expérimentations seront réalisées sous anesthésie générale selon des protocoles approuvés, et avec des procédures analgésiques adaptées à la douleur générée par les gestes chirurgicaux pratiqués. Les constantes de l’animal (fréquence cardiaque, pression artérielle, fréquence respiratoire, etc…) seront suivies par du personnel compétent tout au long de la procédure expérimentale, et les doses d’anesthésiques/analgésiques seront adaptées si des signes de réveil/souffrance étaient observés. Quand les anesthésies générales sont suivies d’un réveil, les animaux recevront un traitement médicamenteux de telle sorte que la douleur post-opératoire soit prise en charge, et leur état de santé général sera surveillé. Si le comportement de l’animal suggère un état de souffrance, un examen vétérinaire sera pratiqué, et sera suivi d’une prise de médicament si nécessaire, ou dans les cas les plus sévères et non traitables, de l’euthanasie. Les animaux bénéficieront de soins quotidiens pratiqués par une équipe de spécialistes compétents. L’hébergement est agréé, les locaux sont entretenus, et les cochons seront regroupés de telle sorte qu’ils pourront exprimer des comportements sociaux naturels, tout en disposant de distractions (Kong, balles, jouets en caoutchouc durs mastiquables …).
Choix des espèces
Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme (mouton, porc, chèvre, chien), le porc a été retenu car (i) une très grande expérience des équipes de recherche sur la création du modèle d’infarctus avec cette espèce (ii) ce modèle animal est bien décrit et caractérisé et constitue donc une référence dans la communauté scientifique ; (iii) le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ce modèle animal ; (iv) il est déjà utilisé par les autres équipes que regroupe le projet, et permettra la mutualisation des données obtenues. Les animaux seront inclus de telle sort qu’ils disposeront à la fois de caractéristiques fonctionnelles proches de celles de l’Homme, et que leur prise de poids (environ 1 kg / jour) soit cohérente avec une prise en charge adaptée lors de l’expérimentation terminale du modèle chronique. Les cochons des groupes chroniques (infarctus définitifs, infarctus reperfusés, cochons contrôles : groupes 1, 2a et 3 respectivement) seront donc inclus en phase (1) – acquisition des données de base- à 15 kg (1-2 mois), pour peser 25 kg (2-3 mois) lors de la phase (2) – création du modèle- et 60 kg (3-4 mois) lors de la phase (3) – remodelage dû à la lésion-. Pour correspondre aux poids de la phase (2), les animaux prévus pour le groupe d’ischémie reperfusion sous inhibition des ganglions rachidiens (groupe 2b) utilisés uniquement en protocole terminal (c’est-à-dire anesthésie sans réveil) seront inclus à 25 kg, d’âge 2-3 mois.
Caractérisation de la stéatohépatite associée à un dysfonctionnement métabolique précoce dans des modèles de trisomie 21
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Des souris de seize lignées différentes, porteuses de duplications partielles reproduisant la trisomie 21, vont être utilisées pour repérer les gènes qui lient ce syndrome aux maladies du foie. Elles sont 720, dont 672 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 48 sous anesthésie profonde sans réveil. Ces 48 souriceaux de sept et quinze jours reçoivent une ponction de sang directement dans le cœur et sont tués sans reprendre conscience. Les autres subissent dix semaines de régime appauvri ou enrichi en graisses, avec l'installation possible d'une maladie du foie, des difficultés à se déplacer et une perte de poids, puis des tests d'apprentissage rendus plus attirants par l'acidification de leur eau de boisson, avant d'être tuées pour le prélèvement d'organes.
