Procédures sans réveil
Étude de l’effet des molécules pro-coagulantes dans des modèles murins de maladie hémorragiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
776 souris porteuses de maladies hémorragiques familiales vont être utilisées, 429 d'entre elles opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, les 347 autres dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le test de saignement consiste en une incision suivie de trente minutes d'observation sous anesthésie, certaines souris recevant d'abord une biopsie de l'oreille puis trois injections rapprochées sur trois semaines. L'objectif déclaré est d'établir la preuve de concept de molécules pro-coagulantes déjà développées pour les patients hémophiles, les essais cliniques restant renvoyés au long terme. Le porteur justifie les actes finaux sans réveil par la collecte de quantités de sang qu'il qualifie d'"indispensables", et affirme que la coagulation "nécessite absolument un organisme vivant entier" pour être reproduite.
Objectifs
Les maladies hémorragiques familiales autre que l’hémophilie (maladie de Willebrand ou de Stuart Prower) restent assez méconnues. Ces maladies empêchent l’arrêt des saignements. En fonction des différents anomalies génétiques, les patients ont des formes plus ou moins sévères. Les traitements disponibles sont lourds et pas toujours efficaces. Récemment, des molécules pro-coagulantes avec différents mécanismes d’action sont été développées pour les patients hémophiles (une autre maladie hémorragique) avec des résultats prometteurs. Notre projet va consister à tester l’efficacité de ces nouvelles molécules médicamenteuses dans des modèles murins de ces maladies en utilisant des tests de saignement bien standardisés.
Bénéfices attendus
A court terme, les résultats de cette étude doivent permettre d'établir la preuve de concept de l'efficacité d’une ou plusieurs molécules dans des maladies hémorragiques autres que l’hémophilie. A long terme, ce projet pourra servir de base pour la mise en place d'essais cliniques visant à déployer les molécules identifiées comme efficaces chez les patients.
Procédures
Un groupe de souris reçoit une anesthésie, une administration rapide (3-5 seconds) de médicament, un test de saignement (30 minutes) et sont ensuite euthanasiées par les méthodes réglementaires. Les administrations (3-5 seconds) des médicaments se font selon différents protocoles, soit par une seule injection, soit par deux injections (a deux semaines d’intervalle). Les tests de saignement effectués toujours sous anesthésie consistent en une petite incision (2-4 seconds), puis les souris sont observées pour 30 minutes maximum. Un groupe des souris reçoit une biopsie une anesthésie, un prélèvement (rapide- moins de 5 seconds) et sont euthanasiées. Une biopsie a l’oreille rapide (
Impact sur les animaux
Stress léger lors de la préhension des animaux. Douleur légère et transitoire après les injections intrapéritonéales et sous-cutanées et après les prélèvements du sang et biopsies.
Devenir
Les actes expérimentaux finaux sont sans réveil du fait de la collecte de quantités importantes de sang, indispensables pour nos recherches scientifiques.
Remplacement
Le système de la coagulation est complexe, nécessite absolument un organisme vivant entier pour pouvoir être reproduit de manière pertinente. Actuellement, il n'existe pas de tests adaptés qui pourraient éviter le recours à l'animal.
Réduction
Afin de déterminer le plus petit nombre d’animaux approprié pour le projet, nous avons réalisé une analyse mathématique de puissance. Les hypothèses sous-jacentes à nos calculs sont basées sur la littérature existante et sur notre expérience en utilisant ces modèles en prenant en compte les variabilités de chaque test.
Raffinement
Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques. Les animaux ne sont jamais seuls dans les cages d’hébergement et ils ont un accès libre à la nourriture et à l'eau. L’ensemble des expériences sera effectué par une personne habilitée à expérimenter sur animaux et l'acte expérimental aura lieu principalement sous anesthésie et sans réveil. Au cours de ce projet, les opportunités de raffinement seront régulièrement ré-évaluées pour nous assurer de la mise en place rapide de tout nouveau développement technique qui interviendrait pendant la période du projet. Les souris sont sous observation quotidienne (une fois pendant le weekend) et la quantification des points limites, susceptibles d'entraîner une procédure d’euthanasie immédiate de l'animal, sont strictement appliquée.
Choix des espèces
Ce projet fait appel à des modèles murins des maladies hémorragiques familiales déjà développés. Ces modèles ont d’ores et déjà montré leur pertinence en tant que modèles des pathologies humaines, sans pourtant que ces souris manifestent des saignements spontanées. Les souris adultes, entre 8 et 20 semaines d’âge, des deux sexes seront utilisées.
Decoder le role des astrocytes dans le traitement visuel du colliculus superieur
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Le crâne est ouvert pour une injection intracérébrale d'une demi-heure, puis une lentille ou une fenêtre de verre est implantée au cours d'une opération d'une heure et demie. Vient ensuite un mois d'isolement, dont le porteur indique qu'il "peut induire une dépression", avant quatre heures d'imagerie sous stimulation visuelle. 464 souris sont concernées, 89 opérées sans jamais se réveiller, 15 dans des procédures légères, 270 modérées et 90 sévères. Toutes finissent par une perfusion intracardiaque de quinze minutes, thorax ouvert, que le porteur justifie en écrivant qu'elles "ne pourront être réutilisées".
Objectifs
Le cerveau est constitué de neurones ainsi que d’autres cellules au moins aussi nombreuses : les astrocytes. Bien que les astrocytes aient été longtemps considérés comme cellules de soutien pour les neurones, il est désormais admis qu’ils participent activement aux fonctions cérébrales en interagissant étroitement avec les neurones. Même si leur implication dans le traitement des informations au sein de certaines régions sensorielles du cerveau a été mise en évidence, leur rôle dans le traitement sensoriel du message visuel par le colliculus supérieur, une structure clé du système visuel, reste encore largement inexploré. De récentes études ont montré que dans les couches visuelles du colliculus supérieur, les astrocytes forment des réseaux particulièrement étendus comparés aux astrocytes d'autres régions du cerveau. Il a été montré que ces réseaux astrocytaires jouent un rôle crucial dans la mise en place des propriétés fonctionnelles des neurones spécifiquement dans cette région. L’objectif de ce projet est de caractériser plus précisément le rôle des astrocytes dans le traitement de l'information visuelle au sein du colliculus supérieur en étudiant leurs propriétés fonctionnelles ainsi que les interactions entre neurones et astrocytes.
Bénéfices attendus
D’un point de vue fondamental, ces travaux permettront d’enrichir nos connaissances concernant les propriétés fonctionnelles des astrocytes ainsi que les mécanismes neurogliaux qui sous-tendent le traitement des informations visuelles. D’un point de vue plus translationnel, l’étude du rôle des astrocytes dans le traitement visuel offrira de nouvelles pistes pour comprendre la contribution des astrocytes dans les pathologies cérébrales visuelles.
Procédures
Injection intracérébrale (environ 30 min, une seule fois par souris). Implantation d’une lentille (environ 1h30, une seule fois par souris). Injection intracérébrale couplée à l’implantation d’une fenêtre crânienne (environ 1h30, une seule fois par souris). Imagerie calcique in vivo (environ 4h, une seule fois par souris). Perfusion intracardiaque (environ 15 min, une seule fois par souris).
Impact sur les animaux
L’injection intracérébrale (environ 30 min, une seule fois par souris) nécessite une incision de la peau au-dessus du crâne ainsi qu’une ouverture du crâne, ce qui peut provoquer une douleur. L’implantation d’une lentille (environ 1h30, une seule fois par souris), l’implantation d’une fenêtre crânienne (environ 1h30, une seule fois par souris) et les expériences d’imagerie calcique (environ 4h, une seule fois par souris) nécessitent une incision de la peau du crâne ainsi qu’une ouverture du crâne ce qui peut provoquer une douleur. L’isolement (1 mois, une seule fois par souris) peut induire une dépression. La perfusion intracardiaque (environ 15 min, une seule fois par souris) nécessite une incision de la peau, et une ouverture de la cage thoracique ce qui provoque une douleur.
Devenir
Les animaux ne pourront être réutilisés à l'issue de chaque procédure et seront donc mis à mort.
Remplacement
Nos précédents résultats ont montré que les astrocytes jouent un rôle crucial dans la mise en place des cartes fonctionnelles dans le Colliculus supérieur. Nous souhaitons maintenant étudier les propriétés fonctionnelles des astrocytes et neurones à l’échelle de la cellule unique pendant une stimulation visuelle. Pour cela, il n’est pas possible de remplacer les enregistrements sur le cerveau intact par des simulations ou des cultures de cellules du cerveau.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons optimisé la taille des lots au nombre minimum d'animaux permettant une analyse statistique pertinente des résultats. Pour les expériences ex vivo, plusieurs régions d’intérêt seront étudiées sur les tranches de cerveau provenant du même animal. De plus, dans les expériences utilisant des agents pharmacologiques, un animal sera son propre témoin en comparant les données avant et après le traitement, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux de manière significative.
Raffinement
Les animaux seront logés à plusieurs dans des cages contenant du coton pour faire leur nid ainsi qu’un abri. Durant les procédures expérimentales, nous utiliserons les analgésiques et anesthésiques appropriés pour limiter au maximum l’inconfort des animaux. Suite à l’injection intra-corticale ou la pose de la fenêtre crânienne, les animaux seront surveillés quotidiennement et suivis à l’aide d’une grille de score prenant en compte l’apparence et le comportement de l’animal afin de détecter tout indicateur de souffrance et décider si besoin l’arrêt de l’expérimentation et l’euthanasie. Lors des chirurgies, pour pallier à la douleur induite par l'incision de la peau au- dessus du crâne, de la lidocaïne sera injectée auparavant. Pour certaines expériences, les enregistrements seront réalisés à travers le crâne aminci afin d’éviter une incision de l’os.
