Procédures sans réveil

Une partie des 2 040 souris est uniquement anesthésiée profondément puis vidée de son sang, sans jamais se réveiller, l'opération durant une trentaine de minutes. Les autres subissent une injection dans le cerveau au cours d'une chirurgie de trente minutes à une heure, puis quatre semaines plus tard des tests comportementaux, cinq injections quotidiennes et un prélèvement de liquide céphalorachidien avant d'être tuées à leur tour, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que leur génotype leur donne, à partir de six mois, un comportement dépressif, une sociabilité réduite et de l'anxiété. Il écrit avoir envisagé les organoïdes mais conclut qu'ils ne développent pas les signatures cellulaires observées, et écarte la drosophile, le nématode et le poisson zèbre au motif que leur barrière cérébrale diffère de celle des mammifères.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative mortelle associée au vieillissement, qui touche 30 à 50 % des personnes de plus de 85 ans. Certains traitements existent pour les maladies neurodégénératives, mais leur efficacité est limitée et de nouvelles approches thérapeutiques sont nécessaires de toute urgence. Des recherches récentes suggèrent qu'une dérégulation circadienne augmente les probabilités de développer la maladie, et les zones d’interface entre sang et cerveau sont connus pour être fortement régulés par le rythme circadien. Les zones d’interface entre sang et cerveau constitue l'une des frontières séparant le cerveau de la périphérie. Elles sont situées dans chacun des quatre ventricules du cerveau et sont adjacentes aux zones impliquées dans la production des neurones. Structurellement, les zones d’interface entre sang et cerveau sont composés d’un réseau de vaisseaux sanguins fenêtrés entourés d’une variétés de cellules. Les principaux rôles physiologiques des zones d’interface entre sang et cerveau sont la production de liquide céphalo-rachidien, qui débarrasse le cerveau des déchets métaboliques et des agrégats de protéines, et la production et le passage contrôlé du sang vers le cerveau de diverses molécules de signalisation, dont des hormones et des facteurs qui ciblent les neurones. Les molécules sécrétées par ces zones façonnent l’activité cérébrale, par exemple en modulant la production de neurones, ce qui les rend cruciales pour l’équilibre du cerveau. Des travaux préliminaires sur l’expression des gènes circadiens de ces zones ont révélé que les oscillations rythmiques sont clé dans l’organisation de son activité, qui est encore modifiée par le sexe, le vieillissement et le contexte pathologique (en particulier la maladie d’Alzheimer). Ces recherches ont également suggéré la présence d'une signature cellulaire. Notre objectif est d'étudier comment la régulation circadienne et, en particulier, un certain programme façonnent la trajectoire du vieillissement cérébral et le cours du développement de la maladie d’alzheimer dans des modèles murins.

Bénéfices attendus

Le cerveau flotte dans le Liquide céphalo rachidien (LCR), un liquide qui joue un rôle clé dans son entretien). Des recherches antérieures ont démontré que les changements liés au vieillissement dans la composition et le flux du LCR favorisent le vieillissement cérébral et la neurodégénérescence et que leur inversion peut inverser certaines caractéristiques du vieillissement cérébral et les propriétés et le flux du LCR sont étroitement contrôlés par l’épithélium du plexus choroïde. Des travaux antérieurs et nos données préliminaires ont montré que la fonction du plexus choroïde dépend de manière critique du rythme circadien, du sexe, de l’âge et de l’état de la maladie (en particulier de la MA). Plus précisément, en utilisant la transcriptomique, nous avons constaté que chez les jeunes souris, nous avons observé une signature neuroépithéliale dépendante du rythme circadien et nos analyses informatiques ont prédit sa dépendance à deux facteurs de transcription compétitifs. Donc, nous visons à étudier les facteurs possibles responsables de l'induction de la signature et l'impact de la modification des programmes circadiens au niveau du plexus choroïde sur le plexus choroïde,

