Procédures sans réveil
Suivi de la progression tumorale et de la formation des métastases par imagerie intravitale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
537 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à cinq séances d'imagerie sous anesthésie de deux heures, après une greffe de cellules tumorales et parfois une chirurgie de trente minutes. 54 sont opérées et tuées avant tout réveil, 246 relèvent d'un niveau de souffrance léger et 237 d'un niveau modéré, et toutes sont tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur décrit une progression tumorale accompagnée de prostration, d'amaigrissement, d'anémie et de difficultés respiratoires, et signale que la pose d'une fenêtre optique peut provoquer une infection locale. Les animaux porteurs de cette fenêtre sont isolés pour la préserver, sans que le nombre d'individus concernés par chacune des procédures décrites soit précisé.
Objectifs
Le projet a pour objectifs de mettre au point des méthodes d'imagerie permettant de caractériser différentes étapes de la progression tumorale et de la formation de métastases. Les interactions entre les cellules cancéreuses et les cellules normales présentes au sein des organes métastatiques demeurent mal connus et ce projet permettre de mieux les décrire en les observant en temps réel par microscopie dans l'animal anésthésié. Cette approche est extrèmement puissante car elle permet de visualiser in situ des étapes critiques du cancer.
Bénéfices attendus
L'objectif principal de ce projet est d'acroitre les connaissances fondamentales sur la formation des métastases. À terme, ceci permettra d'améliorer le diagnostique et les thérapies anti-tumorales. On comprend encore mal comment les cellules tumorales interagissent avec les cellules non-tumorales, en particulier les cellules immunitaires. Pourtant ces données sont essentielles à la compréhension de leur rôle pro-métastatique, à la mise en place d’études fonctionnelles cohérentes et au développement de nouvelles approches thérapeutiques. Notre projet devrait permettre de d’obtenir ces données qualitatives et quantitatives fondamentales et de les corréler à la progression métastatique. .
Procédures
Certains animaux subiront un prélèvement à l'oreille pour génotypage (sur animal vigil, durée 10 secondes). Les animaux subiront une injection de cellules tumorales (sur animal vigil ou sous anesthésie, durée 30 secondes à 3 minutes). Ensuite certains subiront une chirurgie sous anésthésie (30 minutes). Tous les animaux suivront une à 5 séances d'imagerie sous anésthésie (jusqu'à 2 heures par séance). Certains animaux subiront 2 prélèvements sanguins (sur animal vigil ou sous anesthésie, durée 30 secondes), ainsi qu' un traitement chimio thérapeutique (5 injections, durée 30 secondes).
Impact sur les animaux
La progression tumorale et métastatique peut s’accompagner d’inflammation, de prostration, d'amaigrissement, perte de poids, pelage dégradé, anémie et de difficultés respiratoires.Une partie des animaux seront soumis, sous anesthésie, à des injections de cellules tumorales (intraveineuse ou sous-cutané) pouvant entrainer une inflammation au point d'injection. La pause d’une fenêtre optique peut également conduire à une inflammation voir à une infection localisée. Tous ces aspects sont considérés dans l’établissement des points limites. Les anésthésies répétées peuvent entrainer un stress sur l'animal. Dans cette procédure, les animaux doivent être isolés pour garantir l'intégrité des fenêtres d'imagerie ce qui peut entrainer un stress supplémentaire. Le prélèvement à l'oreille pour génotypage entraine une douleur légère et passagère.
Devenir
Mise à mort de l'animal afin de réaliser des prélèvements d'organes pour analyses.
Remplacement
Notre projet a jusqu'ici principalement eu recours à des approches in vitro (cultures cellulaires en 2D et 3D) et in vivo chez le poisson zèbre (embryon de moins de 5 jours post-fécondation). Ces approches présentent des limitations, notamment de ne pas prendre en compte toutes les composants cellulaires formant l’eco-système tumoral. Nous souhaitons maintenant valider ces résultats in vivo, dans un environnement complexe impossible à reproduire en intégralité, étape indispensable pour prouver la véracité des mécanismes observés. Nos solides travaux passés nous permettent néanmoins de concentrer nos efforts sur un petit nombre d'expérience pivot. Par ailleurs, nous allons tirer profit d'une approche ex vivo qui consiste à maintenir des tranches de poumons en culture in vitro pendant deux semaines afin de suivre l'invasion métastatique. Cette méthode de suivi longitudinal fournit de nombreuses informations et permet donc de remplacer un certain nombre d'expériences
Réduction
L'imagerie sous-cutanée et après la pause d'une fenêtre abdominale sont compatibles avec un suivi longitudinal des animaux ce qui nous permet d'en réduire le nombre au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes.
Raffinement
Toutes les chirurgies seront réalisées sur animal anesthésié et sous analgésie avec adjonction de gel oculaire pour prévenir des dommages ophtalmiques aux animaux. Une partie des injections sera réalisé sous anesthésie et toutes les séances d’imagerie sous anesthésie. A chaque fois les animaux sont manipulés sur tapis chauffant et mis sous lampe chauffant pour les réveils de chirurgie. Des points limites ont été établis pour éviter toute souffrance animale. En cas de douleur, les symptômes seront traités par analgésie. Les souris seront hébergées en groupe de maximum 5 par cage avec accès ad libitum à l’eau et la nourriture. Les cages seront enrichies avec des dômes de carton et l'ajout de bâtonnets en ouate. L'enrichissement est particulièrement important pour limiter le stress dans les rares cas où les animaux doivent être isolés. Les animaux seront hébergés au minimum 2 semaines avant le début de l’expérimentation pour permettre leur l’adaptation à l’animalerie. Les animaux sont surveillés fréquemment, voir quotidiennement pour les animaux immunodéprimés.
Choix des espèces
La souris présente l’avantage d’avoir des organes métastatiques (ganglions lympathiques, poumons, foie) identiques à ceux impliqués dans la pathologie humaine. La matrice extracellulaire qui nous intéresse particulièrement est également très proche. Au cours des dernières années, nous avons mis au point des outils et protocoles nous permettant de suivre par bioluminescence la progression in vivo de manière longitudinale et non invasive et par imagerie ex vivo l'invasion métastatique sur coupes de poumons. Les animaux qui seront utilisés sont des adultes pour mimer les pathologies cancéreuses rencontrées dans l’espèce humaine.
Procédures terminales dans le cadre d’études caractérisant les mécanismes physiopathologiques impliqués dans les maladies métaboliques et cardio-vasculaires.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
10 325 souris vont être utilisées, chacune pour un prélèvement de sang de dix à trente secondes ou une chirurgie de quinze minutes sans réveil. 1 460 sont opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, les 8 865 autres relèvent d'un niveau de souffrance léger, et toutes finissent tuées pour prélèvement d'organes. Ce projet ne produit aucune donnée propre, il déclare des mises à mort transférées depuis un autre établissement, celui-ci disposant des équipements d'analyse des tissus. Les bénéfices annoncés, de nouvelles perspectives de diagnostic et de traitement du diabète, de l'obésité et des troubles cardio-vasculaires, appartiennent aux projets d'origine.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de décrire les procédures génériques terminales ayant lieu dans cet Etablissement Utilisateur (EU), afin de transférer la mise à mort des projets déjà déclarés dans l’EU d'origine dans le présent EU. Ce dernier bénéficie de divers équipements indispensables à l’analyse des tissus prélevés et la sécurité des utilisateurs face aux risques chimiques. Les analyses de sang, tissus et cellules issus des prélèvements terminaux répondent aux problématiques décrites dans les différentes saisines. Ces problématiques visent, de façon imbriquée ou non, à étudier le rôle du système lymphatique, vasculaire, hépatique et du tissu adipeux dans les pathologies métaboliques.
Bénéfices attendus
Les procédures terminales définies dans ce projet vont permettre, à l’échelle des tissus adipeux, lymphatique, vasculaire et hépatique, la caractérisation des mécanismes physiopathologiques à l’origine de maladies métaboliques et cardiovasculaires telles que diabète, obésité, hépatopathies métaboliques, troubles cardio-vasculaires… Ces pathologies ont une prévalence élevée dans la population mondiale et ces travaux permettront d’ouvrir de nouvelles perspectives médicales en terme de diagnostic et traitement.
Procédures
Un prélèvement de sang unique peut être réalisé avant la mise à mort des animaux (10 à 30 secondes), sur animal vigile ou anesthésié. Ils peuvent également subir une chirurgie sans réveil d’une durée de 15 minutes.
Impact sur les animaux
Les prélèvements sanguins sur animaux vigiles peuvent provoquer un léger stress et de l’inconfort.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélévements d'organes/tissus à la fin du projet.
Remplacement
La stratégie de remplacement est décrite dans chaque saisine rattachée à ce projet générique. Certains projets utilisent des analyses bioinformatiques pour remplacer l’utilisation des animaux. Des études in vitro sur lignées cellulaires sont également réalisées pour comprendre les mécanismes cellulaires impliqués et limiter l’utilisation des animaux. Cependant, ces approches ne suffisent pas à reproduire la complexité des interactions tissulaires, cellulaires et moléculaires des contextes physiologiques ou physiopathologiques étudiés, nécessitant l’utilisation d’animaux comme modèle intégré. Malgré les efforts pour promouvoir la substitution, la souris demeure un modèle essentiel en raison de sa physiologie proche de celle de l'Homme et de sa similitude génétique, permettant la reproduction moléculaire et phénotypique de nombreuses pathologies humaines.
Réduction
Les méthodes de réduction propres à ces projets sont décrites dans ceux-ci. De manière générale, des tests biostatistiques sont réalisés en amont pour limiter le nombre d’animaux en déterminant le nombre minimal d’animaux nécessaires à l’obtention de résultats robustes. Pour ce faire ainsi que pour l’analyse des résultats, des tests statistiques sont utilisés. L’utilisation d’un même animal comme étant son propre contrôle est également un facteur de réduction fréquemment utilisé dans ces projets. Lors des mises à mort des animaux, les tissus n’étant pas d’intérêt peuvent aussi être récoltés pour les banques de données ou utilisation ultérieure.
Raffinement
Les animaux, gardés dans leur cage d’origine, sont transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Une période d’acclimation propre à chaque projet est définie en accord avec la SBEA (Structure du Bien-Etre Animal). Les animaux en attente/acclimatation sont dans une pièce attenante à la pièce d’expérimentation, contrôlée en lumière et température. Pour les prélèvements sanguins, les animaux peuvent être anesthésiés afin de réduire leur stress, et reçoivent un anesthésique local en cas de besoin. Pour les prélèvements sur animal vigile, les animaux sont laissés au maximum libres de leurs mouvements afin de minimiser le stress. La chirurgie est réalisée sur tapis chauffant, sous protocole anesthésique et analgésique optimisé afin d’éviter toute sensation de douleur jusqu’à la mise à mort de l’animal. Les personnels sont parfaitement formés aux techniques de prélèvement (tissu et sang) et de perfusion qui, procédurées avec du matériel de chirurgie entretenu et désinfecté, permettent de limiter le stress et la douleur des animaux au maximum. Bien que toutes les procédures soient terminales, toutes les précautions sont prises pour que l’animal ait une bonne couverture analgésique afin de ne subir aucune douleur au cours des procédures.