Choix des espèces
Nous utiliserons le modèle souris car son développement cérébral est proche de celui de l’homme, et les propriétés fonctionnelles des neurones et astrocytes ont été bien décrites dans le système visuel, ce qui permettra une meilleure comparaison de nos résultats avec ceux de la littérature. De plus, notre équipe utilise couramment cette espèce et possède l’expertise technique appropriée. Par ailleurs, la période de gestation est courte et le nombre d’embryons par femelles gestantes élevé, ce qui nous permet d’obtenir un nombre d’animaux suffisant pour plusieurs expériences à partir d’un petit nombre de parents. Enfin, la souris permet de nombreuses manipulations génétiques à la différence d'autres mammifères. Les animaux seront utilisés à partir de l’âge de 50 jours afin d’effectuer nos expériences dans un système visuel mature où les cellules et réseaux sont constitués.
Etude de l’effet de la ventilation liquidienne totale sur l’œdème pulmonaire induit par la réanimation cardio-pulmonaire chez le porc
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Quand la circulation ne repart pas au bout de trente minutes de réanimation, le porc est tué. 40 porcs juvéniles de 30 kg vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie générale, tués avant tout réveil, après une chirurgie, un arrêt cardio-respiratoire provoqué, un massage cardiaque et trois heures de surveillance. L'objet est de comparer une ventilation liquidienne totale à la ventilation mécanique classique sur les lésions pulmonaires que la réanimation elle-même provoque. Trente animaux suffiraient au calcul statistique annoncé, dix de plus sont prévus pour couvrir des "pertes chirurgicales ou techniques" que le porteur attribue à la difficulté du modèle.
Objectifs
L’apparition d’une dysfonction respiratoire est fréquente chez les patients réanimés après un arrêt cardiaque. Cette dysfonction s’explique par l’induction d’un œdème pulmonaire lors de la réanimation cardiopulmonaire. Si les compressions thoraciques et la ventilation mécanique sont indispensables pour permettre le retour à une activité circulatoire spontanée, elles peuvent en effet provoquer l’apparition de lésions pulmonaires sévères. Dans ce contexte, l’effet de la ventilation liquidienne totale (VLT) serait une approche thérapeutique pour la prévention de l’apparition de ces lésions, en plus de l’effet neuroprotecteur de l’hypothermie qu’elle est capable d’induire, telle que démontré antérieurement par le laboratoire. En effet, la VLT s’appuie sur un dispositif médical capable d’assurer les échanges d’oxygène et de dioxyde de carbone à chaque cycle respiratoire. L’objectif du présent projet est de comparer l’effet de la VLT et de la ventilation mécanique conventionnelle (VMC) sur les lésions pulmonaires induites après le massage cardiaque. Son effet a été étudié dans des modèles animaux de détresse respiratoire, pour sa capacité à favoriser le recrutement alvéolaire à basse pression et à améliorer les échanges gazeux, mais pas dans le modèle présenté dans ce projet.
Bénéfices attendus
Nous évaluerons les paramètres hémodynamiques (fréquence cardiaque, pression artérielle), gazométriques (pression partielle en oxygène et dioxyde de carbone dans les poumons) et respiratoires. L’intensité des lésions pulmonaires sera quantifiée par analyse histologique. Ainsi nous comparerons les bénéfices entre les différentes modalités de ventilation. La VLT favorisant le recrutement alvéolaire à basse pression et améliorant les échanges gazeux, nous supposons que les 2 groupes soumis à la VLT présenteront des bénéfices supérieurs par rapport au groupe VMC.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale et à un arrêt cardio-respiratoire. Des prélèvements sanguins à l'état anesthésié seront réalisés tout le long de la procédure. Les animaux seront mis à mort au terme des 3 heures de suivi après le début réanimation cardio pulmonaire.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les échecs de réanimation sont possibles chez tous les animaux, puisque cela fait partie des conséquences d’un arrêt cardiaque. En cas d’absence de reprise de la circulation spontanée au bout de 30 min, la réanimation cardiopulmonaire sera interrompue. La mise à mort sera réalisée dans ce contexte précis.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin de protocole.
Remplacement
L’arrêt cardiaque induit une dysfonction de plusieurs organes après la réanimation. Le caractère intégratif de l’affection ne permet pas de la reproduire in vitro ou in silico (absence de Remplacement possible). L’étude de médicaments ou dispositif permettant de lutter contre ses séquelles doit se faire in vivo, en utilisant des animaux à des fins scientifiques.
Réduction
Le critère de jugement principal sera la compliance pulmonaire. D’après des travaux préliminaires, considérant une compliance pulmonaire en fin de protocole de 0,72 ml/cmH2O/kg dans le groupe « ventilation conventionnelle » et une compliance pulmonaire de 1,11 ml/cmH2O/kg dans les groupes « ventilation liquide », il faudra 10 animaux dans chacun des 3 groupes. Le calcul a été déterminé par une approche statistique. Ce calcul permet d’utiliser le nombre d’animaux le plus faible possible pour conduire le projet présenté. Des pertes chirurgicales ou techniques sont possibles chez 10 animaux correspondant à 30% de l’effectif total pour le modèle porcin d’arrêt cardiaque, compte tenu de la difficulté du modèle. Nous envisageons donc d’inclure un total de 40 animaux.
Raffinement
Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés dans des boxes avec des copeaux de bois au sol et enrichissement avec des jouets en plastique. Les animaux seront maintenus sous anesthésie générale, avec administration d’antalgiques puissants, tout au long de la procédure.
Choix des espèces
Notre choix s’est porté sur l’espèce porcine compte tenu de sa proximité avec l’homme au vu de sa masse corporelle, de son anatomie cardiaque et des valeurs usuelles des paramètres hémodynamiques systémiques et cérébraux. Porcs juvéniles de 30 kg car à ce poids les porcs sont plus manipulables. Les valeurs des paramètres hémodynamiques étudiés sont similaires aux valeurs observées chez l’homme.
Etude de la fixation d’anticorps thérapeutiques sur les cellules sanguines de souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Tuées sans reprise de conscience par le prélèvement lui-même, 200 souris vont être utilisées dans une procédure unique de quelques minutes, une ponction du cœur sous anesthésie. Le porteur explique qu'après cette ponction le volume sanguin restant ne permet pas à l'animal de survivre dans de bonnes conditions. Le sang recueilli est mis en commun pour tester la fixation d'une série d'anticorps sur les cellules sanguines de souris, première étape d'un programme visant un traitement des caillots accompagnés d'inflammation. Sur le remplacement, il écrit que des expériences de laboratoire seront faites "autant que possible", puis qu'il reste "nécessaire" de tester la fixation des anticorps sur des cellules sanguines de souris.
Objectifs
Le but du projet est de développer un traitement innovant visant à lutter contre les phénomènes de caillots sanguins avec inflammation. Nous travaillons plus particulièrement sur les mécanismes de l’agrégation entre les globules blancs et les plaquettes lors de la thrombose. L’objectif du programme de recherche vise à démontrer la preuve de concept préclinique en utilisant notre molécule. Le but de ce projet est de tester la fixation de nos molécules sur les cellules sanguines de souris.
Bénéfices attendus
Nous avons pour objectif à court terme de développer une molécule bloquant les interactions excessives et anormales entre les globules blancs et les plaquettes sans augmenter le risque de saignement. Cette approche est une stratégie thérapeutique particulièrement innovante et unique. Elle pourrait représenter un traitement possible pour certaines maladies cardiovasculaires et auto-immunes.
Procédures
Les souris seront anesthésiées, un prélèvement sanguin sera réalisé en ponction intracardiaque sous anesthésie . Il s'agit d'une procédure sans réveil. Une seule procédure par animal (occurence par animal de chaque intervention => 1 fois) pendant une durée de quelques minutes.
Impact sur les animaux
Une injection intrapéritonéale d'anesthésique (qui peut entrainer un stress et une douleur légère de courte durée).
Devenir
La ponction cardiaque nécessite la mise à mort de l’animal car le volume sanguin restant ne sera pas suffisant pour que l’animal survive dans de bonnes conditions.
Remplacement
Des expériences au laboratoire seront réalisées pour remplacer autant que possible les expériences pour lesquelles des souris doivent être utilisées. Il est cependant nécessaire de tester la fixation des anticorps sur des cellules sanguines de souris.
Réduction
Les molécules susceptibles d’être évaluées dans cette étude de fixation des anticorps aux cellules de sang de souris murines seront évaluées en amont afin d’en diminuer le nombre. En effet, les molécules n’ayant pas les propriétés requises seront écartées. L’étude sera arrêtée si les expérimentations initiales invalident l’hypothèse de travail. Un nombre minimal d’animaux par expérience est utilisé afin de pouvoir exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences. Le sang des animaux sera collecté et poolé afin de pouvoir tester la fixation d’une série d’anticorps. Le nombre d’animaux a été calculé de manière à obtenir une quantité suffisante de sang pour chaque expérience.
Raffinement
Nombre d’individus par cage : 5 souris par cage pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de stress engendrés par une surpopulation. Stratégies d’enrichissement pour assouvir leur besoin ludique (blocs de cotons) Quarantaine et acclimatation : après réception dans l’animalerie, les souris sont acclimatées pendant 6 jours avant la procédure expérimentale. Pendant cette période, le personnel de l’animalerie surveille leur bien-être quotidien.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme. Les animaux C57BL/6 seront des adultes âgés de 8 à 20 semaines. Il s’agira de mâles et de femelles. Cette tranche d’âge se justifie par les modèles de pathologie qui seront utilisés pour la suite du projet.
