Procédures sans réveil

Trois chiens sains de huit à douze mois vont être opérés des muscles de la paupière sous anesthésie générale, pendant une heure et demie à deux heures, et tués sans reprendre conscience. La chirurgie sert à mesurer combien de points d'injection et quel volume par point suffisent à atteindre tout le muscle releveur, avec un tampon, le produit de thérapie génique étant réservé aux étapes suivantes. Ce réglage technique prépare une étude de dose, elle aussi chez le chien, avant une demande d'autorisation d'essai clinique sur la chute des paupières liée à la dystrophie musculaire oculo-pharyngée. Un essai est déjà en cours chez des patients pour les troubles de la déglutition, avec des premiers résultats que le porteur juge très prometteurs, et il conclut malgré tout qu'il est "indispensable" d'utiliser des animaux vivants pour observer la diffusion du liquide dans un muscle irrigué.

Objectifs

Ce projet a pour but de développer des injections dans les muscles des chiens sains, afin de tester l’efficacité d’un traitement de thérapie génique pour soigner le ptosis (chute de la paupière) lié à une maladie rare appelée dystrophie musculaire oculo-pharyngée (DMOP). Cette maladie affecte les adultes et touche en moyenne une personne sur 100 000, mais est plus fréquente chez certaines populations, comme les Canadiens français du Québec ou les Juifs de Boukhara en Israël. La DMOP est causée par une mutation génétique qui produit une protéine défectueuse, ce qui perturbe les muscles. Les premiers symptômes incluent des difficultés à avaler (dysphagie) et une chute progressive des paupières (ptosis) généralement avant 45 ans, suivie par une faiblesse des jambes avant 60 ans. Une équipe de recherche a développé un traitement de thérapie génique qui utilise un virus modifié pour bloquer la protéine défectueuse et introduire une version normale du gène. Un essai clinique est en cours pour tester l’efficacité de ce produit thérapeutique sur les difficultés de déglutition des patients. Les premiers résultats sont très prometteurs. Cette équipe souhaite maintenant tester ce produit thérapeutique pour traiter le ptosis en l’injectant directement dans le muscle qui soulève les paupières. Actuellement, il existe deux interventions chirurgicales pour traiter le ptosis chez les patients atteints de DMOP : une opération qui suspend la paupière au muscle frontal ou une autre qui enlève le muscle releveur des paupières. Cependant, le ptosis revient souvent après ces opérations. Nous pensons que cela se produit parce que les muscles releveurs continuent de s’affaiblir. Le produit thérapeutique pourrait aider à traiter ce muscle et améliorer la situation.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de déterminer combien de points d’injection et quel volume d'injection par point sont nécessaires pour traiter l'ensemble du muscle qui soulève la paupière supérieure chez le chien sain. Les résultats de cette étude serviront à préparer une étude de dose avec un produit thérapeutique chez le chien, afin de collecter des données importantes pour demander une autorisation d’essai clinique pour le traitement du ptosis chez des patients atteints de DMOP

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes à une intervention chirurgicale unique au niveau des muscles de la paupière, sous anesthésie générale, d'une durée d’environ 90 à 120 minutes, sans réveil.

Impact sur les animaux

La procédure sera réalisée sous anesthésie générale (fixe ou volatile) et avec un traitement contre la douleur adaptée, afin de limiter les désagréments pour l’animal pendant toute l’intervention. Un petit stress pourra survenir lors de la pose d’un cathéter pour la prémédication, mais cela ne durera que 2 à 3 minutes. Si l'animal ressent de la douleur, une dose supplémentaire de médicament contre la douleur sera donnée, mais cela ne devrait durer que quelques minutes. Si des problèmes de circulation ou de pression sanguine apparaissent, des médicaments supplémentaires seront administrés si nécessaire. Les animaux devront être à jeun entre 6 et 12 heures avant l'anesthésie pour éviter les risques de vomissements ou de fausses routes pendant l'anesthésie. Si nécessaire, un médicament contre les vomissements pourra être donné le jour de l’intervention. Enfin, étant donné que les animaux seront mis à mort à la fin de l’intervention (ils ne se réveilleront pas), aucun effet secondaire ni gêne post-opératoire n'est attendu. Un stress lié à la pose d’un cathéter veineux pour la prémédication pourra être généré (durée 2-3 minutes). Pour limiter ce stress, cette pose sera effectuée en présence de 2 techniciens formés : un pour la contention de l’animal et un pour la pose du cathéther

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de ce projet. Des prélèvements de divers organes et tissus, y compris les muscles injectés et les tissus adjacents seront analysés en post-mortem.