Choix des espèces
Avec une homologie génique dépassant 90% entre l'Homme et la souris, la plupart des gènes humains ont leurs homologues chez la souris, et les voies métaboliques sont largement conservées entre ces deux espèces. La souris représente ainsi un modèle expérimental particulièrement intéressant en tant qu'animal génétiquement modifié. De nombreux modèles murins, qu'ils soient porteurs ou non de mutations sur des gènes qui nous intéressent, offrent la possibilité d'étudier la physiopathologie de diverses maladies. Dans la littérature et/ou les études publiées par les différentes équipes, les mécanismes métaboliques sont pour beaucoup décrits avec les souris (sauvages et transgéniques). Ce modèle intégré permet de rendre compte de la complexité des voies impliquées dans la physiologie et la physiopathologie, avec une transposabilité à l'Homme. En conséquence, la souris demeure une espèce de choix pour les équipes de recherche. Les animaux sont utilisés pour les procédures terminales dès l’âge de 7 semaines, jusqu’à 24 mois (études de vieillissement).
Développement de traceurs moléculaires et validation in vivo d’un neuroprotecteur pour l’amélioration du diagnostic et du traitement de l’accident vasculaire cérébral ischémique par Imagerie TEP.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
415 rats vont être utilisés et tous tués, 90 d'entre eux opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, les 325 autres dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cent quatre-vingts subissent une chirurgie de deux heures au maximum pour obstruer l'artère cérébrale moyenne et provoquer un AVC, 325 passent six séances d'imagerie sous anesthésie étalées sur 21 jours, et 90 sont saignés vingt fois en deux heures. Le porteur indique que la chirurgie provoque des douleurs postopératoires, une perte de poids et des déficits neurologiques visibles, les rats se déplaçant en cercles ou tournant sur eux-mêmes. Il présente le projet comme répondant à un "besoin médical", alors que les traceurs testés servent d'abord à mieux voir les lésions, pas à les soigner.
Objectifs
L'accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une perte soudaine d’une ou plusieurs fonctions cérébrales due à l’obstruction par un caillot de sang de vaisseaux sanguins du cerveau. C'est la troisième cause de mortalité dans le monde. En France, environ 125 000 nouveaux cas d'AVC ischémique se produisent chaque année, dont 50% sont mortels. Les facteurs de risque principaux sont l'hypertension artérielle, le tabagisme, l'hypercholestérolémie, le diabète et le vieillissement. Bien que l'intervention rapide puisse sauver la moitié des patients, les lésions cérébrales causées par l'AVC peuvent laisser des séquelles graves. En effet, les AVC sont la principale cause de handicap acquis chez les adultes dans les pays industrialisés. Le traitement de l'AVC ischémique consiste à éliminer les caillots sanguins à l’aide d’un médicament. Cependant, même après la réouverture du vaisseau principal obstrué, la microcirculation en aval reste souvent bloquée, empêchant l‘irrigation (perfusion) du tissu cérébral affecté. Cette reperfusion incomplète est largement responsable des séquelles post-AVC ischémiques. Le projet se concentre sur deux objectifs principaux. Premièrement, il vise à tester des traceurs permettant une imagerie plus précise de l'AVC ischémique, en offrant notamment une meilleure visualisation des zones de perfusion et d'ischémie. Ces traceurs seront radiomarqués pour être utilisés en tomographie par émission de positons. A terme, ils devraient faciliter et accélérer le diagnostic de l’AVC ischémique. Deuxièmement, le projet vise à tester l'efficacité de candidats médicaments neuroprotecteurs dans des modèles animaux d'AVC ischémique. Ce projet pourrait améliorer le diagnostic et le traitement de l'AVC ischémique, offrant de nouvelles perspectives pour les patients et répondant à un besoin médical.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à améliorer la compréhension et le traitement de l'AVC ischémique. Voici les principaux bénéfices attendus : Bénéfices à Court Terme : En utilisant l'imagerie, nous développerons des signatures moléculaires spécifiques aux lésions cérébrales causées par l'AVC. Cela permettra de mieux comprendre les processus biologiques dans le contexte de l’AVC ischémique. Bénéfices à Moyen Terme : En outre, le projet aidera à créer des méthodes pour diagnostiquer l'AVC ischémique plus tôt. Une détection rapide permettra une intervention plus efficace, réduisant les complications et améliorant les résultats pour les patients. Les nouveaux traceurs offriront une visualisation plus précise des zones touchées, facilitant ainsi un traitement rapide et ciblé. Bénéfices à Long Terme : Les résultats du projet permettront d’identifier des candidats médicaments neuroprotecteurs. A terme, si certains obtiennent une autorisation de mise sur le marché, ils pourront aider les patients dès les premiers stades de l'AVC. Ces médicaments viseront à protéger les neurones et à améliorer la récupération neurologique. En comprenant mieux pourquoi la reperfusion est parfois incomplète, nous pourrons développer des stratégies pour améliorer la perfusion sanguine et réduire les dommages secondaires. Cela aura un impact direct sur la qualité de vie des patients. Les nouvelles informations obtenues dans cette étude pourraient conduire à de nouvelles stratégies de traitement et à des innovations médicales. En résumé, ce projet développera des outils de diagnostic avancés et améliorera les soins pour les patients atteints d’AVC ischémique. Il ouvrira également de nouvelles perspectives pour la recherche et les traitements innovants.
Procédures
Les interventions prévues sur une partie des animaux sont les suivantes : • Réalisation sous anesthésie gazeuse d’une chirurgie entrainant une ischémie cérébrale (durée 120 minutes au maximum, 180 animaux) • Réalisation de sessions d’imagerie sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum, 6 par animal espacé sur 21 jours, 325 animaux) • Injection d’un radiotraceur, sous anesthésie générale (durée 1 min) • Prélèvement sanguin sous anesthésie générale (durée : 10 secondes, répété 20 fois et espacé sur un maximum de 120 minutes, 90 animaux).
Impact sur les animaux
Lors de l'utilisation du modèle d'occlusion de l'artère cérébrale moyenne (MCAO) chez les rats pour induire une ischémie cérébrale, plusieurs effets indésirables peuvent survenir. La procédure implique une chirurgie invasive qui peut provoquer des douleurs postopératoires,. Les rats peuvent également présenter une perte de poids significative due au stress induit par la chirurgie et à la diminution de l'appétit qui en découle. Enfin, les rats peuvent avoir des comportements anormaux tels que le déplacement en cercles, des rotations compulsives et une réponse asymétrique aux stimuli tactiles, indiquant des déficits neurologiques.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin d’extraire les organes et réaliser des manipulations ex vivo permettant de corréler les mécanismes biologiques, la distribution des biomarqueurs d’intérêt avec les données en imagerie.
Remplacement
L'objectif de ce projet est d'identifier et de valider de nouveaux traceurs moléculaires pour l'imagerie de l'accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique et d'évaluer des candidats médicaments neuroprotecteurs. Actuellement, les modèles in vitro et in silico, ne suffisent pas pour modéliser la complexité des interactions biologiques et des processus physiopathologiques dans un organisme entier. Les études in vivo sont essentielles pour comprendre pleinement les mécanismes des AVC ischémiques et les réponses aux traitements potentiels. Les modèles animaux, en particulier les modèles de rats utilisant l'occlusion de l'artère cérébrale moyenne (MCAO), permettent d'observer les effets des interventions dans un organisme entier. Cela inclut la distribution, le métabolisme, et l'élimination des composés. Les interactions entre les différents types de cellules cérébrales, les effets de la reperfusion, et les réponses inflammatoires et immunitaires doivent être étudiées dans un contexte physiologique complet, ce qui est impossible à reproduire complètement avec des modèles non animaux. Bien que des progrès significatifs aient été réalisés dans le développement de modèles non animaux, l'étude des AVC ischémiques et la validation de nouveaux traceurs moléculaires et candidats médicaments nécessitent encore l'utilisation de modèles animaux pour obtenir des données complètes et fiables. Ces modèles permettent de reproduire les conditions pathologiques et les réponses physiologiques de manière holistique, indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet et assurer la transposabilité des résultats aux traitements cliniques.
Réduction
Pour ce projet, nous avons déterminé le nombre d'animaux à utiliser par une approche intégrée visant à utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables et reproductibles. Voici les techniques que nous mettons en œuvre pour réduire le nombre d'animaux nécessaires : - Imagerie longitudinale non invasive : nous utiliserons la tomographie par émission de positons (TEP) pour étudier les différences cardiovasculaires au sein de nos groupes. Cette méthode non invasive permet de réaliser plusieurs examens d'imagerie sur le même animal au fil du temps. En suivant les mêmes animaux à différentes étapes de l'étude, nous réduisons considérablement le nombre total d'animaux nécessaires. - Analyse statistique : l'analyse choisie permet de maximiser la précision des comparaisons entre groupes tout en tenant compte des variations individuelles. - Nous avons également utilisé des logiciels spécialisés pour optimiser la taille des échantillons.
Raffinement
Deux semaines d’acclimatation sont prévues avant l’entrée des animaux en protocole. Une surveillance quotidienne des rongeurs sera pratiquée par les zootechniciens et les expérimentateurs. De l'enrichissement sera ajouté dans les cages des animaux. Tous les examens d’imagerie sont réalisés sous anesthésie générale par voie gazeuse afin de minimiser le stress de l’animal. Un suivi de l’état des animaux est pratiqué de façon hebdomadaire : poids, qualité de la fourrure des animaux et posture de l’animal dans sa cage. Des points limites ont été établis. Ces points limites servent de critères précis pour déterminer les moments où il devient nécessaire de prendre des mesures appropriées, telles que l'intervention médicale ou l'ajustement des conditions expérimentales.
Choix des espèces
Le modèle chez les rats est largement adopté pour plusieurs raisons importantes. • Les rats présentent des similitudes significatives avec les humains en termes de structure et de fonction du système vasculaire cérébral. Cela permet de modéliser fidèlement les conditions pathophysiologiques observées chez les patients atteints d'AVC ischémique. Les études montrent que l'anatomie vasculaire et la réponse physiologique des rats à l'ischémie cérébrale sont comparables à celles des humains. • De plus, cette espèce, de par sa taille, présente l’avantage d’être particulièrement adaptée aux études d’imagerie par TEP (tomographie par émission de positons), imagerie qui est facilement transposable chez l’humain. Les rats jeunes adultes ont un système vasculaire cérébral pleinement développé, ce qui permet une étude plus précise et stable des mécanismes de l'AVC ischémique.
Effets d’une supplémentation en glutamine chez des souris mâles et femelles rendues obèses par l’alimentation.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Les souris dont le score de grimace dépasse 7 sont mises à mort, celles dont le score reste entre 5 et 7 reçoivent un analgésique. 1 088 souris rendues obèses par un régime riche en graisses vont être utilisées, 480 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 480 un niveau modéré et 128 sous anesthésie sans réveil. La gravité sévère vient des distensions colorectales par ballonnet, qui peuvent provoquer des lésions du rectum, auxquelles s'ajoutent des tests de tolérance au glucose et à l'insuline de deux heures répétés jusqu'à quatre fois, des gavages, des antibiothérapies et des permutations de litières entre cages de mâles qui augmentent leur agressivité. Toutes sont tuées pour prélever iléon, côlon, cæcum, foie, tissu adipeux et cerveau, afin de mesurer ce qu'une supplémentation en glutamine change à l'insulino-résistance et aux troubles digestifs.