Procédures

Certaines souris subiront uniquement une exsanguination sous anesthésie profonde et analgésie.Certaines souris subiront uniquement une exsanguination sous anesthésie profonde et analgésie; de l'injection de l'analgésie à l'exanguination complète, cette procédure prend environ 30 minutes. D’autres souris seront soumises à une injection dans le cerveau (une procédure chirurgicale) sous anesthésie générale et analgésie (durée de la procédure : 30 min à 1h sur adulte), suivie deux mois plus tard de 5 injections et un échantillonnage du liquide céphalorachidien sous anesthésié avant l'exsanguination. Les injections réalisées ne prennent que quelques secondes. Certaines souris seront soumises à une injection dans le cerveau (une procédure chirurgicale) sous anesthésie générale et analgésie (durée de la procédure : 30 min à 1h sur adulte). Quatre semaines après chirurgie, les animaux seront impliqués dans des tests de comportement non invasifs (trois tests d'une durée de 1 à 3 jours, avec un jour de repos entre les tests.). Après, les souris recevront 5 injections (une par jour pendant 5 jours). Le jour de la mise à mort, les souris recevront 4 injections et un échantillonnage du liquide céphalorachidien sous anesthésié avant l'exsanguination. Certaines souris recevront une injection supplémentaire. Les injections réalisées ne prennent que quelques secondes. Certaines souris recevront cinq gavages (un tous les deux jour). Quatre semaines après chirurgie, les animaux seront impliqués dans des tests de comportement non invasifs (trois tests d'une durée de 1 à 3 jours, avec un jour de repos entre les tests). Après, les souris recevront 5 injections (une par jour pendant 5 jours). Le jour de la mise à mort, les souris recevront 4 injections et un échantillonnage du liquide céphalorachidien sous anesthésié avant l'exsanguination. Certaines souris recevront une injection supplémentaire. Les injections réalisées ne prennent que quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les chirurgies pourraient générer un stress, une douleur légère et de l’inconfort de courte durée (2-3 jours). Les injections par voie-intrapéritonéale pourront générer une douleur légère de courte durée. Peu de stress à l’animal. Les souris étudiées peuvent présenter un comportement dépressif, un comportement social diminué et des comportements anxieux à partir de 6 mois en raison de leur génotype.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour la dissection des tissus afin de répondre aux questions scientifiques posées dans cette proposition

Remplacement

Notre objectif est d'étudier comment les cellules du programme circadien de certaines zones d’interface sang/cerveau agissent sur le cerveau dans des conditions physiologiques et dans la maladie d'Alzheimer. Il n'existe pas de modèle in vitro ou ex vivo qui rende compte de la complexité d'un organisme ou d'un tissu avec ses composantes tissulaires et focntionnelles. Des animaux plus simples comme la drosophile, Caenorhabditis elegans ou le poisson zèbre ne peuvent pas non plus être utilisés car la physiologie de la barrière cérébrale de ces animaux est très différente de celle des mammifères. Nous avons envisagé la possibilité d'utiliser des organoïdes, mais à notre connaissance, ils ne développent pas les signatures cellulaires que nous avons observées in vivo et dans des explants.

Réduction

Nous souhaitons étudier les interactions entre les programmes circadiens au niveau des zones d’interface sang/cerveau et du cerveau. Les quantités d'animaux (2040 au total) utilisés pour mener à bien notre projet sont établis en tenant compte de notre expérience antérieure et de tests statistiques. Toutes les souris seront utilisées pour mesurer plusieurs résultats d'étude. Nous prévoyons pour chaque groupe, 14 animaux à analyser ; le sexe des animaux peut influencer les phénotypes observés, des mâles et des femelles seront inclus (7 mâles et 7 femelles). Des expériences en triple seront réalisées pour obtenir des résultats robustes. Selon le nombre de groupes comparés : 4 groupes comparés (par exemple sains vs. Maladie d’alzheimer et traités vs. contrôle) : les nombres proposés (7 individus par groupe) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs.