Remplacement

Le remplacement d'animaux ne sera pas possible pour l’étude de dose du produit thérapeutique dans le muscle releveur de la paupière supérieure, car il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pour tester l’effet d’un traitement de thérapie génique in vivo. L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact d’un transfert de gène dans différents types cellulaires (différents organes), en lien avec le produit testé, le mode d’administration utilisé et la dose. D'autre part, l'espèce chien a été choisie du fait que (i) les dimensions des muscles à traiter sont similaires à ceux des humains, (ii) que le produit thérapeutique est actif moléculairement sur le gène endogène canin, et (iii) qu'il existe une quantité importante de données toxicologiques et anatomiques historiques chez le chien qui contribueront à étayer les résultats de l’étude de dose. Du fait que l’étude de dose à suivre se fasse chez le chien, il est nécessaire de réaliser cette mise au point de l‘injection intramusculaire du muscle releveur de la paupière supérieure dans cette même espèce. Pour cette mise au point, il est indispensable d'utiliser des animaux vivants afin de déterminer avec précision la diffusion du tampon après injection intramusculaire dans un muscle vivant, irrigué par la circulation sanguine.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé dans ce projet a été réduit au maximum sachant que le but est de mettre au point une technique d’injection dans un muscle spécifique, difficile d’accès. Ce nombre est un nombre nécessaire mais suffisant pour déterminer dans un total de façon robuste le nombre maximal de points d’injection par muscle et le volume maximal par point d’injection.

Raffinement

La procédure utilisée est adaptée pour éviter tout inconfort de l'animal, et sera réalisée par du personnel formé et expérimenté. Le bien-être animal passera notamment par : - De bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur. Pour leur bien-être les animaux seront hébergés en groupe de 3 et recevront un enrichissement adapté (jeux divers disponibles dans les box, sociabilisation avec présence humaine, éducation, toilettage). - Un suivi régulier des animaux assuré par un vétérinaire ou un technicien animalier formé et expérimenté (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement). La mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions prévues au cours de cette étude : anesthésie générale associée à une analgésie multimodale pour limiter une éventuelle douleur peropératoire.

Choix des espèces

Cette étude a pour but de recueillir des données en vue de traiter une maladie rare appelée DMOP, qui provoque notamment un affaissement des paupières (ptosis). Le traitement envisagé est une thérapie génique, c’est-à-dire l’introduction d’un gène « médicament » dans les cellules pour corriger le problème à la source. Les muscles qui permettent de relever les paupières sont très petits et difficiles à atteindre chez les petits animaux comme les rongeurs. C’est pourquoi cette étude sera réalisée chez le chien. En effet, chez le chien, ces muscles ont une taille très proche de ceux de l’être humain, ce qui permet de tester les doses et la méthode d’injection dans des conditions réalistes. La procédure qui sera utilisée pourra ensuite être reproduite lors des essais chez l’Homme. Dans la suite de cette recherche, un vecteur viral (un virus modifié, inoffensif, servant à transporter le gène thérapeutique) sera injecté. Le gène utilisé fonctionne chez différentes espèces, ce qui permet de mesurer son effet aussi bien chez le chien que chez l’humain. Le chien est une espèce bien connue des chercheurs, avec de nombreuses données disponibles sur sa santé et son anatomie. Cela permettra de mieux interpréter les résultats de l’étude. Les chiens seront traités alors qu’ils sont jeunes adultes (entre 8 et 12 mois). À cet âge, leurs muscles sont assez développés pour les injections prévues. Cela réduit aussi les risques qu’ils aient déjà été en contact avec le virus utilisé comme vecteur, ce qui pourrait rendre le traitement inefficace (en cas d’animaux dits séropositifs). Pour s’en assurer, chaque chien sera testé avant d’être inclus dans la phase de traitement.