Cinétique microglie AVC
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
182 souris vont être utilisées, dont 152 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour le prélèvement du cerveau. 128 d'entre elles subissent un accident vasculaire cérébral provoqué par injection de thrombine, une intervention d'une heure et demie, suivie d'IRM, certaines recevant en plus un cathéter intraveineux, des microparticules d'oxyde de fer ou des injections de microglie fluorescente. Le porteur indique un affaiblissement de la patte avant gauche, une perte de poids et des déficits fonctionnels ou cognitifs possibles, avec un suivi allant jusqu'à trente jours après l'accident. L'effectif retenu inclut 15 % d'animaux comptés pour l'entraînement des expérimentateurs et les pertes, marge chiffrée puis rapportée à l'"aisance" des équipes.
Objectifs
L'accident vasculaire cérébral (AVC) est l'une des principales causes d'invalidité et de décès dans le monde. L’AVC ischémique (AI) représente environ 85% des AVC, il est majoritairement causé par une thrombose ou une embolie entrainant une diminution de l’afflux sanguin vers le cerveau. Peu après l'apparition de l'AI, des phénomènes d’hypoxie et inflammatoires entrainent une dégénérescence neuronale responsable de déficits à long terme. La majorité des études précliniques sur l’AI se sont concentrées sur des temps précoces et sur la mesure du volume de la lésion, définitif 24 à 48 heures après le début de l'AVC, comme critère d'évaluation principal. Cependant, l'AI peut être considéré comme une maladie chronique. En effet, les patients peuvent souffrir de séquelles des mois, voire des années après la phase aigüe. Ainsi, au moins 1/3 des patients développent une dépression et une fatigue en post-AVC. L'origine de ces symptômes n'est pas claire et peut être difficile à traiter, ce qui en fait une priorité de la recherche sur l'AVC. Malgré cela, nos connaissances sur les phases subaiguës et chroniques de l'AI sont très limitées à ce jour. Il a été suggéré que l'apparition de la dépression et de la fatigue post-AVC pourrait être liée à une dérégulation de la réponse immunitaire. La microglie joue un rôle dans la modulation de la neurogenèse et de l'angiogenèse post-AVC. Dans ce projet, nous examinerons la cinétique temporelle et la dynamique spatiale de la microglie après un accident vasculaire cérébral dans les phases aigues et chroniques post-AVC. Une meilleure compréhension de la dynamique microgliale post-AVC pourrait conduire à l'identification de nouvelles stratégies ciblant la microglie pour combattre les séquelles à long terme.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension de la dynamique microgliale post-AVC pourrait conduire à l'identification de nouvelles stratégies ciblant la microglie pour combattre les séquelles à long terme.
Procédures
Une partie des animaux recevra une injection d'un agent dépletant la microglie (n=48, durée de la procédure 15min) pour étudier l'impact de la dépetion. Une partie des animaux (n=64) recevra une injection 24 heures avant AVC d'un agent fluorescent et de microbilles fluorescentes (durée de la procédure : 1 heure) pour étudier la dynamique de la microglie et ses interactions avec les macrophages périvasculaires et des méninges. Une partie des animaux fera l'objet d'une pose de cathéter intraveineux 24 heures avant AVC pour l'injection de MPIO (microparticules d'oxyde de fer) (n=10, durée de la procédure : 15 minutes) pour évaluer la dynamique de la microglie. Le modèle d'ischémie thromboembolique cérébrale focale par injection de thrombine sera réalisé sur 128 animaux (durée de la procédure 1,5 heures) et les lésions cérébrales seront évaluées par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM) (n=128, durée de la procédure : 15min). Une partie des animaux (n=10) sera suivi en imagerie IRM à J7, J15, J30 post-AVC pour évaluer la localisation de MPIO et donc la localisation de la microglie. Une partie des animaux recevra une injection de microglie fluorescente (n=60, durée de la procédure 1h). Une partie des animaux (n=10) sera suivi en microscopie biphotonique à A 2h, J2, J15, J30 post-AVC pour observer la dynamique de la microglie.
Impact sur les animaux
Chirurgies : Certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la chirurgie. Un affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée par l'AVC) qui disparaît dans la première semaine après l'AVC. Ils peuvent également présenter une perte de poids, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs. Injections : certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la réalisation du geste qui disparait dans les jours suivant la procédure. Imagerie : Certains animaux peuvent montrer des signes de stress lié à la nuisance sonore durant les procédures d'imagerie, une perte de masse corporelle après les anesthésies.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures, les animaux seront mis à mort pour récupération de leur cerveaux pour analyses ultérieures.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans l'étude de la réponse immunitaire en post-AVC au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, de nos travaux précédemment publiés, de la littérature et de tests statistiques. Afin d'avoir une idée de la numérotation des groupes, un test de numérotation a été effectué. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de l'aisance des expérimentateurs. Un nombre moyen pour chaque groupe, comprenant un pourcentage d'entrainement et de perte dans ce nombre (15%) a donc été défini. De plus, l'utilisation de techniques d'imagerie non invasives permet de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Nous avons indiqué pour chaque procédure expérimentale les points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7/7, cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l'accès à l'eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose et des carrés de cotons seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l'angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu'à la mise à mort de l'animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences vasculaires et en immunologie. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’homme et la souris. Le fonctionnement du système immunitaire de la souris se rapproche de celui de l'homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la dynamique de microglie dans les AVC ischémiques. Les souris utilisés seront âgées de 8 à 12 semaines et auront un poids d'environ 20 g. Nous réaliserons nos modèles sur des adultes afin de pouvoir pratiquer sur des animaux du même stade de développement que ceux utilisés en majorité dans les modèles d’AVC.
Effets neuromodulateurs d’une stimulation électrique transpinale non-invasive à courant continu sur la Sclérose Latérale Amyotrophique. Etude sur la souris SOD1(G93A).
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumises à six heures de chirurgie et d'enregistrements électrophysiologiques sous anesthésie profonde, une partie des 820 souris utilisées est tuée sans reprise de conscience, 340 d'entre elles relevant de procédures sans réveil et 480 d'un niveau de souffrance modéré. D'autres reçoivent une injection de virus dans un muscle ou une stimulation électrique de la moelle épinière de quinze minutes. Toutes portent une mutation reproduisant la sclérose latérale amyotrophique et sont tuées entre 45 et 55 jours pour que la moelle épinière soit prélevée, le porteur précisant aussi que la mise à mort évite de "laisser les symptômes moteurs se développer". La stimulation transpinale est présentée comme une méthode "non-invasive et non douloureuse" pour de futurs patients, alors que l'évaluer suppose ici d'ouvrir et de tuer des souris.
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), appelée aussi Maladie de Charcot, est une maladie neurodégénérative touchant spécifiquement des cellules de la moelle épinière, appelées motoneurones, qui commandent les muscles. La maladie se déclare à l’âge adulte, elle provoque la paralysie du patient et son issue est fatale. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. La stimulation électrique transpinale à courant continu (tsDCS) est une méthode non-invasive et non-pharmacologique, qui agit sur les cellules de la moelle épinière, et dont les effets bénéfiques ont déjà été montrés en réhabilitation motrice, dans le traitement du syndrome de la jambe sans repos, et dans le traitement de la douleur. Le présent projet a pour objectif d'étudier si la tsDCS peut aussi avoir une éffet bénéfique dans le traitement de la SLA. Cette étude sera réalisée dans un modèle murin de la SLA. Comme cette étude implique non seulement les cellules qui commandent les muscles mais aussi les cellules environnantes qui jouent un rôle important dans l'évolution de la maladie (autres neurones et cellules gliales dans la moelle épinière, cellules musculaires), il est nécessaire d'effectuer l'étude sur des animaux afin de préserver les relations anatomiques et fonctionnelles entre ces différents types de cellules. Il n'y a pas, pour ce projet, d'alternative à l'utilisation d'animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de démontrer si la tsDCS a un effet bénéfique ou non sur les cellules de la moelle épinière qui commandent les muscles (motoneurones) à un stade précoce de la SLA. Dans le cas où l'évolution de la maladie serait ralentie dans les motoneurones par la tsDCS, nous pourrions proposer cette méthode non-invasive et non douloureuse comme moyen thérapeutique utile dans la prise en charge des patients SLA.
Procédures
Stimulation électrique transpinale à courant continu (tsDCS) sous analgésie et anesthésie profondes: cette intervention dure 15 minutes et ne sera réalisée qu'une seule fois par animal. Chirurgie et enregistrements électrophysiologiques sous analgésie et anesthésie profondes: cette intervention dure au total 6 heures environ et ne sera réalisée qu'une seule fois par animal. Injection intramusculaire d'un virus sous analgésie et anesthésie profondes: cette intervention dure 15 minutes et ne sera réalisée qu'une seule fois par animal.
Impact sur les animaux
Certains animaux recevront une injection intramusculaire. La douleur éventuelle générée par cette injection sera prévenue par un traitement antidouleur qui sera donné systématiquement avant l'injection, et pendant les deux jours qui suivent durant lesquels les animaux seront surveillés afin de vérifier qu'ils ne présentent aucun signe de souffrance. Toutes les autres interventions (chirurgie et électrophysiologie, tsDCS) seront réalisées sous analgésie et anesthésie profondes pour éviter toute douleur, et les animaux seront mis à mort dès la fin de l'intervention en maintenant la profondeur de l'analgésie et l'anesthésie.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de pouvoir prélever la moelle épinière et l'étudier, et pour ne pas laisser les symptômes moteurs se développer.