Objectifs
Ce projet adopte une approche interdisciplinaire pour comprendre les pathologies du foie associées à des dysfonctionnements chez les personnes atteintes du Syndrome de Down (SD) ou Trisomie 21 (T21). La T21 affecte 1 naissance sur 1 000, c’est la déficience intellectuelle la plus courante et elle est souvent accompagnée de comorbidités comme l'obésité, le diabète et des pathologies du foie. Le projet s'appuie sur des recherches antérieures financées par l'UE, qui ont montré que la pathologie du foie est présente chez 82 % des personnes atteintes de T21 et d'obésité, et chez seulement 45 % des personnes atteintes de T21 avec un indice de masse corporelle moyen. Les études sur des modèles murins mimant la T21 ont révélé que cette pathologie du foie contribue aux troubles cognitifs. Ces modèles présentent une inflammation du foie, une accumulation d'acides biliaires, une diminution du cholestérol et une augmentation de la bilirubine dans le sang. De plus, une suractivation des voies inflammatoires est observée dans divers tissus, y compris le foie, les muscles, les tissus adipeux et le cerveau. L'hypothèse du projet est que la perturbation de la biologie des acides biliaires et du cholestérol, due à la présence de trois copies de certains gènes (Trisomie) au lieu de deux, est un facteur intrinsèque conduisant aux pathologies du foie dans la T21. Le projet utilisera 16 modèles murins de la T21 avec différentes duplications partielles pour identifier les gènes candidats et étudier leurs effets sur le métabolisme et la cognition. L'identification de ces gènes permettra également d'étudier l'origine du dysfonctionnement hépatique au cours du développement, en se concentrant sur la biologie des acides biliaires et du cholestérol de la naissance à l'âge adulte.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de l’obésité dans la trisomie 21 (T21). L’identification des gènes du chromosome 21 impliqués et la compréhension du changement dû à l’obesité est essentielles. En effet, de meilleures thérapeutiques peuvent être proposées pour cibler cette obésité et en réduire les conséquences directes sur les différents organes du corps, y compris le cerveau. Cette étude ouvrira la voie à de futures investigations et déclencher de nouvelles voies thérapeutiques. Le développement de médicaments nécessitera une compréhension approfondie de la physiopathologie de l’obesité dans la T21. De plus, seule une analyse et une compréhension détaillées de la régulation de l’obesité fourniront un ensemble de marqueurs moléculaires essentiels au développement d’un candidat médicament. La T21 est toujours la forme la plus courante de déficience intellectuelle. Même après un diagnostic prénatal, la prévalence est toujours d’environ 1 sur 2000 naissances dans les pays industrialisés, alors que dans d’autres endroits, le risque est d’environ 1 sur 700 nouveau nés. En Europe, la T21 est responsable de 8 % des troubles congénitaux et d'environ 17 000 décès dans le monde. Pour les enfants atteints, les chances de survie au-delà de la première année de vie se sont améliorées ces dernières années : 90 % des enfants atteints survivent désormais au-delà de 5 ans. Ce taux montre l'importance du besoin médical d'améliorer la qualité de vie des personnes atteintes. Le bénéfice majeur de ce projet sera de documenter les mécanismes génétiques et physiopathologiques aboutissant à l’obésité dans la T21, très peu investigués à ce jour, alors que l’obésité est une comorbidité largement présente chez plus de 30% des individus avec les patients T21.
Procédures
Les souris âgées de 7 et 15 jours auront un prélèvement de sang terminal (sans reveil) intracardiaque sous anesthésie profonde (quelques min) Les souris âgées de 60 jours ou plus auront un prélèvement de sang (5 min) après avoir réalisé ou non des tests de comportement non invasifs pour une évaluation de l’apprentissage et la mémoire. Deux groupes de souris seront nouries avec un régime appauvri ou enrichi en graisses pendant 10 semaines.
Impact sur les animaux
Nuisances liées à la maladie : L’installation d’une maladie hépatique peut entraîner une obésité, certaine gêne/douleur au niveau du foie en cas d’inflammation et/ou de fibrose. Dans le cas extrême d’évolution vers une insuffisance hépatique, les animaux pourraient présenter des signes de fatigue avec difficulté à se déplacer dans la cage et avoir une perte de poids. Nuisances liées au prélèvement de sang : Pour les souris nouveaux nés, le prélèvement de sang sous anesthésie peut engendrer un stress. Pour les souris plus âgées, le prélèvement du sang peut entrainer un stress lié à la contention et une douleur légère de courte durée au point de prélèvement. Celles liées aux tests de comportements : Les souris seront soumises à un stress léger lors des tests comportementaux (changement d’environement, changement ponctuel du pH de l’eau (acidification de l’eau de boisson en cage d’hébergement, qui rend plus appétent le lait sucré lors des tests d’apprentissage réalisés en dehors de la cage d’hébergement)) afin de favoriser l’apprentissage et ainsi réduire la durée des tests. Celles liées au régime alimentaire riche ou pauvre en graisses qui entraine : l’installation d’une maladie du foie impliquant une certaine gêne/douleur au niveau du foie en cas d’inflammation. Les animaux peuvent présenter des signes de fatigue (difficulté à se déplacer dans la cage), des crampes musculaires, une perte d’appétit, une perte de poids).