Endormis puis intubés sans jamais être réveillés, 35 cochons de 50 kilos sont ouverts par sternotomie pour que leurs poumons soient prélevés en une heure. Les procédures se déroulent sous anesthésie générale, les animaux étant tués avant tout réveil. Les poumons sont ensuite perfusés hors du corps, pour mettre au point un système automatisé de régulation du pH et du glucose censé prolonger la durée pendant laquelle un greffon reste utilisable. Le porteur écrit qu'aucun effet indésirable n'est attendu puisque l'animal ne se réveille pas, et retient le porc charcutier de 50 kilos parce que ses poumons et ses vaisseaux ont la taille de ceux d'un être humain, ce qui permet d'utiliser la machine de perfusion conçue pour la clinique.

Objectifs

Ce projet vise à améliorer la qualité des poumons destinés à la transplantation. Aujourd’hui, beaucoup de greffons ne peuvent pas être utilisés parce qu’ils sont jugés trop abîmés. Il existe une technique appelée perfusion pulmonaire ex vivo (PPEV), qui consiste à faire circuler un liquide dans les poumons, à l’extérieur du corps, pour les évaluer, les préserver, voire les « réparer » avant la greffe. Notre objectif est de mieux contrôler deux paramètres clés pendant cette perfusion : le pH (reflet du niveau d’acidité) et le niveau de glucose (sucre), essentiels au bon fonctionnement des cellules. Nous voulons développer un système automatisé capable de mesurer et de réguler ces paramètres en temps réel, pour que les poumons soient maintenus dans des conditions proches de celles du corps humain le plus longtemps possible. En effet, plus la durée de la perfusion hors de corps sera longue, plus les poumons auront le temps de se réparer, naturellement ou à l’aide d’intervention humaine (chirurgie, traitement). Ce « temps de réparation bonus » permettra de tester des traitements anti-rejets ou des thérapies rendant les poumons résistants aux infections, afin d’améliorer les résultats de la greffe.

Bénéfices attendus

En contrôlant mieux les niveaux d’acidité et de sucre pendant la perfusion, nous espérons : - Améliorer la qualité des poumons avant transplantation, même s’ils sont initialement jugés « limite » (organes un peu abîmés, dits marginaux) ; - Augmenter le nombre de greffons utilisables, ce qui pourrait sauver plus de vies en réduisant le temps d’attente pour une greffe ; - Réduire les complications après la greffe, en préservant la fonction des poumons et en évitant certains dommages cellulaires ; - Prolonger le temps pendant lequel un greffon peut être conservé, facilitant l’organisation de la transplantation; - Permettre de traiter les greffons avant la greffe, par exemple en réparant certaines lésions ou en apportant des traitements ciblés (avec des cellules ou des gènes) ; - Faciliter et fiabiliser la procédure pour les équipes médicales, grâce à un système automatisé qui limite les erreurs et améliore la reproductibilité. À plus long terme, ce système pourrait aussi être adapté à d’autres organes (comme le foie ou le rein), et contribuer à faire progresser la médecine de la transplantation dans son ensemble.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés profondément à l'aide de 2 injections permettant de les endormir et de supprimer toute douleur ou stress, puis seront intubés et ventilés. Une fois l’animal sous anesthésie générale profonde, nous prélèverons les poumons par voie chirurgicale (sternotomie) selon la méthode de prélèvement pulmonaire de l’Agence de la Biomédecine (60min).

Impact sur les animaux

S'agissant de procédures expérimentales réalisées sous anesthésie générale balancée sans réveil, aucun effet indésirable ni nuisances ne sont attendus pour l'animal qui sera euthanasié en fin de procédure ou en cas d'échec de l'anesthésie.

Devenir

Pour réaliser notre étude, nous avons besoin de récupérer les poumons des animaux. De ce fait, la procédure consiste en une anesthésie générale suivie d'un prélèvement des poumons, ne permettant pas le réveil de l'animal.

Remplacement

Il n’existe pas, à notre connaissance, de modèle expérimental in silico ou in vitro pouvant servir à la mise au point d’un dispositif médical de perfusion d’organe thoracique. Le matériel dont nous nous servons (machine de perfusion, avec sa connectique) est celui utilisé chez l’homme afin d’assurer une bonne applicabilité future, ce qui impose d’utiliser des poumons similaires anatomiquement et physiologiquement à ceux d’un humain.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé sera strictement limité au nombre nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement fiables, en prenant en compte les éventuels ajustements de protocole et pertes de greffons dûes à l'apparition d'oedèmes avant la fin de la durée de perfusion visée.