Objectifs
L’obésité est un problème de santé publique majeur, dont la prévalence dans la population adulte atteint 17% en France. C’est une pathologie multifactorielle qui est associée à de nombreuses co-morbidités dont des troubles du contrôle glycémique et des troubles fonctionnels digestifs. En effet, l’apparition d’un diabète de type 2 est fréquemment observée chez les patients atteints d’obésité, stade précédé par une période où il existe une insulino-résistance et une intolérance au glucose. Par ailleurs, les sujets obèses de grade III ont une prévalence du syndrome de l’intestin irritable (SII) fortement augmentée (30% vs 5%), ce qui se traduit par des symptômes digestifs importants : douleurs abdominales chroniques, troubles du transit et ballonnements. Des données récentes chez l’animal et chez l’Homme suggèrent qu’une supplémentation orale en glutamine (acide aminé non essentiel) pourrait limiter la résistance à l’insuline, ainsi que les symptômes intestinaux, en améliorant la fonction de barrière intestinale. Dans une étude pilote réalisée sur 6 patients, la glutamine montrait une tendance à favoriser une perte de poids chez des femmes obèses et à améliorer l’insulino-résistance. Chez des souris soumises au stress d’évitement de l’eau (modèle WAS), il a été récemment démontré qu’une supplémentation en glutamine prévenait l’hyperperméabilité colique et réduisait la production de cytokines pro-inflammatoires. Des chercheurs américains ont quant à eux rapporté des effets bénéfiques d’un apport oral de glutamine sur les symptômes digestifs des patients SII-D. Elle limitait l’hyperperméabilité intestinale et diminuait les douleurs abdominales de 50 à 60%. La glutamine semble donc être un bon candidat pour cibler la fonction de barrière intestinale, impliquée dans les complications métaboliques et intestinales observées chez les patients obèses avec troubles fonctionnels digestifs. Ce projet a donc pour objectifs d’évaluer les effets sexe-dépendants d’une alimentation riche en graisse chez la souris et d’évaluer la capacité d’une supplémentation orale en glutamine, (i) à limiter l’insulino-résistance, (ii) à améliorer la fonction de barrière intestinale, et (iii) à moduler la composition de microbiote intestinal selon le sexe de l’animal.
Bénéfices attendus
Nous nous attendons à ce que la supplémentation orale en Glutamine ait des effets bénéfiques chez les souris obèses avec une amélioration de l’insulino-résistance et de leurs troubles fonctionnels digestifs qui pourraient s'expliquer par une amélioration de la fonction de barrière intestinale et une modulation de la composition du microbiote intestinal. Ce travail sera valorisé sous forme de publications, et éventuellement de brevets sur certains aspects mécanistiques. Ce projet fait partie intégrante d’un projet ANR retenu à l’appel d’offre 2020. Dans le cadre de ce projet ANR, une étude clinique pilote portant sur 110 patients obèses est en cours de réalisation. Si les résultats escomptés sont atteints, le projet sera étendu à un programme hospitalier de recherche clinique (PHRC) interrégional ou National. Les perspectives du projet sont de développer des interventions nutritionnelles sexe-dépendantes à faible coût pour les patients obèses afin de réduire les comorbidités telles que les complications métaboliques et les symptômes digestifs. L’ampleur de la population adulte française touchée par cette maladie demande des actions fortes et immédiates en matière de recherche et de développement. Le développement d’interventions nutritionnelles ciblées avec de la glutamine bénéficierait en priorité aux patients obèses dont le faible coût et l’innocuité ne restent plus à démontrer.
Procédures
- Procédure 1. Les souris subiront : test de composition corporelle sur animal vigile (3 tests/souris, 5 min/test), test de tolérance au glucose (OGTT) sur animal vigile (3 tests/souris, 2h/test), test de résistance à l’insuline (ITT, 3 tests/souris, 2h/test), et gavage d’une molécule fluorescente (1 procédure/souris, 1 min/souris). - Procédure 2 : identique à la procédure 2 avec en plus 1 test de viscéro-sensibilité (animal vigile, 30min/test). - Procédure 3. Les souris subiront : permutation de litière, test de composition corporelle sur animal vigile (4 tests/souris, 5 min/test), test de tolérance au glucose (OGTT) sur animal vigile (4 tests/souris, 2h/test), test de résistance à l’insuline (ITT, 4 tests/souris, 2h/test), et gavage d’une molécule fluorescente (1 procédure/souris, 1 min/souris). - Procédure 4 : identique à la procédure 4 avec en plus 1 test de viscéro-sensibilité (animal vigile, 30min/test). - Procédure 5. Les souris subiront : traitement d’antibiotiques dans l’eau de boisson (animal vigile, 7 jours de protocole, 1 fois/souris), gavage oral d’une solution de microbiote caecal (animal vigile, 2 fois/souris, 2min/souris), test de composition corporelle sur animal vigile (4 tests/souris, 5 min/test), test de tolérance au glucose (OGTT) sur animal vigile (4 tests/souris, 2h/test), test de résistance à l’insuline (ITT, 4 tests/souris, 2h/test), et gavage d’une molécule fluorescente (1 procédure/souris, 1 min/souris). - Procédure 6 : identique à la procédure 6 avec en plus 1 test de viscéro-sensibilité (animal vigile, 30min/test). - Procédure 7 : chaque souris subira un prélèvement du contenu caecal.
Impact sur les animaux
- Des administrations par gavage et des prélèvements de gouttes de sang dans la veine caudale seront réalisées au cours de ce projet. Les gavages oraux peuvent engendrer un stress de quelques secondes (nuisance légère). Quant aux prélèvements sanguins, ils peuvent engendrer une légère douleur au niveau de la queue (nuisance légère). - Une partie des souris développeront une obésité modérée après absorption d’une alimentation riche en graisses. Elles pourront ainsi développer des perturbations du contrôle glycémique, des troubles digestifs et des troubles du système cardio-vasculaire (nuisance modérée). - Des distensions colorectales seront réalisées pour certaines souris au cours de projet. La distension colorectale peut (i) engendrer un stress et une douleur chez l’animal, (ii) conduire à quelques lésions tissulaires au moment de l’introduction du ballonnet dans le rectum (nuisance sévère). - Des permutations de litières entre des cages de souris mâles seront réalisées au cours de ce projet. Elles peuvent entraîner un stress supplémentaire et une plus grande agressivité chez certaines souris mâles (nuisance modérée). - Des antibiothérapies par voie orale seront réalisées au cours de ce projet. Elles peuvent engendrer des comportements anxieux et sociaux altérés, et une augmentation de l’agressivité des animaux (nuisance modérée).
Devenir
Etant donné que l'obésité présente de nombreuses comorbidités et atteints de nombreux organes, le recours à l'expérimentation animale est nécessaire pour mieux comprendre cette pathologie et améliorer in fine les conditions de vie des patients. A chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort car nous avons besoin d’étudier de nombreux organes cibles tels que l’iléon, le côlon, le caecum, le foie ou encore le tissu adipeux. Nous étudierons aussi le cerveau des souris (amygdales, hypothalamus, hippocampes). Il s’agira d’évaluer les effets d’une supplémentation orale en glutamine sur (i) les réseaux neuropeptidergiques impliqués dans la régulation du comportement alimentaire, et (ii) sur la neuro-inflammation qui intervient dans l’axe microbiote-intestin-cerveau.
Remplacement
Etant donné les nombreuses comorbidités touchant différents organes au cours de l’obésité, le recours à l'expérimentation animale est nécessaire pour mieux comprendre cette pathologie et améliorer in fine les conditions de vie des patients. Au regard de la règle des 3R, pour limiter le nombre d'animaux, certaines approches très mécanistiques seront menées sur des modèles cellulaires comme par exemple l'étude des voies de signalisation intracellulaires régulant la fonction de barrière intestinale. Nous maitrisons au laboratoire diverses lignées cellulaires intestinales humaines mais aussi la technique d’inserts transwell qui permet d’évaluer le passage des molécules à travers la monocouche cellulaire (systèmes compartimentés avec le compartiment basolatéral et le compartiment apical).
Réduction
Pour limiter le nombre d'animaux et en accord avec les résultats obtenus lors de nos études antérieures, chaque paramètre sera évalué sur un effectif de 12 animaux par lot. Les résultats seront comparés par des tests statistiques appropriés. On s'intéressera principalement aux effets des paramètres "Diète", "Glutamine" et "sexe" sur divers paramètres biologiques (insulinémie, adipokines, perméabilité intestinale…). La taille d'effet est calculée pour un niveau de risque fixé à 5% et une puissance fixée à 80%. La procédure expérimentale sera répétée 1 fois. Lors de la réalisation de l’expérimentation nous prévoyons une perte en animaux de 0%. Les animaux seront répartis en lots de 4 individus par cage (hors procédure 1). Le plan expérimental mis en oeuvre est emboîté. Le problème de dépendance statistique des individus appartenant à une même cage sera minimisé lors de l’analyse des données en ayant recours à des modèles statistiques à effets mixtes. Enfin, nous prélèverons de nombreux tissus de façon à mener des travaux supplémentaires sur d’autres structures d’intérêt comme le cerveau ou encore le foie, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux in fine.
Raffinement
D'une façon générale, les animaux seront manipulés régulièrement par les mêmes expérimentateurs pour tendre à une habituation, et hébergées au nombre maximum de 4 animaux par cage avec de l’enrichissement (tunnel, papier kraft). Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des souris sera maintenue avant tout début de protocole. Pour prendre en charge la douleur, une évaluation de la souffrance sera réalisée une fois par jour à l’aide de la « Mouse Grimace Scale » développée par Langford et ses collaborateurs. Cette méthode sera tout particulièrement utilisée lors du test du viscéro-sensibilité. Lorsque la somme des scores sera comprise entre 5 et 7 (douleur modérée), les animaux recevront une injection d’un analgésique. L’animal sera surveillé et remis dans sa cage d’origine. Si la douleur persiste plus de deux jours, les animaux seront mis à mort. Lorsque la somme des scores sera supérieure à 7 (douleur sévère), les animaux seront mis à mort. Lors d’un gavage de l’animal, si par inadvertance, l’expérimentateur devait noyer les poumons de l’animal, celui-ci sera mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie. Dans le cadre du test de tolérance au glucose (OGTT), la glycémie de l’animal sera contrôlée régulièrement de façon à éviter toute hyperglycémie sévère, qui pourrait avoir des effets délétères sur l’animal. Dans le cadre du test de la tolérance à l’insuline (ITT), la glycémie de l’animal sera contrôlée régulièrement de façon à éviter toute hypoglycémie durant le test (inactivité, yeux fermés, posture prostrée, tremblements, froid au toucher). Pour diminuer l’agressivité et les comportements anxieux des animaux après échanges de litières ou antibiothérapie, il y aura un enrichissement du milieu, avec en particulier la mise à disposition d’abris.
Choix des espèces
Ce projet est un projet de recherche en physiologie intégrée permettant d’étudier des relations inter-organes importantes durant l’obésité, et tout spécialement l’axe microbiote-intestin-cerveau. Le recours à des modèles animaux est donc nécessaire pour mieux comprendre (i) l’influence bénéfique que pourrait avoir une supplémentation orale en glutamine sur les animaux obèses mâles ou femelles, et (ii) d’évaluer si les effets sexe-dépendants observés chez les souris HFD en réponse à la glutamine passent au moins en partie par le microbiote intestinal. La souris est communément utilisée dans les modèles soumis à un régime riche en lipides. De plus, certaines lignées ont un taux de réponse élevée au régime riche en lipides par rapport à d'autres espèces animales. Le choix de la souris par rapport au rat se justifie par une meilleure réponse au régime riche en lipides et par le coût de l'alimentation riche en lipides. Les souris seront livrées à l'animalerie centrale à leur quatrième semaine de vie pour un début de protocole à 7 semaines. Les souris auront ainsi une semaine d’acclimatation minimum. A ce stade, nos études antérieures montrent une bonne réponse des animaux au régime riche en lipides.