Raffinement

Les procédures décrites visent à réduire au maximum l'inconfort des animaux. Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie sur un tapis chauffant sur lequel ils seront maintenus pendant et quelques heures après le réveil. Les interventions sur les adultes peuvent provoquer des douleurs modérées pendant la cicatrisation qui seront prévenues par une injection d’analgésique, 30 min avant l'intervention, 6 heures après, puis toutes les 12 heures pendant 48 heures en cas de douleur. Un analgésique sera aussi appliqué sur les zones à inciser et un autre sera également ajouté après l'intervention dans l'eau de boisson pendant la cicatrisation. Pour améliorer la prise alimentaire, un gel alimentaire sera ajouté dans les cages en post chirurgie ainsi que le renforcement de l’enrichissement. La récupération des animaux après leur chirurgie sera surveillée régulièrement et nous suivrons les signes et les points limite définis. Les procédures décrites sont conçues pour minimiser l'inconfort des animaux. De plus, les modifications génétiques peuvent être associés à une anxiété accrue chez la souris, pour limiter l’inconfort de ces animaux, leur suivi sera assuré selon une liste de signes cliniques et des points limites spécifiques et précoces. Dès l’apparition d’un signe clinique, nous multiplierons l’enrichissement (plus de coton, un igloo) et, le cas échéant, nous chaufferons les cages avec des chaufferettes si l’animal montre des signes d’hypothermie. Des aides alimentaires (type gel hydrique) et une réhydratation sous-cutanée avec de la solution saline seront mises en place au besoin. Si un animal atteint le score limite, il sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée en laboratoire pour l'étude de la physiologie des mammifères. De nombreuses souris transgéniques et outils de modifications génétiques sont disponibles, permettant d'étudier les fonctions précises de gènes et de voies sélectionnés. De plus, la souris permet l’analyse des capacités cognitives au cours d’expériences comportementales. Les souris permettent de travailler avec la meilleure efficacité́ possible tout en offrant une représentation certes imparfaite mais néanmoins proche de la pathologie humaine. Nous avons donc choisi ce modèle pour mener notre étude de certains facteurs agissant sur le cerveau, en condition physiologique et au cours du vieillissement. Nous utiliserons des souris jeunes adultes (8-12 semaines) pour étudier la physiologie de l'activité circadienne du plexus choroïde. Dans certaines procédures, nous ferons vieillir les souris jusqu'à 12 mois pour étudier l'interaction des voies circadiennes avec la neurodégénérescence. Au cours du développement typique de la maladie d’alzheimer chez la souris, les premiers signes de pathologie sont la formation de plaques dans le cerveau, à partir de 3 mois, ainsi que des différences comportementales dans les capacités d'apprentissage et de mémoire, qui sont évidentes entre 6 et 11 mois chez les souris. Cet âge peut varier en fonction du microbiote et du sexe. Pour capturer ces fenêtres de progression de la maladie, nous induirons la modification génétique chez les souris à l'âge de 2 mois et surveillerons la progression de la maladie en termes de capacité cognitive à 6, 8, 10 et 12 mois. Nous nous attendons à ce que les modifications génétiques accélèrent ou ralentissent la courbe du déclin cognitif chez ces souris.

540 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, 80 d'entre eux étant opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Ils reçoivent une injection dans la citerne cérébrale ou sous la peau d'un produit inflammatoire qui provoque une allodynie tactile, un gavage, parfois cinq injections intrapéritonéales, puis sept mesures comportementales de la douleur en une heure trente ou deux heures trente. Le porteur affirme que ces tests n'entraînent pas de stress parce que les animaux y ont été habitués, et fixe la mise à mort à 20 % de perte de poids. Il conclut qu'aucune méthode ne peut remplacer ce protocole, l'installation de l'allodynie après injection d'un produit inflammatoire devant selon lui être observée chez l'animal vivant.

Objectifs

Parmi une série de composés chimiques synthétisés, nous avons identifié une molécule ayant un effet anti-allodynique à la fois très puissant et prolongé sur des modèles murins d’allodynie mécanique inflammatoire comme neuropathique. Nous voulons améliorer cet effet anti-allodynique via l’optimisation de la formule chimique du composé, pour ensuite comparer l’effet thérapeutique des nouveaux composés à notre référence. Ce projet vise a répondre à deux questions : 1. Détermination de l'effet dose du composé de référence sur l'hypersensibilité mécanique d'origine inflammatoire. 2. Les nouveaux composés ont-ils un effet sur l'hypersensibilité mécanique d'origine inflammatoire ?