Raffinement

Avant d’entrer dans le protocole, les animaux auront une semaine minimum d’acclimatation dans l’animalerie et feront l’objet d’un contrôle quotidien par un personnel qualifié (zootechnicien). Lors de ce contrôle, des observations basées sur l’apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales attendues aux stimuli externes (peu enclins aux manipulations, tentative de fuite) seront réalisées. Ces contrôles permettront de repérer tout animal malade ou blessé et de prendre les mesures appropriées. L’environnement sera adapté de façon à réduire l’angoisse des animaux : -Hébergement en groupe pour contact régulier entre congénères -Enrichissement de l’environnement des animaux avec des copeaux (activité de fouissement) -Activités avec plusieurs dispositifs d’enrichissement (medecine ball, planche à gratter ...) -Pesée hebdomadaire réalisée sous forme de jeux, sans contention ni contrainte, avec récompense (portion de fruit).

Choix des espèces

La machine de perfusion que nous utilisons est faite pour des organes humains et impose donc d’utiliser des organes similaires, tant sur le plan des paramètres de perfusion que de la connectique. Le porc charcutier a des poumons proches de ceux d’un humain sur le plan anatomique et physiologique. L’artère et les veines pulmonaires sont du même ordre de taille (ce qui facilite en particulier la cannulation, la pneumoplégie, puis la perfusion isolée). Sa physiologie cardio-pulmonaire est également similaire (fréquence cardiaque 100 battements/mn, débit cardiaque 3-5 L/mn, pression artérielle pulmonaire moyenne < 15mmHg. Le porc permet donc de réaliser une modélisation chirurgicale et expérimentale de haute fidélité pour une meilleure applicabilité des résultats à la pratique clinique. Les animaux de ce protocole sont des porcs de 50kg (environ 90 jours) afin d’avoir un gabarit proche de celui d’un homme. A ce stade, ils ont une physiologie cardio-pulmonaire semblable à l’homme et des poumons du même ordre de grandeur.

60 rats vont être opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil. L'intervention dure environ trente minutes, le temps d'exposer les glandes parathyroïdes du cou, de les éclairer avec différentes longueurs d'onde et de les prélever, avant l'injection létale. L'objectif est de repérer les couleurs de lumière qui distinguent ces glandes de la graisse voisine, pour éviter de les retirer par erreur au cours des thyroïdectomies humaines, complication qui touche 15 à 25 % des patients. Le porteur indique que des études existent sur des glandes déjà prélevées, mais que les bandes lumineuses cherchées ne s'évaluent que sur une glande vascularisée, donc sur un animal dont le cœur bat encore.

Objectifs

L’hypoparathyroïdie est une complication fréquente après l’ablation de la thyroïde, touchant 15 à 25 % des patients, et pouvant causer de graves problèmes rénaux, cardiaques et psychiatriques. Elle résulte principalement d’une ablation accidentelle des glandes parathyroïdes ou de la lésion de leurs vaisseaux, en raison de leur petite taille et de leur ressemblance avec la graisse environnante. Prévenir cette complication repose actuellement sur une meilleure identification de ces glandes lors de l’intervention chirurgicale. Des recherches récentes s’intéressent à l’utilisation de lumières spécifiques, adaptées à chaque chirurgie, pour améliorer la visibilité des parathyroïdes et de leurs vaisseaux. Cette méthode exploite les différences d’interaction de la lumière avec les tissus, dues à leur composition chimique. L’étude des propriétés fluorescentes des parathyroïdes chez le rat, très similaires à celles de l’homme, permet de développer cette technique innovante. Ce projet est mené par une équipe spécialisée en chirurgie thyroïdienne. À ce jour, l’identification directe des parathyroïdes reste la seule méthode efficace pour limiter le risque d’hypoparathyroïdie. L’optimisation de la visualisation peropératoire représente donc une avancée majeure dans la prévention de cette complication.