Effet de l’activité de régulateurs du cholesterol sur la réponse dà l’immunothérapie dans un modèle de carcinogenèse prostatique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris de ce projet portent une inactivation génétique de l'épithélium prostatique qui leur fait développer un cancer de la prostate. 288 d'entre elles vont être utilisées, 216 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et 72 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ces dernières reçoivent des injections intrapéritonéales trois fois par semaine pendant quatre semaines, le porteur précisant qu'elles seront utilisées avant l'apparition des douleurs et des difficultés à uriner, attendues vers quatorze mois. Toutes sont mises à mort trois puis dix-huit jours après traitement, pour prélever la tumeur, les organes lymphoïdes et le foie.
Objectifs
Les régulateurs du cholestérol étudiés sont des récepteurs nucléaires qui agissent sur de nombreux gènes et sont impliqués dans le fonctionnement des cellules immunitaires. Le cancer de la prostate (CaP) est le plus souvent traité par hormonothérapie (blocage des actions androgéniques) avec des réponses positives pendant les premières années. Cependant des rechutes apparaissent systématiquement qui restent dans l’immédiat sans possibilité de thérapie. Le CaP est considéré comme une tumeur résistante à l'immunothérapie, dans laquelle le système immunitaire antitumoral est peu activé. Nous avons montré, dans un modèle murin de tumeur de la prostate que l’absence de ces récepteurs accroit la croissance tumorale et modifie le profil immunitaire des tumeurs. Nous faisons l’hypothèse que la modulation de leur activité peut modifier la réponse immune antitumorale. Nous associerons ainsi des approches pharmacologiques qui régulent leur activité et des inhibiteurs de points de contrôle immunitaire pour déterminer l’impact de la modulation des senseurs de cholestérol sur la réponse à l’immunothérapie.
Bénéfices attendus
Cette étude est partie intégrante d’un projet visant à caractériser la pertinence d’un ciblage pharmacologique de régulateurs du cholestérol dans le cancer de la prostate (CaP). Plusieurs études montrent que ces régulateurs du cholestérol sont capables de moduler le paysage immunitaire d’autres types tumoraux. Ils sont donc des candidats pertinents pour améliorer la réponse immune et/ou l’efficacité des immunothérapies dans la prise en charge thérapeutique du CaP. Ce projet documentera la relation entre la régulation du cholestérol et la réponse immune antitumorale chez la souris, et la possibilité d’améliorer l‘immunothérapie du CaP.
Procédures
Les animaux seront soumis à l’injection en intra-péritonéal des différents traitements. La durée de la procédure sera de maximum 30 secondes répétée trois fois par semaine pendant 4 semaines .
Impact sur les animaux
Les nuisances liées au phénotype dommageable (développement d’un cancer de la prostate suite à une inactivation génétique dans l’épithélium prostatique) apparaissent tardivement dans le modèle (14 mois). Nous utiliserons les souris avant l’apparition des effets indésirables (douleurs, difficulté à uriner). L’injection intra-péritonéale et la contention peuvent engendrer un stress. Ce geste technique sera réalisé par des personnes formées . En revanche nous vérifierons l’innocuité des traitements en suivant le poids des animaux ainsi que leur comportement. Les scores seront évalués selon la grille de score mise en annexe.
Devenir
Les souris seront mises à mort pour effectuer les prélèvements (tumeur, organes lymphoïdes, foie) nécessaires aux analyses cellulaires et moléculaires à deux temps différents post traitements (J3 et J 18).
Remplacement
Ces études sont complémentées par des études in vitro de co-cultures de milieu tumoral obtenu à partir de lignées cellulaires et de cellules immunitaires. Nous évaluerons notamment l’effet de l’activation et/ou de l’inhibition des LXRs sur les mécansimes cellulaires impliquant les cellules immunitaires (phagocytose et migration). Cependant l’utilisation de modèles tumoraux syngéniques permettra d’avoir une cartographie de l’ensemble des cellules immunitaires en fonction de l’état d’activation des LXRs, dans le cadre d’un organisme complet.
Réduction
Ce projet fait suite à des travaux publiés, ayant permis de caractériser les doses d'utilisation prévisible in vivo pour les ligands et l’immunothérapie . Le nombre d’animaux de 6 par groupe a été réduit à trois dans une étude préalable afin d’objectiver des effets significatifs. Si des associations synergiques entre les ligands et l’immunothérapie sont observés, ces résultats seront confortés par une série supplémentaire de 3 souris et un point supplémentaire de suivi plus tardif.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe de 4 souris par cage avec un milieu enrichi renforcé (cabane plastique, tube carton, pad-fibre) et un suivi sera réalisé lors des injections avec une feuille des scores personnalisés (2 visites hebdomadaires). Les observations quotidiennes sont effectuées par des zootechniciens formés.
Choix des espèces
La réponse immunitaire anti-tumorale est un processus complexe impliquant le dialogue entre de nombreux types cellulaires notamment les cellules de la tumeur et les cellules immunes. L’utilisation d‘animaux immunocompétents permet d’étudier les mécanismes mis en jeu dans un organisme complet, ce qui est majeur pour le developpment de nouvelles stratégies anti-cancéreuses. L’utilisation du modèle souris permet aussi d’utiliser des organismes modifiés génétiquement et d’étudier des régulateurs spécifiques. Nous avons ainsi montré dans le modèle d’invalidation des récepteurs nucléaires LXR des modifications de l’infiltrat immunitaire dans les tissus prostatiques normaux et tumoraux chez la souris. Notre projet consitera dans le modèle tumoral à étudier l’effet de regulateurs de ces récepteurs nuléaires sur les populations immunes présentes sur des individus de 4 à 5 mois ce qui correspond à un stade de carcinome.
Radiothérapie vectorisée pour le traitement des méningiomes : évaluation thérapeutique de nouveaux radiopharmaceutiques dans des modèles de xénogreffes orthotopiques murines
- Recherche appliquée
- Cancers
Tester si des particules alpha traitent mieux les méningiomes que les particules bêta déjà employées conduit à utiliser 509 souris, toutes tuées pour prélèvement d'organes. 240 d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère, 140 d'un niveau modéré, 120 d'un niveau léger et 9 sont opérées sans réveil. Les procédures comprennent une greffe de méningiome dans le crâne sous anesthésie pendant 45 minutes, des injections intraveineuses de radiopharmaceutiques sur animal vigile, des prélèvements de sang répétés et une imagerie TEP-IRM hebdomadaire, l'escalade de doses pouvant provoquer perte de poids, chute des cellules sanguines et apathie. L'imagerie sert aussi à fixer le jour de la mise à mort, en complément de l'observation du comportement.
Objectifs
Un méningiome est une tumeur bénigne qui se développe à partir des méninges, qui sont les enveloppes protégeant notre cerveau et notre moelle épinière. Ces tumeurs présentent souvent un grand nombre de récepteurs pour une hormone qui régule certaines sécrétions dans notre corps. Pour diagnostiquer et suivre ces tumeurs, les médecins utilisent une technique d'imagerie particulière, plus informative que l’IRM ou le scanner. Cette méthode consiste à injecter une substance par les veines (un analogue de l'hormone, c’est-à-dire, une molécule qui y ressemble beaucoup) marquée avec un élément radioactif, qui permet de visualiser les méningiomes. En effet, la particule radioactive va rejoindre la tumeur grâce à la molécule qui ressemble à l’hormone en se fixant sur son récepteur. En ce qui concerne le traitement des méningiomes, de nouvelles méthodes, comme la radiothérapie interne, ont été développées (cela revient à faire venir directement dans la lésion la particule radioactive contrairement à la radiothérapie classique, externe qui envoie la particule radioactive au travers de la peau et du cerveau avant d’atteindre la lésion). Cette approche utilise aussi un traceur radioactif, d’un autre type, cette fois-ci pour délivrer des particules radioactives qui vont permettre de traiter la lésion. Certaines particules radioactives (que l’on appelle alpha) pourraient être encore plus efficaces que celles qui sont actuellement utilisées (que l’on appelle Beta). Elles ont un trajet radioactif plus court et donc délivrent toute leur énergie de manière plus concentrée, ce qui pourrait détruire davantage de cellules tumorales tout en préservant les tissus sains autour. Des recherches préliminaires ont montré que cette méthode fonctionnait bien pour d'autres types de tumeurs. Le but de ce projet est donc de vérifier si ces alphas peuvent également améliorer le traitement des méningiomes, qui malheureusement, évolue dans certains cas, sans que les techniques chirurgicales, médicamenteuses (chimiothérapie) et de radiothérapie classique ne fonctionnent.
Bénéfices attendus
La radiothérapie interne est un traitement qui utilise principalement des particules radioactives de type bêta pour cibler et détruire les cellules tumorales. Cependant, une nouvelle méthode prometteuse consiste à utiliser des particules radioactives de type alpha. La différence entre ces deux types est que les alphas parcourent une distance plus courte dans le corps, mais avec une énergie beaucoup plus élevée. Cela signifie qu'ils peuvent libérer plus d'énergie directement dans la tumeur, ce qui peut endommager davantage les cellules cancéreuses tout en protégeant mieux les tissus sains autour qui ne sont pas traversés par la matière radioactive. Ce projet vise donc à développer de nouveaux médicaments radioactifs qui seront plus efficaces dans le traitement des tumeurs et qui entraîneront moins d'effets secondaires pour les patients.
Procédures
Procédure 1 (9 souris) : Validation du geste : Greffe de méningiome sur souris anesthésiées et analgésiées (45minutes/souris), procédure sans réveil . Procédure 2 (80 souris) : Mise en place des 4 modèles de méningiome: Greffe de méningiome sur souris anesthésiées et analgésiées (durée 45 minutes/ souris). Imagerie TEP/IRM 1fois par semaine sur souris anesthésiées (11minutes/souris). Le développement tumoral s'étale sur 4 à 10 semaines en fonction des modèles . Procédure 3 (60 souris) : Escalade de doses: Injection intraveineuse sur souris vigile (1 minute)_ Prélèvement de sang (1 minute) sur souris anesthésiées sous isofurane/air après application d'une goutte de tétracaïne à J-7, J 7, J14, J 21, J28 puis une fois par mois et en terminal sur 3 mois. Procédure 4 (120 souris): Biodistribution : Injection sous cutanée sur le flanc de cellules de méningiome (1 Minute),_ Injection intraveineuse du radiopharmaceutique sur souris vigiles (1 minute). Procédure 5 (240 souris) : Thérapie : Greffe de méningiome sur souris anesthésiées et analgésiées (durée 45 minutes/ souris)_Injection intraveineuse du radiopharmaceutique sur souris vigiles (1 minute)_ Prélèvement de sang (1 minute) sur souris anesthésiées sous isofurane/air après application d'une goutte de tétracaïne à J-7, J 7, J14, J 21, J28 puis une fois par mois et en terminal_ Imagerie TEP/IRM 1fois par semaine sur souris anesthésiées (11minutes/souris). Le développement tumoral s'étale sur 4 à 10 semaines en fonction des modèles pour les souris où le traitement n'aurait pas d'effet. Les souris ayant bénéficié d'un effet thérapeutique sont suivies jusqu'à 150 jours.