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d'améliorer la compréhension du mécanisme d'action du composé ainsi que d'évaluer son efficacité sur plusieurs modèles de douleurs orofaciale et par d'autre voie d'administration.

Procédures

Groupe1: injection intracisternale (1 par animal: 3min) ou voie orale ((1 par animal: 3min) + 1 injection sous-cutanée (1 par animal:2min) sous sédation + tests de mesure de la douleur en comportement (7 fois en 1h30)+ stimulation non nociceptive (10 min sous anesthésie générale). Groupe 2: injection intra péritonéale ( 1 ou 5 par animal : 2min) + voie orale (1 par animal : 3 min) sous sédation+ tests de mesure de la douleur en comportement(7 fois en 1h30)+ stimulation non nociceptive (10 min sous anesthésie générale). Groupe3 : injection voie orale (1 par animal: 2min) sous sédation+ tests de mesure de la douleur en comportement (7 fois en 2h30)+ stimulation non nociceptive (10 min sous anesthésie générale). Groupe 4: injection intracisternale (1 par animal: 3min) + tests de mesure de la douleur en comportement (7 fois en 2h30). Groupe 5: injection voie orale (1 par animal: 3min) + 1 injection sous-cutanée (1 par animal:2min) sous sédation+ stimulation non nociceptive (10 min sous anesthésie générale) Groupe 6: injection par voie orale (1 par animal: 3min) +prélèvement sanguin (2 par animal d'environ 2min espacé de minimum 4h) sous sédation

Impact sur les animaux

La piqûre d’aiguille lors de l’injection intracisternale (1 par animal : 3min sous sédation) entraine une douleur légère de courte durée et le produit injecté ne doit pas produire d’effet indésirable. Le gavage par voie orale ((1 par animal : 3min sous sédation) entraine une irritation légère de courte durée et le produit injecté ne doit pas produire d’effet indésirable. La piqûre d’aiguille lors de l’injection sous-cutanée (1 par animal :2min sous sédation) sous sédation entraine une douleur légère de courte durée et le produit injecté provoque une irritation de courte durée puis une allodynie tactile. Les tests de mesure de la douleur en comportement (7 fois en 1h30) n’entraînent pas de stress car les animaux ont été habitués aux tests : ils sont habitués à être isolés pour ces tests. La stimulation non nociceptive (10 min sous anesthésie générale et procédure sans réveil) n’entraîne pas de stress car les animaux sont sous anesthésie générale. La piqûre d’aiguille lors de l’injection intra péritonéale ( 1 ou 5 par animal : 2min) entraine une douleur légère de courte durée et le produit injecté ne doit pas produire d’effet indésirable. Le prélèvement sanguin (2 par animal d'environ 2min espacé de minimum 4h) sous sédation entraine une douleur légère de courte durée au niveau du prélèvement.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort car ils ne peuvent pas être utiliser dans d'autres procédures.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique. Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après injection de produit inflammatoire.

Réduction

Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrons rencontrer au cours des différentes phases expérimentales. Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif. Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc il est préférable de prévoir un maximum de 10 animaux par groupe: habituation, injections, comportement, prélèvements. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 6 animaux sont suffisants, nous n'utiliserons pas plus d'animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre d'animaux suffisant et nécessaire. Afin de limiter le nombre d'animaux, les études comportementales et moléculaires seront réalisées avec les mêmes groupes.