Bénéfices attendus

Cette étude sur le modèle rat permettra d’identifier des spectres d’intérêt permettant de distinguer les parathyroïdes des tissus avoisinants ainsi que les vaisseaux assurant leur vascularisation. Elle fournira de nouvelles pistes d’exploration en utilisant notamment des systèmes d’imageries différents sur des bandes spectrales identifiées dans l’étude. Les bénéfices attendus du projet sont de mieux comprendre le comportement lumineux de la glande parathyroïde et de ses vaisseaux afin de préserver sa fonction et ainsi diminuer le taux d’hypoparathyroïdie post-opératoire tout en utilisant des systèmes d’imagerie déjà à notre disposition. Cela permettra à moyen terme de réaliser une étude clinique afin d’établir de nouvelles pistes d’identification et de préservation des glandes parathyroïdes lors des thyroïdectomies.

Procédures

Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale d’environ 30min. 2 injections seront réalisées avant l’intervention l’anesthésiant et l’analgésiant. En fin d’intervention les parathyroïdes seront prélevées avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

Il est possible que les contentions et manipulations le jour de l’intervention engendrent un stress. Une douleur per opératoire est susceptible d’être ressentie en cas d’insuffisance analgésique L’injection intra-péritonéale de la « substance lumineuse peut induire un inconfort dû à l’injection.

Devenir

La mise à mort des rats se fait par injection létale IV. L’animal sera toujours sous anesthésie lors de ce geste.

Remplacement

Bien qu’il existe des études ex-vivo afin d’identifier des fluorophores présents dans la glande parathyroïde les bandes d’intérêt ne peuvent être évaluées que sur une glande vascularisée. En effet il existe des différences déjà connues d’émission entre des glandes bien vascularisées et non vascularisées. Ces différences imposent de réaliser l’étude sur des glandes vascularisées d’animaux conservant leur fonction cardiaque.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe est défini comme le nombre minimum nécessaire afin de mettre en évidence une différence significative entre les deux groupes. Compte tenu de la difficulté à évaluer ce nombre, étant donné le caractère novateur de cette étude, nous utiliserons le minimum de rat pour mettre en évidence une différence significative. Une phase de mise au point lumineuse a été faite en amont des expérimentations in vivo. Une étape préliminaire , sur animaux mis à mort au préalable, a été réalisé avant le début du projet afin de surmonter les difficultés techniques possibles (microchirurgie, conditions nécessaires à l’interprétation des images obtenus).

Raffinement

Lors de l’hébergement d’au moins une semaine dans le respect des conditions réglementaires, des manipulations quotidiennes de création de contact permettront d’habituer les animaux et de diminuer le stress lors de la procédure. La procédure sera réalisée intégralement sous anesthésie générale. L’intervention sera réalisée sur des tapis chauffants et prise en charge de la douleur adaptée par analgésique. Il sera également réalisé un contrôle visuel constant de vitalité et d’absence de réveil ou de souffrance pendant l’intervention. Des gouttes d’anesthésiques locales seront instillées avant la réalisation des prélèvements des glandes parathyroïdes afin d’éviter toute douleur. En cas de signes de souffrance pendant l’intervention une mise à mort (dans les mêmes conditions qu’en fin de procédure) sera immédiatement réalisée. Les injections de la substance lumineuse et du produit euthanasiant seront injectés directement en intraveineuse sur le site de la chirurgie ce qui est plus rapide et moins douloureux qu’une injection intrapéritonéale.

Choix des espèces

Pour notre étude, nous avons choisi d'utiliser le rat Wistar. C'est l'animal le plus couramment utilisé pour les recherches sur la chirurgie thyroïdienne, car il offre une base de connaissance déjà bien établie. Grâce à des méthodes d’exposition bien connues, on peut accéder facilement aux glandes parathyroïdes sans complications techniques supplémentaires. De plus, l'absence de graisse dans la région du cou des rats Wistar facilite l'observation directe de ces glandes et la capture d’image. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte soit à partir de 6 semaines. Ce stade de développement permet de réaliser les expérimentations sur des animaux avec des thyroïdes suffisamment volumineuse.