Impact sur les animaux
La procédure d'escalade de doses pour déterminer la dose maximum tolérée peut entrainer une exposition toxique pour les hautes doses. A savoir: perte de poids cytopénie, apathie. Nous limiterons au maximum cette exposition en se référant à la litterature et à nos précédents projets. Pour chaque procédure concernée, c'est l' étape de greffe orthotopique puis l'évolution tumorale qui peuvent induire des nuisances aux souris. A savoir : -1 Les greffes orthotopiques se font par chirurgie ce qui induit de la douleur. 2- L'évolution tumorale peut également engendrer de la douleur notamment dans les groupes contrôle.
Devenir
Pour toutes les procédures les animaux sont mis à mort pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Les pathologies chroniques comme le cancer sont des phénomènes complexes qui font intervenir de multiples étapes. Ces paramètres ne pouvant être étudiés in vitro de façon globale et intégrée, le recours aux animaux est indispensable. La spécificité des vecteurs est préalablement testée in vitro sur des cellules tumorales.
Réduction
Réduire : pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisés est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. L’apport de l’imagerie permet de réduire le nombre de souris utilisées.
Raffinement
Les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les souris sont hébergées avec des frisottis pour pouvoir faire un nid , avec un libre accès à l'eau et la nourriture adaptée. Chaque cage contient un tunnel de préhension, pour pouvoir manipuler l'animal sans stress. Pour chaque procédure, les souris bénéficient d'une période d'acclimatation d'une semaine.L’état général et clinique des animaux sera surveillé de façon quotidienne ce qui permet de déterminer le palier de douleur. L’évaluation journalière permettra la mise en place et l’ajustement de traitements analgésiques lorsque ce sera nécessaire, en accord avec le palier de douleur observé. L’apport de l’imagerie permet d’une part de raffiner les modèles animaux existants et d’autre part de développer et proposer des modèles in vivo toujours plus proches des situations cliniques. Par ailleurs, l’imagerie permet de visualiser et quantifier le volume des tumeurs et donc de pouvoir, en parallèle de l’observation comportementale, d’adapter l’analgésie à mettre en place et de déterminer le jour auquel il faut procéder à la mise à mort. Dans la procédure de thérapie, l'étape d’injection du radiopharmaceutique en intraveineuse n’est pas douloureuse et les doses sont choisies pour être non toxiques. Après l’injection du traceur, l’animal est remis dans sa cage où il a libre accès à l’eau et à la nourriture pendant le temps nécessaire à la biodistribution du traceur (1h à 2h). Pendant l’acquisition d’imagerie, les souris sont anesthésiées durant les 11 minutes de l’examen. Elles sont placées dans une cellule d’imagerie chauffante et une goutte de gel est déposée sur leurs yeux pour prévenir le dessèchement oculaire. Elles sont replacées dans leur cage dès le réveil avec libre accès à la nourriture et à l’eau.
Choix des espèces
De nombreux modèles de tumeurs ont été développés chez la souris. Par ailleurs, l’existence de souches de souris immunodéprimées permet de développer des modèles de tumeurs à partir de cellules humaines. A partir de 7 semaines car les souris sont adultes. Les méningiomes touchent les adultes chez l'homme, les greffes sont faites entre 7 et 12 semaines, et le suivi se fait jusqu'à 150 jours après la greffe.
Etude de l’effet de ratios d’empoissonnement de deux espèces de poissons élevées en circuit fermé sur leur croissance et leur bien-être
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
Le sandre et l'esturgeon du Danube sont retenus pour la qualité de leur chair et, pour le second, de ses œufs vendus comme caviar, avec une demande du marché supérieure à l'offre. 672 poissons juvéniles, 336 de chaque espèce, vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil. Chacun est capturé à l'épuisette, plongé dans un bain anesthésiant de deux minutes, puis soumis à une prise de sang unique de trois minutes au maximum, l'objectif étant de comparer croissance et indicateurs de bien-être selon les proportions des deux espèces dans le bassin. La narration indique que tous les poissons sont mis à mort à l'issue de la procédure, alors que le champ structuré du même résumé déclare 4 128 poissons rendus à l'élevage, soit six fois l'effectif annoncé.
Objectifs
Le projet a pour objectif d'optimiser la production de poissons d'intérêt local par la polyculture (c'est à dire l'élevage d'au moins deux espèces de poissons simultanément) en circuit fermé. Cela repose sur les avantages documentés de la polyculture en circuit fermé, tels que l’amélioration des performances de croissance des poissons, de leur bien-être et de la qualité de l’eau, grâce à un partage des ressources du milieu d’élevage. De tels bénéfices peuvent être atteints uniquement sous certaines conditions. En particulier, il est important de sélectionner des espèces qui n'entrent pas en compétition dans l'utilisation des ressources alimentaires et spatiales (c'est à dire la façon dont les espèces vont occuper le volume d'eau). Lorsqu'il y a absence de compétition, les espèces sont dites compatibles. Un travail antérieur au présent projet a montré par des approches mathématiques que le sandre et l'esturgeon du Danube sont potentiellement deux espèces de poisson compatibles. L'objectif du projet est donc de tester expérimentalement cette hypothèse, en réalisant des élevages en monoculture (espèces séparées) et en polyculture (espèces combinées) selon différents ratios d'empoissonnement (proportions entre les deux espèces). Les différentes modalités d'élevage seront évaluées en termes de croissance des poissons et d'indicateurs de bien-être pour établir s'il existe une plus-value à l'élevage en polyculture par rapport à la monoculture pour ces deux espèces, et si oui, selon quelles proportions entre les espèces.
Bénéfices attendus
Un premier bénéfice attendu du projet est de consolider par validation expérimentale une méthode in silico, qui est une approche mathématique (modélisation) fondée sur l'étude des caractéristiques biologiques des espèces de poisson. Dans l'hypothèse où l'approche expérimentale valide les analyses mathématiques, cela permettrait de mettre à disposition cet outil aux éleveurs pour établir des combinaisons d'espèces en pisciculture (élevage de poissons), en diminant le recours à des animaux selon des méthodes de type essai-erreur. Un deuxième bénéfice attendu est d'établir s'il existe une plus-value à conduire des élevages multi espèces par rapport à des élevages mono espèces et de déterminer des ratios d'empoissonnement des sandres et des esturgeons du Danube les plus satisfaisants pour concilier des objectifs de croissance et de bien-être de ces espèces élevées en polyculture. Enfin un dernier bénéfice qui pourrait découler de ce projet est de proposer des protocoles moins invasifs que la prise de sang pour déterminer le niveau de stress des poissons.
Procédures
Le projet mobilisera 672 poissons, à savoir 336 sandres et 336 esturgeons. Ils seront soumis aux interventions suivantes : - Une capture au moyen d'une épuisette (poissons vagiles), en quelques secondes. - Un placement dans une bassine d'eau à la même température que celle du bassin et contenant un anesthésiant (durée : 2 minutes). - Une prise de sang unique par poissons (poissons anesthésiés; durée maximale : 3 minutes).
Impact sur les animaux
Les poissons pourront subir un stress, essentiellement lors des manipulations liées à leur capture. Le stress subi par les poissons sera de courte durée puisqu'ils seront ensuite directement placés dans une bassine spécifique pour être anesthésiés.
Devenir
Tous les poissons seront mis à mort à l'issue de la procédure.
Remplacement
Le remplacement n'est pas envisageable dans le cadre de ce projet. La compatibilité des deux espèces de poisson (sandres et esturgeons) pour un élevage en polyculture (élevage multi-espèces) a été au préalable estimée par approche mathématique. Ce projet vise entre autres à valider l'approche mathématique en testant en conditions réelles l'élevage de ces deux espèces prenant en compte la complexité des interactions entre les poissons. L'approche expérimentale permet aussi d'étudier l'influence de différents ratios d'empoissonnement des deux espèces (proportions entre les sandres et les esturgeons) sur la croissance, le système de défense et le niveau de stress des poissons. La complexité de ces fonctions biologiques nécessitent des approches expérimentales sur des organismes vivants.
Réduction
Le projet nécessite 672 poissons (c'est à dire 336 sandres et 336 esturgeons au total). Ce nombre permet de réaliser des prélèvements d'échantillons et des mesures de poids et de longueur des poissons de sorte à tirer des conclusions robustes d'un point de vue scientifique.
Raffinement
Le stress des poissons est limité autant que possible durant toutes les étapes du projet en les plaçant toujours dans une eau de bonne qualité (suivis réguliers des paramètres physico-chimiques et corrections si nécessaires), en évitant le bruit et les gestes brusques et en appliquant de façon progressive tout changement d'éclairage (application d'une aube et d'un crépuscule). Pour les prélèvements biologiques, les poissons doivent être sortis de l'eau. Pour cette étape, nous prenons soin de les endormir avec une substance anesthésiante, sur la base d'un protocole validé par le vétérinaire référent. Le comportement des poissons est suivi quotidiennement. Une modification du comportement des poissons (nage atypique, isolement, absence d'alimentation) constitue un point limite, tout comme l'apparition de blessures, de maladies ou un état de maigreur des poissons. Les poissons sont alors sortis du projet et placés en quarantaine pour être soignés dans la mesure du possible.
Choix des espèces
Les deux espèces de poissons choisies pour ce projet sont le sandre et l'esturgeon, au stade juvénile. Ce choix est justifié pour plusieurs raisons. Il s'agit d'évaluer les performances d'élevage de ces espèces durant leur phase de croissance. Ces deux espèces d'eau douce sont très appréciées des consommateurs en raison de la très haute qualité de leur chair et même de leurs oeufs dans le cas de l'esturgeon avec une commercialisation du caviar. D'ailleurs pour ces deux espèces, la demande sur le marché de la consommation est supérieure à l'offre. Ainsi ces espèces sont identifiées comme très prometteuses pour développer l'aquaculture en eau douce sur le marché européen.
Rôle de l’habenula latérale dans l’intégration des signaux olfactifs sociaux chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Une souris dont la fréquence respiratoire chute de moitié pendant la neurochirurgie voit la procédure interrompue, et se retrouve tuée si son état ne permet pas une seconde tentative sept jours plus tard. 835 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement du cerveau, dont 20 opérées sous anesthésie sans réveil et 715 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une neurochirurgie de trente minutes, des injections intrapéritonéales d'endotoxine ou de modulateurs neuronaux, jusqu'à huit frottis vaginaux pour les femelles, un isolement de sept jours et des tests olfactifs de dix minutes. L'enjeu déclaré tient à la compréhension du rôle d'une région du cerveau, l'habenula latérale, dans l'évitement des congénères malades et l'attirance sexuelle.