Remplacement
L'étude des effets de la tsDSC sur les propriétés électriques des motoneurones ne peuvent s'étudier que sur l'animal vivant entier pour plusieurs raisons: 1°) la SLA est une maladie de l'adulte, or à ce stade les motoneurones spinaux, qui sont les plus grandes cellules du système nerveux central, ne peuvent pas s'étudier dans des systèmes cellulaires in vitro dans lesquels ils ne survivent pas (tranches de moelle épinière, moelle épinière entière ex-vivo). 2°) Les propriétés des motoneurones spinaux dépendent étroitement de leur environnement cellulaire en particulier des circuits spinaux, des astrocytes (mais aussi des oligodendrocytes et des cellules gliales) et de leur interaction avec les fibres musculaires à la périphérie. 3°) Les lignes de champ électrique produites par la tsDSCT dépend étroitement des propriétés électriques et géométriques des tissus environnants les motoneurones et la moelle épinière.
Réduction
Chaque procédure est conçue pour apporter le plus possible de résultats avec des lots dont les effectifs ont été réduits au minimum pour obtenir des résultats fiables. Les données obtenues dans chaque procédure seront soumises à des analyses statistiques modernes qui permettront de déterminer quels sont les effets de la stimulation tsDCS sur les différents paramètres considérés.
Raffinement
Les expériences sont conçues pour apporter le moins d'inconfort possible aux animaux. Toutes les interventions (stimulation électrique transpinale à courant continu, injection intramusculaire de virus, chirurgie et enregistrements électrophysiologiques) seront réalisées sous analgésie et anesthésie profondes. Un traitement antidouleur sera donné systématiquement avant l'injection intramusculaire d'un virus, et pendant les deux jours qui suivent l'injection pendant lesquels les animaux seront surveillés afin de vérifier qu'ils ne présentent aucun signe de souffrance. Dans les autres interventions, sans réveil, la profondeur de l'analgésie et de l'anesthésie seront surveillées en continu en utilisant des points limites appropriés. Si la souffrance ne pouvait pas être soulagée, les animaux seraient immédiatement mis à mort. De plus, les expériences sont conçues pour obtenir le plus d'informations possibles sur chaque animal.
Choix des espèces
La découverte d’un lien génétique chez certains patients a permis de développer des modèles murins de la SLA. Nous utiliserons ici des souris transgéniques modèles de la SLA. Histologiquement, ces souris présentent une dégénérescence progressive des neurones moteurs spinaux et aussi des neurones du cortex moteur, reproduisant les atteintes spinales et corticales caractéristiques de cette maladie. Cette souris est un modèle de choix pour étudier les mécanismes physiopathologiques de la SLA et l'effet de thérapies potentielles, comme dans ce projet, la stimulation électrique transpinale à courant continu (tsDCS). Les trois procédures du projet se termineront lorsque les souris seront âgées de 45 à 55 jours. Dans cette tranche d'âge, les animaux sont adultes mais les symptômes moteurs de la SLA ne sont pas encore apparus. Nous voulons en effet étudier les conséquences électrophysiologiques et cellulaires d'une stimulation tsDCS chez un animal mature (adulte) avant l'apparition des symptômes.
Mise en place d’un modèle murin de xénogreffe orthotopique de glioblastome 3/3
- Recherche appliquée
- Cancers
Une tumeur cérébrale humaine implantée dans la boîte crânienne au cours d'une chirurgie de trente minutes, puis quatre semaines d'imagerie hebdomadaire sous anesthésie et des transports en voiture entre trois établissements : 307 souris subissent ce protocole, 60 tuées sans réveil, 188 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 59 un niveau sévère. Cent d'entre elles sont gardées vivantes pour la formation du personnel, les autres tuées aux points limites ou en fin de projet. L'objectif déclaré est de mettre au point un modèle pour tester la réoxygénation des tumeurs et leur sensibilisation à la radiothérapie, bénéfice que le porteur formule au conditionnel en deux lignes. Ce troisième volet reprend le même effectif de 307 souris que le volet précédent, publié le même jour, sans que la répartition entre les deux soit expliquée.
Objectifs
Le glioblastome multiforme est la tumeur cérébrale primitive la plus fréquente et la plus agressive chez l’adulte. La médiane de survie globale varie de 15 à 18 mois et le taux de survie à 5 ans n’excède pas 5%. Le traitement de référence consiste en la chirurgie la plus complète possible suivie de l’association d’une radiothérapie et d’une chimiothérapie par le témozolomide. Malgré ce protocole thérapeutique, la majorité des patients rechute dans un délai médian de 8-9 mois. Il est donc aujourd’hui indispensable d’améliorer ce protocole. Dans cette démarche, il est connu que les glioblastomes sont caractérisés comme des tumeurs résistantes à l’irradiation. Cette résistance repose en partie sur le manque d’oxygène (hypoxie) au cœur de la tumeur et il a été démontré dans de nombreuses études que l’oxygénation des tissus représente un facteur prédictif de réponse à l’irradiation. Dans ce contexte, ce projet aura comme objectif la mise au point d’un modèle orthotopique de glioblastome, c’est-à-dire l’induction d’une tumeur au sein même de la cavité crânienne chez la souris afin d’évaluer la réoxygénation cellulaire et la radiosensibilisation et ainsi d’améliorer la survie des patients atteints de glioblastome. Ce projet se déroulera dans 3 établissement utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait contribuer à optimiser le traitement actuel des patients atteints de glioblastome en sensibilisant les tumeurs aux effets de la radiothérapie pour améliorer la survie de ces patients.
Procédures
A) Dans l’Etablissement Utilisateur (EU) 1/3 nous ferons une Chirurgie 1 : une injection analgésique d’une minute sur animal vigile, puis une anesthésie générale gazeuse, suivie d’une chirurgie de 30 minutes avec une injection d’une minute et suture sous anesthésie générale et locale. B) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Imagerie 1 : une injection d’une minute sur animal vigile, puis imagerie de 30 minutes sous anesthésie générale pour l’observation de la croissance tumorale. Puis, une injection sur animal sur animal vigile, suivi 24h après d'une imagerie de 15 minutes sous anesthésie générale. Cette procédure sera réalisée à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. C) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Imagerie 2 : Imagerie sous anesthésie générale de 2 heures pour l’observation de la croissance tumorale et de l’hypoxie à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. D) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Chirurgie 2 : une injection d’une minute d’un anesthésique général sur animal vigile, puis des injections d’une minute d’un anesthésique local et d'un analgésique, puis une chirurgie de 2 minutes, suivi d’une perfusion de 5 minutes. E) Dans l’EU 3/3 nous ferons une Imagerie 3 : Imagerie sous anesthésie générale de 90 minutes pour l’observation de l’hypoxie à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. F) Dans l'EU 2/3 un groupe subira les procédures A et F. Un autre subira les procédures A, puis B, suivi D puis F. Un autre subira les procédures A, puis C, suivi D puis F. Un autre subira les procédures : A, puis C, D et E puis F. G) Dans l’EU 1/3 et 2/3 nous ferons injection d’une minute sur animal vigile à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines.
Impact sur les animaux
La mise en place des modèles pourra induire des douleurs/infections suite à la chirurgie associée à une potentielle perte de poids transitoire et une déshydratation. Le transport des animaux entre les trois EU pourra induire un stress. Les injections nécessaires à l’imagerie pourront entrainer un stress chez l’animal se traduisant par des problèmes respiratoires. Les suivis par imagerie pourront induire du stress suite aux anesthésies répétées. La croissance des tumeurs pourra entrainer une perte de poids excessive et des effets neurologiques.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort lorsque les points limites sont atteints ou à la fin du projet, sauf les animaux utilisés pour la formation ou le maintien des compétences du personnel.
Remplacement
Les études préliminaires réalisés sur cellules cancéreuses ont permis de valider 2 types de cellules pour notre modèle de glioblastome chez la souris. Ce modèle chez l’animal permet de mimer au plus proche la complexité d'un environnement tumoral chez l'individu (vascularisation, inflammation…).
Réduction
Les études préliminaires sur cellules ont également permis de réduire le nombre de lignées à 2 afin de réduire le nombre de groupe utilisant des animaux. La mise en place du modèle permettra également de réduire le nombre d’animaux utilisées dans de futurs projets étudiant l’amélioration de la radiothérapie sur un modèle de glioblastome. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé avec suffisamment d’animaux pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente par les 2 méthodes d’imagerie décrites. Ce projet utilise des méthodes d’imagerie non-invasives permettant de suivre un même animal au cours du temps réduisant le nombre d’animaux
Raffinement
Chaque protocole expérimental prend en compte un potentiel impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour justifier un arrêt de l'expérience en cours. Les animaux seront hébergés à 5-8 souris par cage (souris issues de différents groupes de traitement), dans des cages à couvercle filtrant avec de la litière, des frisures de papier kraft, des tubes de coton (nidification), des bâtons et des tunnels. Les procédures expérimentales seront réalisées par des manipulateurs expérimentés. Les animaux seront acclimatés à leur hébergement deux semaines avant de démarrer les procédures. Des anesthésies et des analgésies sont appliquées dès que possible pour éviter tout risque de stress et de souffrance. Des points limites ont été établis pour éviter toute souffrance animale et seront évalués 3 fois par semaine. Si une souris présentait des signes d’effet(s) secondaire(s) ou de symptômes révélant un inconfort ou l’apparition de douleur, le vétérinaire désigné sera contacté pour venir voir les animaux, poser un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées. Les méthodes d’imagerie utilisées sont reconnues non-invasives et non-irradiantes. Les animaux seront transportés en voiture entre les trois Etablissements Utilisateur (temps maximum de 10 minutes entre les EU1 et EU2 et de 30 minutes entre les EU2 et EU3). Pour cela, les animaux seront mis dans des boites de transport avec un filtre sanitaire, de la nourriture, de l’eau gélifiée, des frisures de papier et du matériel de nidification avec ajout de chaufferettes sous les boites.