Devenir
Tous les animaux sont mis a mort à l'issue de chaque procédures et certtains organes seront prélevés pour des études histologiques et moléculaires.
Remplacement
L’étude de perturbations comme les maladies du foie est possible chez la souris qui récapitule plusieurs aspects moléculaires et histopathologiques de la pathologie humaine dans la trisomie 21. Le modèle souris mutante est essentiel pour élucider le rôle des différentes régions du chromosome humain 21 dans les déficits cognitifs et comportementaux observés chez les personnes atteintes de T21, car elles sont très utiles pour reproduire le déficit intellectuel de ce syndrome. Comme l'objectif du projet est d'étudier les comorbidités de la T21, et l'ensemble des processus d'obésité nécessitent non seulement des régulations au sein du tissu mais également des communications inter-organes et avec l'environnement, qui n'existent que dans l'organisme entier. Les organoides ne permettent pas ce niveau d’échange et d'intégration physiologique, d'où l'utilisation d’un modèle animal.
Réduction
Nos expériences de base sont construites sur des groupes de 16 animaux pour avoir un résultat significatif. Pour les tests de comportement, la taille des groupes a été déterminé grâce aux résultats de nos précédentes études qui nous ont permises de déterminer le nombre minimum d’animaux à utiliser, soit 16 (8 mâles et 8 femelles) par groupes pour avoir des résultats significatifs. Comme les tests comportementaux sont sans contraintes, certains animaux ne répondront pas, c'est pourquoi nous testerons 4 animaux de plus dans chaque groupe. D’autre part, la stratégie de croisement utilisées ne produit que les animaux nécessaires au déroulement du projet.
Raffinement
Un tube de transfert sera placé dans les cages pour manipuler les animaux sans les toucher et servira également comme enrichissement du milieu durant toute l’expérience, Les animaux aiment bien s’y réfugier et il servira aussi à éviter les contentions par la queue tout au long de leur vie, cela limitera le stress chronique. Tout le personnel impliqué est formé pour réaliser le prélèvement de sang et minimiser le stress. Les souris seront évaluées 2 fois par semaine pour détecter tout signe de souffrance. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués Nous utilisons notamment en score basé sur la mobilité des animaux. Les prises de sang à 7 et 15 jours après la naissance seront réalisées sous anesthésie de manière à limiter l’inconfort.
Choix des espèces
Il existe de nombreux modèles animaux d’obésité mais peu sont ceux qui récapitulent la physiologie, l'histologie, les résultats et les changements transcriptomiques observés chez les humains. Ces modèles sont différents de l’humain, soit parce qu'ils nécessitent des manipulations alimentaires non physiologiques, soit parce qu'ils ne présentent pas de résistance à l'insuline spécifique de la pathologie humaine. Ce qui n’est pas le cas chez la souris. De plus, la souris est l’espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Il existe un grand nombre de modèles murins qui miment la trisomie 21. De plus, son temps de génération associé aux techniques d’édition du génome existantes permettent de réaliser des études complexes et de récapituler de manière assez fidèle les mécanismes chez l’humain. Les souris seront utilisées à l'âge 7 et 15 jours après la naissance pour déterminer à quel moment se met en place l’obésité. Les animaux seront placés sous régime spécial, dès 10 semaines d’âge et pendant 10 semaines, soit l’âge adulte,moment où le développement cérébral est achevé. Les animaux seront prélevés à 60 jours après la naissance ou plus pour les groupes qui passeront les tests de comportement, soit l’âge adulte, moment où le développement cérébral est achevé, chez la souris, ce développement du cerveau se poursuit après la naissance.