Objectifs
Chez la plupart des animaux, les signaux chimiques olfactifs sont cruciaux pour communiquer des informations sur leur identité, leur organisation sociale, leur maturité sexuelle et leur territoire. Ces odeurs sociales sont intégrées via les neurones sensoriels du système olfactif et sont ensuite codées par des voies cérébrales spécifiques, afin de déclencher des comportements sociaux appropriés. Récemment, l'habenula latérale (LHb), une région cérébrale épithalamique qui participe à l'apprentissage à partir d'expériences aversives, a été impliquée dans la régulation des comportements sociaux et reproducteurs chez les mammifères. Les lésions habénulaires chez les rongeurs entraînent une altération de la sensibilité aux stimuli olfactifs, provoquent une diminution de la réactivité sexuelle (lordose) et un évitement des contacts sexuels. En outre, l'Hb reçoit les projections neuronales exprimant des hormones contrôlant la reproduction : la gonadolibérine (GnRH) et la kisspeptine (KP)). Il a été montré que l’LHb exprime les récepteurs de ces deux hormones. Cependant, le rôle de LHb comme centre de traitement olfactif régulant les comportements sociaux ainsi que la modulation de la fonction de l'Hb par les hormones GnRH et KP restent peu compris à ce jour. Nos résultats préliminaires montrent que LHb est activée par des stimuli olfactifs contenus dans l’urine de congénères malades. Ces mêmes stimuli olfactifs provoquent aussi l’évitement du congénère malade par la souris saine. Par conséquent, ce projet a pour objectif de : (i) caractériser le rôle de la LHb dans le traitement des odeurs sociales lié à l'évitement des congénères malades et à l'attirance sexuelle ; (ii) déterminer le rôle de la GnRH et de la KP dans la modulation du traitement des odeurs d'attraction sexuelle par LHb.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus avec ce projet seront de deux ordres à moyen terme : (i) la mise en évidence que l’LHb relaie des informations externes, telles que les odeurs sociales, permettant une régulation fine des comportements sociaux adaptatifs ; (ii) que les hormones KP et GnRH ne sont pas seulement des régulateurs clés de l'axe de reproduction hypothalamo-hypophyso-ovarien mais qu’ils peuvent aussi agir en amont dès la transmission des stimuli olfactifs.
Procédures
Les neurochirurgies seront d'une durée moyenne de 30 minutes par animal. Une seule neurochirugie sera effectué par animal. Pour déterminer le stade du cycle sexuel, les femelles auront 4 à 8 frottis vaginaux, prélévement de quelques secondes. Ces femelles seront vigiles et maintenues pendant le prélèvement. Selon les résultats des tests comportementaux, l'urine sera prelevé entre 4 à 8 fois pour chaque animal, en maintenant la souris et en massant délicatement son ventre afin de favoriser la miction dans le tube et ainsi récolter l'urine. Quelques secondes suffisent pour récolter l'urine. Pour les urines de souris mimiquant un état infectieux aigüe, une seule injection de l'endotoxine en intrapéritonéale (IP) sera effectuée et l'urine sera prélevée qu'une seule fois par animal. Chaque souris injectée avec l'inhibiteur de l'excitation neuronale, recevra au total 4 injections de l'activateur de l'inhibition en IP (1 fois/semaine) et 4 injections du tampon contrôle en IP (1 fois/semaine) juste avant le test olfactif. Chaque test olfactif durera 10 minutes. Toutes les injections IP ne dureront que quelques secondes.
Impact sur les animaux
La chirurgie nécessaire à l'injection des virus, analogues et antagonistes peut entrainer des diminutions de la température corporelle et des hémorragies. Elle peut induire une douleur post opératoire pendant 2-3 jours essentiellement localisée au niveau du site d’incision du crâne. L'injection de la molécule provoquant la mort neuronale peut entrainer des petites convulsions jusqu'à 1 heure post-injection. Un stress dû à la manipulation des animaux pour récolter leurs urines est possible. Il s’agira d’un stress aigu de quelques minutes n’induisant pas d’effet à long terme. Les animaux injectés avec l'endotoxine pourront développer des effets secondaires transitoires tels que fatigue, réduction de l'appétit et diminution de l'intérêt social. Ces effets, qui peuvent être observées 2 à 3 h après l'injection de l'endotoxine, disparaissent rapidement et n’entraînent pas d’effet à long terme. Les animaux injectés avec l'activateur d'inhibition pourront développer des effets secondaires transitoires tels qu'une diminution de la locomotion et de l'anxiété. L'injection intrapérotonéale peut parfois générer une douleurs et hématome au point d'injection. Les animaux expérimentaux isolés 7 jours avant les tests olfactifs pourront présenter du stress lié à leur hébergement solitaire.
Devenir
Tous les animaux seront tous euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études ultérieures. Les animaux utilisés pour les prélévements d'urine qui seront euthanasiés par le personnel animalier.
Remplacement
A ce jour aucune méthode alternative non animale (in vitro et/ou de modélisation) ne peut être utilisée pour ce projet qui est dépendant de l'interconnectivité́ de neurones de résidants dans plusieurs structures qui sont à la fois olfactives et cérébrales. Il est donc impératif d’utiliser un animal entier pour comprendre les mécanismes de transmission et de régulations interconnectant l’olfaction et les fonctions comportementales des mammifères. Néanmoins nos expériences s’appuient sur des données fortes de la littérature ce qui nous permettra de limiter le nombre de tests et d’acquérir des résultats pertinents.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum compte tenu des techniques utilisées et pour maintenir la possibilité d'une mise en évidence statistique. La taille des échantillons est définie à partir des résultats obtenus lors d'expériences précédentes effectuées par notre groupe dans le cadre de tests similaires ainsi que des tailles d'effet observé dans la littérature. Nous avons aussi tenu compte de la variabilité entre les expériences, de la prévalence comportementale, de la survie post-opératoire, et de l'efficacité des injections. La taille de nos échantillons a été calculée grâce à un logiciel spécialisé. Dans l'optique de réduire la quantité de souris nécessaire, nous réutiliseront les mêmes animaux pour l’étude comportementale d’évitement et de préférence sexuelle. La significavité des résultats sera évaluée grace à des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe sociaux en présence d’enrichissements (abri cartonné complémenté de matériel de nidification)] avec un accès à la nourriture et boisson ad libitum. Les souris seront anesthésiées lors des chirurgies avec une première sédation analgésique suivie d’une anesthésie gazeuse. Les animaux recevront un traitement analgésique post-opératoire par injection sous cutanée d’un anti-inflamatoire non stéroidien permettant une couverture analgésique de 24h. L’administration sera poursuivie pendant 2 à 3 jours post-opératoire si nécessaire. Les yeux de l'animal seront protégés au moyen d'une pommade ophtalmique pendant la neurochirurgie pour éviter le dessèchement. Durant la procédure et la période de réveil, les animaux seront maintenus sur un matelas chauffant et leur température sera monitorée afin d'éviter une hypothermie. La fréquence respiratoire sera également monitorée pendant la procédure. Si une hypothermie et/ou une détresse respiratoire est observée (diminution fréquence respiratoire d’au moins 50%), l’animal recevra une dose de molécule contrant les effets de l'analgésique et la procédure sera interrompue. Si l’état de santé de l’animal le permet, une nouvelle tentative sera effectuée après 7 jours de récupération. Dans le cas contraire, l’animal sera euthanasié conformément aux points limites définis dans nos procédures. De plus, une surveillance quotidienne des animaux ayant subi la chirurgie sera effectuée tout au long de l'expérimentation en se conformanat aux points limites post-opératoires connus chez cette espèce.
Choix des espèces
Notre recherche porte sur la mise en évidence des régulations des comportements socio-sexuels induits par l’olfaction chez les mammifères. La souris est un excellent modèle animal de référence. La souris est une espèce sociale présentant des comportements socio-sexuels innés et bien décrits majoritairement régulés par les signaux olfactifs. En outre, cette espèce permet des approches génétiques fonctionnelles (génération d'animaux mutants par exemple) qui ne sont pas ou peu possibles sur d'autres espèces. Les animaux mâles ou femelles seront des adultes qui seront âgés de 8 semaines au début des expériences.
FineFlow : Evaluation in Vivo de la tolérance, de l’innocuité et de l’utilisabilité d’un dispositif innovant d’assistance cardiaque sur modèle ovin.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
L'implantation d'un dispositif d'assistance cardiaque développé par une start-up française conduit ici à ouvrir le thorax de 36 moutons pendant jusqu'à sept heures, sous anesthésie générale, chaque animal étant tué avant tout réveil. Une échocardiographie préalable sur animal vigile vérifie que la taille du cœur convient à l'intervention. Le porteur explique la mise à mort par l'impossibilité de recharger le dispositif s'il reste en place, la recharge relevant d'une autre demande d'autorisation. Sur les 36 moutons, jusqu'à vingt sont utilisés pour la formation de chirurgiens à raison d'un à deux médecins par animal, les autres au rythme d'un individu par session pour ajuster le dispositif en vue du marquage CE.
Objectifs
L'insuffisance cardiaque survient lorsque le cœur ne pompe pas suffisamment de sang pour soutenir les autres organes du corps. Cette maladie est la deuxième cause de décès aux États-Unis et en Europe et entraîne des hospitalisations répétées et prolongées. Un patient sur cinq meurt dans l'année qui suit le diagnostic. L'insuffisance cardiaque critique (IC) avec une espérance de vie courte touche 13 % de la population totale atteinte d'IC en Europe et aux États-Unis. Une jeune start-up française développe un dispositif entièrement implantable, destiné à augmenter l'espérance de vie et à améliorer la qualité de vie des patients souffrant d'insuffisance cardiaque grave. La fonction du système est de fournir une assistance au cœur, qui continue à maintenir sa propre fonction de pompe hémodynamique. L'effet du dispositif est d'ajouter une quantité supplémentaire de flux sanguin au flux sanguin natif, lors de chaque systole. Le dispositif a besoin d'une source d'énergie électrique pour fonctionner. Il est destiné à être utilisé à long terme. Il se compose de deux parties : les composants implantables, qui sont implantés au cours d'une intervention chirurgicale, et l'équipement externe. Dans des conditions normales, le patient peut se passer complètement de l'équipement externe et de la source d'énergie pendant un minimum de 30 minutes et jusqu'à 4 heures. Cela lui permettra d'effectuer des activités physiques telles que prendre une douche, un bain, nager, etc. avec une totale liberté de mouvement. Une 1ere phase, conduite sous forme d’expérimentation terminale avec et sans réveil de l’animal, a permis de valider un ensemble de paramètres hémodynamiques. Au vu de ces résultats, le dispositif est entré en phase clinique. Cependant des améliorations sur le dispositif sont nécessaires avant d’arriver au marquage CE. Il est nécessaire de démontrer son innocuité ainsi que son efficacité avec les améliorations avant que le procédé ne puisse être appliqué chez l’homme en tant que traitement reconnu.
Bénéfices attendus
La phase de vérification du dispositif (utilisabilité, performance, sécurité) sera menée sur un environnement représentatif et permettra au besoin de détecter des améliorations à apporter au dispositif. La formation des chirurgiens sera réalisée dans un environnement représentatif. Cette étude permettra une évaluation, validation du système d'assistance cardiaque testé avec détection éventuelle de pistes d’amélioration et/ou. Ce système innovant et entièrement implanté est destiné au traitement des personnes souffrant d'insuffisance cardiaque sévère, et devrait permettre d’améliorer leur qualité de vie et l’espérance de vie . Ces études permettront de vérifier la faisabilité de l’implantation du dispositif, de vérifier les performances du dispositif et de vérifier l’aptitude à l’utilisation du produit.