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus utilisée en expérimentation en oncologie. La raison la plus importante du choix de la souris pour notre étude est sa similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Le modèle de souris choisi permettra l’implantation de lignées cancéreuses humaines et le développement des tumeurs orthotopiques. Les animaux utilisés seront adultes c’est-à-dire à partir de 6/8 semaines car ils possèdent un poids et un développement optimales pour les actes subit (chirurgie, injections…).
Etablissement d’un modèle d’injection intracérébroventriculaire chez le souriceau
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
320 souriceaux vont être utilisés, tous tués à l'issue, 128 anesthésiés puis tués avant tout réveil et 192 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À deux ou trois jours de vie, chacun reçoit une injection dans les ventricules cérébraux, d'un colorant ou d'un fragment d'ADN ou d'ARN synthétique, sous anesthésie par hypothermie ou par gaz, les deux méthodes étant comparées entre elles. Une partie est suivie jusqu'à trente jours après l'injection, puis autopsiée pour prélever le cerveau, le foie et les reins. Le porteur conclut qu'il n'existe "pas de méthode alternative" pour évaluer une thérapie contre les épilepsies infantiles, au motif que des neurones en culture ne présentent pas de crise spontanée, alors que ce projet ne mesure aucun effet thérapeutique.
Objectifs
L’épilepsie est une maladie des neurones dont le fonctionnement anormal entraîne des décharges électriques brusques et excessives – la crise épileptique. L’épilepsie infantile est une maladie rare mais sérieuse qui apparaît habituellement entre l’âge de 3 mois et 6 ans. Comme pour les adultes, le traitement des épilepsies chez l’enfant est principalement médicamenteux. Toutefois, plus d’un tiers des épilepsies infantiles sont résistants aux approches médicamenteuses existantes, d’où la nécessité d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques notamment pour éviter le recours à des interventions chirurgicales lourdes et risquées. Dans ce sens, de nombreux essais d'administration intra-cérébrale sont en cours, à la fois au stade préclinique et clinique, et suscitent déjà d'importants espoirs thérapeutiques à long terme. L'objectif de ce projet est de développer et valider un modèle permettant d'administrer un colorant non toxique ou une molécule thérapeutique spécifique (un fragment court d'ADN ou d'ARN synthétique) dans des zones précises du cerveau de souris nouveau-nées. Deux techniques d'anesthésie seront comparées : 1) L'anesthésie par hypothermie et 2) L'anesthésie gazeuse par inhalation. Cette comparaison vise à déterminer la méthode optimale pour anesthésier efficacement des souris nouveau-nées, minimiser la durée de l'anesthésie, l'inconfort de l'animal et le temps de séparation entre le souriceau et sa mère, tout en ciblant efficacement la zone cérébrale d'intérêt. La distribution de la substance injectée sera évaluée immédiatement après l'injection pour vérifier le succès du geste (procédure 1), et 7 jours plus tard pour s'assurer de la bonne récupération des souriceaux et comparer les 2 méthodes d’anesthésie (procédure 2). La validation du modèle sera assurée par l’évaluation d’une injection de la molécule thérapeutique avec la méthode anesthésique la plus appropriée. Les souriceaux seront suivis attentivement pendant 30 jours maximum (procédure 3). Une analyse macroscopique des organes post-mortem sera également réalisée au moment de l’euthanasie et le foie, les reins seront prélevés afin de réaliser des analyses sur ces tissus. La validation du modèle sera fonction de l’ensemble des résultats et des analyses. Le modèle établi servira in fine, au travers d’une demande ultérieure d’autorisation de projet, à évaluer l’effet thérapeutique à plus long terme d’une injection d’oligonucléotides dans le cerveau de souris épileptique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent à plusieurs niveaux. Ce projet permettra d’informer sur (i) la tolérance ou la potentielle toxicité de la molécule thérapeutique au niveau du système nerveux central en développement et au niveau périphérique (ii) les modifications physiologiques induites par l’injection intracérébrale de la molécule thérapeutique (iii) le mode d’anesthésie à pratiquer sur des souriceaux afin de minimiser leur inconfort, maximiser leur survie et obtenir des résultats aussi reproductibles que possible.
Procédures
L'injection d'un colorant non toxique ou d’une molécule thérapeutique spécifique (un petit morceau d'ADN ou d'ARN synthétique) directement dans les cavités cérébrales (ventricules) du souriceau sera réalisée sur animal anesthésié et analgésié. L'administration sera unique et durera moins de 5 min par animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront évalués avant toute mise en œuvre du projet. Ils seront anticipés au plus juste en fonction des informations obtenues au cours de protocoles préalablement réalisés et appuyées d’une veille bibliographique inhérente à la molécule thérapeutique spécifique (un petit morceau d'ADN ou d'ARN synthétique) à injecter. Plus précisément, nous surveillerons l’apparition d’effets délétères qui pourraient survenir, comme un traumatisme et une inflammation transitoire au niveau du site d’injection, ou encore un comportement anormal de l’animal, une perte de poids.
Devenir
Devenir des souriceaux utilisés dans les 3 procédures : A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés et minutieusement autopsiés. Les organes d'intérêts, dont les structures cérébrales, seront prélevés. Les organes seront prélevés pour réaliser des analyses ex vivo.
Remplacement
Les agents thérapeutiques que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels présentent plusieurs limites, p.ex., l’étude de cellules neuronales en culture ne permet pas d’observer de crise épileptique spontanée ; la vascularisation cérébrale et les connexions entre neurones de différentes régions cérébrales étant absentes. De plus, ces études ne renseignent pas sur les effets d’agent thérapeutique sur un ensemble de cellules différentes, en particulier ici dans le cerveau. Le système nerveux central comme celui du nouveau-né est en perpétuel remodelage assuré par des régulations impliquant différents types cellulaires. Le développement cérébral et les mécanismes complexes de communication entre cellules ne peuvent donc être mimés par un simple modèle de culture in vitro. Il n'existe donc pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer l’efficacité d’une thérapie dans le traitement des épilepsies infantiles et ses effets éventuels sur le développement cérébral. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
Les souriceaux des deux sexes seront utilisés dans cette étude. Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’obtenir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une étude complémentaire pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité des réponses aux agents thérapeutiques, 8 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique, grâce à nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif pourra être revu après analyse des premiers résultats avant chaque protocole, afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre.
Raffinement
Les souriceaux seront stabulés avec leur mère respective. Pour les souriceaux gardés jusqu’à 30 jours après injection, une fois sevrés, ils seront maintenus en groupes sociaux dans un environnement adapté n’induisant pas de stress et en veillant à séparer les mâles des femelles. Des mesures spécifiques de gestion de la douleur éventuelle occasionnée par l’injection intracérébrale seront prises pour éviter toute souffrance inutile et prolongée des animaux : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilitée d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons des protocoles anesthésiques (par hypothermie ou à l’isoflurane) et analgésiques appropriés dès l’apparition de premiers signes cliniques. Une observation minutieuse des souriceaux sera effectuée durant la phase de réveil sur couverture chauffante puis lors du replacement dans la cage avec la mère. Les souriceaux seront également minutieusement observés 10min, 3h et 24h après le réveil puis 2x par semaine jusqu’à la fin des procédures. Ce score a été déterminé spécialement pour ce projet en se basant sur la littérature existante. Les souriceaux seront également pesés le jour de l’injection, puis tous les 2 jours jusqu’à 10 jours post-injection et enfin 2 fois par semaine jusqu’à 30 jours post-injection. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs points limites à l’appui des grilles du bien-être animal sera euthanasié.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour ce projet car cette espèce mammifère possède des organes et type cellulaires identiques à ceux de l’homme. De plus, la souris présente un patrimoine génétique et des caractéristiques comportementales, physiopathologiques et réponses tissulaires très proches de celles observables chez l'homme, ce qui en fait un excellent modèle pour étudier les pathologies humaines notamment celles du système nerveux. La souris étant fréquemment utilisée à des fins de recherche, l’étude des effets de composés chez cet animal de laboratoire permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme. Par ailleurs, les structures cérébrales et nerveuses peuvent parfaitement être prélevées à partir de cet animal. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Les souriceaux seront soumis à une injection directement dans les cavités cérébrales (ventricules) du cerveau à l'âge de 2 ou 3 jours—une période critique du développement cérébral. Ce stade précoce est optimal pour cette procédure, offrant un accès facilité aux ventricules cérébraux. La procédure n°3, en particulier, permettra d’évaluer les conséquences de l'injection d'oligonucléotides sur un cerveau en pleine maturation. À un mois post-injection, le cerveau murin aura atteint environ 90% de sa taille adulte, avec la majorité des neurones déjà formés et en cours de différenciation. Cette approche permettra d'analyser l'impact global de l'intervention sur les structures et fonctions cérébrales, fournissant ainsi des données cruciales sur la sécurité potentielle de l’élément injecté dans le contexte du développement neurologique. Par ailleurs, l'utilisation de la fenêtre 2-3 jours pour les expériences, plutôt qu'un jour fixe, présente plusieurs avantages cruciaux pour l'optimisation du protocole expérimental et le respect des principes éthiques en recherche animale. Cette approche permet une gestion efficace des ressources en s'adaptant aux naissances survenant hors des horaires de travail habituels, réduisant ainsi le gaspillage d'animaux. Elle prend en compte la variabilité biologique naturelle entre les portées, permettant d'ajuster les protocoles d'anesthésie selon le poids et le développement de chaque souriceau.