Raffinement

Préalablement à toutes études comportementales, les animaux sont (i) hébergés dans des cages à environnement enrichi dans notre animalerie, pendant une semaine, et (ii) soumis à des séances d’habituation, pendant 4 jours, afin de diminuer le stress lié au nouvel environnement et à la manipulation par l’expérimentateur. Pour les injections locales ou sous-cutanées, les rats sont préalablement anesthésiés. L’anesthésie adéquate des animaux est confirmée par l’absence de réflexe de retrait de la patte en réponse à un pincement de la patte postérieure. De plus, en cas d’injection d’un produit inflammatoire au niveau de la patte, le suivi post-opératoire, avec un examen minutieux de la zone d’injection, est poursuivi dans les jours suivants. L'état général de l'animal est surveillé tous les jours avec contrôle du poids. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. Le poids est mesuré quotidiennement. La nourriture sera humidifiée pour faciliter son absorption. Si la perte de poids excède 20% du poids initial, les animaux seront mis à mort par surdose d'anesthésique avec sédation préalable. Nous regarderons également l’apparence et le comportement (poils ébouriffés, animal prostré, posture anormale, vocalisations, agitation, toilettage). S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation.

Choix des espèces

La souche de rat Sprague-Dawley est un des modèles les plus couramment utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Nous utiliserons des animaux âgés de 5 à 8 semaines (125g à 300g). Les différentes études sur la douleur sont réalisées sur des animaux adultes. Les différents types de douleur trigéminale est majoritaire chez les personnes adultes. L'utilisation de rats dans les études comportementales sur la douleur est largement répandue et justifiée par plusieurs facteurs scientifiques et éthiques. Les rats partagent des similitudes biologiques et physiopathologiques avec les humains, en particulier dans le système nerveux et la réponse à la douleur. Leur système nociceptif (responsable de la détection de la douleur) est comparable à celui des humains, ce qui permet d'étudier des mécanismes de la douleur qui peuvent être extrapolés à l'homme.

24 rats vont être utilisés pour répondre aux questions de l'Agence européenne du médicament, adressées à un prestataire qui travaille pour un client industriel. Une partie des procédures se déroule sans réveil, le reste à un niveau de souffrance modéré, et tous les animaux sont tués par prélèvement de sang terminal en intracardiaque pour mesurer où le produit s'est distribué dans les tissus. Ils reçoivent des vésicules extracellulaires radiomarquées destinées à traiter les fistules périanales de la maladie de Crohn, avec pesée quotidienne pendant quatorze jours et deux prises de sang sur animal vigile. Le porteur constitue cinq groupes de quatre animaux, deux mâles et deux femelles, et affirme qu'il "n'est néanmoins pas possible de descendre sous ce seuil".

Objectifs

Plus de 1,9 millions de personnes à travers le monde sont atteints de la maladie de Crohn. Une des manifestations fortement handicapante et fréquente de cette pathologie (un tiers des patients après 20 ans d’évolution) est l’apparition de fistules périanales, fissure pénétrant dans la paroi intestinale avec une forte inflammation environnante. La prise en charge est multidisciplinaire (médicale et chirurgicale) avec des taux de récidive allant jusqu’à 40% à 5 ans. Notre client a pour objectif de proposer une alternative thérapeutique à base de particules naturellement libérées par les cellules appelées vésicules extracellulaires (VEs) qui ont été obtenus à partir de cellules souches issues du tissu adipeux. Ce traitement sera proposé quand les fistules des patients ont montré une réponse inadéquate à une thérapie conventionnelle. Ces VEs seront administrés de manière concomitante par voie sous cutanée le long de la paroi de la fistule et au niveau de son orifice, et en locale à l’intérieure de la fistule. Pour l’administration locale, les VEs seront mélangées à un polymère (Poloxamère 407), une grosse molécule formant un gel à la température du corps et permettant ainsi de retenir les EVs dans le site de la lésion dans des zones peu accessibles et de prolonger la libération du médicament. L’efficacité du traitement de VEs combinées à ce polymère a déjà été montrée dans plusieurs modèles préclinique de fistules digestives et intestinales chez le rat et le cochon. Ces VEs diluées dans une solution saline (pour l’injection sous cutanée) ou mélangées au Poloxamère 407 (pour l’administration locale) n’ont pas montré d’effets délétères. Notre projet vise aujourd’hui à répondre à une des questions posées par l’Agence Européenne du Médicament en vue de compléter le dossier réglementaire d’une future demande d’autorisation d’essais cliniques, à savoir quantifier la persistance des VEs après une administration unique et d’évaluer son élimination de la circulation sanguine ainsi que sa distribution dans les tissus. Les VEs étant difficilement traçables dans l’organisme, elles seront couplées à un élément radioactif (iode-125) afin de pouvoir les suivre et ainsi de répondre à ces questions.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à répondre aux questions scientifiques posées par l’Agence Européenne du Médicament notamment sur la persistance du produit de notre client au site d’intérêt, sur son élimination de la circulation sanguine et sa distribution dans les tissus ; et en cas de réponse positive de poursuivre le développement de ce médicament vers des études de toxicologie réglementaire. Le succès du développement de médicament permettrait une nouvelle solution thérapeutique pour les malades de la maladie de Crohn souffrant de fistules périanales récidivantes.