Évaluation de différentes approches thérapeutiques dans 2 modèles de diabète chez le rongeur (rat ou souris)
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Rats : 755
Pour tester des implants abdominaux contre le diabète, 755 souris et 755 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue. 1 260 d'entre eux relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 210 d'un niveau modéré, 40 étant opérés sans réveil. Ils subissent une à deux chirurgies sous anesthésie gazeuse d'environ trente minutes, des soins post-opératoires de 48 à 72 heures, jusqu'à cinq prélèvements sanguins par 24 heures et des contentions répétées, avec le risque d'hypoglycémies et d'hyperglycémies provoquées. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne permet d'évaluer l'effet d'une molécule sur le diabète et décrit l'animal comme un "passage obligatoire" avant toute administration à l'être humain.
Objectifs
Le diabète est une maladie chronique qui se caractérise par un excès de sucre dans le sang ou hyperglycémie. Il existe 2 principaux types de diabète, dus à des dysfonctionnements différents : le diabète de type 1 (Pas de production d’insuline par le pancréas) et le diabète de type 2 (Résistance à l'insuline). En France en 2015, plus de 3,5 millions de personnes étaient traitées pour un diabète. Ce chiffre est en constante augmentation. En 2022, le nombre de patients est passé à plus de 4,3 millions, soit 6,3 % de la population, 44,8 % de femmes et 55,2 % d’hommes. Au niveau mondial, le diabète de type 2, le plus fréquent (plus de 90 %), est en forte progression : 108 millions en 1980, 422 millions en 2014 et 537 millions en 2021. Ce projet consiste à évaluer de nouvelles thérapies sur un modèle de rongeur diabétique (rat et souris). Ces nouvelles thérapies consistent en des implants placés dans l'abdomen en comparaison avec une technique de référence.
Bénéfices attendus
A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments ou dispostifs pour traiter le diabète, une pathologie humaine touchant plus de 5 millions de personnes en France et plus de 600 millions dans le monde. Du fait de la cible thérapeutique, ce composé pourrait avoir aussi une application en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (rongeurs) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive en fonction de l’objectif scientifique attendus.
Procédures
Les souris de ce projet pourront subir une anesthésie gazeuse (1 à 2 fois, environ 30 min/chirurgie), des soins post-opératoire pendant 48 à 72h, des administrations de produits d’analgésie (1 ou 2 avant la chirurgie puis 3 ou 5 sur les 48 à 72h de soins post opératoires, environ 1 min par administration) ou des prélèvements sanguins [(maximum 5 prélèvements /24h, durée: moins de 30 sec/prélèvement)], une contention lors de suivis cliniques (2 à 3 fois/semaine, environ 1 min).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront subir un stress lié à la chirurgie et aux soins post-opératoires, un stress lié aux administrations des produits d’analgésie et/ou aux prélèvements sanguins, un stress lié à la contention lors de suivis cliniques et un stress lié aux effets d'une potentielle hypo- ou hyperglycémie.
Devenir
Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal ou euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués par le(s) produit(s) ou le modèle chez les animaux.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments ou dispositifs, ce projet est réalisé chez la souris ou le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le diabète. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament ou dispositif. A ce jour, la souris et le rat sont les espèces qui sont les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques adaptées au modèle. Pour obtenir un nombre suffisant de données scientifiques, le nombre d’utilisation d’animaux est notifié dans le paragraphe portant sur le nombre estimé d'animaux utilisés. Cependant, une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : •La mise au point de procédures rigoureuses, •La formation du personnel, •Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, •Le recours à des procédures les moins invasives possibles, •Le suivi d’éventuel signes cliniques, •La détermination des points limites, •Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire •Un protocole anesthésique adapté pour la chirurgie, •Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, •La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, •La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.
Choix des espèces
La souris et le rat sont des espèces animales pertinentes et les plus couramment utilisées notamment pour évaluer l’efficacité de traitements anti-diabétiques, de par leurs facilités d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement. Les produits testés n'ont pas de visée pédiatrique.