Procédures
Les animaux pourront avoir en amont une échocardiographie en vigile (1 séance de 30 min maximum) afin de s'assurer que la taille du coeur est compatible avec l'intervention prévue. Les animaux auront un procédure chirurgicale d'au maximum 7 heures sous anesthésie générale, avant mise à mort, toujours sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
La principale nuisance est le stress des animaux lié au changement de lieu d’hébergement (entre le fournisseur et la plateforme), ainsi que le stress lié à la manipulation le jour de l’intervention.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure, du fait de l'implantation du dispositif, et de la nécessité s'il est laissé en place de le recharger très régulièrement, ce qui n'est pas prévu dans les 2 présentes procédures (fera l'objet d'un autre APAFIS), il ne sera pas possible de réveiller l'animal.
Remplacement
Le dispositif testé est un implant artificiel fixé dans une cavité cardiaque. Il est à démontrer son efficacité, son innocuité et sa tolérance avant que le procédé ne soit appliqué chez l’homme. Afin de tester ce dispositif, l’utilisation d’animaux est indispensable. En effet, il n’est pas possible de remplacer les essais in-vivo pour reproduire la physiologie complexe d’un corps entier.
Réduction
Les études seront optimisées pour tester plusieurs parties du dispositif en une seule session afin de réduire le nombre d’animaux nécessaire. De même, il a été préféré limiter le nombre d’animaux par session à son minimum et permettre de renouveler chaque lot en cas de besoin. Ainsi, pour la procédure visant à la mesure de performance du dispositif, et donc son amélioration au besoin, un seul animal sera utilisé par session, permettant une amélioration du dispositif entre chaque session. Jusqu’à 16 sessions (sur 5 ans) pourront être réalisées dans ce cadre. Concernant la procédure de formation des équipes amenées à implanter le dispositif chez l’homme, jusqu’à 20 animaux pourront être utilisés, chaque animal permettant la formation d’un à deux médecins. Ainsi, en 5 ans, de 20 à 40 professionnels pourraient être formés.
Raffinement
Afin d’éviter de perturber les animaux dans leur environnement une période d’acclimatation de 5 jours minimum sera appliquée. Les animaux sont hébergés dans une structure agréée au moins par deux, pour maintenir des interactions sociales, et dans des conditions maîtrisées (température, ventilation, éclairage). Ils sont suivis quotidiennement. L’accès à l’eau et la nourriture est continue. Au cours des procédures, les animaux seront sous anesthésie générale et l’anesthésie est suivie et ajustée par un personnel qualifié. En cas de signes de souffrance, une analgésie supplémentaire pourra être mise en place. Si une souffrance venait à survenir sans qu’il soit possible de la soulager ou si une procédure venait à présenter des complications trop importantes pour être gérées, l’animal sera mis à mort pour éviter toute douleur inutile
Choix des espèces
Le modèle ovin présente des caractéristiques anatomiques et physiologiques comparables avec ceux de l’Homme : poids, taille, rythme cardiaque, débit cardiaque, système coronaire vasculaire et pression veineuse centrale. Également le coeur de mouton est moins susceptible de présenter des épisodes arythmiques et une mort subite au cours des expériences que celui du porc. Enfin, il a été démontré que le modèle du mouton pourrait être utilisé pour explorer le coeur et recueillir des données pertinentes et robustes. Stade adulte afin d’avoir une cage thoracique suffisamment développée correspondant à la taille d'un homme adulte
Effets du passage de courants électriques au travers de tissus animaux en vue d’améliorer les dispositifs de protection contre les chocs électriques
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Une partie des rats utilisés appartient à une souche mutante dépourvue de poils, choisie pour que la peau puisse être électrisée sans préparation préalable. 208 rats au total vont être soumis, sous anesthésie générale et pendant deux heures au maximum, à des chocs électriques appliqués sur la peau ou en transcutané avec des configurations d'électrodes variées, avant d'être tués sans réveil. Le porteur reconnaît que les chocs les plus élevés peuvent provoquer une fibrillation ventriculaire irréversible et un arrêt circulatoire. Ces électrisations servent à fournir des données à un comité de normalisation électrotechnique, et le cœur de certains rats est ensuite prélevé pour être perfusé isolément.
Objectifs
La série de normes internationales IEC 60479 définit les effets du courant électrique sur le corps humain et les animaux domestiques. Les courbes établissant les limites de dangerosité font actuellement l’objet de controverses, certains acteurs plaidant pour un relèvement de ces limites, ce qui reviendrait à affaiblir les normes de sécurité. Une telle révision entraînerait des conséquences significatives : les dispositifs de protection contre les chocs électriques pourraient réagir plus tard en cas de défaut, augmentant ainsi les durées d'exposition au courant électrique et, par conséquent, les intensités traversant le corps humain. Cela exposerait les individus entrant en contact avec une tension électrique à des courants potentiellement plus dangereux, voire mortels. Il est crucial de souligner que les arguments avancés en faveur de ces modifications reposent sur des bases scientifiques discutables, souvent simplifiées à l’excès et dépourvues des validations expérimentales nécessaires. En particulier, des aspects fondamentaux tels que le comportement de la peau lors d’une électrisation sont complètement négligés. Le projet vise à acquérir des données systématiques sur la réponse des tissus biologiques vivants, ainsi que du corps entier, dans différentes conditions d’électrisation. Une approche scientifique rigoureuse, garantissant la traçabilité et la répétabilité des résultats, ainsi qu’un contrôle strict des conditions de test, est indispensable. Ces travaux fourniront des données fiables aux organismes de normalisation, afin de maintenir un niveau de sécurité optimal dans les installations électriques et une protection efficace contre les chocs électriques.
Bénéfices attendus
Le présent projet de recherche apportera des données biologiques sur les conséquences de l'électrisation du corps, dans des conditions expérimentales contrôlées. Ces données serviront de base à l'établissement des normes de sécurité des installations électriques et de protection des personnes contre les chocs électriques par l'IEC - TC64.
Procédures
Chaque animal subira un protocole sous anesthésie générale avec analgésie, d'une durée maximale de 2 heures pendant lequel il sera soumis à des chocs électriques appliqués sur la surface externe de la peau ou en transcutané avec différentes configurations de géométrie ou de positionnement des électrodes d'électrisation. Au terme de la série de mesures ou des deux heures, l'animal sera mis à mort sans réveil préalable.
Impact sur les animaux
Une anesthésie générale comporte un risque de détresse cardio-respiratoire. Les chocs électriques les plus élevés peuvent induire des fibrillations ventriculaires irréversibles conduisant à un arrêt circulatoire
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour une analyse anatomopathologique des tissus cibles (peau, coeur, foie, rein, etc.) ou pour une utilisation ex-vivo du cœur (perfusion de cœur isolé) ou d'échantillons de peau.
Remplacement
Les manipulations présentées dans cette demande font partie d’un projet d’étude destiné à rassembler les données physiques et biologiques nécessaires à l’établissement des normes de protection des personnes contre les courants électriques. Pour limiter l’utilisation des animaux vivants, des études portant sur les conséquences de l'électrisation sur le tissu cutané seront réalisées sur des biopsies de peau humaine fraichement prélevées dans le cadre de procédures d’abdominoplasties, et sur des cadavres humains. Toutefois, ces manipulations in vitro ne pourrons qu’établir le comportement physique des matériaux (inertes) constituant le derme et seule l’une des 2 composantes de l’impédance tissulaire (R[infini]) sera pertinente, l’accès à la résistance du milieu extracellulaire (R0) n’ayant de sens que dans un tissu vivant. Pour cette raison, des manipulations sur des modèles in vivo sont nécessaires pour permettre l’accès à l’évolution du R0 en réponse à l’électrisation dans des conditions physiologiques (marqueur des phénomènes lésionnels), ou pour évaluer l’impact de l’électrisation sur l’activité cardiaque. Il est à noter que le cœur de certains animaux de cette étude sera prélevé en fin de procédure pour des manipulations complémentaires ex vivo, sur cœur isolé et perfusé. Ces cœurs pourront être prélevés dans le cadre de ce projet ou d'un autre. Dans ce projet, seules les études qui nécessitent un contexte physiologique complet ne pouvant pas être remplacé par un modèle in vitro ou ex-vivo seront réalisés sur des animaux vivants.
Réduction
Un maximum de 208 rats sera utilisé dans ce protocole. Chaque groupe expérimental sera constitué de 8 animaux pour établir des courbes de dangerosité intégrant la variabilité inter-individuelle, qu'elle soit liée au sexe ou non. La taille des échantillons (n=8 par groupe) a été déterminée de façon à pouvoir mettre en évidence une différence de 15% sur des variables dont l'écart type est typiquement de 10% de la moyenne, avec un niveau de significativité de 0,05 et une puissance de 80%. Afin de réduire le nombre d'animaux plusieurs chocs électriques incrémentaux seront pratiqués sur un même animal en évaluant après chaque choc le degré de lésion par la mesure de l'impédance tissulaire. De plus, des biopsies tissulaires (notamment des biopsies cutanées) seront réalisées après la mise à mort des animaux pour compléter les travaux par les études ex-vivo. De même, le cœur de certains animaux sera prélevé en fin de manipulation pour des études de cœur isolé perfusé. Enfin, des animaux provenant d'autres protocoles pourront être utilisés.
Raffinement
Le projet sera mis en oeuvre dans un établissement utilisateur agréé. L'ensemble des personnels impliqués est à jour des formations réglementaires exigibles pour les manipulations sur des animaux vivants. Le rat correspond à l'espèce animale la plus pertinente dans ce type d'étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé et observés régulièrement afin d'anticiper l'apparition des points limites fixés. L'intégralité des gestes sera réalisée sous anesthésie générale complémentée par une analgésie. Les rats mutants sans poil présentent des anomalies de croissance des poils, des vibrisses et un épaississement de la peau, tout en conservant un système immunitaire fonctionnel. Il n'y aura aucune nuisance liée à cette mutation. Toutefois lors de l'hébergement d'acclimatation, l'enrichissement des cages d'hébergement pourra être optimisé.
Choix des espèces
Les études portent sur les conséquences physiologiques de l'électrisation de la peau. La taille du rat de 300g est adaptée à l'utilisation des électrodes d'électrisation actuellement préconisées par les normes internationales (1 cm2). La structure de l'épiderme, du derme et de l'hypoderme du rat est proche de celle des humains. Les rats de souche sans poil, qui feront partie de l'étude, sont des animaux communément utilisés dans les études de dermatolgie, du fait des similitudes physiologique entre la peau de ces animaux et celle des humains, avec une surface glabre et une couche cornée réduite. L'utilisation des animaux de souche sans poil (sur lesquels aucun traitement de la peau n'est nécessaire avant la manipulation) a été limitée au deux groupes nécessaires à la détermination de l'influence de l'impédance de contact de façon à permettre au maximum l'inclusion d'animaux de souches standards issus d'autres protocoles (réutilisation). Dans ce projet, une attention particulière sera portée aux lésions résultant de l'électrisation de la peau et sur ses effets sur l'activité électrique cardiaque. Le modèle rat est un modèle de prédilection reconnu pour l'étude des troubles du rythme et des altérations cellulaires cardiaques et la bibliographie sur l'électrophysiologie chez le rat est abondante. Enfin, les enzymes retenues comme marqueurs des lésions cardiaques sont les mêmes dans les modèles expérimentaux chez le rat et en clinique humaine.
Effet de composés dans un modèle d’hyperactivité vésicale chez le rat ou le cobaye (modèle d’isovolumétrie).