Mise en place d’un modèle murin de xénogreffe orthotopique de glioblastome 2/3
- Recherche appliquée
- Cancers
La souche de souris retenue est choisie pour accepter l'implantation de lignées de glioblastome humain à l'intérieur de la boîte crânienne. 307 souris y sont utilisées, 60 opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 188 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 59 un niveau sévère. Après une chirurgie crânienne de trente minutes, chacune passe par des séances hebdomadaires d'imagerie sous anesthésie générale pendant quatre semaines, jusqu'à deux heures par séance, la croissance de la tumeur pouvant entraîner une perte de poids marquée et des effets neurologiques. Cent souris sont gardées vivantes au terme du projet, pour la formation et le maintien des compétences du personnel.
Objectifs
Le glioblastome multiforme est la tumeur cérébrale primitive la plus fréquente et la plus agressive chez l’adulte. La médiane de survie globale varie de 15 à 18 mois et le taux de survie à 5 ans n’excède pas 5%. Le traitement de référence consiste en la chirurgie la plus complète possible suivie de l’association d’une radiothérapie et d’une chimiothérapie par le témozolomide. Malgré ce protocole thérapeutique, la majorité des patients rechute dans un délai médian de 8-9 mois. Il est donc aujourd’hui indispensable d’améliorer ce protocole. Dans cette démarche, il est connu que les glioblastomes sont caractérisés comme des tumeurs résistantes à l’irradiation. Cette résistance repose en partie sur le manque d’oxygène (hypoxie) au cœur de la tumeur et il a été démontré dans de nombreuses études que l’oxygénation des tissus représente un facteur prédictif de réponse à l’irradiation. Dans ce contexte, ce projet aura comme objectif la mise au point d’un modèle orthotopique de glioblastome, c’est-à-dire l’induction d’une tumeur au sein même de la cavité crânienne chez la souris afin d’évaluer la réoxygénation cellulaire et la radiosensibilisation et ainsi d’améliorer la survie des patients atteints de glioblastome. Ce projet se déroulera dans 3 établissement utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait contribuer à optimiser le traitement actuel des patients atteints de glioblastome en sensibilisant les tumeurs aux effets de la radiothérapie pour améliorer la survie de ces patients.
Procédures
A) Dans l’Etablissement Utilisateur (EU) 1/3 nous ferons une Chirurgie 1 : une injection analgésique d’une minute sur animal vigile, puis une anesthésie générale gazeuse, suivie d’une chirurgie de 30 minutes avec une injection d’une minute et suture sous anesthésie générale et locale. B) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Imagerie 1 : une injection d’une minute sur animal vigile, puis imagerie de 30 minutes sous anesthésie générale pour l’observation de la croissance tumorale. Puis, une injection sur animal sur animal vigile, suivi 24h après d'une imagerie de 15 minutes sous anesthésie générale. Cette procédure sera réalisée à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. C) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Imagerie 2 : Imagerie sous anesthésie générale de 2 heures pour l’observation de la croissance tumorale et de l’hypoxie à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. D) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Chirurgie 2 : une injection d’une minute d’un anesthésique général sur animal vigile, puis des injections d’une minute d’un anesthésique local et d'un analgésique, puis une chirurgie de 2 minutes, suivi d’une perfusion de 5 minutes. E) Dans l’EU 3/3 nous ferons une Imagerie 3 : Imagerie sous anesthésie générale de 90 minutes pour l’observation de l’hypoxie à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. F) Dans l'EU 2/3 un groupe subira les procédures A et F. Un autre subira les procédures A, puis B, suivi D puis F. Un autre subira les procédures A, puis C, suivi D puis F. Un autre subira les procédures : A, puis C, D et E puis F. G) ) Dans l’EU 1/3 et 2/3 nous ferons injection d’une minute sur animal vigile à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines.
Impact sur les animaux
La mise en place des modèles pourra induire des douleurs/infections suite à la chirurgie associée à une potentielle perte de poids transitoire et une déshydratation. Le transport des animaux entre les trois EU pourra induire un stress. Les injections nécessaires à l’imagerie pourront entrainer un stress chez l’animal se traduisant par des problèmes respiratoires. Les suivis par imagerie pourront induire du stress suite aux anesthésies répétées. La croissance des tumeurs pourra entrainer une perte de poids excessive et des effets neurologiques.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort lorsque les points limites sont atteints ou à la fin du projet, sauf les animaux utilisés pour la formation ou le maintien des compétences du personnel.
Remplacement
Les études préliminaires réalisés sur cellules cancéreuses ont permis de valider 2 types de cellules pour notre modèle de glioblastome chez la souris. Ce modèle chez l’animal permet de mimer au plus proche la complexité d'un environnement tumoral chez l'individu (vascularisation, inflammation…).
Réduction
Les études préliminaires sur cellules ont également permis de réduire le nombre de lignées à 2 afin de réduire le nombre de groupe utilisant des animaux. La mise en place du modèle permettra également de réduire le nombre d’animaux utilisées dans de futurs projets étudiant l’amélioration de la radiothérapie sur un modèle de glioblastome. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé avec suffisamment d’animaux pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente par les 2 méthodes d’imagerie décrites. Ce projet utilise des méthodes d’imagerie non-invasives permettant de suivre un même animal au cours du temps réduisant le nombre d’animaux.
Raffinement
Chaque protocole expérimental prend en compte un potentiel impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour justifier un arrêt de l'expérience en cours. Les animaux seront hébergés à 5-8 souris par cage (souris issues de différents groupes de traitement), dans des cages à couvercle filtrant avec de la litière, des frisures de papier kraft, des tubes de coton (nidification), des bâtons et des tunnels. Les procédures expérimentales seront réalisées par des manipulateurs expérimentés. Les animaux seront acclimatés à leur hébergement deux semaines avant de démarrer les procédures. Des anesthésies et des analgésies sont appliquées dès que possible pour éviter tout risque de stress et de souffrance. Des points limites ont été établis pour éviter toute souffrance animale et seront évalués 3 fois par semaine. Si une souris présentait des signes d’effet(s) secondaire(s) ou de symptômes révélant un inconfort ou l’apparition de douleur, le vétérinaire désigné sera contacté pour venir voir les animaux, poser un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées. Les méthodes d’imagerie utilisées sont reconnues non-invasives et non-irradiantes. Les animaux seront transportés en voiture entre les trois Etablissements Utilisateur (temps maximum de 10 minutes entre les EU1 et EU2 et de 30 minutes entre les EU2 et EU3). Pour cela, les animaux seront mis dans des boites de transport avec un filtre sanitaire, de la nourriture, de l’eau gélifiée, des frisures de papier et du matériel de nidification avec ajout de chaufferettes sous les boites.
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus utilisée en expérimentation en oncologie. La raison la plus importante du choix de la souris pour notre étude est sa similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Le modèle de souris choisi permettra l’implantation de lignées cancéreuses humaines et le développement des tumeurs orthotopiques. Les animaux utilisés seront adultes c’est-à-dire à partir de 6/8 semaines car ils possèdent un poids et un développement optimales pour les actes subit (chirurgie, injections…).
Mise au point d’une méthode de perfusion d’adénovirus à visée de thérapie génique dans le rein de porc.
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Une intervention unique de quatre-vingt-dix minutes, une exsanguination et le prélèvement des deux reins : 30 porcs sont opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil. Leurs reins sont ensuite perfusés sur machine pour comparer des souches de virus adéno-associés destinées à la thérapie génique de maladies rénales héréditaires. Le porteur écarte tout effet indésirable au motif que l'animal ne sera jamais conscient, et présente le recours au porc comme une alternative aux modèles primates qu'il qualifie de coûteux et éthiquement complexes. Il retient des porcs charcutiers de 50 kg, environ 90 jours, pour disposer d'un gabarit et d'une anatomie rénale proches de ceux de l'être humain.
Objectifs
Les podocytopathies héréditaires sont des maladies ayant pour origine une altération du fonctionnement du podocyte, structures particulières du rein, qui sont chargées de la filtration et de l'épuration du sang. Les patients atteints de podocytopathies héréditaires présentent tous une protéinurie (présence anormale de protéines dans l'urine), qui évolue le plus fréquemment vers l’insuffisance rénale terminale dans les premières décennies de vie. Aucune solution thérapeutique n'est disponible actuellement et la greffe rénale reste la seule solution thérapeutique. Ces maladies sont dues à des mutations dans une cinquantaine de gènes. La réexpression de la forme normale du gène muté par thérapie génique pourrait corriger le défaut à l'origine du trouble et ainsi empêcher le développement d'une insuffisance rénale. Les traitements par thérapie génique manquent de sélectivité et d’efficacité, nécessitant la production et l’injection de doses importantes pour pouvoir modifier efficacement les cellules malades chez le patient, ce qui peut entrainer des effets indésirables, parfois délétères. C'est pourquoi nous souhaitons tester plusieurs souches de vecteur viral (virus adéno-associés - AAV) afin d'identifier celles(s) qui permet(tent) d'obtenir la plus grande efficacité de transduction des podocytes (la transduction étant l'entrée du virus dans la cellule).