Anesthésiées à dose létale puis perfusées avec un fixateur pendant une dizaine de minutes, 120 souris mâles sont tuées sans reprendre conscience. Quatre y passent chaque jour pendant quinze jours, sur deux lignées mutantes, pour que leurs testicules soient prélevés à des stades précis de la production de spermatozoïdes. Le travail compare l'expression des gènes entre ces mutants et des souris normales déjà utilisées dans un autre projet, avec en perspective l'infertilité masculine et une contraception masculine non chirurgicale. Le porteur affirme que seule une approche impliquant des animaux permet de répondre à ces questions et que le remplacement par des lignées cellulaires est impossible.

Objectifs

La spermatogenèse est le processus par lequel les spermatozoïdes sont produits à partir des spermatogonies (cellules souches des spermatozoides), des cellules souches situées dans les testicules. Ce processus se déroule dans de petits tubes appelés tubes séminifères, à l’intérieur des testicules. Chez la souris, un cycle complet de spermatogenèse dure 35 jours et comprend 12 étapes successives. Dans un testicule normal de souris sauvage, ces étapes se répètent de manière aléatoire tous les 8 jours environ, ce qui permet aux 12 étapes d’être présentes simultanément dans le testicule. Dans le cadre de ce projet, nous travaillons sur des souris mutantes où la spermatogenèse est naturellement synchronisée. Cela signifie que, contrairement aux souris sauvages, seules 1 à 3 étapes du cycle sont présentes simultanément dans les testicules, sans avoir recours à des interventions chimiques. Nous utilisons deux lignées mutantes provenant d’un fond génétique mixte. La première lignée présente des cellules de Sertoli qui ont perdu leur récepteur de l’acide rétinoïque alpha (RARA). La seconde lignée a été modifiée par mutagenèse pour altérer un site de fixation sur RARA, empêchant ainsi son interaction avec les protéines qui permettent d'empecher la répression des gènes. Les testicules de ces mutants seront utilisés pour analyser l'expression des gènes à chaque étape du cycle de la spermatogenèse, en lien avec les mécanismes régulés par l’acide rétinoïque.

Bénéfices attendus

Dans la mesure où la spermatogenèse suit des mécanismes conservés entre la souris et l’Homme, les découvertes réalisées dans ce projet sont pertinentes pour la compréhension de la fertilité humaine. En comparant les profils d’expression génique des souris mutants avec ceux des souris de type sauvage dont nous disposons déjà dans un autre projet réalisé ultérieurement, nous pourrons identifier les gènes essentiels à la différenciation des cellules germinales. Ces résultats fourniront des pistes pour mieux comprendre certaines causes d’infertilité masculine, en augmentation constante dans le monde. De plus, l’étude des mécanismes régissant la signalisation de l’acide rétinoïque pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies de contraception masculine non chirurgicale. Mais aussi, l’acide rétinoïque, régulateur clé de la différenciation cellulaire et de l’expression génique, joue un rôle essentiel dans la spermatogenèse, la folliculogenèse et le maintien de la fertilité. Comprendre sa voie de signalisation pourrait offrir de nouvelles perspectives face à la baisse de la fertilité et de la fécondité observées aujourd’hui.

Procédures

Trente minutes avant l'anesthésie, une injection d’analgésique est administrée (en quelques secondes) pour prendre en charge la douleur. Ensuite, une anesthésie et analgésie à dose létale sont réalisées (en quelques secondes) en vue de la perfusion d'un fixateur histologique lors de l'étape finale de la mise à mort. Cette procédure est effectuée sur des souris âgées de 10 à 12 semaines. Les souris sont placées sous anesthésie générale profonde en moins de cinq minutes. La perfusion, qui dure environ dix minutes, conduit à la mort de l'animal.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés dans cette étude ne présentent aucun phénotype dommageable lié à leur génotype, et leur développement est normal. La procédure est réalisée sous anesthésie générale profonde et analgésie afin de garantir l'absence de douleur ou de souffrance. L'anesthésie peut induire un stress et une hypothermie. Les contentions et injections, peuvent entraîner une gêne passagère chez l’animal, cependant des mesures d’analgésie et d’anesthésie sont systématiquement mises en place pour assurer le confort et l’absence de douleur ou de conscience pendant la procédure.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour prélèvement d'organes.