Evaluation d’une nouvelle génération de microbulles pour la délivrance de médicaments dans le cerveau de rat par sonoporation.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
96 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie générale, chaque animal étant tué avant tout réveil. Chacun reçoit cinq injections, dont celles de microbulles de gaz et d'un colorant, avant une exposition du cerveau aux ultrasons de trente secondes, et il est tué une heure plus tard pour mesurer la quantité de colorant passée dans le tissu cérébral et l'étendue des microhémorragies. Le projet compare quatre solutions de bulles de taille unique, l'application aux tumeurs cérébrales et aux maladies neurodégénératives restant une perspective. Le porteur décrit des mesures acoustiques et un modèle cérébral en trois dimensions déjà réalisés, et affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit la complexité du système cérébrovasculaire.
Objectifs
A ce jour, la délivrance de médicament dans le cerveau par ultrasons exploite principalement des solutions de bulles de gaz de taille très hétérogène. Lorsque nous appliquons une séquence ultrasonore donnée sur une telle population de bulles, nous constatons que nous activons seulement une fraction de ces bulles, limitant ainsi l’efficacité de la délivrance intracérébrale de médicaments par ultrasons. De plus, leur utilisation ne nous permet clairement pas de distinguer les deux principaux régimes ultrasonores responsable de la perméabilisation des tissus, à savoir celui qui est considérée comme le plus sûre pour les tissus et le régime, qui endommagerait les tissus. Dans ce contexte, nous proposons d’exploiter des bulles de taille unique. En effet, nos données préliminaires in-vitro ont montré qu’utiliser de telles bulles permet de solliciter l’ensemble de la population de bulles et de mieux contrôler les deux régimes ultrasonores précédemment cités. Ce projet vise à : Objectif 1 - Évaluer 4 solutions de bulles de taille unique à perméabiliser efficicament le tissu cérébral, en mesurant l’accumulation d’un colorant par histologie, et sans induire des dommages tissulaires (microhémorragies tissulaires), qui seront analysés en histologie, 1 heure après traitement. Objectif 2 - Comparer cette efficacité et cette inocuité à celle d’une solution de bulles de taille très hétérogène.
Bénéfices attendus
Les ultrasons ont émergé comme une stratégie prometteuse de délivrance intracérébrale de médicaments. Cependant, l’utilisation de bulles de gaz de différentes tailles ne permet pas de toutes les activer dans un régime ultrasonore pour assurer une délivrance sûre et efficace de médicaments par ultrasons. L’exploitation de bulles de taille unique pourrait ainsi permettre de contourner les limitations des bulles de différentes tailles et de développer ainsi des protocoles de délivrance sûre et efficace de médicaments dans le cerveau par ultrasons pour le traitement de tumeurs cérébrales et de maladies neuropsychiatriques, neurodégénératives et neurologiques.
Procédures
• Injection de la solution anesthésique, de la solution analgésique, du liquide physiologique, de bulles de gaz, de colorant – 5 injections - 2 min • Exposition du cerveau aux ultrasons – 30 s
Impact sur les animaux
Nuisance 1 – Manipulation des animaux est une source de stress. Nuisance 2 – Positionnement des animaux dans le cadre d'expérimentation est une source de stress. Nuisance 3 – Le point d’injection de la solution d’anesthésie est susceptible d'être douloureuse. Nuisance 4 – Le point d’injection du liquide physiologique, de bulles de gaz et du colorant est susceptible d'être douloureuse. Nuisance 5 – Perméabilisation du tissu cérébral est une source de stress. Nuisance 6 – Le point d’injection de la solution d’analgésie est susceptible d'être douloureuse.
Devenir
A l’issu de la procédure, les animaux seront mis à mort 1h post-injection de la solution de colorant afin de quantifier le colorant dans le tissu cérébral et de mesurer la présence de dommages tissulaires.
Remplacement
Dans une première approche expérimentale, nous avons caractérisé et comparé des solutions de bulles de gaz de taille unique et de taille hétérogène sur des bancs de mesures acoustiques. Nous avons ensuite validé leurs propriétés à perméabiliser le tissu cérébral sur un modèle 3D in-vitro. Ces deux approches ont permis de réduire le nombre de paramètres acoustiques et la concentration et la taille de bulles. Dans la continuité de ce projet, nous souhaitons évaluer la perméabilisation du tissu cérébrale par ultrasons en exploitant des bulles de taille unique in-vivo. Par conséquent, le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle d’étude in-vitro ou in-silico car à ce jour, aucun modèle d’étude in-vitro ou in-silico ne peut reproduire la complexité d’un système cérébrovasculaire in-vivo.