Bénéfices attendus
Impacts et valorisation scientifique : Le projet permettra de démontrer le potentiel des modèles porcins pour les études de thérapie génique en néphrologie, offrant ainsi une alternative aux modèles primates souvent coûteux et éthiquement complexes. Impacts sociétaux et médico-économique : Aujourd’hui, les podocytopathies héréditaires ont des impacts significatifs sur les patients et sur la société en général. Elles entraînent des complications graves, telles que l'insuffisance rénale terminale, ce qui nécessite la mise en place de programmes de dialyse très contraignants et de transplantation rénale dont on connait les difficultés du fait du manque de donneurs et le caractère malheureusement souvent transitoire, nécessitant le retour à la dialyse. En outre, ces maladies vont restreindre les possibilités de travail pour certains patients, avec des conséquences sur leur niveau de vie et sur leur capacité à subvenir à leurs besoins financiers, en plus du coût important lié au traitement de celles-ci. Le développement de thérapies géniques plus performantes pour des maladies rares et fréquentes, à travers ce projet qui vise à apporter des avancées majeures et des réponses concrètes, va permettre l’amélioration de l’accès aux soins et de la qualité de vie des patients traités. En effet, ce projet vise finalement à améliorer considérablement la vie des patients atteints de maladies chroniques (spécifiquement les podocytopathies héréditaires), handicapantes et progressives, qui impactent fortement les malades, leur entourage, et requièrent un parcours de soin long et cher pour lesquelles il n’existe actuellement pas de traitement. Cela permettra non seulement d'améliorer la qualité de vie, mais aussi de réduire le nombre de décès
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule intervention de 90 minutes, réalisée sous anesthésie générale, à savoir une exsanguination et un prélèvement des reins. Aucun animal ne sera par définition réveillé à l'issue de de ces procédures. Il n'y a aucune intervention prévue sur animaux conscient.
Impact sur les animaux
Toutes les procédures expérimentales seront réalisées sous anesthésie générale avec traitement hypnotique et analgésique. A aucun moment l’animal ne sera conscient ni susceptible de ressentir la douleur. Aucun effet indésirable ni nuisances ne sont attendus pour l'animal puisqu’il s’agira de procédures sans réveil avec euthanasie de l’animal en fin de procédure.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort au terme de chaque procédure, le sang et les reins étant prélevés pour être utilisés durant une perfusion d’organe ex vivo. La finalité de ces protocoles est l’étude de l’impact de vecteurs viraux utilisés dans des approches sélectives de thérapie génique ciblant les maladies rénales héréditaires.
Remplacement
Il ne peut s’agir que d’un rein provenant d’un système vivant reproduisant des conditions anatomiques et physiologiques proches de celles d’un rein humain. Enfin seul un modèle sur gros animal permettra une instrumentation chirurgicale adaptée pour réaliser la perfusion rénale isolée ex vivo sur machine. Des essais préliminaires sur des cultures cellulaires de cellules rénales et des organoïdes rénaux ont été réalisés pour vérifier la bonne expression des gènes dans les vecteurs (AAV) séléctionnés.
Réduction
Une échographie rénale sera réalisée chez tous les animaux au moment de leur inclusion dans l’étude afin de dépister une éventuelle malformation rénale qui pourrait compromettre le bon déroulement du protocole expérimental. En cas d’anomalie anatomique, l’animal sera sorti de l’étude et ne sera donc pas mis à mort pour les fins de ce protocole dans un principe de réduction du nombre des animaux. Nous avons choisi de mettre au point les conditions de perfusion des virus adéno-associés sur rein isolé et perfusé pour limiter le nombre d'animaux utilisés (réduction) et leur souffrance (raffinement). En effet, les deux reins de l'animal seront utilisés pour cette mise au point, ce qui aurait été impossible sur animal entier.
Raffinement
Dans un principe de raffinement, nous appliquerons les points suivants : - Respect d’une période d’acclimatation d’une semaine minimum entre l’arrivée à l’animalerie du laboratoire et l’inclusion dans le protocole de recherche - Hébergement en groupe de deux pour favoriser le contact régulier entre congénères - Environnement adapté à chaque phase de l’expérimentation pour réduire l’angoisse des animaux (accompagnement et anxiolyse durant le transfert depuis l’animalerie jusqu’en salle d’intervention) - Procédures expérimentales réalisées par du personnel qualifié et expérimenté (chirurgiens séniors, techniciens anesthésistes) permettant un temps interventionnel réduit au maximum.
Choix des espèces
Nous utilisons des porcs de type charcutier (Large White / Landrace) qui possèdent des caractéristiques anatomiques et physiologiques correspondant aux besoins de nos procédures. Il n'existe pas de numéro d'agrément spécifique pour ce type de porc, dont l'espèce n'appartient pas à la liste fixée réglementairement. Les animaux de ce protocole sont des porcs de 50kg (environ 90 jours) afin d’avoir un gabarit proche de celui d’un homme. A ce stade, ils ont une anatomie rénale semblable à l’Homme avec une structure et une vascularisation rénale compatible avec l’instrumentation du rein sur module de perfusion isolé ex vivo (PerLife).
Mesure du pH tumoral à l’aide de nouveaux agents de contraste: application aux modèles murins MDA-MB231 et 4T1 de cancer du sein 2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Deux heures d'IRM sous anesthésie générale et jusqu'à deux injections d'agents de contraste radiomarqués à vingt-quatre heures d'intervalle: 920 souris femelles immunodéficientes vont être utilisées, dont 100 tuées sans reprendre conscience et 790 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une injection de cellules cancéreuses dans la mamelle pour induire une tumeur du sein triple négatif, puis passe d'un établissement à l'autre en véhicule climatisé entre l'imagerie et les études de biodistribution. Le porteur écrit que les acquisitions IRM sont indolores et atraumatiques et qu'aucun antalgique n'est utilisé pour les injections d'agents de contraste, les nuisances déclarées se limitant au développement des tumeurs. Toutes sont tuées sous anesthésie, par ponction cardiaque pour certaines, afin de récupérer la tumeur et de mesurer la radioactivité retenue par chaque organe.
Objectifs
Malgré les avancées dans le dépistage et le développement de thérapies, le cancer du sein reste un problème de santé public majeur. Il s’agit du cancer le plus fréquent chez la femme. L’incidence du cancer du sein est en constante augmentation dans la plupart des pays malgré les efforts fournis pour la prévention de cette maladie. Une caractérisation tissulaire du cancer du sein est indispensable pour une détection plus précoce, ce qui permettra d’augmenter les chances de réussite du traitement, mais aussi de minimiser les séquelles. Il Il est connu que le pH extracellulaire des tumeurs est plus acide que celui du tissu sain . Ceci est dû à une augmentation de la production d’acide lactique. Nos collaborateurs ont développé des agents de contraste détectables en IRM sensibles au pH. L’objectif de ce projet est dans un 1er temps d’étudier l’efficacité de nouveaux agents de contraste pour mesurer les variations du pH tumoral au cours du développement de la tumeur. Une fois injectés par voie intraveineuse, l’intensité du signal de la tumeur sur l’image IRM va varier en fonction de la valeur de son pH. Ceci permet de calculer le pH tumoral et d’étudier sa variation tout au long du développement de la tumeur mammaire. Néanmoins, la technique d'IRM ne permet pas une quantification absolue de l'agent de contraste dans un organe d'intérêt du fait que le signal dépend à la fois de la concentration locale d’agent mais aussi de son environnement. L’utilisation d’un analogue radioactif permet l’accès à la distribution relative de l’agent dans l’organisme (biodistribution) car l’activité qui est retenue par chaque organe dépend exclusivement de la concentration locale en agent. Dans un 2nd temps, nous allons étudier la biodistribution ex vivo (prélèvements d'organes post mortem à des temps précis) de ces même agents de contraste, sur souris saines et souris modèle de cancer du sein triple négatif à l'aide des analogues marqués soit à l'111In soit avec un autre radiométal. Ils ne sont donc pas éligibles aux traitements ciblant ces trois types de marqueurs et donc plus difficile à soigner. Ce projet se fera donc sur 2 EU
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est d’étudier l’efficacité de nouveaux agents de contraste sensibles au pH pour mesurer les variations du pH tumoral au cours du développement de la tumeur et de quantifier la biodistribution de ces agents de contraste dans les différents organes. Ce projet devrait permettre d'améliorer la connaissance sur le développement du cancer triple négatif puisque le pH est directement lié à l’agressivité tumorale et au développement de métastases.
Procédures
Dans l'EU1 (IRM), certaines souris vont recevoir une injection intra mammaire unique pour l’induction des tumeurs (durée moins de 2 minutes). Tous les animaux vont recevoir 1 injection intraveineuse ou intrapéritonéale pour l’injection des agents de contraste à étudier en imagerie par résonnance magnétique (IRM). Dans l'EU2, tous les animaux vont recevoir 1 injection intraveineuse ou intrapéritonéale pour l’injection des agents de contraste à étudier en biodistribution. Certaines souris venant de l'EU1 serviront pour les études de biodistribution dans l'EU2 et recevront au maximum 2 injections à 24h d'intervalle. Le temps d'injection est de 5 secondes environs. L’induction tumorale et les examens d’imagerie seront effectués sous anesthésie générale. Le temps total d'examen d'imagerie est de 2 heures maximum. Certaines souris vont avoir un prélèvement de sang qui se fera juste avant la mise à mort de l’animal sous anesthésie générale (Dans l'EU1 ou l'EU2).
Impact sur les animaux
Les nuisances possibles sont liées au développement des tumeurs mammaires. Si des signes de souffrance apparaissent, ils feront l'objet de points limites. L’injection IV de agents de contraste ne provoque pas de douleur, juste celle équivalent à une piqure d’aiguille. Notre expérience de l’injection d’agents de contraste fait que nous n’utilisons pas d’antalgiques pour ce geste. Les acquisitions IRM sont totalement indolores et atraumatiques. De plus les souris sont sous anesthésie gazeuse pendant toute la durée des acquisitions IRM et durant la ponction cardiaque. Les souris immunodéficientes utilisées présentent un phénotype dommageable dû à leur immunodéficience.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les souris anesthésiées à l'isoflurane seront mises à mort pour pouvoir récupérer la tumeur et les organes d'intérêt.