Remplacement

La spermatogenèse est un processus complexe qui fait intervenir plusieurs types cellulaires du testicule. Les interactions entre les cellules qui soutiennent la fonction des testicules et celles qui produisent les spermatozoïdes sont essentielles pour garantir une production continue de spermatozoïdes. Notre étude vise à examiner le profil d’expression des gènes impliqués dans la spermatogenèse dans un contexte physiologique où ces interactions cellulaires sont dérégulées chez des mutants. Il est important de souligner que seule une approche expérimentale impliquant des animaux permet de répondre à ces questions. Le remplacement par des lignées cellulaires (1er R de la règle des 3R) est impossible.

Réduction

Dans ce projet, nous utilisons uniquement des souris mâles, car nous étudions la production de spermatozoïdes, appelée spermatogenèse. Ce processus dure 35 jours et se divise en 12 étapes successives. Chez les souris normales, ces étapes coexistent en même temps dans les testicules. Mais chez les souris mutants, seuls 3 à 4 stades sont présents simultanément. Pour analyser toutes les étapes, nous réalisons des prélèvements quotidiens pendant 15 jours, entre les jours 70 et 84 après la naissance. Chaque jour, 4 souris sont utilisées pour garantir la fiabilité des résultats, en prenant en compte les pertes naturelles possibles (comme l'abandon maternel ou le cannibalisme). En tout, nous utilisons 60 souris par lignée, pour un total de 120 souris, le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique. Cependant, dès que nous obtenons 3 souris montrant les stades nécessaires, le projet est arrêté pour éviter l’utilisation excessive d’animaux.

Raffinement

Toutes les mesures requises sont mises en place pour assurer le bien-être des animaux. Les mâles sont gardés en groupe de mâles familiers et stables. Un nid de coton ou un nid végétal est ajouté dans chaque cage pour diminuer le stress de l’animal et faciliter la thermorégulation de l’animal, comme cela est fait dans toutes les cages. Nous surveillons régulièrement le bien-être et l’état de santé des animaux et nous apportons des soins appropriés en cas de besoin, notamment l'administration d'analgésiques qui se fera en cas d’observation de signes de douleur. Toute modification de leur comportement indiquant une souffrance ou de l'anxiété est immédiatement signalée aux responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) afin de prendre les mesures correctives nécessaires. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie et la douleur est prise en charge par l'administration d'analgésiques. De plus, des points limites adaptés sont définis pour chaque animal, de manière à assurer qu’aucune souffrance prolongée ne soit tolérée et que des interventions soient effectuées avant que ces seuils ne soient atteints. Ces points limites servent de guide pour l’arrêt de l’expérience ou la prise en charge d’une situation d’urgence.

Choix des espèces

Notre étude cherche à comprendre comment certains gènes fonctionnent mal dans un modèle de souris mutante pendant la production des spermatozoïdes. Nous nous intéressons particulièrement aux interactions entre les différentes cellules des testicules et à l’impact de certaines molécules sur ce processus dans tout l’organisme. Les souris sont choisies pour cette étude car elles partagent 99 % de leur ADN avec l’Homme, et les mécanismes cellulaires dans les testicules de souris sont similaires à ceux des humains. Nous prélevons les testicules des souris mâles entre 70 et 84 jours après leur naissance. Cela permet d’observer les étapes de la production des spermatozoïdes de manière précise, car prélever plus tôt ne permettrait pas de voir un développement testiculaire suffisant, et attendre plus longtemps pourrait entraîner un blocage de la production. Un cycle complet de production des spermatozoïdes dure environ 35 jours et se divise en 12 étapes. Pendant les 15 jours de notre étude, deux nouvelles vagues de production de spermatozoïdes commencent, mais cela ne correspond pas à deux cycles complets. Chez les souris mutantes, plutôt que d’avoir les 12 étapes présentes en même temps comme chez les souris normales, seules 3 à 4 étapes apparaissent à la fois. En prélevant les souris mutantes chaque jour pendant ces 15 jours, nous pouvons couvrir toutes les étapes du cycle de la production de spermatozoïdes.