Procédures

Sur animal vigile : Pesée (une fois par jour, maximum 14 jours, 20 secondes) ; administration de composé analgésique (maximum 2 fois, 15 secondes) ; prélèvement de sang (2 fois maximum, 3 minutes). Sur animal anesthésié : Prélèvement de sang terminal en intracardiaque sous analgésie (1 fois, 5 min) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 2 fois, 5 minutes)

Impact sur les animaux

Stress lié à l’anesthésie à l’isoflurane ; stress et douleur légère liés aux administrations sous cutanées vigiles; stress lié à la manipulation vigile pour les pesées ; stress et douleur légère liés aux prélèvements de sang vigiles

Devenir

Mise à mort de tous les animaux de chaque procédure lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : Prélèvement d’organes, atteinte d’un point limite justifiant la mise à mort de l’animal, fin de l’étude.

Remplacement

Evaluer la pharmacocinétique, la biodistribution tissulaire nécessite d’être en présence d’un système biologique complexe et est impossible à faire in vitro. De plus, dans le cadre du développement du médicament de notre client, l’Agence du Médicament Européen a demandé que ces études soient complétées chez l’animal. L’animal est donc incontournable dans le cadre de cette étude.

Réduction

Les 5 groupes utilisés sont composés uniquement de 4 animaux (2 mâles et 2 femelles), la méthode de quantification par mesure radioactive étant très précise et répétable. Il n’est néanmoins pas possible de descendre sous ce seuil.

Raffinement

Afin de réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse au maximum, les animaux seront surveillés quotidiennement et des points limites les plus précoces possibles seront mis en place. Les animaux sont également hébergés en groupes sociaux harmonieux de 2 par cage dans un environnement enrichi comme la réglementation l'exige. Les injections et les prélèvements de sang effectués sur l’animal vivant le seront selon les bonnes pratiques de bien-être animal en termes de volumes, de matériel utilisé, d’anesthésie et de préhension des animaux.

Choix des espèces

Le développement préclinique du traitement de notre client a été effectué dans cette espèce et cette espèce a été demandée par l’Agence Européenne du Médicament pour les études complémentaires. Les rats seront utilisés à un âge de 6-7 semaines lors de leur entrée en étude, âge auquel le système immunitaire de ces animaux est considéré comme mature.

L'administration périnerveuse de toxine botulique est déjà en essai clinique chez des patients, et c'est son mécanisme d'action, resté inconnu, que ce projet cherche à établir chez la souris. 1 456 souris vont être utilisées, toutes tuées pour des analyses immunohistochimiques, 1 376 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 80 sous anesthésie sans réveil. Une chirurgie de dix minutes leur lèse un nerf, puis elles subissent jusqu'à vingt-trois tests d'évaluation de la douleur de dix minutes chacun, espacés de vingt-quatre heures. Le porteur écrit que chez certaines la douleur "ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude", et présente les tests nociceptifs comme des épreuves sur lesquelles les souris "gardent le contrôle" en retirant la patte.