Remplacement
Le modèle animal souris est fondamental dans notre cas, puisque à notre connaissance il n'existe pas de modélisation capable de représenter la complexité des tumeurs et la distribution des agents de contrastes in vivo. Pour ces raisons, l’étude préclinique de biodistribution des agents de contraste et l’induction de tumeurs mammaires ne peuvent se faire que sur un organisme vivant entier.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. L’IRM (imagerie par résonance magnétique) pour le suivi du développement des tumeurs mammaires ainsi que la SRM (spectroscopie par résonance magnétique) permettent aussi de réduire le nombre d’animaux puisque l’intérêt de ces techniques réside dans le fait qu’une même souris peut être observée plusieurs fois dans le temps. Des tests non paramétriques seront utilisés pour comparer les valeurs obtenues pour les différents lots de souris.
Raffinement
Elles sont manipulées par du personnel formé et entraîné. Les animaux sont observés quotidiennement afin de déceler toute souffrance. Des points limites prédictifs nous permettront de prendre les mesures nécessaires afin d’éviter toute souffrance au cours de l’expérimentation. Toutes les tumeurs seront induites dans l'établissement 1. Après l'imagerie RM, les souris seront transportées à l'établissement 2 (situé sur le même campus) dans un véhicule climatisé. Les animaux sont transportés dans des cages à couvercle filtrant et des procédures strictes sont appliquées (désinfection du matériel, entretien des locaux, ordre de passage des souris dans l’imageur…) évitant la contamination des animaux durant les séances d'imagerie.
Choix des espèces
Ce modèle animal nous donne la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses humaines et murines. On utilisera des souris femelles adultes de 8 à 10 semaines; âge auquel tous les organes sont arrivés à maturation, ce qui est important pour l’élimination des agents de contraste (en particulier les reins).
Mise au point de modeles et enseignement pratique de techniques de pointe en radiologie interventionnelle
- Formation professionnelle
80 cochons vont être utilisés, chacun anesthésié de quatre à huit heures pendant que des médecins s'exercent sur son corps. 55 ne seront jamais réveillés, les 25 autres sont opérés puis surveillés quinze jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avant une seconde anesthésie sans réveil. Un animal sert à former sept à huit professionnels, et le porteur affirme que les fantômes en silicone et les organes récupérés à l'abattoir couvrent les deux tiers de la formation, l'animal vivant restant "nécessaire" pour naviguer dans le système vasculaire sous guidage radiologique et faire pousser des néovaisseaux par inflammation tendineuse. Le bénéfice annoncé pour les patients est indirect et passe par l'entretien des compétences de radiologues déjà diplômés, quand la mise à mort des 80 cochons est décidée d'avance, les dommages infligés pendant les séances ne permettant pas d'envisager leur survie.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de proposer des programmes de formation continue pour les médecins spécialisés en radiologie interventionnelle (RI) dont la pratique évolue au regard des progrès et innovations technologiques. Cette spécialité de la radiologie associe une technique d’imagerie (rayons X, ultrason, IRM) à un geste invasif à visée diagnostique et/ou thérapeutique pour un large éventail de maladies. Les procédures mini-invasives, souvent moins lourdes que les chirurgies traditionnelles, sont effectuées sous anesthésie, sous guidage et contrôle par l’image pour accéder à une lésion à l’intérieur de l’organisme. La RI a fait son apparition au milieu des années 1960 pour le traitement de pathologies cardio-vasculaires. Cette technique s’est depuis considérablement développée et est aujourd’hui également utilisée dans d’autres domaines, tels que la neurologie et le traitement de cancers. Des études européennes montrent un taux d’augmentation des procédures interventionnelles de l’ordre de 10 à 20 % par an. L’enseignement de la RI est dispensé aux internes en radiologie selon un parcours modulaire, avec des options avancées pour les gestes les plus complexes. Une fois diplômés, les professionnels doivent maintenir leurs compétences et suivre les avancées technologiques (angiographie 3D, Cone Beam CT, imagerie de fusion…). Ce projet propose des programmes éducatifs pour aider les médecins radiologue à affiner leurs compétences pratiques en RI et en apprendre davantage sur les options thérapeutiques actuelles pour les cas courants et les cas techniquement difficiles.
Bénéfices attendus
La radiologie interventionnelle a révolutionné la pratique de la médecine moderne grâce à l'introduction, au développement et à la validation de thérapies peu invasives, dont beaucoup ont non seulement remplacé des procédures invasives, mais ont également offert de nouvelles solutions diagnostiques et thérapeutiques là où il n'en existait pas auparavant. Ce projet de formation bénéficiera indirectement aux patients en permettant aux médecins radiologues d’approfondir leurs connaissances et maitrise pratique dans le traitement d’un grand éventail de maladies : pathologies cardiovasculaires (anévrysmes, varices, hémorroïdes), neurologiques, orthopédiques (arthrose, tendinites), cancers (réduction de la taille des tumeurs en les « asséchant »), avec un focus sur les scénarios d’urgence (hémorragie suite à un accident, saignement tumoral, saignement post accouchement…).
Procédures
Chaque animal sera soumis à une anesthésie générale de 4 à 8 heures pendant laquelle des interventions chirurgicales mini-invasives guidées par l’imagerie (scanner, IRM) seront réalisées. Sur 5 ans, 55 animaux seront soumis à cette procédure sans réveil, 25 seront opérés et suivi pendant 15 jours avant une nouvelle anesthésie générale sans réveil
Impact sur les animaux
Les nuisances pour les animaux sans réveil sont liées à l’induction de l’anesthésie : stress à la contention, injection intramusculaire. Pour les animaux modèles de néovacularisation, le réveil de l’anesthésie peut s’accompagner de nausées, désorientation, hypothermie, irritation trachéale. L’intervention chirurgicale pour créer le modèle est mini invasive (injection percutanée échoguidée sous anesthésie générale), les effets indésirables consécutifs à l’inflammation articulaire sont la boiterie avec fièvre éventuelle.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés sans réveil de l’anesthésie générale car les dommages occasionnés au cours de la formation ne permettent pas d'envisager leur survie.
Remplacement
Les formations sont dispensées sur plusieurs jours avec des sessions théoriques et pratiques. Les sessions pratiques se déroulent sur modèles alternatifs et sur modèle animal. Tout est mis en œuvre avec l’organisateur du cours pour établir des modèles alternatifs pertinents et éviter/limiter l’usage d’animaux vivants. Seul un tiers de la formation est dispensée sur animal vivant, le reste des apprentissages se fait sur la base de cours théoriques, partage de cas cliniques (vidéos d’interventions chirurgicales) et démonstrations pratiques sur modèles ex vivo : Des fantômes en silicone, des simulateurs médicaux, des organes explantés seront utilisés. Aucun animal n’est sacrifié dans ce but, les organes sont récupérés de l’abattoir ou sur des animaux mis à mort à des fins scientifiques dans d’autres projets. L’animal vivant reste néanmoins nécessaire quand il s’agit d’utiliser le système vasculaire pour naviguer sous guidage radiologique et visualiser les cibles (angiographie) ou de générer des néovaisseaux en réaction à une inflammation tendineuse.
Réduction
Tous les moyens seront mis en œuvre pour réduire le nombre d’animaux, à savoir: recherche et développement de modèles alternatifs, réalisations de plusieurs procédures par animal sur un même temps opératoire, mutualisation des sujets entre stagiaires, collecte d’organes pour formation ex vivo. Pour favoriser un environnement d'apprentissage plus efficace, chaque cours est limité à 20-30 participants. Un animal permet de former en moyenne 7 à 8 professionnels à une grande variété de gestes spécifiques de la radiologie interventionnelle.
Raffinement
Toutes les interventions se font sous anesthésie générale avec traitement de la douleur. Les animaux sont euthanasiés en fin de session de cours, sans réveil de l’anesthésie. Avant la procédure, les animaux sont maintenus en groupe social dans un environnement contrôlé en température et hygrométrie. Ils reçoivent une alimentation adaptée à leurs besoins, de l’eau à volonté, des jouets et dispositifs favorisant leurs comportements naturels comme le fouissage et mâchouillement. Un temps d'habituation avec douche tiède, promenade et distribution de récompenses permet la familiarisation des animaux aux manipulations. Une équipe compétente composée de zootechniciens, vétérinaire et chirurgiens assure au quotidien l’entretien, la surveillance et les soins des animaux. La Structure en charge du bien-être animal accompagne la mise en œuvre des formations. Avec le vétérinaire désigné, elle conseille les responsables de cours dans l’amélioration de leurs pratiques en faveur du bien-être des animaux et de l’application des 3R. Les gestes médicaux pour la préparation des modèles et la supervisions des cours sont réalisés par des médecins experts (radiologues, chirurgiens). Les animaux modèles de néovascularisation seront étroitement surveillés à leur réveil et durant les jours suivant l’intervention. Une vidéosurveillance 24h/24 permet un suivi visuel des comportements en animalerie et une intervention rapide du vétérinaire en cas d’anomalie. Une grille d’évaluation de la douleur est établie avec la conduite à tenir en cas de complications. Des points limites sont définis pour arrêter la procédure en cas de souffrance.
Choix des espèces
Le porc est un modèle pertinent pour les études impliquant de la chirurgie en raison de sa grande taille et de ses similitudes anatomiques (volume des organes, diamètres des vaisseaux sanguins…) et physiologiques avec l'homme. Un jeune porc charcutier de 3 à 4 mois, qui pèse entre 30 et 50 Kg, permet de reproduire fidèlement les scénarios cliniques en radiologie interventionnelle avec des imageurs et instruments identiques à ceux utilisés pour les patients (IRM, scanner, CBCT, échographie).