Tués à l'issue de l'opération pour leur éviter les complications d'un geste chirurgical "encore mal connu", quatre cochons de 30 à 40 kilos vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chacun reste anesthésié jusqu'à quatre heures, le temps de tenter une connexion entre un vaisseau lymphatique et une veine de l'abdomen, avec un risque d'hémorragie et d'hypothermie. L'étude est présentée comme préliminaire, avec deux animaux par groupe, les cochons du groupe radiologie interventionnelle basculant vers le groupe chirurgie en cas d'échec. Le porteur affirme que pratiquer ce geste sur un "organisme vivant entier" est "indispensable" avant de le faire sur un patient, l'enjeu immédiat étant l'apprentissage d'une technique chirurgicale encore peu diffusée.

Objectifs

Ce projet vise à améliorer les traitements des patients souffrant d'un mauvais drainage du système lymphatique causant des épanchements généralisés. Normalement, le chyle, un liquide riche en graisses issu de la digestion, est acheminé vers la circulation sanguine par le conduit thoracique. Lorsque ce drainage ne fonctionne pas correctement, le chyle s’accumule dans différentes parties du corps (poitrine, abdomen, cœur), entraînant des complications difficiles à traiter. Une solution prometteuse serait de créer des connexions entre les vaisseaux lymphatiques et les veines (anastomoses lymphatico-veineuses, LVA) pour contourner le blocage du conduit thoracique. Cependant, cette technique est encore peu pratiquée, surtout en dehors de la région cervicale. Ce projet a donc pour objectif de tester la faisabilité de ces anastomoses au niveau abdominal sur un modèle porcin.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de développer une technique d’anastomose lymphatico-veineuse (LVA) au niveau des voies lymphatiques abdominales, en explorant à la fois l’approche chirurgicale et la radiologie interventionnelle. À terme, cette procédure pourrait être appliquée chez l’être humain afin d’offrir une solution curative durable aux patients souffrant d'un défaut de drainage lymphatique du conduit thoracique.

Procédures

Chaque animal sera anesthésié pendant une demie-journée (4 heures) au maximum, pour la réalisation des procédures chirurgicales.

Impact sur les animaux

En dehors des contraintes liées à la préparation de l'animal (stress au moment de la prémédication), cette procédure sans réveil exposera les animaux aux risques liés à toute intervention chirurgicale, à savoir un risque d'hypothermie liée à la durée de l'anesthésie, ainsi qu'à des risques d'hémorragie et de douleur liés aux gestes chirurgicaux réalisés. La gestion de ces risques seront rigoureusement surveillés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour leur éviter des complications liées à un geste chirurgical encore mal connu.

Remplacement

Cette projet par simulation "in vivo" a pour objectif d'étudier la faisabilité d'un geste chirugical permettant, par la suite, de proposer une solution curative définitive à des patients. La réalisation pratique de ce geste sur un organisme vivant entier est indispensable avant de pratiquer soi-même un geste sur un patient, dans des conditions les plus réalistes possibles. Il n’existe pas, à notre connaissance, d’alternative au modèle animal pour évaluer le système lymphatique.

Réduction

S'agissant d'une étude préliminaire, dont le résultat sera la vérification de la perméabilité et de l’étanchéité de l’anastomose par visualisation directe, seulement deux animaux par groupe seront utilisés. En cas d’échec dans le groupe « radiologie interventionnelle », les cochons seront basculés dans le groupe "chirurgie".

Raffinement

Pendant la période d'acclimatation, les procédures habituelles seront appliquées : contacts et observations quotidiennes par les soigneurs, hébergement en groupe de 2 individus minimum, environnement adapté et enrichi. L’animal sera placé sous anesthésie générale durant toute la durée de l’intervention jusqu’à sa mise à mort, avec l’utilisation de médicaments analgésiques et anesthésiques adaptés. Lors des quelques gestes invasifs et possiblement douloureux, un morphinique sera utilisé.

Choix des espèces

Le système lymphatique des porcs, et notamment au niveau abdominal, est semblable à celui de l’homme. La réalisation de ce type de procédure microchirurgicale serait impossible chez des rongeurs, beaucoup trop petits. Les animaux seront choisis à l'âge de 3-4 mois environ (poids entre 30 et 40 kg), pour des raisons techniques. La taille permettra d'accéder plus facilement aux structures anatomiques suffisamment grosses.