Objectifs

La douleur neuropathique est définie par comme « une douleur consécutive à une lésion ou une maladie affectant le système somatosensoriel ». En France, la prévalence de la douleur chronique est de 31,7 %, dont 6,9 % avec des caractéristiques neuropathiques. Elles restent sous diagnostiquées en général, affectant considérablement la qualité de vie des patients et engendrant des problèmes socio-économiques importants. Les recommandations françaises actuelles préconisent l’utilisation de traitements antidépresseur ou anticonvulsivant en première intention, avec cependant des réponses thérapeutiques souvent faibles et des effets indésirables notables. D’autres alternatives thérapeutiques semblent émerger et notamment la toxine botulique de type A (TBA). Récemment une nouvelle voie d’administration émergeante, l’administration périnerveuse de TBA autour du nerf impliqué dans la douleur neuropathique est aujourd’hui en essai clinique. Cependant, le mécanisme d’action de la TBA lorsqu’elle est administrée en périnerveux reste non élucidé. La TBA est normalement recaptée par des terminaisons nerveuses. Ainsi, l’objectif de ce projet vise à comprendre comment la TBA administrée au niveau du nerf est captée pour ensuite permettre une action dans les neurones, cela permettra de comprendre son mécanisme d’action dans cette application locale nouvelle. Nous évaluerons également dans notre modèle animal si l’administration de TBA en périnerveux permet de prévenir l’installation d’une douleur neuropathique ou permet son soulagement une fois cette dernière installée et quel est son mécanisme dans la cadre pathologie. Cela permettra de proposer un mécanisme et une validité afin de développer cette voie application nouvelle en clinique.

Bénéfices attendus

Nous postulons que la TBA administrée en périnerveux pourrait non seulement avoir un potentiel thérapeutique dans le soulagement de la douleur neuropathique installée, mais pourrait également être bénéfique dans la prévention de son initiation et de son maintien. Cela laisse entrevoir une possibilité thérapeutique supplémentaire chez des patients douloureux chroniques dont l’arsenal thérapeutique actuel reste modeste. Cela pourrait apporter des preuves de concepts supplémentaires pour généraliser l'utilisation de la TBA en administration périnerveuse. De plus l’élucidation du mécanisme d’action de la TBA administrée en périnerveux pourrait également permettre révéler de nouvelles cibles thérapeutiques, mais aussi d’en comprendre davantage sur la physiopathologie de la douleur neuropathique

Procédures

Chirurgie d'une durée de 10 minutes sur animal anesthésié et une injection sous anesthésie d'une durée de 5 minutes. Les animaux subiront au maximum 23 tests d'évaluation de la douleur d'une durée de 10 minutes avec un délai de 24h entre chacun. Tous les animaux subiront une chirurgie pour prélèvement terminal d'une durée de 10 minutes.

Impact sur les animaux

Chez certains animaux, il y a présence de douleur qui ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude. Suite à la chirurgie, une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparaît dans les 48-72h après la chirurgie. Les chirurgies vont induire une réponse inflammatoire classique et attendue qui permet la mise en place de ces modèles. Certains animaux subiront des tests comportementaux nociceptifs sur lesquels ils gardent le contrôle (retrait de la patte). Un effet antidouleur de la toxine botulique A est attendu.

Devenir

A l’issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort pour réaliser des analyses immunohistochimiques.

Remplacement

Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l'analyse de l’action de la toxine botulique administrée en périnerveux dans un modèle de douleur neuropathique nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile. De plus, il n’existe pas d’études in vivo montrant la présence de nervi nervorum, les rares études décrivant cette structure étant faites par immunohistochimie sur tissus humain ou murin.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Les groupes expérimentaux concernant les expériences comportementales seront constitués au maximum de 14 souris mâles et 14 souris femelles. Pour les groupes expérimentaux concernant les analyses immunohistochimiques ils seront constitués au minimum de 4 animaux par groupe et au maximum de 10 selon les mises au point techniques nécessaires. Un calcul statistique a également été réalisé pour s’assurer que les résultats obtenus sont valides au plan statistique.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies des méthodes d’anesthésie et d'analgésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé.

Choix des espèces

Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, font de la souris un modèle pertinent. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés (habituation des animaux aux locaux à 8 semaines lorsqu’ils sont jeunes adultes puis début des procédures à partir de 10 semaines).