Réduction
Sur la base de nos études antérieures, cette étude nécessite 96 rats. Nous réaliserons une étude statistique pour déterminer l’efficacité de la délivrance intracérébrale de colorant et l’innocuité de la procédure. Par rapport au groupe contrôle, il sera considéré comme significatif : 1) Une augmentation de 20% de la quantité de colorant dans le tissu cérébral et 2) Une augmentation de 10% de la quantité de dommages tissulaires (microhémorragies cérébrales).
Raffinement
Le stress des animaux est minimisé par l’implication d’un personnel qualifié pour l’expérimentation animale. Lors de la semaine d’acclimatation, l’habituation à la préhension/contention en renforçant nos actes sera réalisée par l’administration de friandises. Ils seront hébergés en groupe (2/cage) avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant). Les animaux seront observés une fois pour jour. Toutes les stratégies d’analgésie, d’anesthésie et de soins seront mises en œuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par les procédures. Après une semaine d’acclimatation, les rats seront anesthésiés par une injection d’une solution d’anesthésie et placés dans une boîte pendant 5 min. Dès que les rats auront des signes d’endormissement, ils seront sortis de la boîte et placés sur une couverture chauffante dans un cadre d'expérimentation. Une protection occulaire sera appliquée. La respiration (capteur électronique), la température (sonde endorectale) et le poids (balance) seront mesurés pendant les procédures. Sous anesthésie générale, les animaux seront mis à mort par injection d’un agent euthanasiant vétérinaire.
Choix des espèces
Dans la littérature et dans notre laboraoire, les rats âgés de 6 semaines, physiologiquement mâture sont couramment utilisés pour le développement de protocole de délivrance intracérébrale de médicaments par ultrasons en raison de l’existence de modèles rongeurs de cancers cérébraux, de maladies neuropsychiatriques, neurodégénératives et neurologiques.
Rôle des cellules endotheliales cuboidales de veinules post-capillaires (High Endothelial Venule ou HEV) dans la recirculation des lymphocytes T dans un contexte de lymphome B chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Porteuses d'un lymphome qui gonfle leurs ganglions et réduit leur mobilité, 2 191 souris reçoivent une à trois injections, dont une chimiothérapie, et une partie subit une chirurgie puis une à deux heures d'imagerie sans jamais être réveillée. Toutes sont tuées à l'issue, les ganglions étant prélevés pour analyse, et 1 658 d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère. L'objectif reste descriptif, comprendre comment le traitement donné aux patients modifie les vaisseaux du ganglion envahi. Le porteur ramène pourtant les atteintes au stress de la pesée et de la contention, alors qu'il indique par ailleurs que le lymphome provoque douleur, sensibilité des ganglions et perte de mobilité.
Objectifs
Les veinules cuboidales ou HEV sont des vaisseaux sanguins particuliers qui constituent les portes d’entrées majeures des lymphocytes dans la plupart des organes lymphoides secondaires comme les ganglions lymphatiques et sont indispensables pour le bon fonctionnement du système immunitaire. Lorsque les cellules d'un lymphome (cellules cancéreuses) envahissent un ganglion, l’organisation du ganglion est détruite, ces vaisseaux disparaissent et le système immunitaire du patient est donc affecté. Le traitement utilisé chez les patients atteints de lymphome est une chimiothérapie associée à un anticorps thérapeutique. Ce traitement permet de réduire le lymphome et de détruire les cellules cancéreuses. Cependant, certains patients rechutent et l’objet de ce projet est donc d’étudier en utilisant le modèle souris comment le traitement utilisé chez les patients module la vascularisation du ganglion infiltré par le lymphome, et de déterminer si ces changements peuvent être utiles pour améliorer la prise en charge des patients notamment lors des rechutes.