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Cochons d'Inde : 600
Anesthésiés sans réveil, opérés pendant 20 à 30 minutes puis la vessie remplie pour provoquer des contractions rythmiques, 600 rats et 600 cochons d'Inde sont tués avant tout retour à la conscience. L'objet est d'évaluer, pour le compte de clients, des candidats médicaments contre l'hyperactivité vésicale. Le porteur écrit ne connaître ni la nature ni les effets secondaires possibles des molécules testées, ce qui le conduit à déclarer qu'il lui est difficile d'anticiper les nuisances. Aucun calcul statistique ne fixe l'effectif de douze animaux par groupe, que le porteur justifie par son expérience et par la littérature.
Objectifs
L’objectif de ce projet sera d’évaluer l’activité pharmacologique de candidats médicament sur les contractions vésicales en étudiant l’effet de ces composés sur l’amplitude et la fréquence des contractions vésicales rythmiques chez le rat ou le cobaye, modèle permettant de mimer une hyperactivité vésicale.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de pathologies vésicales.
Procédures
Les animaux pourront avoir des administrations de composés par différentes voies (gestes rapides de 1 min environ). Ils seront tous anesthésiés et auront des chirurgies (environ 20-30 min) avec une médication analgésique. Leur vessie sera remplie et les contractions vésicales seront observées. Ce protocole expérimental se réalise sous anesthésie sans réveil. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés.
Impact sur les animaux
Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). Cette procédure expérimentale se déroule sous anesthésie sans réveil ce qui limite les nuisances possibles.
Devenir
A l’issue de la procédure les animaux seront euthanasiés car l’anesthésique utilisé ne permet pas le réveil des animaux.
Remplacement
Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de l’hyperactivité vésicale. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible et selon le protocole expérimental, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle) avant l’administration du candidat médicament à tester. Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. Aucun test statistique sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe mais de par notre forte expérience en expérimentation animale, les publications scientifiques publiées, un nombre minimum de 12 animaux par groupe sera utilisé pour avoir des résultats statistiquement différents et fiables. Des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la différence statistique entre les groupes.
Raffinement
En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Des antalgiques seront administrés afin de diminuer la douleur des animaux. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE. Un enrichissement (type tunnel, aspen brick, ajout de foin pour les cobayes…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … . Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient. Les points limites s’appliqueront dans le cadre de la surveillance des animaux.
Choix des espèces
La physiologie de la vessie chez ces deux espèces choisies est bien décrite et caractérisée dans la littérature ce qui permet une bonne caractérisation des candidats médicament à tester sur ces modèles. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 7 semaines pour le rat et des animaux de 250-300 g minimum pour le cobaye afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.
Effets transgénérationnels de traitements anti-épileptiques chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures allant de l'anesthésie sans réveil à un niveau de souffrance modéré. Le protocole prévoit une injection quotidienne d'antiépileptique dès deux semaines avant l'accouplement et jusqu'à la fin de l'allaitement, l'implantation d'électrodes dans le crâne sous anesthésie pendant une à six heures, puis des séances d'enregistrement tête fixée montant progressivement jusqu'à trois heures, en hébergement individuel. Le bénéfice annoncé, mieux choisir les traitements antiépileptiques chez la femme enceinte, reste une perspective. Le porteur écrit qu'aucune étude ne montre que les altérations développementales reproduites chez ces souriceaux soient douloureuses, et conclut que le fonctionnement cognitif ne peut être modélisé ni in vitro ni in silico.
Objectifs
Le traitement de l'épilepsie par l'acide valproïque (VPA) pendant la grossesse est clairement associé à des effets délétères sur le développement cérébral du fetus. L'implication potentielle de mécanismes épigénétiques soulève également la possibilité d'effets transgénérationnels, comme cela a été démontré chez la souris avec l'expression d'un phénotype autistique sur 3 générations suivant le traitement de femelles gestantes. Dans un tel contexte, il est essentiel de déterminer la toxicité prénatale éventuelle des différents traitements anti-épileptiques. L'objectif de notre projet est donc de caractériser les effets délétères et transgénérationnels potentiels des 3 drogues anti-épileptiques les plus prescrites durant la grossesse, ainsi que du VPA considéré comme le traitement de référence pour les effets toxiques attendus. La compréhension de ces mécanismes sera utile pour la sélection et le développement de traitements anti-épileptiques chez la femme enceinte.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de notre projet sont une meilleure compréhension des effets délétères et transgénérationnels potentiels des drogues anti-épileptiques prescrites durant la grossesse. Ces connaissances favoriseront la sélection et le développement de traitements anti-épileptiques chez la femme enceinte, ainsi qu'une meilleure compréhension du fonctionnement cérébral et de ses pathologies, notamment neurodéveloppementales telles que retard mental et autisme, ce qui représente un intérêt sociétal considérable.
Procédures
Les animaux seront soumis à 6 types d'intervention, sur une durée totale de 2 à 4 semaines : traitement pharmacologique (1 injection par jour, démarrage 2 semaines avant l'accouplement et jusqu'à la fin de l'allaitement); procédures chirurgicales (implantation, sous anesthésie, d'électrodes ou d'une barre miniature pour enregistrement chez l'animal vigile), d'une durée de 1 à 6h suivie d'une période de récupération d'au moins une semaine; procédure d'enregistrement sur l'animal vigile libre, d'une durée de 7j, ou en mode tête-fixée, par sessions quotidiennes de quelques minutes au départ (période d'acclimatation d'1 à 2 semaines) puis progressivement jusqu'à 2 ou 3h (période d'apprentissage et d'entrainement, sur 1 à 2 semaines); procédure d'enregistrement sur l'animal anesthésié, d'une durée de 3 à 6h; et enfin anesthésie terminale pour prélèvement du cerveau, procédure d'une durée de 30 à 60 min, au cours de laquelle l'animal est mis à mort.
Impact sur les animaux
Le traitement pharmacologique par injection intra-péritonéale (1 injection par jour, démarrage 7j avant le premier accouplement) représente un stress physique et psychologique léger. Les procédures chirurgicales (implantation d'électrodes ou d'une barre miniature sur l'os cranien), d'une durée de 1 à 6h, sont effectuées sous anesthésie générale et donc sans douleur ni inconfort. L'acte chirurgical n'est associé à aucune perte de fonction. La récupération post-chirurgicale est accompagnée de traitement analgésique (démarré dès avant l'acte chirurgical), ce qui limite la douleur à un niveau modéré. La procédure d'enregistrement sur l'animal vigile libre ou en mode tête-fixée n'est associée à aucune douleur particulière. En plus de l'hébergement individuel (isolement), compensé par un enrichissement de l'environnement et des interactions quotidiennes avec l'expérimentateur, l'inconfort lié à la fixation de la tête (perte de liberté de mouvement) est modéré car mitigé par les interactions avec l'expérimentateur (handling, enrichissement comportemental lié à la tâche) et par une habituation très progressive (sessions quotidiennes de quelques minutes au départ). Les procédures d'enregistrement sur l'animal anesthésié et de prélèvement du cerveau sont effectuées sous anesthésie générale sans réveil, complétée par un traitement antalgique, et donc sans aucune perception de la part de l'animal.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort. Ceci est indispensable pour caractériser l'état histologique du cerveau et pour s'assurer de la localisation des électrodes (identifiée par un marqueur florescent, le DiI) après les enregistrements in vivo.
Remplacement
L'étude des propriétés des circuits neuronaux impliqués dans la cognition nécessite l'observation et la manipulation de systèmes neuronaux intacts, et ne peut donc se faire que sur le cerveau issu de l'animal vivant. Il est en effet à ce stade de nos connaissances impossible de modéliser de façon réaliste le fonctionnement cognitif in vitro ou in silico. Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car elle présente le meilleur équilibre entre les bénéfices (accessibilité expérimentale et pertinence par rapport aux pathologies chez l'homme) et les dommages escomptés (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation dont actes chirurgicaux, perfusion transcardiaque ou mise à mort en cas d'atteinte de point limite).
Réduction
Seules les expériences absolument indispensables ont été prévues, nous avons évité la répétition inutile d'études antérieures, et le protocole expérimental est soigneusement préparé. Une difficulté notable dans le calcul a priori du nombre d'animaux nécessaire est que les variables étudiées sont nouvelles, et leurs paramètres statistiques par conséquent inconnus. Notre estimation du nombre d'animaux est basée sur la littérature du domaine. Le nombre d'animaux retenu dans notre protocole, nécessaire pour garantir un pouvoir statistique suffisant pour chacune de nos expériences réalisée avec un taux de succès de 50%, est ainsi de 20 par lot expérimental. Toutefois, les animaux sont préparés par petites séries de 4 ou 5 et les résultats analysés au fur et à mesure, ce qui permet d'ajuster le nombre final d'animaux utilisés, la procédure s'arrêtant dès que le nombre de 10 expériences réussies par groupe est atteint.
Raffinement
Les dommages en termes de souffrance animale sont minimisés par les conditions d'élevage (cages collectives et enrichies de carré de coton jusqu'à la chirurgie et autant que possible après), le suivi des règles de l'art pour les interventions chirurgicales (aseptie, anesthésie et antalgie), le suivi régulier (quotidien dans les periodes péri-opératoires) des animaux par le chercheur responsable et par le personnel animalier (définition de points limites de bien être général qui déclenchent soins particuliers, voire euthanasie, selon leur gravité). Les animaux utilisés sont des souris exposées directement (in utero) ou indirectement (de parents ou grands-parents exposés in utero) à un traitement antiépileptique. Ce modèle a pour but de reproduire les altérations développementales des circuits neuronaux potentiellement exprimées chez l'homme de façon transgénérationnelle suite à un traitement anti-épileptique pendant la grossesse. Toutefois, aucune étude à notre connaissance ne montre que les troubles associés au développement des circuits neuronaux dans les modèles que nous utilisons soient douloureux pour l'animal, et le phénotype n'est pas considéré comme dommageable.
Choix des espèces
Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car cette espèce présente des similitudes neuronales et cognitives suffisantes pour assurer la pertinence des investigations menées par rapport au cerveau humain. Elle est également une espèce de choix pour modéliser les pathologies cérébrales concernées par cette étude, représentant un bon équilibre entre les bénéfices (disponibilité d'outils de biologie moléculaire, de génétique et de pharmacologie, facilité d'élevage, pertinance par rapport aux pathologies chez l'homme) et les dommages escomptés (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation). En outre, une quantité de données considérable dans le domaine des Neurosciences Cognitives a été obtenue avec cette espèce, ce qui nous permet une comparaison des résultats obtenus et une minimisation du nombre d'animaux utilisés en s'appuyant sur des données publiées par d'autres équipes et obtenues à l'aide de protocoles expérimentaux similaires. Les animaux utilisés seront de façon générale de jeunes adultes (8-16 semaines), car c'est la tranche d'âge qui donne les meilleurs résultats (meilleure récupération post-chirurgicale, enregistrements plus faciles sur cerveau jeune du fait des propriétés physiques de la dure mère et du tissu cérébral probablement moins myélinisé) tout en permettant une expérimentation sur un système nerveux qu'on considère mature, et en minimisant autant que possible la durée d'élevage en condition d'animalerie de laboratoire. Mais dans la mesure où les conséquences attendues des traitements sont potentiellement neurodéveloppementales, un groupe d'animaux immatures (âge P10) sera également inclus dans les procédures d'enregistrements électrophysiologiques en conditions tête-fixée et anesthésié.