Bénéfices attendus
Comprendre à l'aide d'un modèle chez la souris les effets de la chimiothérapie sur les vaisseaux des ganglions infiltrés par une tumeur de type lymphome afin de mieux choisir les traitements à administrer aux patients qui répondent moins bien ou qui rechutent.
Procédures
Les animaux seront soumis à: 1, 2 ou 3 injections (La durée de chaque injection allant de 10 secondes à quelques minutes mais toujours < 5min chacune). Certains animaux auront trois injections puis seront anesthésiés pour la réalisation d'une procédure de chirurgie dont la durée est de moins d'une heure et d'imagerie par microscopie dont la durée est de 1 à 2h cette chirurgie et imagerie se faisant sans réveil de l'animal.
Impact sur les animaux
Le modèle de souris utilisé développe des cancers au niveau des ganglions appelés lymphome. Ce lymphome peut provoquer de la douleur à l’animal, sensibilité au niveau des ganglions et une perte de mobilité liée notamment au gonflement des ganglions au niveaux de l'aine ou du creux axillaire. Les souris qui subiront des injections subiront du stress lié à la pesée et à la contention nécessaire à l'injection. Les souris qui reçoivent la chimiothérapie ou qui sont anesthésiées pour une chirurgie sans réveil peuvent aussi subir un stress au moment de l'injection.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure car les analyses nécessitent le prélèvement des ganglions.
Remplacement
A l’heure actuelle, les procédures réalisées sur l'animal dans le cadre de ce projet ne peuvent pas être remplacées par des méthodes expérimentales alternatives. En effet, les veinules cuboïdales des ganglions ou HEV sont dépendantes de l'environnement du ganglion lymphatique. De ce fait, toute étude in vitro est actuellement non envisageable. De plus, ces cellules sont associées à une fonction particulière qui permet la recirculation des lymphocytes qui sont des cellules majeures dans la surveillance immunitaire, et cela ne peut également être évalué qu’in vivo. Par conséquent, l’ensemble des études sur ces veinules se font exclusivement chez l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque groupe a été déterminé par nos études antérieures et celles de la littérature. Il est de 15 animaux dans chaque groupe étudié, un nombre d’individus suffisants pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Enfin, le projet est conçu avec une hiérarchie des procédures où la réalisation d’une procédure ultérieure est possible uniquement si les résultats de la précédente procédure le justifient.
Raffinement
La stratégie de raffinement est premièrement fondée sur l’utilisation de points limites précoces, prédictifs et adaptés. Le suivi des animaux est réalisé par les expérimentateurs ou l’équipe de zootechnie quotidiennement (aspect externe, comportement, palpation des ganglions périphériques). Les procédures d'injections ont été optimisées afin de générer le moins de stress et de douleurs aux animaux. Les injections se font sous anesthésie locale et les chirurgies sous anesthésie générale avec administration préalable d’un analgésique. Les conditions d’hébergement et les méthodes expérimentales utilisées sont les plus appropriées pour réduire au maximum toute angoisse ou dommage durable que pourraient subir les animaux.
Choix des espèces
Le choix de l'espèce est lié au fait que les ganglions lymphatiques ne sont véritablement apparus au cours de l'évolution qu'à partir des mammifères. La souris est donc le plus petit mammifère adapté à l'étude des veinules cuboïdales dans le cadre des lymphomes. Seuls des adultes âgés d'un minimum de 6 semaines sont utilisés car le développement de ces ganglions et du système immunitaire mature est tardif.
Role de l’acétylcholine sur l’attention
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
268 rats vont être utilisés et tués, dont 40 opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil pour enregistrer l'activité de leurs neurones. 180 subissent une chirurgie intracérébrale d'une heure, avec un stress au réveil, une perte de poids et des douleurs les premiers jours, et 48 réalisent chaque jour pendant soixante et onze jours un test d'attention d'une heure, sous restriction alimentaire pendant toute cette période. Le projet vise à comprendre comment l'acétylcholine agit sur la concentration dans le cortex frontal, avec l'idée lointaine de mieux traiter les troubles de l'attention. Tous finissent par une chirurgie terminale, leur cerveau étant récupéré pour analyse.
Objectifs
Le principal objectif de ce projet est de mieux comprendre comment une substance dans le cerveau, appelée l’acétylcholine participe à la concentration. Elle agit surtout dans une partie du cerveau appelée le cortex frontal, qui est important pour l’attention. Contrairement à ce que l'on pensait, ses projections vers le cortex frontal ne sont pas diffuses, mais bien organisées en sous-régions. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment ces différentes voies agissent et influencent l’attention, notamment en mesurant l’activité des neurones qui libèrent de l’acétylcholine. Une partie de l’étude se concentre sur l’établissement des conditions nécessaires pour tester l’attention de manière expérimentale chez des rats, avant de pouvoir manipuler ces voies pour étudier leurs effets dans des situations attentionnelles spécifiques.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice de ce projet est qu'il pourrait améliorer la compréhension de la manière dont certaines zones du cerveau, en particulier celles liées à l’attention, fonctionnent et interagissent entre elles. La compréhension de chaque région spécifique du cerveau contribuant à l’attention pourrait ainsi ouvrir la voie à de meilleures stratégies pour traiter des troubles attentionnels ou des problèmes liés à l’attention dans des pathologies psychiatriques.
Procédures
48 animaux vigiles réaliseront 1 test comportemental : d’une durée de 1heure tous les jours pendant maximum 71 jours. 180 animaux anesthésiés auront une chirurgie intracérébrale d'une durée d'1 heure. 40 animaux anesthésiés 1 chirurgie sans réveil pour l’enregistrement des neurones. 268 animaux auront une chirurgie terminale.
Impact sur les animaux
Les tests comportementaux peuvent induire un léger stress transitoire dû à l'isolement de l'animal au cours de la réalisation du test. La chirurgie peut induire un stress au réveil des animaux ainsi qu'une légère perte de poids et des douleurs/un inconfort au cours de premiers jours suivant l'acte chirurgical. Lors du suivi post chirurgical, l’animal peut ressentir un inconfort lors de l’injection d’analgésique en sous cutané. La restriction alimentaire durant 71 jours lors du test peut induire un stress.
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort en fin afin de récupérer les cerveaux pour analyse.
Remplacement
Les approches de modélisations informatiques ou basées sur des cultures cellulaires sont impossibles à mettre en place dans ce projet puisque nous nous intéressons aux modifications de réseaux neuronaux et aux comportements associés.
Réduction
Le nombre d’animaux dans chaque groupe expérimental a été calculé à l'aide d'un test statistique qui tient compte de la variabilité du vivant et permet d'obtenir des résultats robustes. La standardisation des conditions expérimentales et la maitrise des facteurs environnementaux décrits dans le paragraphe raffinement contribuent à limiter la variabilité.
Raffinement
Les expérimentations sont réfléchies de façon à minimiser au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux au cours des différentes procédures de ce projet. Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale (gazeuse, facilement modulable et permettant un réveil rapide et plus confortable) avec surveillance de la température corporelle, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgique. Le traitement antalgique sera poursuivi au lendemain de la chirurgie soit 48heures de couverture antalgique. Des points limites gradés, précis et adaptés ont été définis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites et aboutir à une gestion optimale de ceux-ci. Des critères d'arrêt de souffrances sont définis. Les animaux sont hébergés deux par cage avec eau et nourriture ad libitum. Un enrichissement avec des bâtons de bois est mis dans les cages d'hébergement permettant aux rats d'assouvir leur besoin de ronger. Les animaux sont manipulés au minimum de façon hebdomadaire tout au long du projet permettant une habituation à un binôme d’expérimentateurs, qui reste le même tout au long de l’étude.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée est le rat. La lignée de rat a été choisie en raison des données déjà disponibles pour les tâches attentionnelles. De plus, ces rats viennent de croisements entre différentes familles, ce qui réduit la consanguinité (ils ne sont pas tous très proches génétiquement). Cela permet de maintenir une diversité génétique, offrant ainsi un meilleur reflet de la variabilité observée chez l’Homme. Les animaux utilisés seront des animaux adultes (7 semaines) puisque nous avons besoin d'avoir des circuits et systèmes neuronaux entièrement développés.